CN101003822A - 一种用固定化青霉素酰化酶生产d－氨基酸的方法 - Google Patents
一种用固定化青霉素酰化酶生产d－氨基酸的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101003822A CN101003822A CN 200610021327 CN200610021327A CN101003822A CN 101003822 A CN101003822 A CN 101003822A CN 200610021327 CN200610021327 CN 200610021327 CN 200610021327 A CN200610021327 A CN 200610021327A CN 101003822 A CN101003822 A CN 101003822A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- amino acid
- enzyme
- phenylacetyl
- milliliters
- reaction
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
D－氨基酸的制备方法，以DL－氨基酸为原料，衍生得到N－苯乙酰－DL－氨基酸，在水溶液中用酶催化不对称水解，分离得到的N－苯乙酰－D－氨基酸通过化学水解，结晶，得到D－氨基酸。本发明涉及的酶为固定化青霉素酰化酶，其重复使用批次达100次以上。使用该方法拆分DL－氨基酸所得产品收率高，光学纯度高，适合于绝大多数DL－氨基酸对映体的拆分。
Description
技术领域
本发明涉及一种D-氨基酸的生产工艺。具体的说，本发明涉及利用固定化青霉素酰化酶酶解反应，生成D-氨基酸的生产工艺。
背景技术
氨基酸是含有氨基的有机酸，是构成蛋白质的基本单位。组成人体内生命物质的20种基本氨基酸除甘氨酸外，都有两种互成镜像的对映体D-氨基酸和L-氨基酸。历来认为生命物质中只存在L-氨基酸，随着分析方法的发展，人们相继在海洋动物、陆生动物、脊椎和无脊椎动物、种子植物和人体中发现了各种D-氨基酸，D-氨基酸才引起了人们的重视，并认识到D-氨基酸在生命活动和药物制备中具有L-氨基酸不能替代的地位，特别是作为β-内酰酰类抗生素和生理活性肽的中间体。
D-氨基酸的功能和生理作用正被逐渐阐明，人类的某些疾病如白内障、早年痴呆、肾脏病等与体内D-氨基酸的含量密切相关，因此D-氨基酸对研究疾病和衰老机制的研究十分重要。动物实验证明，超量的D-氨基酸会阻断一些重要生物物质的合成，从而抑制细胞、生物体的生长。D-氨基酸构成的多肽通常不能或只能缓慢地被肽酶水解，所以D-氨基酸已经越来越多地被用于合成β-内酰酰类抗生素和生理活性肽。
D-氨基酸是非蛋白源氨基酸，不能象L-氨基酸一样采用发酵法生产。关于D-氨基酸的制备，文献报道的方法主要有诱导结晶法、化学拆分法、不对称转换法、生物法等。
据Susenm Tatsumi等报道，在饱和或超饱和的外消旋缬氨酸(DL-Val)盐酸盐溶液中加入晶种，可以优先结晶出D-缬氨酸盐酸盐，中和D-缬氨酸盐酸盐得到D-缬氨酸，光学纯度为93％，收率低于10％。诱导结晶法制取D-氨基酸周期长、收率低、光学纯度也不高，不适合工业生产。
化学拆分法主要是利用手性的拆分试剂与DL-氨基酸形成非对映体盐，通过分级结晶将其分开，非对映体盐通过用酸或碱中和反应脱掉拆分试剂，得到光学活性的D-氨基酸。化学拆分法得到的产物收率和光学纯度不够高，并且手性拆分试剂价格昂贵，限制了大规模工业化生产。
不对称转化法作为光学活性化合物的一种新的拆分方法，通过不对称转换由外消旋体或L-氨基酸直接制备D-氨基酸。但化学不对称合成采用价格昂贵的手性源、手性助剂或手性催化剂，拆分工艺路线复杂、生产成本高，只有少数的D-氨基酸用此方法生产。
生物法生产D-氨基酸涉及的方法有酶催化拆分法和酶催化转化法。酶催化拆分法主要包括酰化酶法和羧肽酶法。日本1969年利用固定化L-氨基酰化酶，由N-乙酰-DL-氨基酸连续生产L-氨基酸获得成功。该工艺也已用于D-氨基酸的商业规模生产，基本工艺为以固定化的L-氨基酰化酶拆分N-乙酰-DL-氨基酸，L-氨基酸通过沉淀析出，然后乙酰化，消旋成N-乙酰-DL-氨基酸，再循环拆分，生成的N-乙酰-D-氨基酸经水解制备D-氨基酸。存在的主要缺点是终产物产率低、过程复杂、生产成本高。国内一些生产商采用猪或牛肾L-氨基酰化酶制备D-氨基酸，但酶源有限，生产成本高。荷兰DSM公司开发的L-羧肽酶法制备D-氨基酸技术已成功用于半合成抗生素侧链D-苯甘氨酸和D-对羟苯甘氨酸的规模化生产，该工艺普适性差，不适合其他D-氨基酸的生产。酶催化转化法主要包括微生物降解法、D-氨基酸转氨酶法和海因酶法等。微生物降解法采用微生物酶或整细胞为生物催化剂降解DL-氨基酸中的L-对映体，D-氨基酸保留。该法的缺点是D-氨基酸的理论产率仅为50％，光学纯度很难达到要求。D-氨基酸转氨酶法以难于制备的酮酸为原料，价格昂贵的D-氨基酸为氨供体，制备成本非常高。日本率先开发的海因酶法以化学合成的海因为原料，通过一菌双酶法、双菌双酶法或一酶一酸法制备D-氨基酸，该法已成功用于D-苯甘氨酸和D-对羟苯甘氨酸的千吨级规模化生产。国内国家生化工程技术研究中心采用该法制备D-苯丙氨酸、D-酪氨酸、D-丙氨酸、D-缬氨酸等，但海因的制备成本高，限制了该法在D-氨基酸生产中的大规模应用。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术上的不足，提出了一种利用固定化酶生产D-氨基酸的技术，使用该方法拆分DL-氨基酸所得产品收率高，光学纯度高，适合于绝大多数DL-氨基酸对映体的拆分。
