CN102888431A

CN102888431A - 一种制备l-叔亮氨酸的方法

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Publication number: CN102888431A
Application number: CN2011102023254A
Authority: CN
Inventors: 陈依军; 江金鹏; 吴旭日
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2011-07-19
Filing date: 2011-07-19
Publication date: 2013-01-23

Abstract

本发明公开了一种以亮氨酸脱氢酶为生物催化剂制备单一光学纯L-叔亮氨酸的工艺方法，具体包括以下步骤：在反应液中加入底物三甲基丙酮酸、甲酸铵、亮氨酸脱氢酶和由甲酸脱氢酶介导的辅酶循环再生体系，振荡或搅动，反应后加热反应体系，过滤或离心除去变性蛋白，除去溶剂，过滤后，得到L-叔亮氨酸产物和含有少量L-叔亮氨酸的滤液，滤液循环用于下一轮反应，反应温度为15~50℃。本发明利用亮氨酸脱氢酶，配合辅酶循环再生体系，采用循环工艺制备L-叔亮氨酸，底物浓度高达2.0M，所需的辅酶NAD⁺或NADH浓度较低，并且可循环多次使用而达到忽略辅酶成本的水平，具有重要应用价值。

Description

一种制备L-叔亮氨酸的方法

技术领域

本发明属于手性医药中间体制备领域，涉及一种生物催化法不对称制备手性医药中间体的方法，具体涉及一种以三甲基丙酮酸为底物，以亮氨酸脱氢酶为生物催化剂，实现单一光学纯度的L-叔亮氨酸高效制备的工艺方法。

背景技术

L-叔亮氨酸，即L-2-氨基-3,3-二甲基丁酸，分子式为C₆H₁₃NO₂，分子量为131.17，CAS号为20859-02-3。L-叔亮氨酸是一种非蛋白源的手性氨基酸，由于疏水性叔丁基侧链具有较大空间位阻，在化合物的合成中它能够很好地控制分子构象，因此，该氨基酸作为一种重要的医药中间体，被广泛用于合成生物抑制剂、生物活性肽、抗癌和抗病毒等药物，例如百时美-施贵宝公司2009年销售额就达到14亿美金的抗HIV药物阿扎他韦；以L-叔亮氨酸作为医药中间体合成的抗丙型肝炎病毒药物博赛普韦、特拉普韦，已经完成了临床研究并于2011年上市；另一些从L-叔亮氨酸合成的抗丙型肝炎病毒药物BI201335，narlaprevir，vaniprevir以及BMS791325，也都进入了二期临床研究。因此，预计今后医药行业对L-叔亮氨酸的需求量将呈现逐年上升的趋势。

传统的合成医药中间体L-叔亮氨酸的方法为化学方法，包括化学拆分法和化学不对称合成法。前者利用手性拆分试剂对外消旋体进行拆分，例如专利号为200710044378的中国发明专利采用光学纯酸性拆分剂拆分消旋叔亮酰胺获得光学纯度的叔亮氨酸，但最大收率不超过50%（参见：Chem. Pharm. Bull. 1989, 37, 280-283）；不对称合成法则可以直接合成L-叔亮氨酸，如Corey等利用叔丁基三氯甲基酮合成L-叔亮氨酸，得率近80%。但是，不对称合成存在诸多不足：反应过程复杂、反应条件苛刻（-78℃）、生产成本高，并且在生产过程中需要用到多种有毒试剂，环境污染严重（参见： J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 1906-1908）。

