CN101665811B

CN101665811B - 一种制备s-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的方法

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Publication number: CN101665811B
Application number: CN200910182736A
Authority: CN
Inventors: 陈依军; 吴旭日
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2009-09-04
Filing date: 2009-09-04
Publication date: 2012-09-05
Anticipated expiration: 2029-09-04
Also published as: CN101665811A

Abstract

本发明公开了一种制备S-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的方法，包括如下步骤：(1)在溶剂中加入底物、双羰基还原酶和由甲酸脱氢酶介导的辅酶循环再生体系，振荡反应1～18小时；(2)将步骤(1)得到的产物进行分离提纯，即得到所述S-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯。本发明利用了新的双羰基还原酶，配合溶剂和辅酶体系催化合成了S-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯，其光学纯度ee值可达99.5％，底物浓度高达0.8M以上，具有现实的积极意义。

Description

一种制备S-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的方法

技术领域

本发明涉及一种制备S-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的方法，属于生物催化不对称还原制备医药手性中间体技术领域。

背景技术

S-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯，分子式为C₁₂H₁₆O₃，英文名为ETHYL(S)-2-HYDROXY-4-PHENYLBUTYRATE，CAS号：125639-64-7。与R-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯相对应，是一种重要的手性化合物。后者是合成众多血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)普利类药物的关键手性中间体；而对S-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的应用正在进一步研究中。

该类化合物的制备方法主要有拆分法和合成法，其中，拆分法主要包括化学拆分和生物拆分，但其最大收率一般不超过50％；合成法主要包括化学合成法和生物合成法，其中化学合成法的收率一般在70～90％，对映体过量(ee)值为50～82％，其所用催化剂价格昂贵，产物的光学纯度也不理想，且一般需要较高的氢气压力，对设备要求较高。生物催化法具有高效、高立体选择性、反应条件温和等优点，近年来得到了研究者的青睐。目前，羟基腈化酶和脂肪酶是最为普遍和最为常用的生物催化剂，羟基腈化酶是第一个用于合成光学纯度的羟腈类化合物的生物催化剂，但该合成过程的第二步是腈基水解反应(J.Biotechnol.1994，33：175-182)，剧烈的腈基水解反应会带来终产物消旋、降解和其他一些副反应(J.Mol.Catal.B：Enzym.2003，24-25：89-98)。脂肪酶拆分外消旋体是制备光学纯2-羟基-4-苯基丁酸乙酯一个较为成功的方法(J.Org.Chem.1990，55：812-815)，据报道，来自Psedomonascepacia中的脂肪酶可在水和有机溶剂组成的两相体系中选择性水解2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的外消旋体，并可通过透析过滤的方法获得单一光学纯度的产物(Enzyme Microb.Technol.2002，30：673-681)，然而，就其本质而言，消旋体拆分的最高理论产量是50％。此外，醇脱氢酶选择性还原2-氧代-4-苯基丁酸制备其单一光学异构体的方法是一个重要和具有广泛应用价值的生物催化手段，例如，Cha等(Biotechnol.Prog.2007，23：606-612)利用Enterobacter sp.BK2K中的醇脱氢酶以2-氧代-4-苯基丁酸为底物，偶联甲酸脱氢酶进行辅酶NAD⁺循环，制备得到S-2-羟基-4-苯基丁酸，然而，其ee值只有94％，底物浓度也仅为0.1M，催化效率和产物光学纯度不高。

因此，开发一种高效稳定的生物催化制备S-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的方法，选择适当的反应条件，最大限度地提高ee值和底物浓度，具有现实的积极意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种制备S-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的方法，以最大限度地提高ee值和底物浓度。

为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：一种制备S-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的方法，包括如下步骤：

(1)在溶剂中加入底物、双羰基还原酶和由甲酸脱氢酶介导的辅酶循环再生体系，振荡反应1～18小时；

其中，所述溶剂为有机溶剂和缓冲液的混合溶液，有机溶剂和缓冲液的体积比为1∶9～5∶5，所述有机溶剂选自乙醇、四氢呋喃、二甲基亚砜、乙酸乙酯、甲苯和正己烷中的一种或几种，所述缓冲液的pH值为4～7.5；

所述底物为：

其中R为H或C_1～6的烷基；底物浓度为0.1～1.5M；

所述双羰基还原酶的用量为0.5～5U/mL；

(2)将步骤(1)得到的产物进行分离提纯，即得到所述S-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯。

