CN108384775A - 一种固定化L-天冬氨酸α脱羧酶的方法及生产β-丙氨酸的方法 - Google Patents

一种固定化L-天冬氨酸α脱羧酶的方法及生产β-丙氨酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种固定化L‑天冬氨酸α脱羧酶的方法。所述方法步骤如下：配置L‑天冬氨酸α脱羧酶缓冲溶液，活化树脂交联固化，得固定化L‑天冬氨酸α脱羧酶。本发明还涉及一种生产β‑丙氨酸的方法，采用固定化L‑天冬氨酸α脱羧酶为酶源制备而得。通过利用本发明获得的固定化酶进行生产获得的产物纯度高，容易分离；因此本发明在β‑丙氨酸的工业化生产领域具有良好的产业化前景。

Description

一种固定化L-天冬氨酸α脱羧酶的方法及生产β-丙氨酸的 方法
技术领域
本发明涉及一种固定化L-天冬氨酸α脱羧酶的方法，还涉及一种生产β-丙氨酸的方法，属于生物技术生产氨基酸的技术领域。
背景技术
β-丙氨酸是天然存在的唯一β型非蛋白氨基酸，广泛应用于医药、食品等领域；在医药产品方面主要用于合成泛酸、泛酸钙、肌肽、巴柳氮和帕米磷酸钠；在食品方面主要用于食品的营养添加剂。最早生产β-丙氨酸是主要依靠化学合成法，但是随着对微生物法生产β-丙氨酸研究的深入，这种方法已经走向实用并处于主导地位。微生物法可以分为发酵法、微生物转化法和酶法合成法。其中酶法合成法是利用微生物泛酸生物合成途径的关键酶L-天冬氨酸α-脱羧酶催化L-天冬氨酸脱α位羧基生成β-丙氨酸。酶法生产β-丙氨酸具有产物浓度高、收率高、纯度高、副产物少以及精制操作容易等优点，是一种高效、廉价生产β-丙氨酸的方法。
2006年，郭恒华等报道了利用重组大肠杆菌菌株生产β-丙氨酸的方法。该技术以工程菌为酶源，不利于后续的分离纯化，并且不能重复利用，成本相对较高。焦庆才(CN107012180A)等利用多酶偶联转化马来酸制备β-丙氨酸的方法；该技术采用多酶体系偶联催化，各种酶的最佳催化条件不同，导致酶活利用率低，底物转化不彻底。因此，有必要提出有效的技术方案，解决上述问题。
发明内容
本发明针对上述现有技术成本高、底物反应不彻底的不足，提供一种固定化L-天冬氨酸α脱羧酶的方法及一种生产β-丙氨酸的方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
一种固定化L-天冬氨酸α脱羧酶的方法，所述方法步骤如下：
①配置L-天冬氨酸α脱羧酶缓冲溶液：将活性1000U/g～10000U/g的L-天冬氨酸α脱羧酶用质量浓度为0.1mol/L的磷酸缓冲液溶解，再溶解温度为4～10℃，制备出L-天冬氨酸α脱羧酶缓冲溶液；
所述L-天冬氨酸α脱羧酶缓冲溶液中L-天冬氨酸α脱羧酶活力为50U/mL；
②交联固化：将活化树脂置于反应器中，温度保持在0～10℃条件下，加入L-天冬氨酸α脱羧酶缓冲溶液，在搅拌下处理30～60min；待活化树脂充分吸附酶并牢固结合后，加入戊二醛溶液，室温下搅拌1～2h，过滤收集固定化酶，用10倍体积的去离子水洗涤3次，得固定化L-天冬氨酸α脱羧酶树脂；在-80℃条件下冷冻干燥24h，4℃冰箱保藏备用；
所述活化树脂的质量与L-天冬氨酸α脱羧酶缓冲溶液的体积比为1g:(50～100)ml；活化树脂的质量与戊二醛溶液的体积比为1g:(5～10)ml。
优选地，所述活化树脂的制备方法包括：将树脂用95％乙醇浸泡振荡洗涤4h，用4％HCl振荡洗涤1h，4％NaOH振荡洗涤1h，得初级活化树脂；将初级活化树脂与浓度为10％的碳酸钠溶液浸泡12h后，过滤，过滤出的树脂用去离子水洗涤，然后将过滤洗涤后的树脂按树脂：NaCO3：去离子水＝1:0.2～0.9:30～100的质量比配成混合液，用NaOH溶液调节混合液pH至9～12，搅拌条件下降温至-5℃以下，加入固化剂保温1h，得到活化树脂。
