JPS61209596A - 固定化微生物による有機酸の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は固定化微生物による有機酸の製法に関する。さ
らに詳しくは、微生物保持材料に固定した有機酸生成能
を有する微生物に基質を接触させ、有機酸を効率よく生
産させ、採取する方法に関する。

〔従来の技術〕

クエン酸、グルコン酸、乳酸は、古くから食品、化学品
、医薬品などとして極めて広い分野に用いられている有
用な物質である。

有機酸の一般的な発酵製造法としては、微生物菌体また
は胞子を液状の基質含有物に加え、有機酸に変換させる
、いわゆるサスペンション系にて実施されているが、近
年、アルギン酸カルシウムやカラギーナンなどの固定化
剤により固定化した微生物粒子を一種の固体触媒として
用いて変換させる固定化微生物法が試みられている。

たとえばクエン酸の製造に固定化剤としてアルギン酸カ
ルシウムを用いる方法（アプライド・バイオケミストリ
ー・アンド・バイオテクノロジー（Ａｐｐ　ｌ　、　Ｂ
　ｉｏｃｈｅｍ、　Ｂ　１ｏｔｅｃｈｎｏ　Ｉ　、　）
　、ヱ、５１（１９８２）　ニアブライド・マイクロバ
イオロジー・アンド・バイオテクノロジー（Ａｐｐｌ、
Ｈｉｃｒｏｂｉｏｌ。

Ｂ１０ｔｅＣｈｎＯ１，）、２０．３６５（１９８４）
　：同、　１９．５３（１９８４））やカラギーナンを
用いる方法（アプライド・マイクロバイオジー・アンド
・バイオテクノロジー１９．５３（１９８４））あるい
はポリアクリルアミド、カラギーナン、アルギン酸、そ
の他の固定化剤を用いる方法（特開昭５８−５１５９号
公報）などがあげられる。

固定化微生物を用いる有機酸の製法では、■反応槽内の
微生物濃度が高められ、生産性や収率などを増加させう
る、■生産物の分離や精製が容易になる、などの利点が
期待されるため、種々の研究がなされてきている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

このような固定化微生物を用いる方法は上記の期待とは
裏腹に、■アルギン酸カルシウムやカラギーナンなどの
固定化剤を使用するためコスト高になる、■無菌状態で
固定化することが非常に好ましいが、固定化の操作が複
雑になるため、無菌的な固定化が困難である、■固定化
剤を用いるため固定化ゲル内での基質あるいは生産され
た有機酸の物質移動速度が極めて遅い、■微生物の増殖
あるいは機械的な摩擦力、剪断力などにより固定化した
ゲルが破断され易く、長期運転が困難となる、など種々
の欠点を有するので、大巾な改善が強く望まれている。

本発明はこのような問題を員消し、効率よく有機酸を生
成させる固定化法を開発するためになされたものである
。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は、微生物保持材料を用いて微生物を吸着させれ
ば固定化剤ば不要となり、目的物を効率よく、しかも好
ましくない副生成物を少なくしうろことが見出されたこ
とによりなされたものであり、アスペルジラス属または
りゾブスー属に属し、有機酸生成能を有する微生物を微
生物保持材料に固定化した固定化微生物に基質を接触さ
せ、変換された有機酸を採取することを特徴とする固定
化微生物による有機酸の製法に関する。

（実施例〕 本発明に使用される有機酸生成能を有する微生物として
は、アスベルジラス属（ＡｓｐｅｒＯｉｌｌｕＳ）属ま
たはリゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する微生物（
カビ類）があげられる。

前記アスペルジラス属に属する微生物の具体例としては
、たとえばクエン酸を生成するアスベルジラス・ニガー
（Ａｓｐｅｒａｉｌｌｕｓ　ｎ１ａｅｒ）ＡＴＣＣ１１
４１４、イタコン酸を生成するアスベルジラス・テリウ
ス（Ａｓｐｅｒｏｉｌｌｕｓ　ｔｅｒｒｅｕｓ）　ＩＦ
Ｏ６１２３、グルコン酸を生成するアスペルジラス・ニ
ガー（Ａｓｐｅｒｇｌｌｌｕｓ　ｎ１ａｅｒ）　ＩＡＨ
２５３３など、リゾプス属に属する微生物の具体例とし
ては、たとえばフマル酸を生成するリゾプス・ニグリカ
ンス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｎｉｇｒｉｃａｎｓ）や乳酸
を生成するリゾプス・オリゼー・ウェノト・アンド・ギ
ーリッグス３９５（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｏｒｙｚａｅ　
Ｗｅｎｔ　ａｎｄ　Ｇｅｅｌｉｇｓ３９５）などがあげ
られるが、これらに限定されるものではない。

本発明に使用される微生物保持材料としては、前記のご
とき微生物がそれ自身が有する粘着力により微生物保持
材料に固定化されうる材料があげられ、このような材料
であれば、とくに限定されることなく使用されつる。こ
のような材料の具体例としては、たとえばポリエチレン
やポリプロピレンなとのオレフィン系重合体、ボリブタ
ジエンヤボリイソプレンなどのジエン系重合体、ウレタ
ン系重合体、ポリ塩化ビニル、ポリアクリルアミド、ポ
リスチレンなどのビニル系重合体、ポリエーテル、ポリ
エステル、ポリカーボネート、ディロン、フェノール樹
脂などの縮合系重合体、シリコーン系重合体またはフッ
素系重合体などから形成された発泡材料、セラミックス
、ガラス、活性炭、軽石または金属類などの無機材料が
あげられるが、いずれの材料においても前記のごとき微
生物（カビ類）をうまく該微生物保持材料に固定化させ
るために、空隙率７０〜９９％で、車位置線長さ当りの
孔数が２〜５０個／Ｃｍの多孔質材料や、たとえば金属
線をプレス加工により網目状あるいは不定形状に成形し
、空隙率が７０〜９９％となるように成形加工した金属
材料などを使用するのが好ましい。

このような微生物保持材料の形状や大きさは、微生物の
種類や反応条件、反応器の種類などによって適宜選択す
ればよいが、たとえば球状、柱状、角形、ブロック状、
ラシヒリング状、中空状あるいはシート状などの形状の
ものが代表的であり、概ね球状のものであれば直径が１
〜１００ａ＋■、ブロック状のものであれば一辺が１〜
１００■のものが反応性に富み、しかも取扱いやすいな
どの点から好ましい。

微生物を上記保持材料に固定化させるには、通常、公知
の回分法、半回分法、連続培養法などを用いて容易に吸
着固定化させることができる。微生物を用いて有機酸を
生成させるとき、微生物はベレット状や菌糸状などの種
々様々な様相を呈するが、前記のごとき微生物保持材料
を用いれば微生物が増殖を繰り返す過程において、微生
物が有する粘着力や微生物保持材料の包括作用などによ
り、安定な固定化微生物がえられる。

このような固定化微生物の一例を示すと、あらかじめ蒸
気などで殺菌を施した微生物保持材料と微生物とを好ま
しい条件下、たとえばアスペルジラス・ニガーＡＴＣＣ
１１４１４によるクエン酸生成では、グルコースあるい
はシュクロースを基本培地とし、ｐＨ２〜５、温度２８
℃で通気培養すれば、約１００時間後には該微生物が微
生物保持材料に吸着され、反応に適した固定化微生物が
えられる。このような固定化法は他の微生物についても
同様に適用でき、好適な条件下で培養することにより容
易に固定化しうる。

このようにしてえられる固定化微生物を用いて引き続き
同一反応器において回分法、半回分法あるいは連続培養
法などにより培養すると、各種有機酸を生成させること
ができる。す°なわち、回分法あるいは半回分法による
培養の（ｆあい、生成物に変換した基質を新しい基質と
交換し、反応を継続させる。このような交換操作を幾度
も繰り返すことによって生産効率をより高めることがで
きる。また連続培養法のばあい、微生物を固定化後、新
しい基質をポンプなどで連続的に送り込み、反応器の一
方から連続的に注入速度と同じ割合で変換物を含む液を
流出させ、目的物をえればよい。

有機酸の製造に際しては、一般に知られている各種微生
物（菌種）に適した条件に準じた条件を用い、各種微生
物に適した基質を用いてそれらを接触させればよく、た
とえばアスペルジラス・ニガーを用いたクエン酸やグル
コン酸の生成においては、グルコースやシュクロースな
どの糖類を基本とした培地に必要な栄養源を加え、２５
〜３５℃、ｐＨそれぞれ２〜５および６〜９の条件で通
気培養させればよい。また、アスペルシラス・テリウス
を用いたイタコン酸生成においても、グルコースなどの
糖類を基本とした培地に必要な栄養源を加え、約３０℃
、ｐＨ３〜５の条件で通気培養すればよい。

本発明により有機酸を製造する際には、空気や酸素ある
いは両者の混合ガスを通気させる必要があるが、通気方
法は通常の方法に従い、各種微生物に適した通気量を供
給すればよい。

また、反応器としては、撹拌型あるいは各種気泡塔型な
どのあらゆる型式の反応器を適用しろるが、通常、撹拌
機のない気泡塔型のものが操作が簡単で、消費動力が少
ないなどの点から好ましい。

次に本発明の製法を実施例にもとづきさらに詳細に説明
するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１および比較例１ アスベルジラスーニガー　ＡＴＣＣ１１４１４の胞子を
、グルコース７％、果糖７％、ＭＣｌＳＯ４＝　７Ｈ２
００，１％、ＮＨ４ＮＯ３０，２％、ＫＨ２ＰＯ４０，
０１５％、ＣａＣＩｚ　・２８２００．００５％、ＣＯ
３Ｏ４・５Ｈ２００，０００８％、Ｚｎ５Ｏａ　　・７
）１２００．００１％、クエン酸鉄アンモン０．０００
４％を含む培地で［２培養し、種母をｍ製した。

種母用培地と同じクエン酸生産培地３ｊに種母液を１０
０Ｉｒｉ添加し、あらかじめ殺菌された一辺３〜６Ｉｌ
１ｍのブロック状ポリウレタン（空隙率９７％、孔数３
０個／Ｃ１）の微生物保持材料約２１とともに、５ｊ容
の通常の気泡塔に入れてｐＨ２〜５の範囲で温度を２８
℃に制御して約３日間通気培養を行ない、クエン酸を生
成させるとともに微生物を吸着固定させた。微生物が吸
着固定されたので、以後同一反応器、同一培養条件下で
５０時間毎に前記と同じ新しい培地と入れかえ、３回繰
り返し回分培養を行なった。

比較として、通常の公知のカラギーナンによる固定化法
を用いた固定化微生物を用いて同一条件下で反応させた
。

生成したクエン酸を公知の方法にて測定した結果、本発
明の方法においては５０時間後の３回のそれぞれのクエ
ン酸量は１２ｇ／ｊ！　、　１０．５９／Ｊｌ　、１３
ｇ／４１で、溶液中には精製に支障をきたす他の有機酸
の副生がみられなかった。

しかしながら、カラギーナンによる方法では、クエン酸
量がいずれも本発明の方法の５０％にも満たず、しかも
３回目の交換時にはゲルの破壊が著しかった。

本発明の方法による生成液を濾過し、濾液を消石灰懸濁
液にてＩ）８７〜８に中和し、生ずるクエン酸石灰を濾
過して取得した。クエン酸石灰に計算量の硫酸を加えて
クエン酸を遊離させ、濃縮晶析することにより、クエン
酸を各々８．ｏ。