上文中，所述双羰基还原酶是指中国发明专利申请CN101429514A公开的双羰基还原酶，其核苷酸序列与原文中的SEQ ID NO.1具有80％以上的同源性，或者由与SEQ ID NO.2具有80％以上的同源性的氨基酸序列组成。所述由甲酸脱氢酶介导的辅酶循环再生体系是常规技术，通常包括甲酸盐、辅酶NAD⁺和甲酸脱氢酶，本领域的技术人员可以根据实际情况选择合适的组分和用量。所述底物中的R基为C_1～6的直链烷基或侧链烷基。所述步骤(1)中的振荡反应的转速一般在100～300rpm，优选150～250rpm。所述步骤(2)的分离提纯方法可以是：将反应体系分离取有机层，再将水相用有机溶剂萃取，合并有机相，纯化后即得到所述产物。

进一步的技术方案，所述步骤(1)中的有机溶剂选自乙醇、二甲基亚砜和甲苯中的一种或几种。

进一步的技术方案，所述步骤(1)中的缓冲液为磷酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液。该缓冲液的制备均为现有技术。

本发明的反应过程可用如下反应式表示：

由于上述技术方案的采用，与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1.本发明采用了新的双羰基还原酶，并配合溶剂和辅酶体系的选择，催化合成了S-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯，其光学纯度ee值可达99.5％，底物浓度高达0.8M以上，具有现实的积极意义；其中，选择甲酸脱氢酶介导的辅酶循环再生体系、特定的溶剂并规定缓冲液的pH值，可以有效地与双羰基还原酶配合，获得所需的高光学纯度的产物。

2.本发明的制备方法简单、过程可控，效率极高，具有良好的应用前景。

附图说明

图1是本发明实施例四中底物转化率与反应时间的关系曲线图；

图2是本发明实施例一中2-羟基-4-苯基丁酸乙酯消旋体对照品手性高效液相色谱图；

图3是本发明实施例一中R-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯消旋体对照品手性高效液相色谱图；

图4是本发明实施例一中S-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯消旋体对照品手性高效液相色谱图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述：

实施例一

一种制备S-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的方法，包括如下步骤：在1ml的反应体系中，依次加入甲酸钠208mg(2M)，2-氧代-4-苯基丁酸乙酯0.1～1.5M，0.1M(pH＝6.0)磷酸钾缓冲液，NAD⁺20μl(0.5mM)，甲酸脱氢酶40μl(4U/ml)，双羰基还原酶上清100μl(5U/ml)，最后加入甲苯200μl；在常温、振荡速度为200rpm条件下反应18小时，停止反应后，分离提纯，样品进行高效液相色谱分析底物转化率和产物光学纯度。

在底物浓度小于等于0.8M时转化率为95.2％，产物S-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的ee值均为99.5％。

上文中，所述双羰基还原酶可以通过下述方法得到：将含有诱导表达的双羰基还原酶的大肠杆菌细胞用0.1M(pH＝6.0)磷酸钾缓冲液，按20％的比例重悬，高压破细胞，12000rpm离心15～20min获得双羰基还原酶上清，其酶活力为57U/ml。

所述甲酸脱氢酶可以采用如下方法制备：将含有甲酸脱氢酶工程质粒的大肠杆菌菌种于含50μg/ml卡那霉素的LB培养基中37℃培养12小时，制备种子液，再按5％接种量转接到新鲜的含50μg/ml卡那霉素的LB培养基中37℃培养1小时，再加入IPTG诱导表达4小时，IPTG的终浓度为50μM，4800rpm离心5min收集菌体，再将菌体用0.1M(pH＝7.0)磷酸钾缓冲液按20％的比例重悬，高压破细胞，12000rpm离心15～20min获得甲酸脱氢酶上清，冷冻干燥，使用时用蒸馏水配制成55U/ml储液。

2-氧代-4-苯基丁酸乙酯的转化率和产物纯度用反相C₁₈柱(5μm，4.6×250mm，Shimadzu，Japan)进行高效液相(Shimadzu 2010A HT，Japan)分析，流动相为：A泵水(含0.1％三氟乙酸)，B泵乙腈(含0.1％三氟乙酸)，25-90％的梯度洗脱时间为14min，流速为1ml/min，柱温为40℃，检测波长220nm；出峰顺序依次为：S-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯(10.4min)，2-氧代-4-苯基丁酸乙酯(12.2min)。

产物的对映体过量值(ee值)用手性液相色谱柱Chiralcel 0D-RH(5μm，150×4.6mm，Daicel，USA)进行分析，流动相为：A泵水(含0.1％三氟乙酸)，B泵乙腈(含0.1％三氟乙酸)，30～40％的梯度洗脱时间为25min，40％B保留5min，流速为0.5ml/min，柱温为25℃，检测波长220nm。出峰顺序依次为S-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯(21.2min)，R-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯(23.8min)，参见附图2～4所示。

