JPS6258708B2

JPS6258708B2 -

Info

Publication number: JPS6258708B2
Application number: JP3805878A
Authority: JP
Inventors: Shuichi Suzuki; Masao Karube
Original assignee: Amano Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Amano Enzyme Inc
Priority date: 1978-04-03
Filing date: 1978-04-03
Publication date: 1987-12-07
Also published as: JPS54132294A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は酵素の高能率製造法に関するものであ
る。さらに詳しくは微生物菌体を生菌体のまま担
体に固定化して得られる微生物菌体固定化物と炭
素源、窒素源およびその他の栄養源を含む反応液
とを接触させ、反応液中に酵素を生成せしめ、こ
れを採取する酵素の製造法に関するものである。

従来、酵素を微生物により製造する場合、発酵
槽に適当な培地を入れ、微生物を接種し、通気撹
拌により菌体を増殖せしめたのち、酵素を培地中
に生成せしめ、採取する方法が通常行なわれてい
る。しかしながら、この方法では酵素生産がバツ
チ方式であつて、種菌から菌体の増殖、酵素生産
の各段階が一回ごとに行なわれ、せつかく増殖し
た菌体もすべて一回の酵素生産に用いられるだけ
で廃棄されなければならない。また、増殖した菌
体を培養液から分離するのはきわめて困難な作業
を要し、長時間を要するものであつた。

本発明者らは、これら従来の酵素生産における
欠点を改善し、工業的により有利な酵素の製造法
を求めて種々研究を行なつた結果、１度生産され
た微生物菌体をそのまま固定化し、その微生物菌
体固定化物を用いて、各種栄養源を含む水溶液と
接触せしめるのみで、繰り返し酵素を生産する方
法を見い出し本発明を完成したものである。

本発明は、酵素生産能を有する微生物の生菌体
を、担体に固定化せしめ、得られた微生物菌体固
定化物を栄養源を含む水溶液と接触せしめ、水溶
液中に酵素を生成せしめる酵素の製造法である。

本発明に使用する微生物としては固定化した後
にも生きており、酵素を生産するものであれば、
いかなる種類の微生物でも用いることができる。

生産される酵素としてはα―アミラーゼ、β―
アミラーゼ、中性セルラーゼ、ヒアロニダーゼ、
コラゲナーゼ、ホスホリパーゼＣ、リポプロテイ
ンリパーゼ、ホスホマンナーゼ、その他ほとんど
すべての菌体外酵素があげられる。

微生物菌体の増殖においては通常の生産培地が
使用される。

バチルス・ズブチリスNo.24FERM―ＰNo.2040
（α―アミラーゼ生産）、バチルス・ポリミキサNo.
55FERM―ＰNo.3952（β―アミラーゼ生産）、ア
エロモナスspNo.212FERM―ＰNo.2306（中性セル
ラーゼ生産）、シユードモナス・シリキリエンシ
スNo.2662FERM―ＰNo.2319（ホスホリパーゼＣ
生産）、シユードモナス・フルオレツセンス
IAM1057、FERM―ＰNo.1460（微生物リポプロ
テインリパーゼ生産）、フラボバクテリウム・ド
ルミテーター・バル・グルカノリテイカエ
FERM―ＰNo.1289（ホスホマンナナーゼ生産）
などの菌体外酵素生産菌が培養される。培地とし
てはグルコース、可溶性澱粉、蔗糖などの炭素
源、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、尿素、硝
安、コーンスチープリカーなどの窒素源、塩化ナ
トリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウムなど
の無機塩、その他栄養素を含む一般培地で培養さ
れ、増殖した菌体は過、遠心分離などによつて
集菌される。

菌体は洗滌され、生菌体のまま、ポリアクリル
アミドゲル、コラーゲン膜、アルギン酸カルシウ
ムゲル、寒天等の担体に固定化される。

ここに得られる微生物菌体固定化物は、カラム
による連続法やバツチ法によつて反応液と接触さ
せられる。反応液は微生物に酵素生産を行なわせ
るものであればいかなるものでもよい。例えば肉
エキス、酵母エキス、カザミノ酸、コーンスチー
プリカー、無機塩、その他やこれらの混合物など
が好適である。

反応は酵素生産に適した20〜40℃で行なわれ、
連続式の場合、カラム中でかなり長時間通液して
も酵素の生産を続けることができるものである。
バツチ式であれば１回の接触時間３〜７時間で十
分な酵素生産を行なわせ、20〜30回も十分に酵素
生産を行なわせることができる。

