JPS63251086A - 固定化微生物の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は親水性架橋ポリマーを用いて固定化微生物を製
造する方法に関するものである。

〔従来の技術〕

近年、微生物を担体に固定し、これを生体触媒として種
々の物質生産に利用しようとするいわゆるバイオリアク
ターの研究開発が盛んに行われている。バイオリアクタ
ーを構成する上で重要とな乙問題点の一つに、微生物の
固定化方法があり、従来から種々の固定化方法が提案さ
れている。しかしこれらの方法は次に述べる様な問題点
があり固定化方法として満足しうるものではない。

すなわち、合成ポリマーを用いる代表的な微生物の固定
化方法としては、ポリアクリルアミドゲル法〔バイオテ
クノロジー　アンド　バイオエンジニアリング（Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌ。＆　Ｂｉｏｅｎｇ、）、２１．２６１
（１９７９）　］及び光架橋性プレポリマーを用いる方
法（特公昭６１−２６０８７０号公報）が知られている
。しかし、前者は微生物に対するモノマー、架橋剤、重
合開始剤の毒性、重合熱及び生成ラジカルの攻撃の影響
に問題があり、後者は前者より改良されたものではある
が、工業規模で使用する場合に固定化操作の簡便性に問
題がある。

一方、微生物の固定化方法として用いられる代表的な天
然ポリマーとしてアルギン酸〔アプライド　マイクロバ
イオロジー　アンド　バイオテクノロジー（Ａｐｐｌｌ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　＆　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ。）
、　１９゜３１２＜１９８４）　Ｅ及びに−力ラギーナ
ン〔アブライドマイクロバイオロジー　アンド　バイオ
テクノロジー（Ａｐｐｌ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、＆　
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、）、　２１，２２０（１９８５
）　：］が知られている。これらは、微生物に対する毒
性の少ない反面、前者は長期間の使用においてゲルの安
定性に問題があり、後者は固定化時に４５〜５０℃程度
の加熱が必要で、熱による微生物の失活と長期間安定に
固定化する点からは完全なものとは言い難い。

また、何れの固定化方法も固定化操作中に微生物への酸
素供給が断たれるため、特に好気性菌を安定に固定化す
るという観点からは好ましい方法ではない。更に、望ま
ざる菌による汚染を防止するために無菌状態で必要とす
る菌を固定化することが必要であるが、何れの方法も固
定化資材をそれぞれ個別に滅菌するなど固定化操作が複
雑になるため、無菌的な固定化が困難である。

また、セライト〔バイオテクノロジー　アンドバイオエ
ンジニアリング（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、　＆　Ｂｉｏ
ｅｎｇ、）。

２３、２７４７（１９８１）　）及びポリウレタンフォ
ーム（特開昭６０−２１４８７８　号公報）などへの付
着による固定化も試みられているが、親水性が乏しいこ
れらの担体では一旦付着した細胞が脱離し易い問題点が
ある。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明は上記従来の微生物固定化方法に関する問題点を
解決し、温和な環境条件下で微生物を安定、簡便且つ無
菌的に固定化する固定化微生物の製造方法を提供するこ
とを目的とするものである。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は親水性架橋ポリマーを培地で膨潤させた後、こ
れを液内又は固相で微生物と接触させることにより、微
生物が増殖を操り返す過程において、親水性架橋ポリマ
ーに微生物が吸着若しくは吸収された固定化微生物を製
造する方法である。

本発明に用いる親水性架橋ポリマーは、吸水能を有する
水不溶性の水膨潤性樹脂、所謂吸水性樹脂〔アブツーバ
ント　ポリ？　−（ａｂｓｏｒｂａｎｔ　ｐｏｌｙ−ｍ
ａｒ）　）と称せられるもので、通常自重の１０〜１５
００倍程度の吸水率をもつものが望ましく、更に好まし
くは２０〜１０００倍のものが使用される。このような
吸水性樹脂としては例えば特公昭４９−４３３９５号公
報で開示されている澱粉−ポリアクリロニトリルグラフ
ト共重合体、特公昭５１−３９６７２号公報で開示され
ているポリアルキレンオキシド、特公昭５３−１３４９
５号公報で開示されているビニルエステル−エチレン系
不飽和カルボン酸共重合体鹸化物、特公昭５３−４６１
９９号公報で開示されている殿粉−アクリル酸ソーダグ
ラフト重合体、特公昭５４−３０７１０号。