７．８，８．５９７１の割合で採取することができた。

実施例２ 実施例１と同様にして、アスベルジラス・ニガーＡＴＣ
Ｃ１１４１４を固定化したのち、引き続き同一反応器で
グルコース３％、果糖３％、その他は実施例１と同等量
含む培地を３００ａｉ！　／　ｈｒの速度で連続的に送
り込み、２８℃、ｐＨ２〜３の条件で連続的にクエン酸
を生成させた。定常状態での流出液中のクエン酸量を測
定した結果、１１９７１であった。

実施例１と同様にしてクエン酸を採取したところ、９ｇ
／４１の割合でえられた。

実施例３および比較例２〜３ アスペルジラス・テリウス　ＩＦＯ６１２３の胞子をグ
ルコース１０％、ＮＨａ　）１２　ＰＯ４０，２７％、
ＮＨａ　ＮＯ３０，３％、ＨＱＳＯｉ　・７Ｈ２００，
２％、コーン・スチープ・リカー（Ｃ，Ｓ、Ｌ、）　　
０．１％を含む培地で擾撮培養し、種母を調製した。

種母用培地と同じ培地３Ｊｌに種母液を１００ｍ添加し
、実施例１で用いたものと同様の微生物保持材料２１と
ともに５ｊ容気泡塔に入れ、３０℃、Ｉ）８３〜５に制
御して通気培養を行なった結果、約１００時間後には微
生物が吸着固定されたので、引き続き同一反応器にてグ
ルコース６％、ＮＨ４ＮＯ３０，３％、ｕｇｓｏ４　　
・　７）１２０　０゜２％、　ＮＨ４）１２Ｐ０４０．
２７％を含む溶液を２６０１ｄ／　ｈｒの速度で連続的
に送り込み、イタコン酸を連続的に生成させた。

比較として公知のアルギン酸カルシウムおよびカラギー
ナンをそれぞれ固定化剤として用いた固定化微生物を用
いて同一条件下で反応させた。

定常状態での流出中のイタコン酸を測定した結果、本発
明の方法では１５．２ｇ／４１であったのに対し、固定
化剤を用いた方法ではいずれも１０９／ｆＪ以下であっ
た。

本発明の方法による生成液を濾過し、濾液を濃縮晶析さ
せたところ、イタコン酸を１０ｇ／Ｊｌの割合で採取す
ることができた。

実施例４および比較例４ アスベルジラス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎ
＋ｇｅｒ）ＩＡＨ２５３３の胞子懸濁液１００ｍをグル
コース５％、コーン・スチープ・リカー（Ｃ，Ｓ、Ｌ、
）　　１．５％、硫酸アンモニウム０．１％、リン酸−
カリウム０．１％、！１ｉＩｉｌ！マグネシウム０．０
５％を含む培地を用いて、実施例１に準じて３６℃、Ｐ
Ｈ５〜７に制御して通気培養を行なった結果、約５０時
間後には微生物が吸着固定された。引き続き同一反応器
にてグルコース５％、硫酸アンモニウム０．１５％、リ
ン酸−カリウム０．１％、硫酸マグネシウムＯ，ＯＳ％
を含む溶液を２５（ｌｄ　／　ｈｒの速度で連続的に送
り込み、グルコン酸を連続的に生成させた。

比較としてカラギーナンを固定化剤とした固定化微生物
を用いて同一条件下で反応させた。

定常状態での流出中のグルコン酸を測定した結果、本発
明の方法では８．４ｇ／ｆＪであったのに対し、固定化
剤による方法では３．３ｇ／ＩＩであった。

本発明の方法による生成液を濾過し、濾液を濃縮して晶
析させたところ、グルコン酸塩を４．０ｇ／ｊ！の割合
で採取することができた。

実施例５および比較例５ リゾプス・オリゼーＡＴＣ０９３６３の胞子を、グルコ
ース１１％、尿素０．２％、にＨ２ＰＯａ　　０．０６
％、８０３０４　　・７Ｈ２００，０２５％、Ｚｎ５Ｏ
ａ　・７Ｈ２００，００８８％、ＣａＣＯ５１％を含む
培地で振盪培養し、種母を調製した。

グル：ｌ−ス１５％、尿素０．２％、ＫＨ２ＰＯ４０，
０θ％、ＭＧＳＯ４・７ＨｚＯ０，０２５％、ＺｎＳＯ
４’７Ｈ，ＯＯ，００４４％、ＣａＣＯ３２０％、オク
タデカノール０．００３％を含む乳酸生産培地に、上記
種母液を１００ｄ添加し、実施例１と同じ微生物保持材
料２ｇとともに、５１容の通常の気泡塔に入れ、温度３
０℃に制御して約４０時間の通気培養を行なった。この
ようにして微生物を吸着固定させたのち、以後同一反応
器、同一培養条件下で５０時間毎に新しい培地と入れか
え、３回繰り返して回分培養を行なった。

比較として、通常の公知のカラギーナンによる固定化法
を用いた固定化微生物を用いて同一条件下で反応させた
。

生成した乳酸を公知の方法にて測定した結果、本発明の
方法においては５０時間後の３回のそれぞれの乳酸量は
５４ｇ／Ｊ　、　５１ｇ／４１．４７ｇ、／！で、溶液
中には生成に支障をきたす他の有機酸の副生がみられな
かった。

しかしながら、カラギーナンを用いた方法では、乳酸量
がいずれも本発明の方法の６０％以下であった。

本発明による生成液１ｊをＣａ（ＯＨ）２でｐＨ７，０
に中和し、濾過後濾液を減圧濃縮し、さらに冷蔵して結
晶化させた結果、結晶を３５Ｑ　、３２１Ｊ、３２ｉＪ
の割合で採取できた。

本発明の方法では、以上に説明したごとく固定化剤を全
く使用しないので、固定化剤によるコスト高、操作の複
雑さ、物質移動速度の低さなどの欠点が解消されつる。

さらに本発明の方法によると、好適な反応条件下で固定
化された微生物が増殖を繰り返し、絶えず新しい菌体と
容易に入れかわるので、常に活性の高い微生物で充填さ
れた状態を維持することができる。したがって本発明の
製法では、有機酸の製造効率を極めて高くし、しかも副
生産物を減少させることが可能となり、このことは工業
的実施に際して実大な利点を与える。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　アスペルジラス属またはリゾプス属に属し、有機酸
   生成能を有する微生物を微生物保持材料に固定化した固
   定化微生物に基質を接触させ、変換された有機酸を採取
   することを特徴とする固定化微生物による有機酸の製法
   。 ２　微生物保持材料として、オレフィン系重合体、ジエ
   ン系重合体、ウレタン系重合体、ビニル系重合体、縮合
   系重合体、シリコーン系重合体またはフッ素系重合体か
   ら形成された発泡材料を用いる特許請求の範囲第１項記
   載の製法。 ３　微生物保持材料として、セラミックス、ガラス、活
   性炭、軽石または金属類からなる多孔質材を用いる特許
   請求の範囲第１項記載の製法。 ４　微生物保持材料として空隙率７０〜９９％で、単位
   置線長さ当りの孔数が２〜５０個／ｃｍである多孔質材
   料を用いる特許請求の範囲第２項または第３項記載の製
   法。 ５　微生物保持材料として空隙率が７０〜９９％の金属
   加工材料を用いる特許請求の範囲第１項記載の製法。 ６　微生物保持材料として直径１〜１００ｍｍの球状ま
   たは一辺１〜１００ｍｍのブロック状のものを用いる特
   許請求の範囲第１項記載の製法。 ７　基質を新しい基質と繰り返し交換して固定化微生物
   と接触させる特許請求の範囲第１項記載の製法。 ８　基質を連続的に補給しながら固定化微生物と接触さ
   せ、変換物をうる特許請求の範囲第１項記載の製法。