本発明によれば、菌体の増殖と酵素生産を分離
し、酵素生産のみを連続して行うことができるの
で、酵素生産がきわめて高能率となつた。また、
酵素生産の反応液中にはほとんど酵素のみが存在
することになるので、酵素の精製が著じるしく容
易となる顕著な効果がある。

次に本発明の試験例及び実施例を示す。

試験例１ α―アミラーゼ産生能を有するバチルス・ズブ
チリス（Bacillus subtilis）FERM―ＰNo.2040を
可溶性澱粉５％、ペプトン１％、肉エキス１％、
塩化ナトリウム0.5％、塩化カルシウム0.02％、
硫酸マグネシウム0.01％（PH7.0）を含む培地100
mlを500ml容坂口フラスコに入れ殺菌後菌体を接
種し、30℃、20時間振盪培養を行ない、集菌し、
洗浄した後、得られた湿菌体４ｇを40mlの生理的
食塩水に懸濁し、アクリルアミド2.125ｇ、Ｎ―
N′メチレンビスアクリルアミド0.375ｇを加えた
後、全量を生理的食塩水で50mlとし、200ml容の
三つ口フラスコに入れ、約10分間窒素ガスを吹き
込む。その後５％のβ―ジメチルアミノプロピオ
ニトリルを0.2mlおよび、５％過硫酸カリウム溶
液を0.5ml加え、重合を開始させる。水冷下で窒
素ガスを吹き込み、又撹拌しつつ、30分間反応
後、菌体を含有する重合物を容器からとりだし３
〜４mm角に細断し、生理食塩水で４回洗浄し、菌
体固定化物を得た。

得られた菌体固定化物20ｇ（湿重量）を、殺菌
した１％肉エキス（PH7.0）30mlを入れた坂口フ
ラスコに加え、30℃で５時間（毎分150振盪）振
盪反応を行ない、反応液中のα―アミラーゼ活性
を測定したところ1800u／mlであつた。なお、α
―アミラーゼの活性は0.2％アミロース溶液２
ml、0.4Mリン酸緩衝液（PH7.0）１mlに酵素１ml
を加え、40℃で30分間反応後、ブルーバリユー法
にて測定し、基質を40℃、１分間で0.2％低下さ
せる力価を１単位とした。

試験例２試験例１で得られた菌体固定化物20ｇ（湿重
量）及び固定化せず培養後洗浄しただけの未処理
菌体２ｇ（湿重量）をそれぞれ殺菌した１％肉エ
キス（PH7.0）30mlを入れた坂口フラスコに加
え、30℃にて５時間接触反応（毎分150振盪）を
行ない、溶液中にα―アミラーゼをそれぞれ生産
せしめた。１回目の振盪反応を終えたのち、反応
溶液を取り出し、新たに殺菌した１％肉エキスを
菌体固定化物ｂ及び未処理菌体ａのおのおのに加
え２回目の接触反応を行ない溶液中にα―アミラ
ーゼを生産せしめる。以下同様にしてａ，ｂ各菌
体と１％肉エキスとの接触反応を12回まで繰り反
し反応液中のα―アミラーゼ活性と反応回数との
関係を比較した。その結果は第１図にされるが、
固定化菌体にあつては１回目の接触反応では反応
液のα―アミラーゼ活性が約1800u／mlであるが
回数が増すにつれて７回目まで直線的に活性が増
加し８回目以降は約16000u／mlで高産生能を保
持した。

一方、未処理菌体は１回目、２回目の接触反応
では反応液中のα―アミラーゼ活性は4000〜
5000u／mlを有するものの３回目以降活性が直線
的に減少した。即ち本発明における固定化菌体に
よる酵素の製造法では菌体の再使用ができるとと
もに高収量の酵素生能を可能ならめるものであ
る。

実施例１ α―アミラーゼ産生能を有するバチルス・ズブ
チリスFERM―ＰNo.2040を用い試験例１に準じ
て菌体固定化物を調製する。得られた菌体固定化
物20ｇ（湿重量）を殺菌した肉エキス１％、酵母
エキス１％の溶液（PH7.0）30mlを入れた坂口フ
ラスコに加え、30℃にて５時間接触反応（毎分
150振盪）を行ない、反応液中にα―アミラーゼ
を生成せしめた後に、菌体固定化物を液から過
により分離し、該固定化物を別の肉エキス１％、
酵母エキス１％の溶液（PH7.0）30mlを入れた坂
口フラスコに入れ２回目の接触反応を行なつた。
同様にして接触反応を12回繰り返したところ、７
回の繰り返し反応まではα―アミラーゼ活性の増
加があり、８回目以降12回目まではほぼ同一の産
生量を示し１ml当り16000単位であつた。

実施例２ヒアロンダーゼ産生能を有する放線菌ストレプ
トミセス・ヒアルロリテイカス・ノブエスピー
（Streptomyces hyalurolyticus nov.sp.）FERM
―ＰNo.427をグルコース2.5％、カザミノ酸１％、
硫酸アンモニウム0.5％、酵母エキス0.25％、
K₂HPO₄0.1％の培養液100ml（PH7.2）の入つた
500ml容坂口フラスコに接種し30℃、24時間振盪
培養を行なつた。培養後、集菌、洗浄を行なつて
得た菌体を試験例１に準じて固定化した。得られ
た菌体固定化物20ｇ（湿重量）を殺菌したカザミ
ノ酸１％、酵母エキス0.25％の水溶液（PH7.0）
30mlを入れた坂口フラスコに加え、30℃にて５時
間接触反応（毎分150振盪）を行ない反応液中に
ヒアルロニダーゼを生成せしめた。この菌体固定
化物とカザミノ酸１％、酵母エキス0.25％からな
る水溶液との接触反応を繰り返し行なつたところ
７回目以降ほぼ同一の産生量を示し反応液中のヒ
アルロニダーゼ活性は１ml当り0.8単位であつ
た。１単位とは60℃、30分間ヒアルロン酸と酸性
馬血清とが結合してできる混濁物の濁りを半減さ
せる酵素力である。

実施例３試験例１で得られた洗浄菌体２ｇ（湿重量）
を、１％コラーゲンフイブリル液（PH4.0）50ｇ
に懸濁しテフロン板上に厚さ５mmにキヤステイン
グし一夜風乾した。ここに得られた菌体含有コラ
ーゲン膜を２〜３cm辺に切断し、0.1％（Ｗ／
Ｖ）グルタルアルデヒド液（PH7.0）に１分間浸
漬してタンニング処理した。これを１％肉エキス
（PH7.0）30mlを入れた坂口フラスコに加え30℃に
て５時間接触反応（毎分150振盪）行なつたとこ
ろ、850u／mlのα―アミラーゼが生成した。

実施例４試験例１で得られた洗浄菌体２ｇ（湿重量）を
２％アルギン酸ソーダ溶液20mlに懸濁した。この
懸濁液を２％CaCl₂水溶液中に高さ10cmから滴下
したところ、直径２mmの菌体を含む球状のアルギ
ン酸カルシウムゲルを得た。これを１％肉エキス
（PH7.0）、CaCl₂0.1％を入れた坂口フラスコに加
え、30℃にて５時間接触反応（毎分150振盪）を
行なつたところ、900u／mlのα―アミラーゼが
生成した。

実施例５コラゲナーゼ産生能を有するクロストリデイウ
ム・ヒストリテイカム（Clostridium
hystolyticum）FERM―ＰNo.683をプロテオース
ペプトン３％、ゼラチン５％、牛血液20％を含
む、培養液３（PH7.5）を５の三角フラスコ
に分注し殺菌後菌体を接種し、37℃、９時間静置
培養した。集菌後、洗浄菌体を得、試験例１に準
じて固定化菌体を調製し、得られた固定化菌体20
ｇ（湿重量）を２×10cmのカラムに充填した。殺
菌したプロテオースペプトン３％、ゼラチン５％
を含む水溶液（PH7.5）を流速10ml／hrで上昇法
で通塔したところ５時間後の活性は0.005単位で
あつたが20時間後には0.03単位で、40時間後には
0.06単位となりそれ以後ほぼ一定となつた。

なお１単位とは30℃、１分間に1log比粘度低下
を示す酵素力である。

実施例６試験例１で得られた洗浄菌体２ｇを50℃に保温
した２％寒天溶液20mlに懸濁し、氷冷す。得られ
た菌体含有寒天ゲルを２−３mm角に細断し、これ
を用いて実施例４と同様に接触反応せしめ、
900u／mlのα―アミラーゼが生成した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、試験例２において、バチルス・ズブ
チリスの洗浄菌体ａと本発明の固定化菌体ｂをそ
れぞれ１％肉エキスに繰り返し接触反応せしめた
場合の、接触回数と反応溶液中のα―アミラーゼ
活性の関係を示したものである。

Claims

【特許請求の範囲】

１酵素生産能を有する微生物の生菌体をポリア
クリルアミドゲル、コラーゲン膜、アルギン酸カ
ルシウムゲル、寒天等の担体に固定せしめ、得ら
れた微生物菌体固定化物を炭素源、窒素源および
その他栄養源を含む反応液と接触せしめ、反応液
中に酵素を生成せしめることを特徴とする酵素の
製造法。