本发明是通过下述方案得以实现的：一种DL-氨基酸的拆分方法，包括下述步骤：
(一)N-苯乙酰-DL-氨基酸的制备：在搅拌下DL-氨基酸与苯乙酰氯反应合成N-苯乙酰-DL-氨基酸，
DL-氨基酸和苯乙酰氯的反应摩尔比为1∶(1-1.5)，反应温度为0-40℃，反应介质为NaOH溶液，反应时间为1-12小时，加入浓盐酸调pH值0-3，抽滤，得白色固体I，滤液浓缩，冷却，过滤，得到白色固体II。
(二)酶解N-苯乙酰-DL-氨基酸：在搅拌下将白色固体I和II投入到0.05mol/L的硼酸缓冲液中，
底物浓度0.1-1mol/L，加入100克的固定化青霉素酰化酶，搅拌反应2-12小时，反应温度20-40℃，反应pH＝6-10，搅拌速率为100-300转/分。离心分离出固定化酶，用浓盐酸调pH＝0-4，过滤，得白色固体III，滤液浓缩，冷却，过滤，得白色固体IV，水洗固体III和IV至不含L-氨基酸，得白色固体V，合并滤液和洗液，得溶液IV。固定化青霉素酰化酶用于下次重复拆分。
(三)水解N-苯乙酰-D-氨基酸：将白色固体V加入到6mol/L HCl溶液中，在加热条件下搅拌反应，
反应温度为100-140℃，反应时间为1-6小时，浓缩，冷却到4℃，抽滤，得白色晶体VII和滤液VII。
(四)将滤液VII用NH3水调pH＝3-10，在4℃冷藏过夜，结晶，过滤，水洗，得白色晶体IX，滤液
浓缩，4℃下冷藏过夜，结晶，过滤，得白色晶体X和滤液XI，合并晶体IX和晶体X，溶于乙醇和水的混合溶剂，乙醇/水＝10/1-5/1，重结晶，，过滤并洗涤，得到D-氨基酸。滤液XI直接用于下次重结晶。
相对于现有技术而言，本拆分方法具有拆分路线短、工艺稳定、操作简单、分离效果好、产品纯度高，生产成本低。另外本发明方法生产过程中只使用有机溶剂乙醇、整个过程绿色化。
本发明使用的酶为国内生产的固定化青霉素酰化酶，酶源易得，完全可以大规模工业化生产，另外本固定化的酶重复拆分次数可达100次以上，大大降低了生产成本。
本发明涉及的D-氨基酸生产的化学反应方程式如下：
附图说明
图1表示D-氨基酸生产工艺流程图。
具体实施方式
实施例一：D-蛋氨酸的生产工艺
1.合成N-苯乙酰-DL-蛋氨酸：
在10升的反应釜中加入298克DL-蛋氨酸，240克NaOH，4000毫升水，在10℃下充分搅拌，搅拌下滴加387.5克苯乙酰氯，反应过程中控制pH＝8-10，温度10℃以内，滴加完成后保温反应2小时，然后在室温下继续搅拌反应5小时，停止反应，加入浓盐酸将pH调至1-2，析出大量白色固体，真空抽滤，得到白色固体。滤液减压浓缩(真空度0.1p.m，温度60℃)使之为原体积的1/20(240毫升)，冷却，过滤析出的白色固体，合并两次得到的白色固体，投入下步反应。
2.酶解N-苯乙酰-DL-蛋氨酸
将上一步的白色固体加入到10升的反应釜中，加入4000毫升0.05mol/L硼酸缓冲液，用NaOH调pH＝8.0，加入100克的固定化青霉素酰化酶，在30℃下搅拌反应5h，停止反应，离心分离出酶，溶液用浓盐酸调pH＝1-2，真空浓缩(真空度0.1p.m，温度60℃)使之为原体积的1/20(200毫升)，过滤，固体用水洗至不含L-蛋氨酸(茚三酮显色法)，直接投入第3步。将滤液、洗液投入第5.1步。
注：固定化青霉素酰化酶可重复利用多次，当酶活为开始的1/2时停止使用。
3.水解N-苯乙酰-D-蛋氨酸
将第2步得到的白色固体加入到1升的反应釜中，加入400毫升6mol/LHCl溶液，在110℃下搅拌反应5h，真空浓缩(真空度0.1p.m，温度60℃)使之为原体积的1/5(80毫升)，冷却到4℃，真空抽滤，片状晶体苯乙酸直接投入第5.2步。滤液80毫升投入到第4步。
4.结晶与重结晶D-蛋氨酸：
将滤液用NH3水调pH＝5.74，在4℃冷藏过夜，过滤析出的晶体，滤液浓缩(真空度0.1p.m，温度60℃)至20毫升，4℃下冷藏过夜，真空抽滤，合并两次所得晶体，95％的乙醇重结晶，得到D-蛋氨酸120克(产率40％，αD 20＝-22.5(C＝2，1NHCl)。滤液直接用于下次重结晶。
实施例二：D一丙氨酸的生产工艺
1.合成N-苯乙酰-DL-丙氨酸：
在5升的反应釜中加入365克DL-丙氨酸，340克NaOH，2000毫升水，在10℃下充分搅拌，搅拌下
滴加697.5克苯乙酰氯，反应过程中控制pH＝8-10，温度10℃以内，滴加完成后保温反应2小时，然后在室温下继续搅拌反应5小时，停止反应，加入浓盐酸将pH调至1-2，析出大量白色固体，真空抽滤，得到白色固体。滤液减压浓缩(真空度0.1p.m，温度60℃)使之为原体积的1/20(100毫升)，冷却，过滤析出的白色固体，合并两次得到的白色固体，投入下步反应。
2.酶解N-苯乙酰-DL-丙氨酸
将上一步的白色固体加入到10升的反应釜中，加入6800毫升0.05mol/L硼酸缓冲液，用NaOH调pH＝8.0，加入140克的固定化青霉素酰化酶，在30℃下搅拌反应5h，停止反应，离心分离出酶，溶液用浓盐酸调pH＝1-2，真空浓缩(真空度0.1p.m，温度60℃)使之为原体积的1/20(340毫升)，过滤，固体用水洗至不含L-丙氨酸(茚三酮显色法)，直接投入第3步。将滤液、洗液投入第5.1步。
注：固定化青霉素酰化酶可重复利用多次，当酶活为开始的1/2时停止使用。
3.水解N-苯乙酰-D-丙氨酸
将第2步得到的白色固体加入到1升的反应釜中，加入400毫升6mol/L HCl溶液，在110℃下搅拌反应5h，真空浓缩(真空度0.1p.m，温度60℃)使之为原体积的1/5(80毫升)，冷却到4℃，真空抽滤，片状晶体苯乙酸直接投入第5.2步。滤液80毫升投入到第4步。
4.结晶与重结晶D-丙氨酸：
将滤液用NH3水调pH＝6.11，在4℃冷藏过夜，滤析出的晶体，滤液浓缩(真空度0.1p.m，温度60℃)至20毫升，4℃下冷藏过夜，真空抽滤，合并两次所得晶体，95％的乙醇重结晶，得到D-丙氨酸140克(产率40％，αD 20＝-14.6°(C＝2，5N HCl)。滤液直接用于下次重结晶。
实施例三：D-谷氨酸的生产工艺
1.合成N-苯乙酰-DL-谷氨酸：
在5升的反应釜中加入500克DL-谷氨酸，460克NaOH，3000毫升水，在10℃下充分搅拌，搅拌下滴加573.5克苯乙酰氯，反应过程中控制pH＝8-10，温度10℃以内，滴加完成后保温反应2小时，然后在室温下继续搅拌反应5小时，停止反应，加入浓盐酸将pH调至1-2，析出大量白色固体，真空抽滤，得到白色固体。滤液减压浓缩(真空度0.1p.m，温度60℃)使之为原体积的1/20(150毫升)，冷却，过滤析出的白色固体，合并两次得到的白色固体，投入下步反应。
2.酶解N-苯乙酰-DL-谷氨酸
将上一步的白色固体加入到10升的反应釜中，加入4200毫升0.05mol/L硼酸缓冲液，用NaOH调pH＝8.0，加入200克的固定化青霉素酰化酶，在30℃下搅拌反应5h，停止反应，离心分离出酶，溶液用浓盐酸调pH＝1-2，真空浓缩(真空度0.1p.m，温度60℃)使之为原体积的1/20(210毫升)，过滤，固体用水洗至不含L-谷氨酸(茚三酮显色法)，直接投入第3步。将滤液、洗液投入第5.1步。
注：固定化青霉素酰化酶可重复利用多次，当酶活为开始的1/2时停止使用。
3.水解N-苯乙酰-D-谷氨酸
将第2步得到的白色固体加入到1升的反应釜中，加入400毫升6mol/L HCl溶液，在110℃下搅拌反应5h，真空浓缩(真空度0.1p.m，温度60℃)使之为原体积的1/5(80毫升)，冷却到4℃，真空抽滤，片状晶体苯乙酸直接投入第5.2步。滤液80毫升投入到第4步。
4.结晶与重结晶D-谷氨酸：
将滤液用NH3水调pH＝3.15，在4℃冷藏过夜，过滤析出的晶体，滤液浓缩(真空度0.1p.m，温度60℃)至20毫升，4℃下冷藏过夜，真空抽滤，合并两次所得晶体，95％的乙醇重结晶，得到D-谷氨酸140克(产率40％，αD 20＝-31.4°(C＝2，2N HCl)。滤液直接用于下次重结晶。
实施例四：D-天冬氨酸的生产工艺
1.合成N-苯乙酰-DL-天冬氨酸：
在5升的反应釜中加入400克DL-天冬氨酸，600克NaOH，1500毫升水，在10℃下充分搅拌，搅拌下滴加620克苯乙酰氯，反应过程中控制pH＝8-10，温度10℃以内，滴加完成后保温反应2小时，然后在室温下继续搅拌反应5小时，停止反应，加入浓盐酸调pH＝1-2，析出大量白色固体，真空抽滤，得到白色固体。滤液减压浓缩(真空度0.1p.m，，温度60℃)使之为原体积的1/10(150毫升)，冷却，过滤析出的白色固体，合并两次得到的白色固体，投入下步反应。
2.酶解N-苯乙酰-DL-天冬氨酸
将上一步的白色固体加入到10升的反应釜中，加入4200毫升0.05mol/L硼酸缓冲液，用NaOH调pH＝8.0，加入200克的固定化青霉素酰化酶，在30℃下搅拌反应4.5h，停止反应，离心分离出酶，溶液用浓盐酸调pH＝1-2，真空浓缩(真空度0.1p.m，温度60℃)使之为原体积的1/20(210毫升)，过滤，固体用水洗至不含L-天冬氨酸(茚三酮显色法)，直接投入第3步。将滤液、洗液投入第5.1步。
注：固定化青霉素酰化酶可重复利用多次，当酶活为开始的1/2时停止使用。
3.水解N-苯乙酰-D-天冬氨酸
将第2步得到的白色固体加入到1升的反应釜中，加入600毫升6mol/L HCl溶液，在120℃下搅拌反应5h，真空浓缩(真空度0.1p.m，温度60℃)使之为原体积的1/5(120毫升)，冷却到4℃，真空抽滤，片状晶体苯乙酸直接投入第5.2步。滤液120毫升投入到第4步。
4.结晶与重结晶D-天冬氨酸：
将滤液用NH3水调pH＝2.85，在4℃冷藏过夜，过滤析出的晶体，滤液浓缩(真空度0.1p.m，温度60℃)至20毫升，4℃下冷藏过夜，真空抽滤，合并两次所得晶体，95％的乙醇重结晶，得到D-天冬氨酸160克(产率40％，αD 20＝-24.7°(C＝2，6NHCl)。滤液直接用于下次重结晶。
实施例五：D-苯丙氨酸的生产工艺
1.合成N-苯乙酰-DL-苯丙氨酸：
在5升的反应釜中加入330克DL-苯丙氨酸，180克NaOH，2500毫升水，在10℃下充分搅拌，搅拌下滴加287.5克苯乙酰氯，反应过程中控制pH＝8-10，温度10℃以内，滴加完成后保温反应2小时，然后在室温下继续搅拌反应6小时，停止反应，加入浓盐酸将pH调至1-2，析出大量白色固体，真空抽滤，得到白色固体。滤液减压浓缩(真空度0.1p.m，温度60℃)使之为原体积的1/20(125毫升)，冷却，真空抽滤析出的白色固体，合并两次得到的白色固体，投入下步反应。
2.酶解N-苯乙酰-DL-苯丙氨酸
将上一步的白色固体加入到10升的反应釜中，加入7000毫升0.05mol/L硼酸缓冲液，用NaOH调pH＝8.0，加入130克的固定化青霉素酰化酶，在30℃下搅拌反应4h，停止反应，离心分离出酶，溶液用浓盐酸调pH＝1～2，真空浓缩(真空度0.1p.m，温度60℃)使之为原体积的1/20(350毫升)，过滤，固体用水洗至不含L-苯丙氨酸(茚三酮显色法)，直接投入第3步。将滤液、洗液投入第5.1步。
