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Die
Erfindung betrifft die Herstellung eines bioaktiven Kompositmaterials,
das aus zementartig abbindendem Magnesiumphosphat und darin homogen
verteilten Mikroorganismen wie Bakterien, Hefen, Pilzen, Sporen
von Bakterien oder Pilzen, oder Mikroalgen besteht und die Bildung
bioaktiver Formkörper, Granulaten und Schichten bei Raumtemperatur
ermöglicht. Das Kompositmaterial kann als Biokatalysator
oder Biofilter zur Reinigung von schadstoffbelastetem Abwasser verwendet
werden. Durch thermische Zersetzung der biologischen Bestandteile
kann das Kompositmaterial in Magnesiumphosphat mit definierter Porenstruktur
umgewandelt werden.
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Es
ist bekannt, daß derzeit große Anstrengungen unternommen
werden, Biomoleküle und lebende Zellen in anorganischen
Matrizen zu immobilisieren, da daraus im Vergleich zu den bislang
verwendeten polymeren Matrizen u. a. folgende Vorteile resultieren:
- – hohe mechanische, thermische und
photochemische Stabilität
- – ggf. hohe Transparenz
- – biologische Inertheit (d. h. keine Nahrungsquelle
für Mikroorganismen)
- – steuerbare Porosität und variabler Immobilisierungsgrad.
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Solche
Biokompositmaterialien bieten zahlreiche neue potenziell vorteilhafte
Anwendungsmöglichkeiten, z. B. zur Herstellung bioaktiver
Oberflächen in der Medizintechnik, zur Biokatalyse oder
als Biofilter in der Umwelttechnik.
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Die
direkte Einbettung von Biomolekülen in eine anorganische
Matrix erfolgt gegenwärtig vorzugsweise durch Nutzung der
modernen Sol-Gel-Technik, wobei die Biokomponente in einem wässrigen
oder wässrig-alkoholischen SiO2-Nanosol
gelöst oder dispergiert wird und durch pH-Änderung
oder Temperaturerhöhung geliert wird. Die bioaktiven Gele
können in Form dünner Schichten, Granulate oder
Formkörper genutzt werden.
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Auf
diese Weise ist zum Beispiel die vorteilhafte Einbettung von Enzymen
oder anderen Proteinen in anorganische Matrizen möglich,
wie es z. B. in
US 5,200,334 oder
US 5,300,564 beschrieben
wurde. In ähnlicher Weise ist die Immobilisierung lebender
Zellen wie Bakterien, Algen, Hefen, Pilze bzw. pflanzliche oder tierische
Gewebeteile in anorganische Oxidgele möglich (
DE10054119 ). In mehreren Patenten
wird zur Einkapselung von Mikroorganismen die Kombination von SiO
2-Gelen mit wasserlöslichen Polymeren
wie Polyvinylalkohol, Gelatine (
US
4148689 ) bzw. Alginaten (
US
4797358 ,
WO 9635780 )
beschrieben.
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Alternativ
zu den Sol-Gel-Systemen wurde die homogene Einbettung von Biomolekülen
in keramische Werkstoffe untersucht, da diese gegenüber
Sol-Gel-Matrizen billiger, stabiler und formbar sind, und zudem eine
etablierte Herstellungstechnologie zur Verfügung steht.
Das Problem bestand dabei darin, den klassischen Sinterprozess zur
Herstellung von Keramiken oberhalb 600°C zu umgehen, um
eine Thermolyse der Biomaterialien zu vermeiden. Dies konnte durch
die Nutzung neuartiger Verfestigungsprozesse (Freeze-cast-Technik)
erreicht werden, wie sie für die Herstellung biokomponenten-freier
poröser Keramikformteile genutzt wird (
DE 10065138 ). Diese neue Tieftemperatur-Route
für poröse Keramikformteile wird durch eine spezielle
Zusammensetzung der keramischen Suspension (insbesonders durch den
Einsatz nanopartikulärer Verfestiger) sowie einer gezielten
Steuerung des Trocknungsvorgangs erreicht. Auf diese Weise konnten
erstmalig bioaktive keramische Kompositmaterialien mit darin homogen
verteilte, lebende Zellen hergestellt werden (
WO2004 065328 ).
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Allerdings
zeigt auch dies Verfahren eine Reihe von Nachteilen: das Verfahren
erfordert Eine leistungsfähige Gefriertechnik, durch den
Gefrierprozess werden große Teile der lebenden Mikroorganismen
abgetötet und die erhaltenen Freeze-Cast-Formkörper
zeigen geringe mechanische Festigkeiten, insbesondere ist die Abriebbeständigkeit
gering.
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Aufgabe
der vorliegenden Erfindung war es darum, ein alternatives Verfahren
zur Einbettung von Mikroorganismen in eine anorganische Matrix zu
finden, das zum Erhalt der Lebensfähigkeit der Mikroorganismen
bei Raumtemperatur arbeitet und mechanisch stabile Produkte unter
Erhalt der Bioaktiviät liefert.
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Diese
Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch
ein Kompositmaterial entsprechend Anspruch 1; weitere Aspekte und/oder
bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung und Anwendungsmöglichkeiten
sind Gegenstand der weiteren Ansprüche.
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Überraschenderweise
konnte die Aufgabe mit einfachen Mitteln dadurch gelöst
werden, dass bestimmte, in Wasser gelöste oder dispergierte
Magnesiumverbindungen, die mitt den entsprechenden Reaktionspartnern
in kurzer Zeit (wenige Minuten zu zementösen Magnesiumammoniumphosphat·Hexahydrat ((NH4)MgPO4·6(H2O), Struvit), Magnesiumkaliumphosphat, Magnesiumnatriumphosphat
oder Magnesiumcalciumphosphat abbinden, verwendet werden, um Mikroorganismen
unter Erhalt ihrer Lebensfähigkeit bei Raumtemperatur zu
immobilisieren. Der Herstellungsprozess gewährleistet eine
so hohe Lebensfähigkeit der eingebetteten Zellen, dass
eine Verwendung des Biokompositmaterials z. B. als Biokatalysator
oder Biofilter zur Reinigung von schadstoffbelastetem Abwasser möglich
ist.
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Das
bioaktive Kompositmaterial nach Anspruch 1, das aus festem Magnesiumphosphat
und darin homogen verteilten Mikroorganismen besteht, kann in verschiedener
Weise hergestellt werden:
- (a) durch Verfestigung
wäßriger Lösungen oder Dispersionen von
Magnesiumsalzen und Ammoniumphosphaten in Gegenwart dispergierter
Mikroorganismen
- (b) durch Verfestigung wäßriger Lösungen
oder Dispersionen von Magnesiumsalzen und/oder Magnesiumoxid und
Ammoniumphosphaten in Gegenwart dispergierter Mikroorganismen
- (c) durch Verfestigung wäßriger Dispersionen
von Sinterprodukten aus Magnesiumphosphat und/oder Magnesiumoxid
(z. B. im molaren Verhältnis 1:1 bei 1050°C) und
Ammoniumphosphaten in Gegenwart dispergierter Mikroorganismen.
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Das
Kompositmaterial kann durch Zusatz gelöster oder dispergierter
Erdalkalimaterialien, insbesondere durch Ca-Salze, modifiziert werden,
wodurch die Abbindezeit in weiten Grenzen varriiert werden kann.
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Dem
Fachmann auf dem Gebiet der Magnesiumphosphat Zemente ist bekannt,
dass solche Zemente in besonders vorteilhafter Weise durch die Reaktion
von Magnesiumphosphaten und/oder Magnesiumoxiden mit Ammoniumphosphaten
abbinden. Der Austausch von Ammoniumphosphaten gegen Alkaliphosphate,
insbesondere Kaliumphosphate führt ebenfalls zu guten Magnesiumphosphat-Zementen
mit guten Abbindeeigenschaften und mechanischen Kennwerten; sie
sind daher auch bevorzugt. Für Natriumphosphate liegen
weniger Daten vor, insbesondere weil Natriumphosphate geringere
Löslichkeiten aufweisen als Ammoniumphosphate und Kaliumphosphate.
Grundsätzlich können aber auch Magnesiumphosphat-Zemente
mit Natriumphosphaten als Reaktionspartner erhalten werden, insbesondere
mit NaH2PO4. Ähnliches
gilt auch für Calciumphosphate. Hier kommt als Reaktionspartner
für Magnesiumphosphate und/oder Magnesiumoxid nur das Calciumdihydrogenphosphat
Ca(H2PO4)2 in Betracht, da die anderen Calciumphosphate
keine ausreichende Wasserlöslichkeit aufweisen.
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Besonders
vorteilhafte Zement-Basisformulierungen im Sinne der vorliegenden
Erfindung werden durch die Kombination von Magnesium- und Calciumphosphaten
in Form eines gemeinsamen Sinterprodukts erhalten, das ebenso wie
die zuvor genannten Magnesiumphosphate und/oder Magnesiumoxide mit
wasserlöslichen Phosphatsalzen von Ammonium-, Alkali- oder
Erdalkaliionen in zementartiger Reaktion abbinden und Zemente mit
ausgezeichneter Festigkeit und Abbindeeigenschaften bilden. Solche
Magnesium-Calciumphosphat-Zemente sind von so hoher Biokompatibilität,
dass sie als implantierbare Knochenzemente verwendet werden können.