优选地，所述戊二醛溶液中戊二醛体积分数5％～10％。
优选地，所述树脂为LKZ128树脂、AB-8和ES-2树脂中的一种。
优选地，所述固化剂为溴化氰，加入量为树脂质量的0.5％～1％。
本发明提供一种固定化L-天冬氨酸α脱羧酶，采用上述的固定化L-天冬氨酸α脱羧酶的方法制备得到的。
本发明提供一种生产β-丙氨酸的方法，步骤包括：采用权利要求6所述的固定化L-天冬氨酸α脱羧酶为酶源，以100g/L的L-天冬氨酸为初始底物浓度，进行酶法转化反应，所述酶法转化反应条件为：在35℃至50℃下，流加L-天冬氨酸稳定pH为7，经酶法转化反应3-7h后，经过滤除去固定化酶，上清液加入活性炭脱色，再分离获得β-丙氨酸粗品；将β-丙氨酸粗品经纯化后得到β-丙氨酸纯品。
优选地，所述酶法转化条件为：转化温度为37℃，转化时间为5h。
优选地，所述酶法转化反应中固定化酶的加入量为10至80mL,底物L-天冬氨酸的加入量为10至80g。
优选地，所述纯化方法为：将所述β-丙氨酸粗品经超滤膜过滤后减压浓缩，将浓缩物缓慢搅拌进行降温，析出白色晶体，减压抽滤，经乙醇洗涤，干燥获得β-丙氨酸。
有益效果：
本发明以固定化的L-天冬氨酸α脱羧酶为酶源，以L-天冬氨酸为底物，经酶法转化反应生产β-丙氨酸；由于选用大孔吸附树脂作为优选载体，同时在固定化过程中采用固化剂及交联剂进行特殊处理，使酶和树脂更充分的接触，可以有效避免酶固定化过程中的聚集问题；并且本发明获得的固定化酶的使用半衰期长，4℃条件下的保存半衰期最长可达100天，可重复使用70次以上，且固定化酶的活力回收可达70％；另外，通过利用本发明获得的固定化酶进行生产获得的产物纯度高，容易分离；因此本发明在β-丙氨酸的工业化生产领域具有良好的产业化前景。
附图说明
图1是催化条件的优化关系图；
A:反应温度与L-天冬氨酸转化率的关系；B：反应时间与L-天冬氨酸转化率的关系；C：底物L-天冬氨酸与L-天冬氨酸转化率的关系；D：固定化酶体积与L-天冬氨酸转化率的关系；
图2是HPLC法检测反应液中以及纯化后的β-丙氨酸；
在图2中，14.304min为β-丙氨酸出峰时间，10.839min，18.110min和29.744min为溶剂峰。
具体实施方式
本发明涉及一种固定化L-天冬氨酸α脱羧酶的方法，步骤包括：
(1)配置L-天冬氨酸α脱羧酶缓冲溶液：将活性1000U/g～10000U/g的L-天冬氨酸α脱羧酶(EC号4.1.1.11)产品先用质量浓度为0.1mol/L的磷酸缓冲液溶解，再溶解时调节温度为4～10℃，用NaOH调节pH为6～8；然后用1.0～1.5微米的微孔滤膜过滤，收集滤液，制备出L-天冬氨酸α脱羧酶缓冲溶液，其中所述L-天冬氨酸α脱羧酶缓冲溶液中L-天冬氨酸α脱羧酶活力为50U/mL；
(2)交联固化：将活化树脂置于反应器中，温度保持在0～10℃条件下，加入L-天冬氨酸α脱羧酶缓冲溶液，在搅拌下处理30～60min；待活化树脂充分吸附酶并牢固结合后，加入戊二醛溶液，室温下搅拌1～2h，过滤收集固定化酶，用10倍体积的去离子水洗涤3次，得固定化L-天冬氨酸α脱羧酶树脂；在-80℃条件下冷冻干燥24h，4℃冰箱保藏备用；所述活化树脂的质量与L-天冬氨酸α脱羧酶缓冲溶液的体积比为1g:(50～100)ml；活化树脂的质量与戊二醛溶液的体积比为1g:(5～10)ml。
作为本发明的一个实施例，所述活化树脂的制备方法包括：将树脂用95％乙醇浸泡振荡洗涤4h，用4％HCl振荡洗涤1h，4％NaOH振荡洗涤1h，得初级活化树脂；将初级活化树脂与浓度为10％的碳酸钠溶液浸泡12h后，过滤，过滤出的树脂用去离子水洗涤，然后将过滤洗涤后的树脂按树脂：NaCO3：去离子水＝1:0.2～0.9:30～100的质量比配成混合液，用NaOH溶液调节混合液pH至9～12，搅拌条件下降温至-5℃以下，加入固化剂保温1h，得到活化树脂。
下面采用具体实施例进一步详细阐述本发明所述的固定化L-天冬氨酸α脱羧酶的方法。
实施例1
LKZ128树脂固定化L-天冬氨酸α脱羧酶的方法，
①配置L-天冬氨酸α脱羧酶缓冲溶液：将活性1000U/g～10000U/g的L-天冬氨酸α脱羧酶产品先用质量浓度为0.1mol/L的磷酸缓冲液溶解，再溶解时调节温度为4～10℃，用NaOH调节pH为6～8；然后用1.0～1.5微米的微孔滤膜过滤，收集滤液，制备出L-天冬氨酸α脱羧酶缓冲溶液，其中所述L-天冬氨酸α脱羧酶缓冲溶液中L-天冬氨酸α脱羧酶活力为50U/mL；
②将LKZ128树脂用95％乙醇浸泡振荡洗涤4h，用4％HCl振荡洗涤1h，4％NaOH振荡洗涤1h，获得初级活化树脂；将初级活化树脂与浓度为10％的碳酸钠溶液浸泡12h后，过滤，过滤出的树脂用去离子水洗涤，然后按树脂：NaCO3：去离子水＝1:0.3:50的质量比配成混合液，用NaOH溶液调节混合液pH至10，搅拌条件下降温至-5℃以下，加入固化剂保温1h；
③将活化树脂置于反应器中，温度保持在4℃条件下，按树脂的质量：L-天冬氨酸α脱羧酶缓冲溶液的体积比为1:80的比例加入L-天冬氨酸α脱羧酶缓冲溶液，在搅拌下处理60min；再按照树脂的质量：戊二醛体积分数8.5％的戊二醛溶液的体积比为1:10的比例加入戊二醛溶液，室温下搅拌2h，反应完成后进行抽滤，过滤出树脂，用10倍体积的去离子水洗涤3次，得固定化L-天冬氨酸α脱羧酶树脂。
固定化酶活力回收达到70％，可重复使用70次，在4℃下的保存半衰期为100天。
其中，L-天冬氨酸α脱羧酶活力的测定，酶活定义：在pH7.0，温度为37℃的条件下，每升发酵液所含的菌体每1h转化生成β-丙氨酸1μmol所需的酶量定义为一个酶活力单位(μmol L-1h-1)，简称为U。
实施例2
AB-8树脂固定化L-天冬氨酸α脱羧酶的方法，
①配置L-天冬氨酸α脱羧酶缓冲溶液的制备同实施例1
②将AB-8树脂用95％乙醇浸泡振荡洗涤4h，用4％HCl振荡洗涤1h，4％NaOH振荡洗涤1h，获得活化树脂；将活化的树脂与浓度为10％的碳酸钠溶液浸泡12h后，过滤，过滤出的树脂用去离子水洗涤，然后按树脂：NaCO3：去离子水＝1:0.4:60的质量比配成混合液，用NaOH溶液调节混合液pH至9，搅拌条件下降温至-5℃以下，加入固化剂保温1h；
③将处理后的树脂置于反应器中，温度保持在4℃条件下，按树脂的质量：L-天冬氨酸α脱羧酶缓冲溶液的体积比为1:50的比例加入L-天冬氨酸α脱羧酶缓冲溶液，在搅拌下处理45min；再按照树脂的质量：戊二醛体积分数7.5％的戊二醛溶液的体积比为1:8的比例加入戊二醛溶液，室温下搅拌1h，反应完成后进行抽滤，过滤出树脂，用10倍体积的去离子水洗涤3次，得固定化L-天冬氨酸α脱羧酶树脂。
固定化酶活力回收达到60％，可重复使用55次，在4℃下的保存半衰期为70天。
实施例3
ES-2树脂固定化L-天冬氨酸α脱羧酶方法，
①配置L-天冬氨酸α脱羧酶缓冲溶液的制备同实施例1
②将ES-2树脂用95％乙醇浸泡振荡洗涤4h，用4％HCl振荡洗涤1h，4％NaOH振荡洗涤1h，获得活化树脂；将活化的树脂与浓度为10％的碳酸钠溶液浸泡12h后，过滤，过滤出的树脂用去离子水洗涤，然后按树脂：NaCO3：去离子水＝1:0.5:60的质量比配成混合液，用NaOH溶液调节混合液pH至11，搅拌条件下降温至-5℃以下，加入固化剂保温1h；
③将处理后的树脂置于反应器中，温度保持在4℃条件下，按树脂的质量：L-天冬氨酸α脱羧酶缓冲溶液的体积比为1:70的比例加入L-天冬氨酸α脱羧酶缓冲溶液，在搅拌下处理60min；再按照树脂的质量：戊二醛体积分数5％的戊二醛溶液的体积比为1:6的比例加入戊二醛溶液，室温下搅拌0.5h，反应完成后进行抽滤，过滤出树脂，用10倍体积的去离子水洗涤3次，得固定化L-天冬氨酸α脱羧酶树脂。
