CN103014086B - 一种酶固定化连续生产l-鸟氨酸复合盐的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酶固定化连续生产L-鸟氨酸复合盐的方法。该方法选择具有胺基基质的大孔吸附树酯，在酶与树酯结合固定化过程中，采用固化剂进行特殊处理，使得精氨酸水解酶与大孔吸附树酯在充分的接触过程中，其孔内外表面的胺基反应形成牢固的共价结构，再通过简单的淋洗除去表面杂质达到固定的目的。本发明保持了酶法生产收率高，品质好以及质量稳定的优点，同时解决了酶法生产过程酶无法回收利用，导致的使用成本高、不能连续化生产等缺点，同时还可以一步合成L-鸟氨酸复合盐，且收率高、能耗低、工艺简单、质量稳定。
Description
技术领域
本发明涉及一种氨基酸的制备方法，尤其是涉及一种酶固定化连续生产L-鸟氨酸复合盐的方法。
背景技术
L-鸟氨酸是一种重要的非蛋白质组成的碱性氨基酸，具有重要的活性和生理功能，其兼具有营养和治疗功能，在医疗保健、化工等领域有着广泛的应用。
目前，L-鸟氨酸的合成主要有化学合成法、化学水解法、生物酶水解法以及菌种发酵法等几种。化学合成法主要是以丙稀醛、氰化氢、氨气、二氧化碳等为原料进行化学合成，该方法主要缺点是步骤多，收率不高，同时得到的产品为活性的L-鸟氨酸与非活性的D-鸟氨酸混合物，后期分离难度大，涉及的生产原料剧毒，对环境不友好等，所以基本上没有进入工业化生产。化学水解法是目前国内一些厂家所采用的普遍方法，该方法是以氢氧化钡等碱性物质对精氨酸进行水解生产L-鸟氨酸的方法，该方法理论收率可达到80%左右，主要缺点是合成后对碱性物质进行分离造成污水量大，同时因为使用强碱性物质水解L-精氨酸的过程中，不可避免的会同时有D-鸟氨酸的生成，使得所得的产品旋光度不高，纯度受到很大的限制，不能得到药用甚至食品用纯度的产品，所以，该方法也已经逐步被淘汰。生物酶法是以精氨酸水解酶(EC3.5.3.1)对L-精氨酸进行水解生产L-鸟氨酸的方法，是目前许多研究机构及生产厂家的重点研究对象。精氨酸水解酶水解L-精氨酸在适当的条件下，可以达到99%以上的水解收率，并且因为酶的定向水解特性，使得到L-鸟氨酸最终产品的纯度可达99%以上，光学纯度几乎没有任何变化，能达到药用级标准。在接近于100%的水解收率情况下，对于水解完毕后的产品分离提纯也显得非常简单便利。但因为酶在水解完成后无法回收，酶的来源及提取方式的固有问题，使得其价格高、来源有限，正是由于这些问题的存在，导致了酶法生产L-鸟氨酸成本过高，产量受制于酶源，限制了该方法的规模化生产。菌种发酵法日益成为目前L-鸟氨酸的研究重点。在已经用发酵法工业化生产鸟氨酸的日本昧之素公司，也存在着菌种产酸率不高、后期分离难、菌种传代差异导致生产不稳定、菌种控制及生产控制相对比较复杂等诸多因素，导致实际生产成本相对于化学水解法和酶水解法要高很多，产品质量也不稳定性，菌种的选择与培养技术以及高额的设备投资，严重制约了这种生产方法推广与普及。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术不足而提供一种收率高、能耗低，且工艺简单、质量稳定的酶固定化连续生产L-鸟氨酸复合盐的方法。
本发明的目的是这样实现的：一种酶固定化连续生产L-鸟氨酸复合盐的方法，其特征在于包含如下工艺步骤和工艺参数：
①将树酯与浓度为10%碳酸钠溶液浸泡12h后，过滤，滤出的树酯用纯水洗涤，然后按树酯∶碳酸钠∶纯水＝1∶0.3～0.8∶30～100质量比配成溶液，调溶液的PH值为9～13，搅拌下降温至≤-5℃，加入固化剂保温2h，再加入酶水溶液，升温至0～10℃保温10～16h，滤出树酯，用10倍纯水洗涤三次，得固定化酶树脂；
②在反应釜中加入去离子水，边搅拌边加入L-精氨酸，升温至25～55 ℃，得质量浓度为300～500g／l的L-精氨酸水溶液；
③将150～250g醋酸锰加入反应釜中，搅拌10分钟，再将固定化酶树脂加入反应釜中，加入量为步骤②中L-精氨酸质量的2～3%，对L-精氨酸水溶液进行水解，得L-鸟氨酸粗品水溶液，经过滤除酶，淋洗除去表面杂质，得L-鸟氨酸游离单质溶液；