Diese Zemente sind daher auch geeignet, um im Sinne der Erfindung
als Trägermaterial für Pflanzen- und Säugetierzellen
zu fungieren. Die Herstellung solcher Magnesium-Calciumphosphat
Zemente ist in der
Deutschen
Patentanmeldung Nr. 10 2008 010 210.5-45 beschrieben.
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Die
Formulierung der Zemente kann auf verschiedene Arten erfolgen. Die
Magnesiumphosphate und/oder Magnesiumoxide können als feinteilige
Pulver vorliegen, die mit wässrigen Lösungen von
wasserlöslichen Phosphatsalzen von Ammonium-, Alkali- oder
Erdalkaliionen gemischt werden, womit die Abbindereaktion gestartet
wird. Alternativ können die wasserlöslichen Phosphatsalze
von Ammonium-, Alkali- oder Erdalkaliionen auch in fester Form mit
den Magnesiumphosphaten und/oder Magnesiumoxiden gemischt werden und
als solche Pulvermischungen mit Wasser oder wässrigen Lösungen
zu einem Zementbrei angemischt werden.
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Die
Mikroorganismen können jeweils in der wässrigen
Lösung vorgelegt werden oder dem bereits angemischten Zement
zugesetzt werden. Im zweiten Fall sollte eine Zementrezeptur mit
verlängerter Abbindezeit gewählt werden.
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Aus
der Technologie der Magnesiumphosphat Zemente sind zahlreiche Füll-
und Zuschlagstoffe bekannt, die einerseits als kostengünstige
Füller dienen können, die andererseits aber auch
deutlichen Einfluss auf die Zementeigenschaften nehmen können.
Prinzipiell sind alle diese Füll- und Zuschlagstoffe auch
in die vorliegende Erfindung einbezogen. Besonders erwähnt
werden sollen in diesem Zusammenhang Füllstoffe aus feinteiligen
bis nanoskaligen Silikaten, die dem Zement bis zu 60% zugesetzt
werden können und die mechanischen Eigenschaften weiter
verbessern können. Weiterhin sind im Sinne der Erfindung
und bezogen auf den bevorzugten Anwendungsbereich der bioaktiven
Kompositmaterialien Glashohlkugeln als Füllmaterialien besonders
interessant und bevorzugt, da mit ihnen geeignete Füllmaterialien
zur Verfügung stehen, mit denen die Dichte der Kompositmaterialien
gezielt eigestellt werden kann. Geeignete Glashohlkugeln stehen
beispielsweise von der Firma 3M (Scotchlite® Glass
Bubbles) zur Verfügung, die eine Dichte von bis zu ca.
0,1 g/cm3 herunter aufweisen. Durch ihren
Einsatz in den Kompositmaterialien können auf einfache
Weise mineralische Trägermaterialien für Mikroorganismen
und insbesondere Mikroalgen hergestellt werden, die in wässrigen
Medien aufschwimmen.
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Um
Vitalitätsverluste der Mikroorganismen aufgrund des Kompressionsstresses
während des Verfestigungsvorganges der anorganischen Matrix
zu minimieren, können organische Polymere in gelöster
oder dispergierter Form als Kompressionsdämpfer zugefügt
werden.
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Dazu
geeignet sind gelöste, biologisch abbaubare Polymere auf
natürlicher Basis wie Dextran, Stärke, Pektine,
Celluloseether, Chitosan, Alginate, Gelatine sowie synthetische
Polymere auf Basis vom Polyvinylalkohol, Polyvinylamin, Polyvinylphosphat,
Polyacrylsäure und Polyethylen- bzw. Polypropylenoxid bzw.
deren Copolymerisate. Durch den Zusatz dispergierter Celluloseprodukte
wie Bakteriencellulose oder Microcellulose kann zusätzlich
die Flexibilität der Kompositschichten verbessert werden.
Der Anteil der polymeren Zusätze kann 1–30 Gew.-%
bezogen auf das trockene Biokomposit betragen.
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Das
bioaktive Kompositmaterial, das als Immobilisierungsmatrix festes
Magnesiumammoniumphosphat verwendet, ist zur Immobilisierung von
unterschiedlichen dispergierten Mikroorganismen wie lebende (und
tote) Bakterien, Hefen, Pilze, Sporen von Bakterien oder Pilzen,
oder Mikroalgen geeignet. Zur Sicherung der Lebensfähigkeit
der lebenden Mikroorganismen können dem Komposit Nährstoffe
wie Kohlenhydrate, Proteine, Vitamine, Supline zugesetzt werden.
Außerdem kann die Bioaktivität durch zellschützende
Polyolverbindungen wie Glycerol, Sorbit, Trehalose oder Celluloseether
verbessert werden. Der Anteil der Mikroorganismen kann 0.1–50
Gew.-% bezogen auf das trockene Biokomposit betragen.
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Das
erfindungsgemäße bioaktive Kompositmaterial kann
als Formkörper, Granulate oder Beschichtung appliziert
werden. Es ist möglich, das Kompositmaterial als Biokatalysator
zur Stoffumwandlung oder als Biofilter zur Reinigung von schadstoffbelastetem
Abwasser zu nutzen.
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Darüberhinaus
ist es möglich, durch thermische Zersetzung der biologischen
Bestandteile bei Temperaturen von mindestens 500°C zementartige
Werkstoffe mit definierter Porenstruktur, die der Form und der Menge
der immobilisierten Biokomponente entspricht, zu erzeugen. Von besonderem
Interesse sind aufgrund ihrer leichten Zugänglichkeit und
ihrer fast monodispersen Größenverteilung sphärische
Hefesporen, die beim Verflüchtigen während des
Sinterns formgetreue kugelförmige Poren hinterlassen
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Die
Vorteile der erfindungsgemäßen bioaktiven Kompositmaterialien
gegenüber dem Stand der Technik bestehen in folgenden Punkten:
- – es können erstmals lebende
Zellen in homogener Verteilung und hoher biologischer Aktivität
in einem zementartigen Formkörper immobilisiert werden
- – die Herstellung der bioaktiven Komposite erfolgt
(1) bei Raumtemperatur (2) in neutraler wässriger Lösung
in (3) kurzen Zeiten
- – die Herstellung der bioaktiven Komposite kann durch
Rühren in offenen Gefäßen unter Verwendung
billiger Industriechemikalien erfolgen
- – die Immobilisierungsmatrix ist biologisch abbaubar
bzw. bioinert und problemlos zu entsorgen
- – die bioaktiven Kompositmaterialien sind beliebig
formbar und zeigen eine hohe mechanische Stabilität,
- – durch die Art der Zusammensetzung und Herstellungstechnologie
kann die Porosität der Komposite und damit deren biologische
Aktivität und Reaktivität in weiten Grenzen gesteuert
werden
- – das Verfahren ist universell anwendbar; unterschiedliche
Mikroorganismen und Zellsysteme können nach dem erfindungsgemäßen
Verfahren in ein Komposit überführt werden
- – es sind zahlreiche Anwendungen als Biokatalysator
oder Biofilter möglich
- – die thermische Entfernung der Biokomponente bietet
neue Möglichkeiten zur Herstellung poröser Keramiken
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Ausführungsbeispiele
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Beispiel 1
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Immobilisierung von Saccharomyces cerevisiae
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(a) Herstellung des Kompositmaterials
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10
g einer Mischung aus Magnesiumphosphat und Magnesiumoxid (molares
Verhältnis 1:1) wurden mit 8 ml einer Ammoniumphosphatlösung
aus 2 mol/l (NH4)2HPO4 und 1,5 mol/l (NH4)H2PO4 sowie Bäkerhefe bei
Raumtemperatur vermischt und in zylindrische Formen (⌀ 6
mm, Höhe 8 mm) gegossen. Es wurden Varianten mit unterschiedlichen
Hefeanteilen von 3.0, 5.9 und 8.6 Gew.-% (Hefetrockengewicht) bezogen
auf das Gesamtgewicht des Kompositmaterials hergestellt.
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Weiterhin
wurde eine Variante unter Zugabe von 10,5 Gew.-% Microcellulose
wie folgt hergestellt: 8,5 g einer Mischung aus Magnesiumphosphat
und Magnesiumoxid (molares Verhältnis 1:1) und 1,5 g Microcellulose
(JELUCEL HM30, Jelu-Werk Ludwigsmühle, Rosenberg, Deutschland)
wurden mit 8 ml einer Ammoniumphosphatlösung aus 2 mol/l
(NH4)2HPO4 und 1,5 mol/l (NH4)H2PO4 sowie Bäkerhefe
(0,844 g = 5,9 Gew.-%) bei Raumtemperatur vermischt und in zylindrische
Formen (⌀ 6 mm, Höhe 8 mm) gegossen.