特開昭５６−２６９０９号公報で開示されている逆相懸
濁重合法によって得られる自己架橋ポリアクリル酸塩、
特開昭５４−２００９２号公報で開示されているポリビ
ニルアルコール系重合体と環状酸無水物との反応生成物
、特開昭５５−８４３０４号公報で開示されているポリ
アクリル酸塩架橋物、特開昭５５−１３３４１３号公報
で開示されている水溶液重合により得られるポリアクリ
ル酸ソーダ並びに特開昭５９−６２６６５号公報で開示
されている後架橋ポリマーなどが挙げられる。

本発明に用いられる吸水性樹脂は粉状、粉粒状。

粒状、ブロック状、鱗片状、シート状、Ｉａ維状などの
形状のものを使用し得る。形状が粒状のときは培地又は
培養液で膨潤させたときの粒径が１〜５ｆｆＩＩ１１程
度のものが、固液の分離の容易さの点から好ましい。こ
れらの吸水性樹脂は、単独あるいは金属、樹脂などで補
強整形されて使用される。

上記吸水性樹脂の使用量は、液内で固定化微生物を製造
する場合、望ましくは培地重量の０．０５〜１０％更に
望ましくは０．１〜５％が用いられる。また同相で固定
化微生物を製造する場合、望ましくは培地重量の０．０
５〜１００　％更に望ましくは０．５〜５０％が用いら
れる。

本発明に用いろれる培地は生物学的に言う培地と同義で
あり、炭素源として例えばグルコース。

スクロース、マルトール、スターチ、　大豆油、　窒素
源としては例えばペプトン、酵母エキス、ソイトン、脱
脂大豆、小麦胚芽、コーンステイブリカ＋、　　コーｙ
グルテン、　尿Ｌ　硫酸アンモニウム。

無機塩類としては例えばナトリウム、カリウム。

カルシウム、マグネシウム、リン、鉄、コバルト等の塩
類等を含む溶液及び／又は懸濁液である。

溶媒としては通常水が用いられる。

本発明に用いられる微生物は糸状菌、放線菌。

酵母、細菌。１類など吸水性樹脂に吸着若しくは吸収さ
れるものであれば如何なる種類の微生物でも良い。例え
ばペニシリウム属、セファロスポリウム属、アスペルジ
ラス属、リゾップス属、ムコール１ｍ、）リコヂルマ属
、ストレプトマイセス属。

バチルス属、ストレプトコッカス属１人陽菌属。

叶ソカロマイセス属などが挙げられる。

−Ｊ−、記の微生物と培地又は培養液で膨潤させた吸水
性樹、猪との接触時間は微生物、培地及び吸水性樹脂の
種類によって異なるが、望ましくは１日〜３０日、更：
こ望ましくは１日〜１５日である。一方、菌体の接種量
は０．０１〜１５％、更に望ましくは０．０１〜６％で
ある。

〔作用〕

本発明の固定化微生物の製造方法は、前記吸水性樹脂を
前記ｉ教生物の培地又は培養液中に浸漬するだけで、微
生物が増殖を繰り返す過程において、微生物がその有す
る粘着力により吸水性樹脂に吸着され、固定化されるも
のである。

従って、架橋された吸水性樹脂に微生物を含む水を吸収
させた後、多価金属塩溶液を接触させて固定化する特開
昭６１−１７３７７７号公報開示の方法とは本質的に異
なる方法である。すなわち、前記開示の方法は固定化操
作が微生物の吸水性樹脂への吸収と、多価金属塩溶液と
の接触による水の救出及び架橋反応の２段の操作である
。これに対し本発明の方法では微生物が増殖を繰り返す
過程において、微生物がその粘着力により吸水性樹脂に
吸着される１段操作であり、明らかに固定化方式力（こ
となるものである。また、本発明で用いる金腎塩は、単
に生育、生産に必要なために加えるものであって固定化
には必須のものではない。

〔実施例〕

以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する、しか
しこれらの実施例は本発明の範囲を制限するものではな
い。

実施例１ ストレプトマイセス・バイグロスコピカス３２−１株を
ラフィノース１０ｇ、酵母エキス２ｇ、水１１゜寒天２
０ｇからなる寒天培地上において、２８℃で１週間培養
し、この栄養細胞１エーゼをグルコース２０ｇ、酵母エ
キス１５ｇ、　Ｋ２ＨＰ　０４０．５ｇ−Ｍｇ５Ｏ，−
７８２００，５ｇ、　ＣａＣ０，４ｇ、水１ｐからなる
種母培地４０ｒｎ１．に植菌し、３０℃にて２４時間振
盪培養し、種母を調製した。

グルコース７０　ｇ　、　　バタトソイトン４４　ｇ　
。

ＫＨ２ＰＯ４５，４４ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４１，４２ｇ、
ＴＥＳｌｌ、５　ｇ　、　Ｃｏ　Ｃ１，２・６　Ｈ２Ｏ
０，００１ｇ　、水１βからなる菌体増殖培地を吸水性
樹脂〔ポリアクリル酸塩架橋物、アラソーブＫ　Ｒ−４
５０（前用化学製）〕３ｇとともにオートクレーブ殺菌
し、上記の種母を２０１ｎ１．植菌した。この混合物３
０献を３０℃で４日間振盪培養してアラソーブＫ　Ｒ−
７５０に菌体を生育結合させた後、３０メツシユの金網
で液相を除去して固定化微生物を調製した。

比較例としてアラソーブＫ　Ｒ−７５０の代わりに、ポ
リウレタンフォーム（日東電工！り及びセライト（米国
マンビル社製）を１３ｇ用い、同様の方法によって固定
化微生物を調製した。

グルコＸ３０ｇ、　ＫＨ２Ｐ　０４２．０４ｇ、　Ｎａ
ｚＨＰ　ＯａＯ，９３ｇ　、　　Ｌ−グルタミン酸ソー
ダ１　ｇ　、　　Ｃａ（Ｊ、　　１６　Ｈ２Ｏ１ｇ、　
Ｃｏｃ１２・６　Ｈ２Ｏ０，０１ｇ　、水１１からなる
ビアラホス（除草活性物質）生産培地２０ｍ１へ上記で
得られた３種類の固定化微生物を各々全量添加し３０℃
で振盪しつつ２日間反応させた。

上記のγラソーブＫ　Ｒ−７５０，ポリウレタンフォー
ム及びセライトを用いた３通りの試験例について、反応
前後の菌体吸着量（アラソーブＫ　Ｒ−７５０の吸着閑
体量を１００　として相対値で示す）、及び反応生産＠
（アラソーブＫ　Ｒ−７５０で生成したビアラホス量を
１００として相対値で示す）を比較し、その結果を表１
で示す、。

（以下、この頁余白） 表　　１ 表１より、菌体吸着量、反応生産量の何れの点からも吸
水性樹脂を用いて得られる固定化微生物が最も良好であ
った。また、アラソーブＫ　Ｒ−７５０への菌体吸着状
態を顕微鏡下で観察した結果、樹脂内部まで高密度に菌
体が付着していた。

実施例２ 吸水性樹脂（アブソーブＫＲ−７５０）を用い、実例１
と同様な方法で調製した固定化微生物を実施例１に示し
たビアラホス生産培地２０ｍ１！を用いて、３０℃で振
盪しつつ２日間反応させた。

この後、３０メツシユの金網で固定化微生物を回収し、
再び同条件でビアラホス生産反応を行うことを２回繰り
返した。すなわち、固定化微生物を計３回繰り返し使用
したときの歯体保持率は９１％と好ましく、またビアラ
ホス生産量は１回目１００．２回目９４．３回目８９と
生産活性の低下も極めて少なく、良好な性能を示すこと
がわかった（表２）。

表　　２ 実施例３ ストレプトマイセス会マイクロファシェンスをグルコー
ス５ｇ、ポリペプトン１０ｇ、水Ｉｌ、寒天２０ｇから
なる寒天培地上において、２８℃で一週冊培養し、この
栄養細胞１−エーゼをグルコース２０ｇ、ポリペプトン
１０ｇ、水１１からなる種母培地４０−に植菌し、３０
℃にて２４時間振盪培養し、種母を調製した。

グルコース５ｇ、サラダ油２５ｇ、バタトソイトン３２
ｇ、水１１からなる菌体増殖培地を吸水性樹脂（アラソ
ーブＫ　Ｒ−７５０）　　３　ｇとともにオートゲレー
プ殺菌し、上記の種母を２０−植菌した。

この混合物を３０℃で３日間振盪培養してアラソーブＫ
　Ｒ−７５０に菌体を吸着させた後、３０メツシ二の金
網で液相を除去して固定化微生物を調製した。

比較例として４％アルギン酸ソーダと上記菌体増殖培地
で生育させた培養液を１０ｒｎＩ！当量づつ加え、０．
１Ｍ塩化カルシウムに滴下してゲルを完成させたアルギ
ン酸カルシウムゲルによる固定化微生物をｍ製した。