注：固定化青霉素酰化酶可重复利用多次，当酶活为开始的1/2时停止使用。
3.水解N-苯乙酰-D-苯丙氨酸
将第2步得到的白色固体加入到1升的反应釜中，加入400毫升6mol/L HCl溶液，在120℃下搅拌反应5h，真空浓缩(真空度0.1p.m，温度60℃)使之为原体积的1/5(80毫升)，冷却到4℃，真空抽滤，片状晶体苯乙酸直接投入第5.2步。滤液80毫升投入到第4步。
4.结晶与重结晶D-苯丙氨酸：
将滤液用NH3水调pH＝5.49，在4℃冷藏过夜，过滤析出的晶体，滤液浓缩(真空度0.1p.m，温度60℃)至20毫升，4℃下冷藏过夜，真空抽滤，合并两次所得晶体，95％的乙醇重结晶，得到D-苯丙氨酸150克(产率40％，αD 20＝34.5°(C＝2，H2O)。滤液直接用于下次重结晶。
实施例六：D-苯甘氨酸的生产工艺
1.合成N-苯乙酰-DL-苯甘氨酸：
在5升的反应釜中加入302克DL-苯甘氨酸，180克NaOH，2500毫升水，在10℃下充分搅拌，搅拌下滴加287.5克苯乙酰氯，反应过程中控制pH＝8-10，温度10℃以内，滴加完成后保温反应2小时，然后在室温下继续搅拌反应6小时，停止反应，加入浓盐酸将pH调至1-2，析出大量白色固体，真空抽滤，得到白色固体。滤液减压浓缩(真空度0.1p.m，温度60℃)使之为原体积的1/20(125毫升)，冷却，真空抽滤析出的白色固体，合并两次得到的白色固体，投入下步反应。
2.酶解N-苯乙酰-DL-苯甘氨酸
将上-步的白色固体加入到10升的反应釜中，加入7000毫升0.05摩尔硼酸缓冲液，用NaOH调pH＝8.0，加入130克的固定化青霉素酰化酶，在30℃下搅拌反应4h，停止反应，离心分离出酶，溶液用浓盐酸调pH＝1～2，真空浓缩(真空度0.1p.m，温度60℃)使之为原体积的1/20(350毫升)，过滤，固体用水洗至不含L-苯丙氨酸(茚三酮显色法)，直接投入第3步。将滤液、洗液投入第5.1步。
注：固定化青霉素酰化酶可重复利用多次，当酶活为开始的1/2时停止使用。
3.水解N-苯乙酰-D-苯甘氨酸
将第2步得到的白色固体加入到1升的反应釜中，加入400毫升6摩尔HCl溶液，在120℃下搅拌反应4.5h，真空浓缩(真空度0.1p.m，温度60℃)使之为原体积的1/5(80毫升)，冷却到4℃，真空抽滤，片装晶体苯乙酸直接投入第5.2步。滤液80毫升投入到第4步。
4.结晶与重结晶D-苯甘氨酸：
将滤液用NH3水调pH＝5.6，在4℃冷藏过夜，过滤析出的晶体，滤液浓缩(真空度0.1p.m，温度60℃)至20毫升，4℃下冷藏过夜，真空抽滤，合并两次所得晶体，95％的乙醇重结晶，得到D-苯甘氨酸127克(产率42％，αD 20＝-31.5°(C＝，1NHCl)。滤液直接用于下次重结晶。
实施例七：D-亮氨酸的生产工艺
1.合成N-苯乙酰-DL-亮氨酸：
在5升的反应釜中加入392克DL-亮氨酸，320克NaOH，3000毫升水，在10℃下充分搅拌，搅拌下滴加620克苯乙酰氯，反应过程中控制pH＝8-10，温度10℃以内，滴加完成后保温反应2小时，然后在室温下继续搅拌反应6小时，停止反应，加入浓盐酸将pH调至1-2，析出大量白色固体，真空抽滤，得到白色固体。滤液减压浓缩(真空度0.1p.m，温度60℃)使之为原体积的1/20(150毫升)，冷却，真空抽滤析出的白色固体，合并两次得到的白色固体，投入下步反应。
2.酶解N-苯乙酰-DL-亮氨酸
将上一步的白色固体加入到10升的反应釜中，加入7500毫升0.05摩尔硼酸缓冲液，用NaOH调pH＝8.0，加入200克的固定化青霉素酰化酶，在30℃下搅拌反应4h，停止反应，离心分离出酶，溶液用浓盐酸调pH＝1～2，真空浓缩(真空度0.1p.m，温度60℃)使之为原体积的1/20(375毫升)，过滤，固体用水洗至不含L-亮氨酸(茚三酮显色法)，直接投入第3步。将滤液、洗液投入第5.1步。
注：固定化青霉素酰化酶可重复利用多次，当酶活为开始的1/2时停止使用。
3.水解N-苯乙酰-D-亮氨酸
将第2步得到的白色固体加入到1升的反应釜中，加入800毫升6摩尔HCl溶液，在120℃下搅拌反应5h，真空浓缩(真空度0.1p.m，温度60℃)使之为原体积的1/5(160毫升)，冷却到4℃，真空抽滤，片装晶体苯乙酸直接投入第5.2步。滤液160毫升投入到第4步。
4.结晶与重结晶D-亮氨酸：
将滤液用NH3水调pH＝6.01，在4℃冷藏过夜，过滤析出的晶体，滤液浓缩(真空度0.1p.m，温度60℃)至20毫升，4℃下冷藏过夜，真空抽滤，合并两次所得晶体，95％的乙醇重结晶，得到D-亮氨酸156克(产率40％，αD 20＝-17°(C＝2，6NHCl)。滤液直接用于下次重结晶。
5.重复拆分第二步产生的L-亮氨酸
实施例八：D-缬氨酸的生产工艺
1.合成N-苯乙酰-DL-缬氨酸：
在5升的反应釜中加入468克DL-缬氨酸，360克NaOH，3000毫升水，在10℃下充分搅拌，搅拌下滴加697.5克苯乙酰氯，反应过程中控制pH＝8-10，温度10℃以内，滴加完成后保温反应2小时，然后在室温下继续搅拌反应6小时，停止反应，加入浓盐酸将pH调至1-2，析出大量白色固体，真空抽滤，得到白色固体。滤液减压浓缩(真空度0.1p.m，温度60℃)使之为原体积的1/20(150毫升)，冷却，真空抽滤析出的白色固体，合并两次得到的白色固体，投入下步反应。
2.酶解N-苯乙酰-DL-缬氨酸