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Eine
Verfestigung der Zemente erfolgte in ca. 20 min.. Nach 2 h Lagerung
wurden die bioaktiven Kompositmaterialien ausgeformt und hinsichtlich
der Glucoseverwertung durch die immobilisierten Hefezellen ausgetestet.
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(b) Austestung als Fermentationskatalysator
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Es
wurde je ca. 1,7 g des bioaktiven Kompositmaterials in 2 ml Glucoselösung
(2,99 g/l) über 7 h bei 30°C inkubiert und stündlich
die Glucosekonzentration bestimmt (Colorimetrischer Nachweis, GLUCOSE
liquicolor Test, HUMAN mbH, Wiesbaden, Deutschland). Die Tabelle
zeigt vergleichend die Abnahme der Glucosekonzentration.
| Einwaage g | Glucosekonzentration
in g/l |
0
h | 1
h | 2
h | 3
h | 4
h | 5
h | 6
h | 7
h |
Kompositmaterial
mit 3.0% Hefeanteil | 1,76 | 2,99 | 2,64 | 2,25 | 1,97 | 1,73 | 1,40 | 1,13 | 0,81 |
Kompositmaterial
mit 5,9% Hefeanteil | 1,74 | 2,99 | 2,24 | 1,54 | 1,19 | 0,94 | 0,60 | 0,36 | 0,06 |
Kompositmaterial
mit 8,6% Hefeanteil | 1,59 | 2,99 | 1,96 | 1,05 | 0,71 | 0,51 | 0,18 | 0,05 | 0,01 |
Kompositmaterial
mit Microcellulose und 5.9% Hefe | 1,87 | 2,99 | 2,30 | 1,38 | 0,85 | 0,56 | 0,35 | 0,19 | 0,03 |
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Beispiel 2
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Immobilisierung von Rhodococcus
ruber
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(a) Herstellung des Kompositmaterials
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5
g einer Mischung aus Magnesiumphosphat und Magnesiumoxid (molares
Verhältnis 1:1) wurden mit 4 ml einer Ammoniumphosphatlösung
aus 2 mol/l (NH4)2HPO4 und 1,5 mol/l (NH4)H2PO4 sowie Rhodococcus ruber
Bakterien (DSMZ 7512) bei Raumtemperatur vermischt und in zylindrische
Formen (⌀ 6 mm, Höhe 8 mm) gegossen. Rhodococcus
ruber wurde zuvor in einem phenolhaltigen Medium (500 mg/l Phenol,
5 g/l Hefeextrakt, 10 g/l Trypton, 10 g/l NaCl) bei 30°C über
4 Tage angezogen. Anschließend wurde die Biomasse abzentrifugiert
und drei Varianten des Kompositmaterials mit unterschiedlichem Biomasseanteil
hergestellt. Es wurden R. ruber Bakterien entsprechend eines Biomassetrockengewichts
von 224 mg (Variante 1), 1118 mg (Variante 2) oder 1900 mg (Variante
3) dem Schlicker zugemischt. Eine Verfestigung der Zemente erfolgte
in ca. 20 min.. Nach 2 h Lagerung wurden die bioaktiven Kompositmaterialien
ausgeformt und hinsichtlich der Phenolverwertung durch die immobilisierten
R. ruber Zellen getestet.
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(b) Austestung des Phenolabbaus durch
das bioaktive Kompositmaterial
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Das
bioaktive Kompositmaterial wurde in 50 ml einer Phenollösung
mit einer Konzentration von 488 mg/l inkubiert und die Abnahme des
Phenolgehalts über einen Zeitraum von 40,75 Stunden bestimmt
(Colorimetrischer Phenolnachweis mittels 4-Aminoantipyrin nach Emerson
und Kelly, J. Org. Chem, 1948, 13, 532–534). Die Ergebnisse
sind in nachfolgender Tabelle dargestellt.
Kompositmaterial | Phenolkonzentration
in mg/l |
0
h | 16,75
h | 24,5
h | 40,75
h |
Variante
1 | 488 | 403 | 175 | 0 |
Variante
2 | 488 | 253 | 0 | 0 |
Variante
3 | 488 | 281 | 69 | 0 |
Kontrolle
ohne bioaktives Kompositmaterial | 488 | 484 | 492 | 488 |
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- - US 5200334 [0005]
- - US 5300564 [0005]
- - DE 10054119 [0005]
- - US 4148689 [0005]
- - US 4797358 [0005]
- - WO 9635780 [0005]
- - DE 10065138 [0006]
- - WO 2004065328 [0006]
- - DE 0102105-45 [0014]