产物S-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯ee值的计算：

ee(％)＝[(C_S-C_R)/(C_S+C_R)]×100％

底物转化率计算：转化率(100％)＝1-C/C₀×100％

产物得率计算：得率(100％)＝N_S/N₀×100％

式中：C_S为反应后S-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的浓度，C_R为反应后R-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的浓度；C为反应后剩余底物2-氧代-4-苯基丁酸乙酯的浓度，C₀为反应前底物2-氧代-4-苯基丁酸乙酯的浓度；N_S为纯化后产物S-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯物质的量，N₀为反应投入底物2-氧代-4-苯基丁酸乙酯的物质的量。

实施例二

一种制备S-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的方法，包括如下步骤：在1ml的反应体系中，依次加入甲酸钠208mg(2M)，2-氧代-4-苯基丁酸乙酯0.1～1.5M，0.1M(pH＝6.0)磷酸钾缓冲液，NAD⁺20μl(0.5mM)，甲酸脱氢酶40μl(4U/ml)，双羰基还原酶上清100μl(5U/ml)，最后加入乙醇200μl，在常温、振荡速度为200rpm条件下反应18小时，停止反应后，分离提纯，样品利用高效液相色谱分析底物转化率和产物光学纯度。

在底物浓度为20mM时转化率为99.0％，50mM时转化率仅为47.7％，产物S-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的ee值为99.5％。

实施例三

一种制备S-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的方法，包括如下步骤：在1ml的反应体系中，依次加入甲酸钠208mg(2M)，2-氧代-4-苯基丁酸乙酯0.1-1.5M，0.1M(pH＝6.0)磷酸钾缓冲液，NAD⁺20μl(0.5mM)，甲酸脱氢酶40μl(4U/ml)，双羰基还原酶上清100μl(5U/ml)，最后加入二甲基亚砜400μl；在常温，振荡速度为200rpm条件下反应18小时，停止反应后，分离提纯，样品进行高效液相色谱分析底物转化率和产物光学纯度。

在底物浓度小于等于1.2M时转化率为98.1％，1.5M时转化率降为74.2％。产物ee值为99.5％。

实施例四

一种制备S-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的方法，包括如下步骤：在1ml的反应体系中，依次加入甲酸钠208mg(2M)，2-氧代-4-苯基丁酸乙酯164.8mg(0.8M)，0.1M(pH＝6.0)磷酸钾缓冲液，NAD⁺20μl(0.5mM)，甲酸脱氢酶40μl(4U/ml)，双羰基还原酶上清100μl(5U/ml)，最后加入甲苯200μl；在常温，200rpm条件下反应，每隔1小时取样，乙醇停止反应后，用高效液相色谱分析底物转化率和产物光学纯度；参见附图1所示，底物转化率在反应9小时后达到恒定，为95.2％，产物的ee为99.5％。

实施例五

一种制备S-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的方法，包括如下步骤：在50ml的放大反应体系中，依次加入甲酸钠10.4g(2M)，2-氧代-4-苯基丁酸乙酯8.24g(0.8M)，0.1M(pH＝6.0)磷酸钾缓冲液，NAD⁺20μl(0.5mM)，甲酸脱氢酶2ml(4U/ml)，双羰基还原酶上清5ml(5U/ml)，最后加入甲苯10ml；在常温，200rpm条件下反应9小时，待反应体系分层后取甲苯层，再将水相用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，旋转蒸发有机溶剂，减压浓缩得到油状产物混合物，产物混合物用95/5乙酸乙酯/石油醚(v/v)的硅胶层析柱纯化，旋转蒸发洗脱剂得到无色油状S-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯，其纯度为99％，ee值为99.5％，产物收率为88.7％。

Claims

1.一种制备S-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的方法，其特征在于，包括如下步骤：

在1ml的反应体系中，依次加入甲酸钠208mg，2-氧代-4-苯基丁酸乙酯0.1～1.5M，pH为6.0的0.1M磷酸钾缓冲液，NAD⁺20μl至终浓度0.5mM，甲酸脱氢酶40μl至终浓度4U/ml，双羰基还原酶上清100μl至终浓度5U/ml，最后加入甲苯200μl或乙醇200μl或二甲基亚砜400μl；在常温、振荡速度为200rpm条件下反应18小时，停止反应后，分离提纯，即得到所述S-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯。