JPS6321474B2

JPS6321474B2 -

Info

Publication number: JPS6321474B2
Application number: JP58228486A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Motai; Yaichi Fukushima; Masamichi Oosaki; Katsutoshi Okamura; Kazutaka Imai
Original assignee: Fuji Deuison Kagaku Kk; KITSUKOOMAN KK
Current assignee: Fuji Deuison Kagaku Kk; KITSUKOOMAN KK
Priority date: 1983-12-05
Filing date: 1983-12-05
Publication date: 1988-05-07
Also published as: JPH0320234B2; JPS60137289A; JPS60120987A; DE3520001A1; GB2175917B; GB2175917A; US4797358A; GB8513555D0; DE3520001C2

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は固定化された微生物菌体もしくは酵素
の製法に関し、その目的とするところは酵素活性
の低下が著しく少なく、しかも機械的ゲル強度の
強い固定化された微生物菌体もしくは酵素を簡易
な操作で効率良く得る方法を提供することにあ
る。従来、微生物菌体もしくは酵素をアルギン酸塩
で包括固定化する方法は、加熱操作を必要とせず
比較的温和な条件でゲル化するため、固定化に際
し酵素活性の低下が起り難く、又食品衛生上も安
全な方法として近年食品、医薬工業への応用が試
みられている。しかしながら、アルギン酸塩包括ゲルは、ポリ
アクリルアミド、ポリメタアクリレート等の高分
子化合物を用いた包括ゲルに比してゲルの機械的
強度が弱く、変形膨潤しやすい等の欠点があるた
め、発酵法等で一般的に使用されている充填層型
リアクターとして用いるのは困難である等の欠点
がある。また、微生物菌体もしくは酵素含有ゲルの固定
化担体として、無機物質、特にシリカゲルを用い
る方法としては、次のような方法が知られてい
る。例えば英国特許第1267685号の方法は、ケイ
酸ナトリウム水溶液に塩酸を加えPH1.6のシリカ
ゾルを調製し、これを透析により食塩等の塩を除
去して安定なシリカゾルを得、該ゾルのPHを５〜
８程度に調整後、これに微生物菌体もしくは酵素
を加えてゲル化させるものであり、又特開昭52−
120190号及び特開昭54−49392号の方法において
は、コロイド状シリカに酵素を吸着させた後、塩
を加えてゲル化させ、ついで凍結、解凍操作を経
て無定化の破砕状の固定化ゲルを得ている。しかしながら、これらの方法は、ベースとなる
シリカゾルの調製に時間がかかること、包括固定
化（ゲル化）操作が複雑であること、からにこれ
らをバイオリアクターとして用いる場合、無定形
のシリカゾルであるため、これらを基質反応容器
に充填するには該容器に適した形状のゲルに調製
しなければ充分な充填効果が得られない等の欠点
がある。そこで本発明者等は、このような従来技術の欠
点を解消すべく鋭意検討した結果、微生物菌体、
酵素等を固定化させる際、ゲル基材としてシリカ
ゾルにアルギン酸塩を加えたゲル基材を用いれ
ば、通常の塩化カルシウム、塩化アルミニウム等
のゲル化剤の速やかにゲル化し得ること、更に得
られる微生物菌体もしくは酵素含有ゲルは機械的
ゲル強度が著しく強く、しかもアルギン酸ゲル及
びシリカゲルの２種ゲル構造を持つため著しく膨
潤し難くなること、更には酵素活性低下の著しく
少ないものであること等を知り、これら知見に基
いて本発明を完成した。即ち、本発明は、微生物菌体、酵素、酵素をタ
ンニンもしくは多官能性架橋試薬で不溶化したも
の、又は酵素を不溶化担体に吸着したもの、ある
いはこれらを水、緩衝液もしくは親水性有機溶媒
に懸濁したものを、アルギン酸塩もしくはアルギ
ン酸塩水溶液と、シリカゾルとに混合し、PH３〜
10の混合液を得、ついでこれらをゲル化剤中と噴
霧接触させることを特徴とする固定化された微生
物菌体もしくは酵素の製法である。以下、本発明について詳述する。先ず、本発明に用いられる微生物菌体として
は、細菌、酵母、黴、放線菌等、如何なる種別の
菌体でも良い。又酵素も如何なる種別のものでも
良く、例えばアルコール脱水素酵素、グルコース
オキシダーゼ、乳酸脱水素酵素等の酸化還元酵
素、Ｄ−グルタミントランスフエラーゼ、グルタ
ミントランスアミネース、ヘキソキナーゼ等の転
移酵素、ロイシンアミノペプチダーゼ、カルボキ
シペプチダーゼ、ペニシリナーゼ等の加水分解酵
素、フマラーゼ、アスパルターゼ、β−チロシナ
ーゼ等のリアーゼ酵素、グルコースイソメラー
ゼ、マンノースイソメラーゼ等の異性化酵素、グ
ルタチオンシンセターゼ、NADシンセターゼ等
のリガーゼ酵素等が代表例として挙げられる。上記した酵素は、タンニンもしくは多官能性架
橋試薬で不溶化させるか、又は該酵素を不溶化担
体に吸着させて用いてもよい。先ず、タンニンで不溶化させる場合は、酵素量
に対し１〜10倍量（Ｗ／Ｗ）のタンニンを含有す
る溶液を加え、PH８以下、好ましくはPH３〜７で
撹拌しつつ反応させ、得られた酵素沈澱物より例
えば遠心分離、過等の通常の分離手段を用いて
不溶化酵素を得る。なお上記タンニンとしては、タンニン酸の他、
ピロガロールタンニン例えば没食子タンニン又は
五倍子タンニン、カテコールタンニン例えば茶、
カカオ等から得られるタンニン質分（カテコール
重合体）等が用いられる。これらのタンニンはタ
ンニン作用を有する限り精製されていないもので
も良く、例えば市販の柿渋タンニン等も用いられ
る。これらは単独でも２種以上のタンニン混合物
としても用いることが出来る。又、多官能性架橋剤で不溶化させる場合は、前
記酵素を１〜20％（Ｗ／Ｖ）の多官能性架橋剤を
含有する液に加え、５〜40℃で10分〜16時間反応
させ、得られた酵素沈澱物より例えば遠心分離、
過等の通常の分離手段を用いて不溶化酵素を得
る。なお、多官能性架橋剤としては、ポリアルデヒ
ド類、イソシアネート類等が適しており、例えば
ジアルデヒドデンプングリオキザール、マロンア
ルデヒド、コハク酸アルデヒド、グルタルアルデ
ヒド、ピメリジアルデヒド、ヘキサメチレンイソ
シアネート、ｐ−トルイレンジイソシアネート等
が挙げられ、特にグルタルアルデヒドが望まし
い。そして、酵素を不溶化担体に吸着させる手段と
しては、通常の吸着剤、例えば活性炭、シリカゲ
ル、酸性白土、多孔質ガラス等、又DEAE−セフ
アデツクス、CM−セフアデツクス、DEAE−セ
ルロース、CM−セルロース、アンバーライトIR
−45、ダウエツクス−50等のイオン交換体等の不
溶化担体をカラムに詰めて前記酵素を通液する
か、又は該不溶化担体を酵素と混合、撹拌して吸
着させた後、これを必要により例えば遠心分離、
過等の分離手段により不溶化担体に吸着した酵
素を得る。なおその後、必要により、該酵素を吸
着した不溶化担体に前記多官能性架橋剤を加えて
反応させてもよい。上記した微生物菌体、酵素、酵素をタンニンも
しくは多官能性架橋試薬で不溶化したもの、又は
酵素を不溶化担体に吸着したものはそのまま、あ
るいはこれらを水、緩衝液もしくは親水性有機溶
媒に懸濁して使用する。これに用いる緩衝液としては、例えば酢酸緩衝
液、マツキルヴエイン緩衝液、リン酸緩衝液、ト
リス緩衝液、ベロナール緩衝液等が挙げられ、又
親水性有機溶媒としては、メチルアルコール、エ
チルアルコール、プロピルアルコール、アセトン
等が挙げられ、これらの有機溶媒は通常10〜20％
（Ｗ／Ｖ）程度で用いられる。次に、上記した微生物菌体、酵素、酵素をタン
ニンもしくは多官能性架橋試薬で不溶化したも
の、又は酵素を不溶化担体に吸着したもの、ある
いはこれらを水、緩衝液もしくは親水性有機溶媒
に懸濁したものを、ゲル基材であるアルギン酸塩
もしくはアルギン酸塩水溶液と、シリカゾルに混
合し、PH３〜10、好ましくはPH６〜８の混合液を
得る。この場合、上記した微生物菌体、酵素、不
溶化した酵素、不溶化担体に吸着した酵素、ある
いはこれらを水、緩衝液もしくは親水性有機溶媒
に懸濁したものを、先ずアルギン酸塩もしくはア
ルギン酸塩水溶液に加え、これにシリカゾルを加
えて混合してもよく、逆に先ずシリカゾルに加
え、これにアルギン酸塩もしくはアルギン酸塩水
溶液を加えて混合してもよく、あるいはアルギン
酸塩もしくはアルギン酸塩水溶液とシリカゾルの
両者に加えて混合してもよい。この際、上記混合液中のアルギン酸塩の最終含
有量は0.5〜3.5％（Ｗ／Ｖ）、又シリカゾルの最
終含有量（SiO₂濃度）は0.5〜35％（Ｗ／Ｖ）程
度とするのが望ましい。なお、ゲル基材として用いられるアルギン酸塩
としては、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カ
リウム、アルギン酸アンモニウム等が挙げられ、
又シリカゾルとしてはケイ酸アルカリ水溶液に鉱
酸を加え、次いで脱塩、PH調整したもの、あるい
はケイ酸アルカリ水溶液をイオン交換樹脂に通過
させ、次いで脱塩したもの等が挙げられ、例えば
スノーテツクス−20、スノーテツクス−30、スノ
ーテツクス−40（何れも日産化学株式会社製）等
が好適な例として挙げられる。次に前記したPH３〜10の混合液を、ゲル化剤中
に注射器、多孔板等を用いて滴下するかもしくは
押出すか、又は該混合液を噴霧器、好ましくは加
圧噴霧器を用いてゲル化剤と噴霧接触することに
より、固定化された微生物菌体もしくは酵素を得
る。これに用いるゲル化剤としては、例えば塩化カ
ルシウム、塩化アルミニウム、酢酸カルシウム、
硫酸アルミニウム等が用いられ、これらは通常１
〜10％（Ｗ／Ｖ）程度の濃度の溶液として用いら
れる。なお、上記ゲル化手段として、ゲル化剤と噴霧
接触させる手段を採用すれば、ゲルの平均粒子径
が最大限800〜900ミクロン以下のものを得ること
が出来、このような微粒子とすることにより基質
との反応効率を著しく高め得る利点がある。本発明により得られる固定化された微生物菌体
もしくは酵素は、機械的ゲル強度が著しく強く、
しかも２重ゲル構造を持つため、著しく膨潤し難
く、更には酵素活性の低下の著しく少ないもので
あるので、本発明方法は産業上極めて有意義であ
る。以下、実施例により本発明を更に具体的に説明
する。実施例１グルコース２％（Ｗ／Ｖ）、ペプトン１％
（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス１％（Ｗ／Ｖ）を含む栄養
培地、（PH5.0）200mlを１フラスコに入れ、常
法により殺菌した後、該培地にサツカロミセス・
セレビシエーIFO 0224を接種し、30℃で48時間
培養して得られた培養液20ml（10⁹／ml）を、PH
7.0に調整したスノーテツクス−40（日産化学株式
会社製）100mlと３％（Ｗ／Ｖ）アルギン酸ナト
リウム（和光純薬株式会社製）水溶液100mlとを
混合した液に加えて混合し（PH：7.0、SiO₂濃
度：18.0％・Ｗ／Ｖ、アルギン酸ナトリウム濃
度：1.36％・Ｗ／Ｖ）、これを注射器を用いて５
％（Ｗ／Ｖ）塩化カルシウム溶液中に滴下し、球
状の固定化酵母菌体（実施例１の固定化酵母菌
体）を得た。対照として、上記酵母培養液20ml（10⁹／ml）
を1.5％（Ｗ／Ｖ）アルギン酸ナトリウム水溶液
200mlに加えて混合し（PH：7.0、アルギン酸ナト
リウム濃度：1.36％・Ｗ／Ｖ）、これを注射器を
用いて５％（Ｗ／Ｖ）塩化カルシウム溶液中に滴
下し、球状の固定化酵母菌体を得た。又、アルコール生産性の測定は、上記各固定化
酵母菌体65Kgを30℃に保温したジヤケツト付カラ
ム（内径：３cm、高さ：15cm）に充填し、該カラ
ムにグルコース10％（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス0.1％
（Ｗ／Ｖ）、硫安0.2％（Ｗ／Ｖ）を含む液体培地
（PH3.3）を、上昇法（SV＝0.15）で20日間通過さ
せつつ、アルコール発酵を行ない、発酵液のアル
コール濃度を測定することにより行なつた。その
結果を第１表に示す。

【表】第１表より明らかな如く、実施例１の固定化酵
母菌体のアルコール発酵能は長期間の保持にもか
かわらず対照に比し著しく優れたものであること
が認められた。又、発酵中のゲルの膨張率は対照
が185％であるに対し、実施例１の固定化酵母菌
体のゲルは130％と著しく優れたものである。実施例２ウレアーゼ（タイプ、シグマ社製）を0.05M
燐酸緩衝液に溶解した10mlを、２％（Ｗ／Ｖ）ア
ルギン酸ナトリウム水溶液100mlとPH8.0に調整し
たスノーテツクス−30（日産化学株式会社製）100
mlとを混合した液に加えて混合し（PH：8.0、
SiO₂濃度：14.3％・Ｗ／Ｖ、アルギン酸ナトリウ
ム濃度：0.95％・Ｗ／Ｖ）、これをワグナーハン
デイーペインターＷ−170（２流体型、ノズル口
径：0.7mm、日本ワグナースプレーテツクス社製）
で５％（Ｗ／Ｖ）塩化カルシウム溶液中に噴霧圧
力120Kg／cm²・Ｇで加圧噴霧し、固定化ウレアー
ゼ（平均粒子径：350ミクロン）を得た。実施例３アスペルギス・オリゼーFERM Ｐ−1149の〓
培養物より硫安分画しDEAE−セルロースを用い
て精製したロイシン・アミノペプチターゼ標品10
ｇを200mlの0.05Mトリス緩衝液（PH7.0）に溶解
したものを、タンニン酸（和光純薬株式会社製）
20ｇを0.05Mトリス緩衝液（PH7.0）200mlに溶解
したものに混合し、これを常法により遠心分離し
て不溶化酵素を得た。この不溶化酵素に、0.05M
トリス緩衝液（PH7.0）20mlを加えて不溶化酵素
を調製した。次に、上記不溶化酵素液を、４％（Ｗ／Ｖ）ア
ルギン酸ナトリウム水溶液100mlにPH6.0に調整し
たスノーテツクス−20（日産化学株式会社製）80
mlを加え混合した液に、加えて混合し（PH：6.0、
SiO₂濃度：8.0％・Ｗ／Ｖ、アルギン酸ナトリウ
ム濃度：2.0％・Ｗ／Ｖ）、これを注射器を用いて
５％（Ｗ／Ｖ塩化カルシウム溶液中に滴下し、球
状の固定化酵素〔ロイシン・アミノペプチターゼ
活性：25000単位／ゲル１個（0.8ｇ）〕を得た。なお、ロイシン・アミノペプチターゼの酵素活
性の測定は、ロイシン−ｐ−ニトロアニリドを基
質として中台の方法〔中台忠信：日本醤油研究所
報告３、99（1977年）〕で測定した。実施例４食塩12％（Ｗ／Ｖ）、グルコース３％、（Ｗ／
Ｖ）、肉エキス１％（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス１％
（Ｗ／Ｖ）、チオグリコール酸ナトリウム0.1％
（Ｗ／Ｖ）、酢酸0.58％（Ｖ／Ｖ）を含む液体培地
（PH7.2）800mlを１フラスコに入れ、常法によ
り殺菌後、これにペデイオコツカス・ハロフイル
スFERM Ｐ−6420を接種し、30℃、24時間培養
して得られた培養液を常法により遠心分離して該
培養液を20倍に濃縮した。この濃縮液10ml（２×
10¹⁰個／ml）を、３％（Ｗ／Ｖ）アルギン酸ナト
リウム水溶液100mlにPH7.0に調整したスノーテツ
クス−40（日産化学株式会社製）50mlを加え混合
した液に、加えて混合し（PH7.0、SiO₂濃度：
12.5％・Ｗ／Ｖ、アルギン酸ナトリウム濃度：
1.9％・Ｗ／Ｖ）、これを注射器を用いて５％
（Ｗ／Ｖ塩化カルシウム溶液中に滴下し、球状の
固定化乳酸菌菌体を得た。上記固定化乳酸菌菌体70ｇを、30℃に保温した
ジヤケツト付カラム（内径：３cm、高さ：15cm）
に充填し、該カラムに肉エキス１％（Ｗ／Ｖ）、
ポリペプトン１％（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス１％
（Ｗ／Ｖ）、グルコース１％（Ｗ／Ｖ）、チオグリ
コール酸ナトリウム0.1％（Ｗ／Ｖ）、食塩15％
（Ｗ／Ｖ）を含む液体培地（PH7.2）を上昇法
（SV＝0.1）で30日間通過させつつ乳酸発酵を行
なつた。その結果を第２表に示す。

【表】第２表より明らかな如く、実施例４で得た固定
化乳酸菌の乳化発酵能は長期間の保持にもかかわ
らず、著しく優れたものであることが認められ
た。

Claims

【特許請求の範囲】

１微生物菌体、酵素、酵素をタンニンもしくは
多官能性架橋試薬で不溶化したもの、又は酵素を
不溶化担体に吸着したもの、あるいはこれらを
水、緩衝液もしくは親水性有機溶媒に懸濁したも
のを、アルギン酸塩もしくはアルギン酸塩水溶液
と、シリカゾルとに混合し、PH３〜10の混合液を
得、ついでこれをゲル化剤中に滴下するかもしく
は押出すか、又はゲル化剤と噴霧接触させること
を特徴とする固定化された微生物菌体もしくは酵
素の製法。