将上一步的白色固体加入到20升的反应釜中，加入10000毫升0.05摩尔硼酸缓冲液，用NaOH调pH＝8.0，加入200克的固定化青霉素酰化酶，在30℃下搅拌反应4h，停止反应，离心分离出酶，溶液用浓盐酸调pH＝1～2，真空浓缩(真空度0.1p.m，温度60℃)使之为原体积的1/20(500毫升)，过滤，固体用水洗至不含L-缬氨酸(茚三酮显色法)，直接投入第3步。将滤液、洗液投入第5.1步。
注：固定化青霉素酰化酶可重复利用多次，当酶活为开始的1/2时停止使用。
3.水解N-苯乙酰-D-缬氨酸
将第2步得到的白色固体加入到1升的反应釜中，加入700毫升6摩尔HCl溶液，在120℃下搅拌反应5h，真空浓缩(真空度0.1p.m，温度60℃)使之为原体积的1/5(120毫升)，冷却到4℃，真空抽滤，片装晶体苯乙酸直接投入第5.2步。滤液120毫升投入到第4步。
4.结晶与重结晶D-缬氨酸：
将滤液用NH3水调pH＝6，在4℃冷藏过夜，过滤析出的晶体，滤液浓缩(真空度0.1p.m，温度60℃)至20毫升，4℃下冷藏过夜，真空抽滤，合并两次所得晶体，95％的乙醇重结晶，得到D-缬氨酸187克(产率40％，αD 20＝-28.9°(C＝2，5NHCl)。滤液直接用于下次重结晶。
实施例九：D-赖氨酸的生产工艺
1.合成N，Nε-二苯乙酰-DL-赖氨酸：
在5升的反应釜中加入146克DL-赖氨酸，160克NaOH，2000毫升水，在10℃下充分搅拌，搅拌下滴加620克苯乙酰氯，反应过程中控制pH＝8-10，温度10℃以内，滴加完成后保温反应2小时，然后在室温下继续搅拌反应6小时，停止反应，加入浓盐酸将pH调至1-2，析出大量白色固体，真空抽滤，得到白色固体。滤液减压浓缩(真空度0.1p.m，温度60℃)使之为原体积的1/10(200毫升)，冷却，真空抽滤析出的白色固体，合并两次得到的白色固体，投入下步反应。
2.酶解N，Nε-二苯乙酰-DL-赖氨酸
将上一步的白色固体加入到10升的反应釜中，加入5000毫升0.05摩尔硼酸缓冲液，用NaOH调pH＝8.0，加入200克的固定化青霉素酰化酶，在30℃下搅拌反应12h，停止反应，离心分离出酶，溶液用浓盐酸调pH＝5.5，真空浓缩(真空度0.1p.m，温度60℃)使之为原体积的1/20(250毫升)，过滤，固体用水洗至不含L-赖氨酸(HPLC法)，直接投入第3步。将滤液、洗液投入第5.1步。
注：固定化青霉素酰化酶可重复利用多次，当酶活为开始的1/2时停止使用。
3.水解N，Nε-二苯乙酰-DL-赖氨酸
将第2步得到的白色固体加入到1升的反应釜中，加入400毫升6摩尔HCl溶液，在120℃下搅拌反应5h，真空浓缩(真空度0.1p.m，温度60℃)使之为原体积的1/5(80毫升)，冷却到4℃，真空抽滤，片装晶体苯乙酸直接投入第5.2步。滤液80毫升投入到第4步。
4.结晶与重结晶D-赖氨酸：
将滤液用NH3水调pH＝9.6，在4℃冷藏过夜，过滤析出的晶体，滤液浓缩(真空度0.1p.m，温度60℃)至20毫升，4℃下冷藏过夜，真空抽滤，合并两次所得晶体，95％的乙醇重结晶，得到D-赖氨酸51克(产率35％，αD 20＝-21°(C＝1，6NHCl)。滤液直接用于下次重结晶。
实施例十：D-鸟氨酸的生产工艺
1.合成N，Nε-二苯乙酰-DL-鸟氨酸：
在5升的反应釜中加入203克DL-鸟氨酸二盐酸盐，160克NaOH，1000毫升水，在10℃下充分搅拌，搅拌下滴加372克苯乙酰氯，反应过程中控制pH＝8-10，温度10℃以内，滴加完成后保温反应2小时，然后在室温下继续搅拌反应12小时，停止反应，加入浓盐酸将pH调至1-2，析出大量白色固体，真空抽滤，得到白色固体。滤液减压浓缩(真空度0.1p.m，温度60℃)使之为原体积的1/10(100毫升)，冷却，真空抽滤析出的白色固体，合并两次得到的白色固体，投入下步反应。
2.酶解N，Nε-二苯乙酰-DL-鸟氨酸
将上一步的白色固体加入到10升的反应釜中，加入5000毫升0.05摩尔硼酸缓冲液，用NaOH调pH＝8.0，加入200克的固定化青霉素酰化酶，在30℃下搅拌反应12h，停止反应，离心分离出酶，溶液用浓盐酸调pH＝5.5，真空浓缩(真空度0.1p.m，温度60℃)使之为原体积的1/20(250毫升)，过滤，固体用水洗至不含L-赖氨酸(HPLC法)，直接投入第3步。将滤液、洗液投入第5.1步。
注：固定化青霉素酰化酶可重复利用多次，当酶活为开始的1/2时停止使用。
3.水解N，Nε-二苯乙酰-DL-赖氨酸
将第2步得到的白色固体加入到1升的反应釜中，加入400毫升6摩尔HCl溶液，在120℃下搅拌反应5h，真空浓缩(真空度0.1p.m，温度60℃)使之为原体积的1/5(80毫升)，冷却到4℃，真空抽滤，片装晶体苯乙酸直接投入第5.2步。滤液80毫升投入到第4步。
4.结晶与重结晶D-鸟氨酸：
将滤液用NH3水调pH＝9.6，在4℃冷藏过夜，过滤析出的晶体，滤液浓缩(真空度0.1p.m，温度60℃)至20毫升，4℃下冷藏过夜，真空抽滤，合并两次所得晶体，95％的乙醇重结晶，得到D-鸟氨酸46.2克(产率35％，αD 20＝-28.4°(C＝2，5NHCl)。滤液直接用于下次重结晶。
实施例十一：D-叔亮氨酸的生产工艺
1.合成N-苯乙酰-DL-叔亮氨酸：
在5升的反应釜中加入262克DL-叔亮氨酸，200克NaOH，1000毫升水，在10℃下充分搅拌，搅拌下滴加400克苯乙酰氯，反应过程中控制pH＝8-10，温度10℃以内，滴加完成后保温反应2小时，然后在室温下继续搅拌反应6小时，停止反应，加入浓盐酸将pH调至1-2，析出大量白色固体，真空抽滤，得到白色固体。滤液减压浓缩(真空度0.1p.m，温度60℃)使之为原体积的1/10(100毫升)，冷却，真空抽滤析出的白色固体，合并两次得到的白色固体，投入下步反应。