由于生物催化技术具有很强的底物专一性、较高的催化效率、温和的反应条件以及对环境污染较小等优点，已被广泛用于制备L-叔亮氨酸。通过生物催化合成L-叔亮氨酸主要包括两大类方法，即利用酶拆分光学活性叔亮氨酸以制备L-叔亮氨酸的方法和生物催化直接合成L-叔亮氨酸的方法。例如：专利号为200610020854的中国发明专利利用米曲霉氨基酰化酶以及中国专利201010138158利用一种双酶体系（酰化氨基酸消旋酶和水解酶）都能拆分叔亮氨酸消旋体，制备高光学纯度的L-叔亮氨酸（光学纯度达99%ee值以上）。虽然这两种方法的生产成本适中，便于工业化生产，整个生产过程也较简单，但是，L-叔亮氨酸的理论得率低于50%。利用生物催化手段直接合成L-叔亮氨酸的方法，能提高L-叔亮氨酸的得率，如欧洲专利EP0726891B1用合适的酶（酯酶，脂肪酶或蛋白酶）催化底物azlactones合成目标产物L-叔亮氨酸以及美国专利US6197558B1利用转氨酶催化合成L-叔亮氨酸的方法。但是，这些方法操作步骤较多，工序繁琐，过程中需要用到较多有机溶剂，生产成本较高，并造成环境污染。Bommarius等报道了甲酸脱氢酶与亮氨酸脱氢酶的偶联系统，利用甲酸脱氢酶为亮氨酸脱氢酶提供必要的还原型辅酶NADH，合成L-叔亮氨酸（参见： Tetrahedron Asymmetry 1995, 6, 2851-2888； Org. Process Res. Dev. 2000, 4, 286?290）。然而，该方法受到底物浓度低，辅酶投入量大以及生产过程复杂导致成本过高等因素的制约。Esaki等用含有亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的全细胞催化剂对α酮羧酸进行还原转氨合成L-叔亮氨酸（参见：Appli. Environm. Microbiology 1997, 63, 4651-4656）。该方法虽然能够避免外加辅酶，但是用此种全细胞催化剂进行反应时，终产物的最大浓度约为0.3M，难以进行工业化应用。中国专利CN1934264也采用类似的全细胞催化剂转化酮羧酸为L-叔亮氨酸，其优选的最大稳定底物浓度小于0.4M，由于其产物浓度仍然较低，不利于工业化生产。Kula等用经分离后的亮氨酸脱氢酶与甲酸脱氢酶偶联催化底物三甲基丙酮酸合成L-叔亮氨酸（参见：J. Biotechnol. 1997,53,29-39）。虽然该方法能将底物的浓度提高到0.5~1M，但L-叔亮氨酸的产率只有85%，并且该反应需要投入大量外加辅酶（2mM NAD⁺），导致生产成本过高，同样限制了它在工业上的应用。

因此，建立一种高效制备L-叔亮氨酸的生物催化工艺以提高底物浓度、减少辅酶投入和简化生产流程，对降低生产成本具有广泛的实用价值和重要意义。

发明内容

本发明的发明目的是提供一种制备L-叔亮氨酸的方法，在保证高立体选择性、高转化率和高得率的基础上，有效提高底物浓度，减少辅酶投入，简化生产工艺和降低生产成本。

为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：一种制备L-叔亮氨酸的方法，包括以下步骤：

(1) 向反应液中加入底物三甲基丙酮酸、共底物甲酸铵、亮氨酸脱氢酶以及由甲酸脱氢酶介导的辅酶循环再生体系，配制得到反应体系；

所述反应液为水或pH7.0~10.0的缓冲液；底物浓度为1.0M~2.0M；所述共底物甲酸铵和底物三甲基丙酮酸的摩尔比为1∶1~10∶1；所述亮氨酸脱氢酶的浓度大于或等于2U/mL，亮氨酸脱氢酶与甲酸脱氢酶摩尔比为1∶1~1∶5；所述由甲酸脱氢酶介导的辅酶循环再生体系中NAD⁺或NADH的浓度大于或等于0.01mM（0.007g/L）；

(2)步骤(1)所得反应体系在振荡或搅拌条件下，调节反应体系pH至7.0~10.0，于15~50 ℃下，反应制备L-叔亮氨酸。

上述技术方案中，步骤(1)中，所述底物三甲基丙酮酸的结构式为：，优选底物浓度为1.0M~1.5M。

上述技术方案中，步骤(1)中，所述由甲酸脱氢酶介导的辅酶循环体系属于本领域技术人员公知的常规现有技术，通常包括甲酸盐、辅酶NAD⁺或NADH和甲酸脱氢酶。

上述技术方案中，步骤(1)中，各试剂的添加顺序为任意随机的次序，无严格要求。

上述技术方案中，步骤(2)中调节反应体系的试剂选自：甲酸、乙酸、盐酸、硫酸、氨水、氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液。

优选的技术方案中，步骤(2)中，在保持反应进行的同时，补加底物三甲基丙酮酸；补加底物的方式选自：一次性加入底物或分批加入底物或连续加入底物中的一种；并且保持反应体系中的底物浓度小于或等于2.0M。

进一步技术方案中，所述制备L-叔亮氨酸的方法还包括：步骤(2)反应完成后将反应液于50~100 ℃下加热，使蛋白变性，离心或过滤除去变性蛋白，除溶剂后，经过滤，得到L-叔亮氨酸产物和含有少量L-叔亮氨酸的滤液。

更进一步的技术方案中，所述制备L-叔亮氨酸的方法还包括步骤(3)：循环利用滤液，向滤液中补加三甲基丙酮酸、甲酸铵、亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶，构成与步骤(1)相同的反应体系；调节反应体系溶液pH至7.0~10.0，振荡或搅拌，于15~50 ℃下，反应3~24小时，制备L-叔亮氨酸，重复该步骤直至转化率低于95%。

优选地，上述技术方案中，补加的亮氨酸脱氢酶与甲酸脱氢酶的摩尔比为1∶1~1∶5；补加后，底物浓度为1.0M~2.0M；所述三甲基丙酮酸和甲酸铵摩尔比为1∶1~1∶10。

其中，步骤(3)中，向滤液中补加底物时，补加的方式选自：一次性加入底物、分批加入底物或连续加入底物中的一种。

上述技术方案中，所述亮氨酸脱氢酶的制备见文献Enzyme Microb. Technol. 2000, 26: 348-358，反应形式为粗酶液。所述由甲酸脱氢酶介导的辅酶循环再生体系是常规技术，通常包括甲酸盐、辅酶NAD⁺或NADH和甲酸脱氢酶，本领域的技术人员可以根据实际情况选择合适的组分和用量。

上述技术方案中，所述步骤(2)中所述过滤分离的步骤可以采用自然过滤、加压过滤、抽滤或离心过滤等方式去除所制得的L-叔亮氨酸，过滤分离后向滤液中补加底物、甲酸铵、甲酸脱氢酶和亮氨酸脱氢酶，无需重新补加辅酶，然后进行新一轮反应。

上述技术方案中，所述pH值为7.0~10.0的缓冲液的制备方法为现有技术，优选缓冲液为甲酸铵-氨水缓冲液、氯化铵-氨水缓冲液、Tris-HCl缓冲液或硼酸缓冲液。

上述技术方案中，优选的反应温度为20~40℃；优选的pH值为8.0~9.0。

优选的技术方案中，步骤(1)中向反应液中加入二硫苏糖醇（DTT），稳定酶的活性。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

1、由于本发明采用甲酸脱氢酶介导的辅酶循环再生体系，有效地与亮氨酸脱氢酶配合，实现辅酶再生；同时，采用循环反应的方式实现了辅酶的反复利用，使辅酶成本降低至可以忽略的水平。

2、由于本发明采用高底物浓度（260g/L，2.0M三甲基丙酮酸，该底物浓度为已报道最高底物浓度的2倍以上）的反应体系以及能耐受高浓度底物的酶（亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶）进行催化反应，并使底物在高浓度下能完全转化为产物；同时采用底物补加方式，更有利于提高底物浓度和产物的产率。

3、由于本发明采用粗酶液（亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的粗酶液）对底物直接进行催化反应，不需纯化亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶，简化了生产工艺，降低了成本；同时，与全细胞催化剂相比，该粗酶液反应体系能在高底物浓度下使底物完全转化为底物，提高了反应的效率，具有较高的经济价值。

4、本发明采用的氨基供体为铵盐，价格低廉。

5、本发明工艺简单，成本低廉，经加热、过滤，除去溶剂即可得到纯度较高的L-叔亮氨酸产物，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为实施例中所述由甲酸脱氢酶介导的辅酶循环体系偶联亮氨酸脱氢酶催化合成L-叔亮氨酸的反应过程示意图；

图2为实施例一中反应前对底物三甲基丙酮酸的HPLC-UV分析图谱；

图3为实施例一中反应后对底物三甲基丙酮酸的HPLC-UV分析图谱；

图4为实施例一中反应后对产物L-叔亮氨酸的HPLC-ELSD分析图谱。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

实施例一

在10 mL的反应体系中，依次加入底物三甲基丙酮酸，甲酸铵，甲酸铵-氨水缓冲液，NAD⁺，亮氨酸脱氢酶，甲酸脱氢酶，所述反应体系含有：底物三甲基丙酮酸1.0M(130g/L)，甲酸铵1.0M(63g/L)，0.1 M（pH 8.0）甲酸铵-氨水缓冲液，NAD⁺ 0.01mM（0.007 g/L），亮氨酸脱氢酶2.0 U/mL，甲酸脱氢酶2.0 U/mL，用氨水和盐酸维持pH，室温（25℃）搅动反应3小时，反应结束后，加热至80℃，维持30分钟，使反应液中的蛋白质充分变性，离心15 min除去变性蛋白，除溶剂后，过滤，得到L-叔亮氨酸产物。

利用高效液相色谱分析底物转化率。结果表明，底物完全转化为产物L-叔亮氨酸。

三甲基丙酮酸的转化率和产物纯度用反相C18柱(5 μm, 4.6×250 mm, Shimadzu, Japan)进行高效液相(Shimadzu 2010A HT, Japan)色谱分析，流动相为：A为水(含0.1%三氟乙酸)，B为乙腈(含0.1%三氟乙酸)，10~90%的梯度洗脱时间为12 min，流速为1 mL/min，柱温为40℃，用蒸发光散射检测器（Alltech 3300, Germany），载气为氮气，流速为2L/min，检测器温度为40℃，检测产物L-叔亮氨酸的生成量，同时在系统中串联紫外检测器（220nm），检测底物三甲基丙酮酸的剩余量；出峰顺序依次为：L-叔亮氨酸(6.1 min)（见图4），三甲基丙酮酸（8.6 min）（见图2，图3）。经HPLC分析，结果表明底物三甲基丙酮酸完全转化成产物L-叔亮氨酸。

实施例二

配制10 mL的反应体系，所述反应体系包括：底物三甲基丙酮酸2.0M(260 g/L)，甲酸铵3.0M(189g/L)，0.1 M（pH 8.5）氯化铵-氨水缓冲液，NAD⁺0.04mM（0.03 g/L），亮氨酸脱氢酶3.0 U/mL，甲酸脱氢酶4.6 U/mL，室温摇动反应24小时。其它操作如同实施例1纯化处理得到白色产物L-叔亮氨酸，底物转化完全。

实施例三

配制100 mL的反应体系，所述反应体系包括：底物三甲基丙酮酸1.5M (195 g/L)，甲酸铵3.0M (189g/L)，0.1 M（pH 8.5）Tris-HCl缓冲液，NAD⁺0.1mM（0.07 g/L），亮氨酸脱氢酶3.0 U/mL，甲酸脱氢酶4.6 U/mL，室温摇动反应24小时。其它操作如同实施例1纯化处理得到白色产物L-叔亮氨酸，底物转化完全。

实施例四

配制1L的反应体系，所述反应体系包括：底物三甲基丙酮酸1.0M(130 g/L)，甲酸铵10.0M(630g/L)，0.1 M（pH 8.5）甲酸铵-氨水缓冲液，NAD⁺0.15mM（0.1 g/L），亮氨酸脱氢酶3.0 U/mL，甲酸脱氢酶4.6 U/mL，室温摇动反应24小时。其它操作如同实施例1纯化处理得到白色产物L-叔亮氨酸，底物转化完全。

实施例五

配制10 mL的反应体系，所述反应体系包括：底物三甲基丙酮酸1.0M(130 g/L)，甲酸铵3.0M(189g/L)，0.1 M（pH 7.0）甲酸铵-氨水缓冲液，NAD⁺0.45mM（0.3 g/L），亮氨酸脱氢酶3.0 U/mL，甲酸脱氢酶4.6 U/mL，用乙酸和氢氧化钠溶液维持pH，室温摇动反应24小时。其它操作如同实施例1纯化处理得到白色产物L-叔亮氨酸，底物转化完全。

实施例六

配制10 mL的反应体系，所述反应体系包括：底物三甲基丙酮酸1.0M(130 g/L)，甲酸铵3.0M(189g/L)，0.1 M（pH 10.0）氯化铵-氨水缓冲液，NAD⁺0.04mM（0.03g/L），亮氨酸脱氢酶3.0 U/mL，甲酸脱氢酶4.6 U/mL，用甲酸和氨水维持pH，室温摇动反应24小时。其它操作如同实施例1纯化处理得到白色产物L-叔亮氨酸，底物转化完全。

实施例七

配制10 mL的反应体系，所述反应体系包括：底物三甲基丙酮酸1.0M(130 g/L)，甲酸铵3.0M(189g/L)，0.1 M（pH 8.0）硼酸缓冲液，NAD⁺0.45mM（0.3 g/L），亮氨酸脱氢酶3.0 U/mL，甲酸脱氢酶4.6 U/mL，室温摇动反应24小时。其它操作如同实施例1纯化处理得到白色产物L-叔亮氨酸，底物转化完全。

实施例八

配制10 mL的反应体系，所述反应体系包括：底物三甲基丙酮酸1.0M(130 g/L)，甲酸铵3.0M(189g/L)， 0.1 M（pH 8.0）磷酸盐缓冲液，NAD⁺ 0.04mM（0.03 g/L），亮氨酸脱氢酶3.0 U/mL，甲酸脱氢酶4.6 U/mL，用硫酸和氢氧化钾维持pH，室温摇动反应10小时。其它操作如同实施例1纯化处理得到白色产物L-叔亮氨酸，底物转化完全。

实施例九

配制10 mL的反应体系，所述反应体系包括：底物三甲基丙酮酸1.0M(130 g/L)，甲酸铵3.0M(189g/L)， 0.1 M（pH 9.0）甲酸铵-氨水缓冲液，NAD⁺ 0.01mM（0.007 g/L），亮氨酸脱氢酶3.0 U/mL，甲酸脱氢酶4.6 U/mL，用盐酸和氢氧化钠溶液维持pH，室温摇动反应10小时。其它操作如同实施例1纯化处理得到白色产物L-叔亮氨酸，底物转化完全。

实施例十

配制10 mL的反应体系，所述反应体系包括：底物三甲基丙酮酸2.0M(260 g/L)，甲酸铵10.0M(630g/L)，适量水，NAD⁺ 0.15mM（0.1 g/L），亮氨酸脱氢酶3.0 U/mL，甲酸脱氢酶15.6 U/mL，用盐酸和氢氧化钠溶液维持pH，室温摇动反应12小时。其它操作如同实施例1纯化处理得到白色产物L-叔亮氨酸，底物转化完全。

实施例十一

配制10 mL的反应体系，所述反应体系包括：底物三甲基丙酮酸1.0M(130 g/L)，甲酸铵3.0M(189g/L)， 0.1 M（pH 9.0）甲酸铵-氨水缓冲液，NAD⁺ 0.6mM（0.4 g/L），亮氨酸脱氢酶3.0 U/mL，甲酸脱氢酶15.6 U/mL，用盐酸和氢氧化钠溶液维持pH，15℃摇动反应12小时。其它操作如同实施例1纯化处理得到白色产物L-叔亮氨酸，底物转化完全。

实施例十二

配制10 mL的反应体系，所述反应体系包括：底物三甲基丙酮酸1.0M(130 g/L)，甲酸铵3.0M(189g/L)， 0.1 M（pH 9.0）甲酸铵-氨水缓冲液，NAD⁺ 0.9mM（0.6 g/L），亮氨酸脱氢酶3.0 U/mL，甲酸脱氢酶5.4 U/mL，用盐酸和氢氧化钠溶液维持pH，50℃摇动反应3小时。其它操作如同实施例1纯化处理得到白色产物L-叔亮氨酸，底物转化完全。

实施例十三

在10 mL的反应体系中，依次加入底物三甲基丙酮酸，甲酸铵，甲酸铵-氨水缓冲液，NAD⁺，亮氨酸脱氢酶，甲酸脱氢酶，所述反应体系含有：底物三甲基丙酮酸1.0M(130 g/L)，甲酸铵6.0M(378g/L)，0.1 M（pH 9.0）甲酸铵-氨水缓冲液，NAD⁺ 0.15mM（0.1 g/L），亮氨酸脱氢酶2 U/mL，甲酸脱氢酶9.8 U/mL，用氨水和盐酸维持pH，37℃搅动反应3小时，反应结束后，加热至100℃，维持30分钟，采用自然过滤除去变性蛋白，其它操作如同实施例1纯化处理得到白色产物L-叔亮氨酸，底物转化完全。

实施例十四

在10 mL的反应体系中，依次加入底物三甲基丙酮酸，甲酸铵，甲酸铵-氨水缓冲液，NAD⁺，亮氨酸脱氢酶，甲酸脱氢酶，所述反应体系含有：底物三甲基丙酮酸1.0M(130 g/L)，甲酸铵3.0M(189g/L)，0.1 M（pH 9.0）甲酸铵-氨水缓冲液，NADH 0.04mM（0.03 g/L），亮氨酸脱氢酶2 U/mL，甲酸脱氢酶5.4 U/mL，用氨水和盐酸维持pH，37℃搅动反应3小时，反应结束后，加热至50℃，维持40分钟，采用抽滤除去变性蛋白，其它操作如同实施例1纯化处理得到白色产物L-叔亮氨酸，底物转化完全。

实施例十五

配制100 mL的反应体系，所述反应体系包括：底物三甲基丙酮酸1.5M（195 g/L），甲酸铵3.0M(189g/L)，0.1 M（pH 8.0）甲酸铵-氨水缓冲液，NAD⁺ 0.4mM(0.3 g/L)，DTT 0.5 mM，亮氨酸脱氢酶7 U/mL，甲酸脱氢酶15.8 U/mL，室温下振荡反应，起始后补加底物6g，并用0.5 N 氢氧化钠溶液和0.5 N盐酸维持反应pH。反应3小时后，浓缩反应液并自然过滤，滤液作为下一轮循环的母液，补加起始量的一半的亮氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶、底物和共底物，共循环四次，共投入底物54.75g，用酸碱溶液控制反应pH在7.5~8.5之间，底物转化完全。