グルコース５ｇ、サラダ油２５ｇ、グルタミン酸ソーダ
１ｇ、水１１からなるメゾマイシン生産培地２０−へ上
記で得られた２種類の固定化微生物をＫ　Ｒ−７５０は
全量、アルギン酸ソーダゲルは１０ｇそれぞれ添加し、
２６℃で振盪しつつ４日間反応させた。アラソーブＫ　
Ｒ−７５０及びアルギン酸カルシウムゲルを用いた２通
りの試験例について、反応前後の菌体含有量（アラソー
ブＫ　Ｒ−７５０の吸着菌体量を１００　として相対値
で示す）及び反応生産量（アラソーブＫ　Ｒ−７５０で
生成したメゾマイシンＩを１００　として相対値で示す
）を比較したく表３〉。

表　　３ 吸水性樹脂（アラソーブＫ　Ｒ−７５０）　　に対して
ストレプトマイセス・マイクロファシェンスは著量吸着
することが認められ、樹脂からの脱離も少なく、菌体保
持率も９６％と高いことがわかった。また、アルギン酸
カルシウムゲルとの比較では菌体含有量は２／３　と少
ないにもかかわらず生産量は３倍高く、これはアルギン
酸カルシウムゲルに比べ吸水樹脂が酸素移動及び基質の
移動の面で優れているための結果と考えられる。

実施例４ ストレプトマイセス、グリセウス、ストレプトマイセス
、マイクロファシェンス、セファロスポリウム、アクレ
モニウムについて吸水性樹脂（アラソーブＫ　Ｒ−７５
０）　への菌体含有量を調べた。

ストレプトマイセス、グリセウスの菌体増殖培地はグル
コース７０ｇ、バタトソイトン３２ｇ１食塩２ｇ、水１
ｊ２からなる培地を用い、セファ）１スボリウム、アク
レモニウムの場合はファーマメディア２０ｇ、脱脂ビー
ナツツミール抽出ｍ２ｇ、　　ラフ）　　　　Ｘ４０ｇ
、　　　ＣａＣ０：＋　　１０ｇ、　　　Ｃａ５Ｏ＊　
　１２ｇ。

Ｎａ　Ｓ　０４１０　ｇ　、”、−メヂオニン０．５ｇ
からなる菌体増殖培地を用いた。またストレプトマイセ
ス・マイクロファシェンスの場合は実施例３に記敞と同
様の培地を用いた。アラソーブの使用量は全て３ｇとし
実施例１と同様の方法によって固定化微生物を調製した
。

比較例としてアラソーブに代わり、ポリウレタンフォー
ムを１３ｇ用い、実施例１と同様の方法によって固定化
微生物を調製した。アラソーブＫＲ−７５０およびポリ
ウレタンフォームを用いた試験例について菌体吸着量と
生食塩水で１回洗浄後の残存吸着量を比較した（表４）
。菌体吸着量はポリウレタンフォームへの吸着量を１０
０　として各々の菌種ごとに表した。

表　　４ これら３閑種はいずれも吸水性樹脂（アラソーブＫ　Ｒ
−７５０）　　に著量の吸着が認められ、吸着量および
菌体保持率（残存量）ともにポリウレタンフォームを土
羽るものであった。

実施例５ 吸水性樹脂として、アラソーブＫＲ−７５１を用いた他
は、実施例４と同様の方法で実験を行った。供試した３
菌種ともアラソーブに’Ｒ−７５１に対して著量の吸着
が認められ、ポリウレタンフォームと同等もしくはこれ
をｈｉるものであった。

実施例６ 吸水性樹脂として、アラソーブＫ　Ｒ−８５０を用いた
他は、実施例４と同様の方法で実験を行った。供試した
３菌種とも、アラソーブＫ　Ｒ−８５０に対して著量の
吸着が認められポリウレタンを土羽るものであった。

〔発明の効果〕

本発明によれば、固定化微生物を簡便にかつ安定に製造
することができる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、親水性架橋ポリマーを培地で膨潤させた後、これに
   微生物を移植し、微生物が増殖を繰り返す過程において
   、微生物を該ポリマーに吸着固定化させることを特徴と
   する固定化微生物の製造方法。 ２、親水性架橋ポリマーが吸水性樹脂である特許請求の
   範囲第１項記載の固定化微生物の製造方法。