④在L-鸟氨酸游离单质溶液中加入成盐原料，经反应、脱色、过滤、结晶和干燥，得到L-鸟氨酸复合盐。
所述步骤①中的树酯为具有胺基基质的大孔吸附树酯。
所述步骤①中的固化剂为溴化氰或碳酸钠，加入量为树酯质量的0.3～0.8%。
所述步骤①中的酶水溶液为浓度1%的精氨酸水解酶，加入量为树酯质量0.001～0.005%。
所述步骤③中的水解温度为20～65C°，保温时间为10～16h。
所述步骤④中的成盐原料为L-天门冬氨酸或a-酮戊二酸，加入量为步骤②中L-精氨酸质量的75～85%。
本发明使用的酶是精氨酸水解酶（EC3.5.3.1），这是一种亚胺基蛋白酶，分子量在12000左右，能重复使用30次以上，再生简单。本发明针对其结构特点以及其活力特性，选择具有胺基基质的大孔吸附树酯，不同于普通吸附方式的是，在酶与树酯结合固定化过程中，采用溴化氰或碳酸钠作为固定化处理剂进行特殊处理，使得精氨酸水解酶与大孔吸附树酯在充分的接触过程中，其孔内外表面的胺基反应形成牢固的共价结构，再通过简单的淋洗除去表面杂质达到固定的目的。这样不仅具备吸附固定酶处理方便、成型容易，固载量大的特点，同时又具备共价固定不易脱落的特性，达到酶固定的目的，为后期连续化生产打下了坚实的基础。
与现有技术相比，本发明的优点是：
1、本发明方法不仅保持了酶法生产收率高，品质好以及质量稳定的优点，同时解决了酶法生产过程酶无法回收利用的问题导致的使用成本高、不能连续化生产等缺点，综合效能比目前发酵法更具有优势，并且同时可以非常方便的达到一步法合成L-鸟氨酸复合盐，从而摒弃了先通过L-鸟氨酸盐酸盐经树酯柱处理得到游离状态的L-鸟氨酸，然后再与其他氨基酸合成盐的传统复合盐生产方法，使得复合盐的生产过程大为简化，生产过程中无废水产生，能耗也大为下降，完全达到节能降耗的绿色生产目的。
2、本发明采用填装树酯柱，进行多级串并联，物料配制成固定浓度后，经过泵输送方式，以稳定的流速通过树酯柱的方法进行生产方式的改进，进行连续化不间断生产，反应底物经过树酯柱中酶的充分水解后，从串联级未端流出的是最终产物。生产过程中对每只树酯柱流出产物浓度进行过程监控，对于因使用过程时间过长或其他原因导致的固定化酶失活的树酯柱及时更换方式，保证生产过程的不间断生产。整个生产过程可完全实施电脑程序化自动控制，改变传统的生产模式，不仅节省了人力资源，节约了能耗，同时大幅提高了生产效能，并能完全保证最终产物的质量，收率达93%以上。
3、本发明制备方法因为酶的高效运用，终端产物中基本上是游离状态的L-鸟氨酸，基本不存在其他的游离基质，所以，可以根据市场的需要，非常方便的合成出相应的L-鸟氨酸复合盐，从而避免了常规通过鸟氨酸盐酸盐经树酯交换除盐转化成游离鸟氨酸后再进行复合盐的传统方法，彻底简化了生产流程，减少了因过柱吸附、解析所产生的大量含酸含氨生产废水。
附图说明
图1为本发明工艺流程图。
具体实施方式
以下实施例结合附图对本发明一种酶固定化连续生产L-鸟氨酸复合盐的方法作进一步说明。
实施例1：
①将大孔吸附树酯与浓度为10%碳酸钠溶液浸泡12h后，过滤，滤出的树酯用纯水洗涤，然后按树酯∶碳酸钠∶纯水＝1∶0.3∶30质量比配成溶液，调溶液的PH值为9，搅拌下降温至≤-5℃，缓慢滴加树酯质量0.3%的碳酸钠，保温2h后，加入浓度为1%、质量为树酯质量0.001%的酶水溶液，升温至0℃保温10h，滤出树酯，用10倍纯水洗涤三次，得固定化酶树脂；
②在2000L的反应釜中加入去离子水1000L，边搅拌边加入L-精氨酸300公斤，升温至25℃，得质量浓度为300g／l的L-精氨酸水溶液；
③将150g醋酸锰加入反应釜中，搅拌10分钟后，加入固定化酶树脂5公斤，对L-精氨酸水溶液进行水解，水解温度40℃，保温时间10h，得L-鸟氨酸粗品水溶液，过滤滤除树酯，得L-鸟氨酸游离单质溶液；
④在L-鸟氨酸游离单质溶液中加入a-酮戊二酸250公斤，升温至60℃，保温1小时，加入活性炭脱色，过滤，滤液转入5000L结晶釜中，加入浓度为95%以上的乙醇3000L，在10℃下搅拌下结晶3h，然后过滤，滤饼烘干，得L-鸟氨酸a-酮戊二酸复合盐产品。
实施例2：
①将大孔吸附树酯与浓度为10%碳酸钠溶液浸泡12h后，过滤，滤出的树酯用纯水洗涤，然后按树酯∶碳酸钠∶纯水＝1∶0.5∶60质量比配成溶液，调溶液的PH值为11，搅拌下降温至≤-5℃，缓慢滴加树酯质量0.5%的溴化氰，保温2h后，加入浓度为1%、质量为树酯质量0.003%的酶水溶液，升温至5℃保温13h，滤出树酯，用10倍纯水洗涤三次，得固定化酶树脂；
②在2000L的反应釜中加入去离子水1000L，边搅拌边加入L-精氨酸400公斤，升温至40℃，得质量浓度为400g／l的L-精氨酸水溶液；
③将200g醋酸锰加入反应釜中，搅拌10分钟后，加入固定化酶树脂8公斤，对L-精氨酸水溶液进行水解，水解温度50℃，保温时间13h，得L-鸟氨酸粗品水溶液，过滤滤除树酯，得L-鸟氨酸游离单质溶液；
④在L-鸟氨酸游离单质溶液中加入L-天门冬氨酸300公斤，升温至60℃，保温1小时，加入活性炭脱色，过滤，滤液转入5000L结晶釜中，加入浓度为95%以上的乙醇3000L，在10℃下搅拌下结晶3h，然后过滤，滤饼烘干，得L-鸟氨酸L-天门冬氨酸复合盐产品。
实施例3：
①将大孔吸附树酯与浓度为10%碳酸钠溶液浸泡12h后，过滤，滤出的树酯用纯水洗涤，然后按树酯∶碳酸钠∶纯水＝1∶0.8∶100质量比配成溶液，调溶液的PH值为13，搅拌下降温至≤-5℃，缓慢滴加树酯质量0.8%的溴化氰，保温2h后，加入浓度为1%、质量为树酯质量0.005%的酶水溶液，升温至10℃保温16h，滤出树酯，用10倍纯水洗涤三次，得固定化酶树脂；
②在2000L的反应釜中加入去离子水1000L，边搅拌边加入L-精氨酸500公斤，升温至55℃，得质量浓度为500g／l的L-精氨酸水溶液；
③将250g醋酸锰加入反应釜中，搅拌10分钟后，加入固定化酶树脂10公斤，对L-精氨酸水溶液进行水解，水解温度65℃，保温时间16h，得L-鸟氨酸粗品水溶液，过滤滤除树酯，得L-鸟氨酸游离单质溶液；
④在L-鸟氨酸游离单质溶液中加入L-天门冬氨酸380公斤，升温至60℃，保温1小时，加入活性炭脱色，过滤，滤液转入5000L结晶釜中，加入浓度为95%以上的乙醇3000L，在10℃下搅拌下结晶3h，然后过滤，滤饼烘干，得L-鸟氨酸L-天门冬氨酸复合盐产品。
Claims (2)
1.一种酶固定化连续生产L-鸟氨酸复合盐的方法，其特征在于包含如下工艺步骤和工艺参数：
①将树酯与浓度为10％碳酸钠溶液浸泡12h后，过滤，滤出的树酯用纯水洗涤，然后按树酯∶碳酸钠∶纯水＝1∶0.3～0.8∶30～100质量比配成溶液，调溶液的PH值为9～13，搅拌下降温至≤-5℃，加入树脂质量的0.3-0.8％的溴化氰或碳酸钠作为固化剂保温2h，再加入浓度为1％、质量为树酯质量0.001-0.005％的精氨酸水解酶作为酶水溶液，升温至0～10℃保温10～16h，滤出树酯，用10倍纯水洗涤三次，得固定化酶树脂；
②在反应釜中加入去离子水，边搅拌边加入L-精氨酸，升温至25～55℃，得质量浓度为300～500g/l的L-精氨酸水溶液；
③将150～250g醋酸锰加入反应釜中，搅拌10分钟，再将固定化酶树脂加入反应釜中，加入量为步骤②中L-精氨酸质量的2～3％，对L-精氨酸水溶液进行水解，水解温度20℃-65℃，保温时间10-16h，得L-鸟氨酸粗品水溶液，经过滤除酶，淋洗除去表面杂质，得L-鸟氨酸游离单质溶液；
④在L-鸟氨酸游离单质溶液中加入步骤②中L-精氨酸质量的75-85％的L-天门冬氨酸或a-酮戊二酸作为成盐原料，经反应、脱色、过滤、结晶和干燥，得到L-鸟氨酸复合盐。
2.根据权利要求1所述的一种酶固定化连续生产L-鸟氨酸复合盐的方法，其特征在于所述步骤①中的树酯为具有胺基基质的大孔吸附树酯。
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