实施例十六

配制100 mL的反应体系，所述反应体系包括：底物三甲基丙酮酸1.5M （200 g/L），甲酸铵6.0M(378g/L)，0.1 M（pH 9.0）甲酸铵-氨水缓冲液，NAD⁺ 0.2mM(0.14 g/L)，DTT 0.5 mM，亮氨酸脱氢酶7 U/mL，甲酸脱氢酶15.8 U/mL，室温下振荡反应，起始后以0.05ml/min的流速连续补加液态底物9g，并用0.5 N 氢氧化钠溶液和0.5 N盐酸维持反应pH。反应3小时后，浓缩反应液并经抽滤，滤液作为下一轮循环的母液，补加起始量的一半的亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶，同时以0.05ml/min的流速连续补加液态底物，共循环四次，共投入底物56g，用酸碱溶液控制反应pH在8.5~9.5之间，底物转化完全。

实施例十七

配制100 mL的反应体系，所述反应体系包括：底物三甲基丙酮酸1.6M（208 g/L），甲酸铵2.0M(126g/L)，0.1 M（pH 9.0）甲酸铵-氨水缓冲液，NAD⁺ 0.15mM(0.1 g/L)，亮氨酸脱氢酶2 U/mL，甲酸脱氢酶2.8 U/mL，室温下振荡反应，并用0.5 N 氢氧化钠溶液和0.5 N盐酸维持反应pH。反应3小时后，浓缩反应液并离心过滤，滤液作为下一轮循环的母液，补加起始量的一半的亮氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶、三甲基丙酮酸（10.4 g）和甲酸铵（6.3g），共循环四次，共投入底物52g，用酸碱溶液控制反应pH在8.5~9.5之间，底物转化完全。

实施例十八

配制10 mL的反应体系，所述反应体系包括：底物三甲基丙酮酸2.5M(325 g/L)，甲酸铵6.0M(378g/L)， 0.1 M（pH 9.0）甲酸铵-氨水缓冲液，NAD⁺ 0.6mM（0.4 g/L），亮氨酸脱氢酶5.0 U/mL，甲酸脱氢酶10.6 U/mL，用盐酸和氨水维持pH，室温摇动反应24小时。其它操作如同实施例1纯化处理得到白色产物L-叔亮氨酸。高效液相色谱分析底物转化率，结果表明，底物转化率为63.0%。

Claims

1.一种制备L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

所述反应液为水或pH7.0~10.0的缓冲液；底物浓度为1.0M~2.0M；所述共底物甲酸铵和底物三甲基丙酮酸的摩尔比为1∶1~10∶1；所述亮氨酸脱氢酶的浓度大于或等于2U/mL，亮氨酸脱氢酶与甲酸脱氢酶摩尔比为1∶1~1∶5；所述由甲酸脱氢酶介导的辅酶循环再生体系中NAD⁺或NADH的浓度大于或等于0.01mM；

2.根据权利要求1所述制备L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，步骤(2)中，在保持反应进行的同时，补加底物三甲基丙酮酸；补加底物的方式选自：一次性加入底物或分批加入底物或连续加入底物中的一种；并且保持反应体系中的底物浓度小于或等于2.0M。

3.根据权利要求1所述制备L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，所述制备L-叔亮氨酸的方法还包括：步骤(2)反应完成后将反应液于50~100 ℃下加热，使蛋白变性，离心或过滤除去变性蛋白，除溶剂后，经过滤，得到L-叔亮氨酸产物和含有少量L-叔亮氨酸的滤液。

4.根据权利要求3所述制备L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，所述制备L-叔亮氨酸的方法还包括：循环利用滤液，向滤液中补加三甲基丙酮酸、甲酸铵、亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶，构成与步骤(1)相同的反应体系；调节反应体系溶液pH至7.0~10.0，振荡或搅拌，于15~50 ℃下，反应3~24小时，制备L-叔亮氨酸，重复该步骤直至转化率低于95%。

5.根据权利要求1所述制备L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，所述pH 7.0~10.0的缓冲液为甲酸铵-氨水缓冲液、氯化铵-氨水缓冲液、Tris-HCl缓冲液或硼酸缓冲液。