2.酶解N-苯乙酰-DL-叔亮氨酸
将上一步的白色固体加入到10升的反应釜中，加入5000毫升0.05摩尔硼酸缓冲液，用NaOH调pH＝8.0，加入220克的固定化青霉素酰化酶，在30℃下搅拌反应6h，停止反应，离心分离出酶，溶液用浓盐酸调pH＝1～2，真空浓缩(真空度0.1p.m，温度60℃)使之为原体积的1/20(250毫升)，过滤，固体用水洗至不含L-叔亮氨酸(茚三酮显色法)，直接投入第3步。将滤液、洗液投入第5.1步。
注：固定化青霉素酰化酶可重复利用多次，当酶活为开始的1/2时停止使用。
3.水解N-苯乙酰-D-叔亮氨酸
将第2步得到的白色固体加入到1升的反应釜中，加入500毫升6摩尔HCl溶液，在120℃下搅拌反应5h，真空浓缩(真空度0.1p.m，温度60℃)使之为原体积的1/5(100毫升)，冷却到4℃，真空抽滤，片装晶体苯乙酸直接投入第5.2步。滤液160毫升投入到第4步。
4.结晶与重结晶D-叔亮氨酸：
将滤液用NH3水调pH＝6.1，在4℃冷藏过夜，过滤析出的晶体，滤液浓缩(真空度0.1p.m，温度60℃)至20毫升，4℃下冷藏过夜，真空抽滤，合并两次所得晶体，95％的乙醇重结晶，得到D-叔亮氨酸156克(收率40％，αD 20＝-6.92°(C＝2，5NHCl)。滤液直接用于下次重结晶。
实施例十二：D-对氟苯甘氨酸的生产工艺
1.合成N-苯乙酰-DL-对氟苯甘氨酸：
在5升的反应釜中加入169克DL-对氟苯甘氨酸，110克NaOH，1300毫升水，在10℃下充分搅拌，搅拌下滴加180克苯乙酰氯，反应过程中控制pH＝8-10，温度10℃以内，滴加完成后保温反应2小时，然后在室温下继续搅拌反应6小时，停止反应，加入浓盐酸将pH调至1-2，析出大量白色固体，真空抽滤，得到白色固体。滤液减压浓缩(真空度0.1p.m，温度60℃)使之为原体积的1/10(130毫升)，冷却，真空抽滤析出的白色固体，合并两次得到的白色固体，投入下步反应。
2.酶解N-苯乙酰-DL-对氟苯甘氨酸
将上一步的白色固体加入到10升的反应釜中，加入5000毫升0.05mol/L硼酸缓冲液，用NaOH调pH＝8.0，加入120克的固定化青霉素酰化酶，在30℃下搅拌反应6h，停止反应，离心分离出酶，溶液用浓盐酸调pH＝1～2，真空浓缩(真空度0.1p.m，温度60℃)使之为原体积的1/20(250毫升)，过滤，固体用水洗至不含L-对氟苯甘氨酸(茚三酮显色法)，直接投入第3步。将滤液、洗液投入第5.1步。
注：固定化青霉素酰化酶可重复利用多次，当酶活为开始的1/2时停止使用。
3.水解N-苯乙酰-D-对氟苯甘氨酸
将第2步得到的白色固体加入到1升的反应釜中，加入350毫升6摩尔HCl溶液，在120℃下搅拌反应5h，真空浓缩(真空度0.1p.m，温度60℃)使之为原体积的1/5(100毫升)，冷却到4℃，真空抽滤，片装晶体苯乙酸直接投入第5.2步。滤液100毫升投入到第4步。
4.结晶与重结晶D-对氟苯甘氨酸：
将滤液用NH3水调pH＝6.4，在4℃冷藏过夜，过滤析出的晶体，滤液浓缩(真空度0.1p.m，温度60℃)至20毫升，4℃下冷藏过夜，真空抽滤，合并两次所得晶体，95％的乙醇重结晶，得到D-对氟苯甘氨酸68克(收率40％，αD 20＝-137.5°(C＝2，1NHCl)。滤液直接用于下次重结晶。
实施例十三：D-邻氯苯甘氨酸的生产工艺
1.合成N-苯乙酰-DL-邻氯苯甘氨酸：
在10升的反应釜中加入370克DL-邻氯苯甘氨酸，240克NaOH，4000毫升水，在10℃下充分搅拌，搅拌下滴加372克苯乙酰氯，反应过程中控制pH＝8-10，温度10℃以内，滴加完成后保温反应2小时，然后在室温下继续搅拌反应6小时，停止反应，加入浓盐酸将pH调至1-2，析出大量白色固体，真空抽滤，得到白色固体。滤液减压浓缩(真空度0.1p.m，温度60℃)使之为原体积的1/20(200毫升)，冷却，真空抽滤析出的白色固体，合并两次得到的白色固体，投入下步反应。
2.酶解N-苯乙酰-DL-邻氯苯甘氨酸
将上一步的白色固体加入到20升的反应釜中，加入10000毫升0.05mol/L硼酸缓冲液，用NaOH调pH＝8.0，加入150克的固定化青霉素酰化酶，在30℃下搅拌反应6h，停止反应，离心分离出酶，溶液用浓盐酸调pH＝1-2，真空浓缩(真空度0.1p.m，温度60℃)使之为原体积的1/30(330毫升)，过滤，固体用水洗至不含L-邻氯苯甘氨酸(茚三酮显色法)，直接投入第3步。将滤液、洗液投入第5.1步。
注：固定化青霉素酰化酶可重复利用多次，当酶活为开始的1/2时停止使用。
3.水解N-苯乙酰-D-邻氯苯甘氨酸
将第2步得到的白色固体加入到1升的反应釜中，加入600毫升6mol/L HCl溶液，在120℃下搅拌反应5h，真空浓缩(真空度0.1p.m，温度60℃)使之为原体积的1/5(120毫升)，冷却到4℃，真空抽滤，片状晶体苯乙酸直接投入第5.2步。滤液120毫升投入到第4步。
4.结晶与重结晶D-邻氯苯甘氨酸：
将滤液用NH3水调pH＝6.5，在4℃冷藏过夜，过滤析出的晶体，滤液浓缩(真空度0.1p.m，温度60℃)至20毫升，4℃下冷藏过夜，真空抽滤，合并两次所得晶体，95％的乙醇重结晶，得到D-邻氯苯甘氨酸148克(收率40％，αD 20＝-112.4°(C＝2，1NHCl)。滤液直接用于下次重结晶。
Claims (10)