固定化酶活力回收达到60％，可重复使用60次，在4℃下的保存半衰期为80天。
本发明提供一种生产β-丙氨酸的方法，涉及以底物L-天冬氨酸出发，经固定化L-天冬氨酸α脱羧酶直接催化L-天冬氨酸反应，制备β-丙氨酸。本研究对表达的L-天冬氨酸α脱羧酶进行固定化研究，并对固定化的L-天冬氨酸α脱羧酶反应条件进行了初步研究，为微生物酶法制取β-丙氨酸的生产工艺奠定了基础。
试验例1固定化L-天冬氨酸α脱羧酶的稳定性考察
单次催化反应结束后过滤分离固定化酶和β-丙氨酸，回收固定化酶重复用于下一次催化反应，反复使用70次，固定化酶的重复试验结果表明，70次使用后，L-天冬氨酸的转化率可达70％，结果见下表：
试验例2固定化酶的条件优化
以上述实施例1中固定化酶为酶源，分别在每升反应体系中加入底物L-天冬氨酸为10～80g；转化温度为35～50℃；转化时间为3～7h；固定化酶用量为10至80mL。(以上各参数具体取值如图2中各点所示)考察不同转化条件对L-天冬氨酸转化率的影响，并采用下述高效液相色谱法检测β-丙氨酸的含量，计算L-天冬氨酸的转化率。
如图2所示，反应液中β-丙氨酸的高效液相色谱法检测：以高效液相色谱法测定生成的β-丙氨酸浓度，与β-丙氨酸标准曲线比对，计算底物溶液中L-天冬氨酸的摩尔转化率。
检测条件：
色谱柱：C18(250mm*4.6mm,5um)
流动相：甲醇:0.01mol/L磷酸二氢钾缓冲液(pH7.0，v:v为30:70)
流速:1.0mL/min：柱温：40℃；检测波长:360nm；进样量：20uL
衍生化反应：精密量取样品标准各2mL，分别置于10mL量瓶中，加水3mL、质量分数5％的碳酸钠水溶液1mL和质量分数4％的2,4—二硝基氟苯乙腈溶液2mL；摇匀后立即在40℃下反应2h，放冷，加水稀释至刻度，摇匀。
如图1所示，其中，
A：考察反应温度与L-天冬氨酸转化率的关系；固定化酶浓度20mL；底物L-天冬氨酸用量20g；转化pH值由流加L-天冬氨酸稳定至7；转化时间5h；
B：考察反应时间与L-天冬氨酸转化率的关系；固定化酶浓度20mL；底物L-天冬氨酸用量20g；转化pH值由流加L-天冬氨酸稳定至7；转化温度37℃；
C：考察底物与L-天冬氨酸转化率的关系；固定化酶浓度20mL；转化pH值由流加L-天冬氨酸稳定至7；转化时间5h；转化温度37℃；
D：考察固定化酶与L-天冬氨酸转化率的关系；底物L-天冬氨酸用量20g；转化pH值由流加L-天冬氨酸稳定至7；转化时间5h；转化温度37℃。
确定的最适酶促反应条件为：反应温度，37℃；反应体系pH，7；反应时间，5h；底物浓度，50g/L；固定化酶用量，40mL/L。在该最适酶促反应条件下，L-天冬氨酸的转化率约为67％。
本发明提供一种生产β-丙氨酸的方法，以实施例1的固定化酶为酶源，以上述最适酶促反应条件，酶法合成β-丙氨酸，得到的催化反应液经过滤除去固定化酶，上清液加入活性炭脱色，经超滤膜过滤后减压浓缩，将浓缩物缓慢搅拌进行降温，析出白色晶体，减压抽滤，经乙醇洗涤，干燥获得β-丙氨酸，经计算β-丙氨酸的收率91％，纯度为99.5％。
本发明涉及一种酶固定化生产β-丙氨酸方法，该方法分别选取溴化氰和戊二醛作为固化剂和交联剂，对固定化过程中的酶和树脂进行特殊处理，使L-天冬氨酸α脱羧酶与树脂充分接触，可以有效避免酶固定化过程中的聚集问题；并且本发明获得的固定化酶的使用半衰期长，4℃条件下的保存半衰期最长可达100天，可重复使用70次以上，且固定化酶的活力回收可达70％；另外，通过利用本发明获得的固定化酶进行生产获得的产物纯度高，容易分离；因此本发明在β-丙氨酸的工业化生产领域具有良好的产业化前景。
本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。因此，无论从哪一点来看，本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明而不能限制本发明，权利要求书指出了本发明的范围，而上述的说明并未指出本发明的范围，因此，在与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在本发明的权利要求书的范围内。

Claims (10)

1.一种固定化L-天冬氨酸α脱羧酶的方法，其特征在于，所述方法步骤如下：
①配置L-天冬氨酸α脱羧酶缓冲溶液：将活性1000U/g～10000U/g的L-天冬氨酸α脱羧酶用质量浓度为0.1mol/L的磷酸缓冲液溶解，再溶解温度为4～10℃，制备出L-天冬氨酸α脱羧酶缓冲溶液；
所述L-天冬氨酸α脱羧酶缓冲溶液中L-天冬氨酸α脱羧酶活力为50U/mL；
②交联固化：将活化树脂置于反应器中，温度保持在0～10℃条件下，加入L-天冬氨酸α脱羧酶缓冲溶液，在搅拌下处理30～60min；待活化树脂充分吸附酶并牢固结合后，加入戊二醛溶液，室温下搅拌1～2h，过滤收集固定化酶，用10倍体积的去离子水洗涤3次，得固定化L-天冬氨酸α脱羧酶树脂；在-80℃条件下冷冻干燥24h，4℃冰箱保藏备用；
所述活化树脂的质量与L-天冬氨酸α脱羧酶缓冲溶液的体积比为1g:(50～100)ml；活化树脂的质量与戊二醛溶液的体积比为1g:(5～10)ml。
2.如权利要求1所述的固定化L-天冬氨酸α脱羧酶的方法，其特征在于，所述活化树脂的制备方法包括：将树脂用95％乙醇浸泡振荡洗涤4h，用4％HCl振荡洗涤1h，4％NaOH振荡洗涤1h，得初级活化树脂；将初级活化树脂与浓度为10％的碳酸钠溶液浸泡12h后，过滤，过滤出的树脂用去离子水洗涤，然后将过滤洗涤后的树脂按树脂：NaCO3：去离子水＝1:0.2～0.9:30～100的质量比配成混合液，用NaOH溶液调节混合液pH至9～12，搅拌条件下降温至-5℃以下，加入固化剂保温1h，得到活化树脂。
3.如权利要求1所述的固定化L-天冬氨酸α脱羧酶的方法，其特征在于，所述戊二醛溶液中戊二醛体积分数5％～10％。
4.如权利要求1所述的固定化L-天冬氨酸α脱羧酶的方法，其特征在于，所述树脂为LKZ128树脂、AB-8和ES-2树脂中的一种。
5.如权利要求2所述的固定化L-天冬氨酸α脱羧酶的方法，其特征在于，所述固化剂为溴化氰，加入量为树脂质量的0.5％～1％。
6.一种固定化L-天冬氨酸α脱羧酶，其特征在于，采用如权利要求1-5任一项所述的固定化L-天冬氨酸α脱羧酶的方法制备得到的。
7.一种生产β-丙氨酸的方法，其特征在于，步骤包括：采用权利要求6所述的固定化L-天冬氨酸α脱羧酶为酶源，以100g/L的L-天冬氨酸为初始底物浓度，进行酶法转化反应，所述酶法转化反应条件为：在35℃至50℃下，流加L-天冬氨酸稳定pH为7，经酶法转化反应3-7h后，经过滤除去固定化酶，上清液加入活性炭脱色，再分离获得β-丙氨酸粗品；将β-丙氨酸粗品经纯化后得到β-丙氨酸纯品。
8.如权利要求7所述的生产β-丙氨酸的方法，其特征在于，所述酶法转化条件为：转化温度为37℃，转化时间为5h。
9.如权利要求7所述的生产β-丙氨酸的方法，其特征在于，所述酶法转化反应中固定化酶的加入量为10至80mL,底物L-天冬氨酸的加入量为10至80g。
10.如权利要求7所述的生产β-丙氨酸的方法，其特征在于，所述纯化方法为：将所述β-丙氨酸粗品经超滤膜过滤后减压浓缩，将浓缩物缓慢搅拌进行降温，析出白色晶体，减压抽滤，经乙醇洗涤，干燥获得β-丙氨酸。
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