1.一种D-氨基酸的制备方法，其特征在于：以DL-氨基酸为原料，衍生得到N-苯乙酰-DL-氨基酸，在水溶液下用酶催化不对称水解，得到N-苯乙酰-D-氨基酸，分离回收酶；将所得N-苯乙酰-D-氨基酸通过化学水解，结晶，得到D-氨基酸。
2.根据权利要求1所述的D-氨基酸的制备方法，其特征在于：所述DL-氨基酸为DL-蛋氨酸、DL-丙氨酸、DL-谷氨酸、DL-天冬氨酸、DL-苯丙氨酸、DL-苯甘氨酸、DL-亮氨酸、DL-缬氨酸、DL-赖氨酸、DL-鸟氨酸、DL-叔亮氨酸、DL-对氟苯甘氨酸、DL-邻氯苯甘氨酸。
3.根据权利要求1所述的D-氨基酸的制备方法，其特征在于：所述的D-氨基酸为D-蛋氨酸、D-丙氨酸、D-谷氨酸、D-天冬氨酸、D-苯丙氨酸、D-苯甘氨酸、D-亮氨酸、D-缬氨酸、D-赖氨酸、D-鸟氨酸、D-叔亮氨酸、D-对氟苯甘氨酸、D-邻氯苯甘氨酸。
4.根据权利要求1所述的D-氨基酸的制备方法，其特征在于：在0-40℃下，NaOH溶液为反应介质，在搅拌下DL-氨基酸与苯乙酰氯反应合成N-苯乙酰-DL-氨基酸，DL-氨基酸和苯乙酰氯的摩尔比为1∶(1-1.5)。
5.根据权利要求1所述的D-氨基酸的制备方法，其特征在于：酶为固定化青霉素酰化酶。
6.根据权利要求1所述的D-氨基酸的制备方法，其特征在于：酶催化不对称水解中，底物浓度0.1-1mol/L，反应时间2-12小时，反应温度20-40℃，反应pH＝6-10，搅拌速率为100-300转/分，酶与N-苯乙酰-DL-氨基酸质量比为0.1-10∶1。
7.根据权利要求1所述的D-氨基酸的制备方法，其特征在于：N-苯乙酰-D-氨基酸化学水解为无机酸酸水解，无机酸浓度为3-6mol/L，无机酸为盐酸、硫酸、磷酸。
8.根据权利要求1所述的D-氨基酸的制备方法，其特征在于：N-苯乙酰-D-氨基酸化学水解的温度为100-140℃，反应时间为1-6小时。
9.根据权利要求1所述的D-氨基酸的制备方法，其特征在于：将N-苯乙酰-D-氨基酸经过化学水解得到的D-氨基酸的溶液用碱调至等电点，冷藏8-12小时，结晶，所用的碱为氨水、氨气、三乙胺、氢氧化钠、氢氧化钾。
10.根据权利要求1所述的D-氨基酸的制备方法，其特征在于：将得到的D-氨基酸通过重结晶纯化，纯化所用的溶剂为水和有机溶剂的混合物，有机溶剂为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、正丁醇及丙酮中的一种或任意混合物，纯化所用的水和有机溶剂的体积比为：(10-5)∶1。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 200610021327 CN101003822A (zh) | 2006-07-05 | 2006-07-05 | 一种用固定化青霉素酰化酶生产d－氨基酸的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 200610021327 CN101003822A (zh) | 2006-07-05 | 2006-07-05 | 一种用固定化青霉素酰化酶生产d－氨基酸的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101003822A true CN101003822A (zh) | 2007-07-25 |
Family
ID=38703199
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 200610021327 Pending CN101003822A (zh) | 2006-07-05 | 2006-07-05 | 一种用固定化青霉素酰化酶生产d－氨基酸的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101003822A (zh) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101864464A (zh) * | 2010-04-29 | 2010-10-20 | 重庆凯乐尔生物催化技术有限公司 | 一种制备氯吡格雷手性中间体(s)-邻氯苯甘氨酸甲酯的化学-酶法 |
| CN102352388A (zh) * | 2011-09-29 | 2012-02-15 | 重庆邮电大学 | 一种制备l-2-氨基己二酸的化学-酶法 |
| CN102352389A (zh) * | 2011-09-29 | 2012-02-15 | 重庆邮电大学 | 一种制备l-对氟苯甘氨酸的化学-酶法 |
| CN102352392A (zh) * | 2011-09-29 | 2012-02-15 | 重庆邮电大学 | 一种制备d-酪氨酸的化学-酶法 |
| CN102392061A (zh) * | 2011-09-29 | 2012-03-28 | 重庆邮电大学 | 一种制备d-碱性氨基酸盐酸盐的化学-酶法 |
| CN102432413A (zh) * | 2011-09-29 | 2012-05-02 | 重庆邮电大学 | 一种提高d-氨基酸手性纯度的纯化方法 |
| CN102533888A (zh) * | 2010-12-29 | 2012-07-04 | 浙江九洲药物科技有限公司 | 连续化酶法生产l-叔亮氨酸 |
| CN106083675A (zh) * | 2016-06-03 | 2016-11-09 | 宁夏紫光天化蛋氨酸有限责任公司 | 一种蛋氨酸新晶型i及其制备方法 |
-
2006
- 2006-07-05 CN CN 200610021327 patent/CN101003822A/zh active Pending
Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101864464A (zh) * | 2010-04-29 | 2010-10-20 | 重庆凯乐尔生物催化技术有限公司 | 一种制备氯吡格雷手性中间体(s)-邻氯苯甘氨酸甲酯的化学-酶法 |
| CN102533888A (zh) * | 2010-12-29 | 2012-07-04 | 浙江九洲药物科技有限公司 | 连续化酶法生产l-叔亮氨酸 |
| CN102533888B (zh) * | 2010-12-29 | 2015-07-15 | 浙江九洲药物科技有限公司 | 连续化酶法生产l-叔亮氨酸 |
| CN102352388A (zh) * | 2011-09-29 | 2012-02-15 | 重庆邮电大学 | 一种制备l-2-氨基己二酸的化学-酶法 |
| CN102352389A (zh) * | 2011-09-29 | 2012-02-15 | 重庆邮电大学 | 一种制备l-对氟苯甘氨酸的化学-酶法 |
| CN102352392A (zh) * | 2011-09-29 | 2012-02-15 | 重庆邮电大学 | 一种制备d-酪氨酸的化学-酶法 |
| CN102392061A (zh) * | 2011-09-29 | 2012-03-28 | 重庆邮电大学 | 一种制备d-碱性氨基酸盐酸盐的化学-酶法 |
| CN102432413A (zh) * | 2011-09-29 | 2012-05-02 | 重庆邮电大学 | 一种提高d-氨基酸手性纯度的纯化方法 |
| CN102432413B (zh) * | 2011-09-29 | 2014-02-19 | 重庆邮电大学 | 一种提高d-氨基酸手性纯度的纯化方法 |
| CN102352388B (zh) * | 2011-09-29 | 2014-10-15 | 重庆邮电大学 | 一种制备l-2-氨基己二酸的化学-酶法 |
| CN106083675A (zh) * | 2016-06-03 | 2016-11-09 | 宁夏紫光天化蛋氨酸有限责任公司 | 一种蛋氨酸新晶型i及其制备方法 |
| CN106083675B (zh) * | 2016-06-03 | 2018-07-27 | 宁夏紫光天化蛋氨酸有限责任公司 | 一种蛋氨酸新晶型i及其制备方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101003822A (zh) | 一种用固定化青霉素酰化酶生产d－氨基酸的方法 | |
| CN101368199A (zh) | 固定化青霉素酰化酶催化制备d-氨基酸的方法 | |
| CN109836362B (zh) | 一种制备手性(2s,3r)-对甲砜基苯丝氨酸乙酯的方法 | |
| Bommarius et al. | Comparison of different chemoenzymatic process routes to enantiomerically pure amino acids | |
| CN102851333A (zh) | 一种生物催化合成β-丙氨酸的方法 | |
| JPS592694A (ja) | 遊離Ｌα−アミノ酸の製造法 | |
| CN103014086B (zh) | 一种酶固定化连续生产l-鸟氨酸复合盐的方法 | |
| CN102373246B (zh) | 一种制备l-高苯丙氨酸的方法 | |
| CN102888431A (zh) | 一种制备l-叔亮氨酸的方法 | |
| CN109136298B (zh) | 一种d-氨基酸的制备方法 | |
| CN208308870U (zh) | 一种酶催化合成d-丝氨酸和dl-丝氨酸联产工艺系统 | |
| CN106480009B (zh) | 一种固定化氨基酸酯酰转移酶及在制备丙谷二肽中的应用 | |
| CN1062604C (zh) | 氨基酰化水解酶拆分混旋蛋氨酸制左旋蛋氨酸的方法 | |
| CN1155716C (zh) | D－天冬氨酸及l－丙氨酸的制备方法 | |
| CN1740188A (zh) | 甘氨酰谷氨酰胺的制备方法 | |
| CN101007772B (zh) | 一种手性正缬氨酸的合成方法 | |
| CN100391934C (zh) | 制备左旋谷氨酸的方法 | |
| CN103074409A (zh) | 一种拆分卤代α-氨基酸的方法 | |
| CN102234309A (zh) | 一种c-端修饰为氟甲基酮的肽的制备方法 | |
| JP3239905B2 (ja) | Ｌ−フェニルアラニンの製造法 | |
| CN114164238B (zh) | 一种l-酪氨酸的酶法合成方法 | |
| CN103243141A (zh) | 一种一锅法制备γ-谷氨酰小肽类化合物的方法 | |
| US5906927A (en) | Process for producing L-2-aminoadipic acid | |
| CN102392061A (zh) | 一种制备d-碱性氨基酸盐酸盐的化学-酶法 | |
| CN100334222C (zh) | 酶法拆分外消旋色氨酸15n制备左旋和右旋色氨酸15n的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |