DE3520001C2 - Verfahren zur Herstellung immobilisierter Mikroorganismen oder Enzyme - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung immobilisierter Mikroorganismen oder Enzyme. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung immobilisierter Mikroorganismen oder Enzyme unter Verwendung eines Gemisches aus Alginat und Silicasol (SiO₂-Sol) als ein einfangendes Material.

Es ist ein Verfahren zum Immobilisieren von Mikroorganismen oder Enzymen bekannt, wobei Alginat dazu dient, dieselben einzufangen bzw. zu adsorbieren. Bei diesem Verfahren wird die Enzymaktivität im Verlaufe der Immobilisierung nur wenig vermindert, da keine Erwärmung erforderlich ist, und das Gelieren unter relativ milden Bedingungen vorgenommen werden kann. Dieses Verfahren bietet auch keine Risiken vom Standpunkt der Lebensmittelhygiene, so daß man Anstrengungen unternimmt, diese Methode in der Lebensmittel- und pharmazeutischen Industrie anzuwenden.

Das Gel aus einer Alginatmatrix weist jedoch eine geringe mechanische Festigkeit auf und tendierte dazu, sich zu deformieren und zu quellen, insbesondere im Vergleich mit dem unter Verwendung einer Polymerverbindung, wie Acrylamid oder Polymethacrylat, erhaltenen eingeschlossenen Gel; somit ergeben sich bei Verwendung derartiger Alginatmatrix-Gele in Form von Füllkörper-Reaktoren, wie sie im allgemeinen bei Fermentierungsverfahren verwendet werden, große Schwierigkeiten.

Es sind auch Verfahren bekannt, wonach man eine anorganische Substanz, insbesondere Silicagel, als immobilisierenden Träger für das Gel, welches einen Mikroorganismus oder ein Enzym enthält, verwendet. So offenbart z. B. GB-PS 12 67 685 ein Verfahren, bei welchem Salzsäure zu einer wäßrigen Lösung von Natriumsilicat unter Bildung eines Silicasols mit einem pH-Wert von 1,6 zugegeben wird, worauf dieses Sol zur Entfernung von Natriumchlorid unter Erhalt eines stabilisierten Silicasols dialysiert wird; nachdem der pH auf ca. 5 bis 8 eingestellt wurde, wird dieses einem Mikroorganismus oder Enzym zugegeben und in ein Gel umgewandelt. Bei den in den japanischen Patentanmeldungen (Kokai) Nr. 1 20 190/77 und 49 392/79 beschriebenen Verfahren wird ein Enzym an kolloides Siliciumdioxid adsorbiert, daraufhin wird dasselbe durch Zugabe eines Salzes, wie Magnesiumchlorid, Natriumcarbonat oder dergleichen geliert, und dann das Gel einem Gefrier- und Auftauschritt unterworfen, um ein pulverisiertes immobilisiertes Gel zu erhalten.

Diese Verfahren weisen jedoch die folgenden Nachteile auf: Es ist viel Zeit erforderlich, um Silicasol, das als Basis verwendet wird, herzustellen; die Einfang- und Immobilisierungs-(Gelierungs)schritte sind kompliziert; bei der Verwendung dieser Gele als Bioreaktoren wird kein befriedigender Packungseffekt erzielt, wenn derartige Gele in ein Substrat-Reaktions-Gefäß eingefüllt werden, da diese Gele unregelmäßige oder pulverisierte Silicagele darstellen, es sei denn, die Gele werden in eine Form umgewandelt, die für das genannte Gefäß geeignet ist.

Aus Biotechnology and Bioengineering, Vol. XXVI (1984) 217 bis 220 ist ein Verfahren zur Zellimmobilisierung bekannt, bei dem man eine Nährlösung mit einer sterilen Lösung, die Alginat und Siliciumdioxid enthält, vermischt und die Mischung unter sterilen Bedingungen mit 0,65% CaCl₂ · 2 H₂O zu Teilchen mit einem mittleren Durchmesser von 0,5 mm geliert; das verwendete Siliciumdioxid ist kein Silicasol, sondern ein Siliciumdioxid mit einer Größenordnung im Mikrometer-Bereich.

Um die Nachteile der im Stand der Technik bekannten Verfahren zu vermeiden, wurden von den Anmeldern weitere umfangreiche Versuche durchgeführt, wobei gefunden wurde, daß beim Immobilisieren eines Mikroorganismus oder Enzyms die Verwendung eines Gemisches aus Silicasol (Kieselsäuresol) und einem Alginat als einfangendes Material mit üblichen Gelierungsmitteln, wie Calciumchlorid, Aluminiumchlorid und dergleichen, zu einer prompten Gelbildung führt, daß das auf diese Weise erhaltene Gel, welches den Mikroorganismus oder das Enzym enthält, eine extrem hohe mechanische Festigkeit aufweist und sich gegenüber Quellung außerordentlich widerstandsfähig verhält, was auf eine Dual- Gelmatrix-Struktur, welche das Alginatgel und das Silicagel umfaßt, zurückzuführen ist, und daß im Verlaufe des Immobilisierungsverfahrens nur eine geringe Verminderung der Enzymaktivität erfolgt. Die vorliegende Erfindung basiert auf diesen Befunden.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung eines immobilisierten Mikroorganismus oder Enzyms zur Verfügung zu stellen, ohne daß dabei eine wesentliche Verminderung der Enzymaktivität erfolgt, wobei eine hohe mechanische Gelfestigkeit mit Hilfe eines einfachen Verfahrens gewährleistet wird.

Die vorstehende Aufgabe wird gemäß der Erfindung durch ein Verfahren zur Herstellung eines immobilisierten Mikroorganismus oder Enzyms gelöst, wonach man einen Mikroorganismus oder ein Enzym mit einem Alginat und Silicasol in Gegenwart von Wasser vermischt, dabei ein flüssiges Gemisch mit einem pH-Wert von 3 bis 10 erhält, und dasselbe mit einem Gelierungsmittel, das in Form einer wäßrigen Lösung vorliegt, in Kontakt bringt.

Die Erfindung wird im folgenden näher beschrieben.

Der gemäß der Erfindung verwendete Mikroorganismus kann jeder beliebigen Spezies von Mikroorganismen angehören, wie Bakterien, Hefen, Schimmelpilze, Strahlenpilze, etc. Ebenso können Enzyme beliebiger Art gemäß der Erfindung verwendet werden; typische Beispiele von Enzymen stellen Oxidoreduktasen dar, wie Alkoholdehydrogenase, Glucoseoxidase, Milchsäuredehydrogenase, etc.; sowie ebenfalls Transferasen, z. B. D-Glutamyltransferase, Glutamintransaminase, Hexokinase, etc.; Lyasen, wie Fumarase, Aspartase, β-Tyrosinase, etc.; Isomerasen, wie Glucoseisomerase, Mannoseisomerase, etc.; und Ligasen, wie Glutathionsynthetase, NAD-Synthetase, etc.

Die genannten Enzyme können nach dem Insolubilisierungsverfahren mit Tannin oder einem multifunktionellen Vernetzungsmittel oder nach der Adsorptionsbehandlung an einen unlöslichen Träger verwendet werden.

Zur Insolubilisierung eines Enzyms mit Tannin wird das Enzym zu einer Lösung, die das Tannin in einer Menge der ein- bis zehnfachen (G/G) Menge des Enzymes enthält, zugegeben und unter Rühren bei pH 5 oder darunter, vorzugsweise bei pH 3 bis 8, umgesetzt; der gebildete Niederschlag wird unter Anwendung üblicher Trennmethoden, wie z. B. Zentrifugation oder Filtration, unter Erhalt des insolubilisierten Enzyms abgetrennt.

Als Tannin können Gerbsäure, Pyrogalloltannin, wie Galläpfel-Tannin oder chinesisches Gallotannin, und Catecholtannin, wie Gerbsäure enthaltene Substanzen (Catechol-Polymer), die aus Tee, Kakao und dergleichen extrahiert sind, verwendet werden. Das gemäß der Erfindung verwendete Tannin muß vorher keiner speziellen Reinigung (Raffination) unterzogen werden, vorausgesetzt, daß es die gerbende Wirkung besitzt; z. B. kann im Handel erhältliches Persimon-Tannin verwendet werden. Außerdem können die genannten Tanninsubstanzen entweder allein oder im Gemisch von zwei oder mehreren verwendet werden.

Zum Insolubilisieren eines Enzyms mit einem multifunktionellen Vernetzungsagens wird das Enzym zu der wäßrigen Lösung, die 1 bis 20% (G/V) eines multifunktionellen Vernetzungsagens enthält, zugegeben und 10 Minuten bis 16 h bei 5 bis 40°C umgesetzt; der gebildete Niederschlag wird unter Verwendung üblicher Trennverfahren, wie Zentrifugation, Filtration, etc., unter Erhalt eines insolubilisierten Enzyms abgetrennt.

Als multifunktionelle Vernetzungsagenzien eignen sich gemäß der Erfindung Polyaldehyde, Isocyanate und dergleichen. Typische Beispiele sind Dialdehyd-Stärke- Glyoxal, Malonaldehyd, Bernsteinsäurealdehyd, Glutaraldehyd, Pimelindialdehyd, Hexamethylenisocyanat, p- Toluylendiisocyanat und dergleichen. Am meisten bevorzugt ist Glutaraldehyd.

Zur Adsorptionsbehandlung des Enzyms auf einem unlöslichen Träger stehen die folgenden Methoden zur Verfügung: ein unlöslicher Träger, z. B. übliche Adsorbenzien, wie Aktivkohle, Silicagel, saurer Ton, poröses Glas, etc., oder Ionenaustauscher, wie DEAE-Sephadex, CM-Sphadex, DEAE-Cellulose, CM-Cellulose, Amberlite IR-45, Dowex-50, etc., wird in eine Säule gefüllt; eine wäßrige Lösung des genannten Enzyms wird dann durch die Säule geleitet; oder der unlösliche Träger wird mit der Enzymlösung vermischt und das Gemisch gerührt, wobei das Enzym an den genannten Träger adsorbiert; das genannte Gemisch wird im weiteren - sofern dies erforderlich ist - einem Trennverfahren unterworfen, wie Zentrifugation oder Filtration, um den flüssigen Teil abzutrennen, wobei das an den unlöslichen Träger adsorbierte Enzym zurückbleibt. Sofern dies erforderlich ist, kann dem unlöslichen Träger mit dem adsorbierten Enzym nochmals das genannte multifunktionelle Vernetzungsmittel zugegeben werden, so daß eine weitere Umsetzung erfolgt.

Der genannte Mikroorganismus, das Enzym, das mit Tannin oder einem multifunktionellen Vernetzungsagens insolubilisierte Enzym oder das an einen unlöslichen Träger adsorbierte Enzym können als solche oder nach Suspendieren derselben in Wasser, einer Pufferlösung oder einem hydrophilen organischen Lösungsmittel verwendet werden.

Als Pufferlösung können bei dem vorstehend genannten Verfahren z. B. verwendet werden: Acetat-Pufferlösung, McIlvaine-Pufferlösung, Phosphat-Pufferlösung, Tris- Pufferlösung, Veronal-Pufferlösung und dergleichen. Als hydrophile organische Lösungsmittel können bei der genannten Behandlung Methylalkohol, Ethylalkohol, Propylalkohol, Aceton und dergleichen verwendet werden. Die Konzentration des in wäßriger Lösung verwendeten organischen Lösungsmittels beträgt bei der genannten Behandlung gewöhnlich ca. 10 bis 20% (G/V).

Daraufhin wird der genannte Mikroorganismus, das Enzym, das mit Tannin oder einem multifunktionellen Vernetzungsmittel insolubilisierte Enzym oder das an einen unlöslichen Träger adsorbierte Enzym, oder eine Suspension derselben in Wasser, einer Pufferlösung oder einem hydrophilen organischen Lösungsmittel mit einem Alginat oder einer wäßrigen Lösung desselben und Silicasol, das als Einfangsmaterial verwendet wird, vermischt, wobei ein flüssiges Gemisch mit einem pH von 3 bis 10, vorzugsweise 6 bis 8, erhalten wird. Bei der Herstellung des genannten flüssigen Gemisches kann der Mikroorganismus oder das Enzym, die gegebenenfalls wie vorstehend beschrieben behandelt worden sind, zunächst zu einem Alginat oder einer wäßrigen Lösung desselben zugegeben werden, worauf sich die Zugabe von Silicasol und ein Vermischen der Materialien anschließt; oder der genannte Mikroorganismus oder das Enzym können zunächst zu Silicasol zugegeben werden, woran sich die Zugabe von Alginat oder einer wäßrigen Lösung desselben anschließt; oder er bzw. es können zu einem Alginat oder einer wäßrigen Lösung desselben und Silicasol gleichzeitig zugegeben werden, worauf das Ganze vermischt wird.

Die Zugabe eines Alginates oder einer wäßrigen Lösung desselben und Silicasol erfolgt vorzugsweise in einer Weise, daß die Endkonzentration an Alginat in dem Gemisch 0,5 bis 3,5% (G/V) und die Endkonzentration an SiO₂, die aus dem Silicasol herrührt, 0,5 bis 35% (G/V) beträgt.

Beispiele von Alginaten, die als Einfangmaterial gemäß der Erfidung geeignet sind, umfassen Natriumalginat, Kaliumalginat, Ammoniumalginat und dergleichen. Die Charakteristik des Silicasols ist folgende: Der Teilchendurchmesser des Silicakolloids beträgt 1 nm bis 100 nm, Lösungsmittel ist Wasser, der pH liegt im Bereich von 2 bis 11; es kann z. B. ein Produkt verwendet werden, das durch Zugabe einer Mineralsäure, wie Salzsäure, Salpetersäure, Schwefelsäure, etc., zu einer wäßrigen Lösung eines Alkalisilicats, wie Natriumsilikat, und anschließendem Entsalzen der Lösung durch Dialyse und Einstellen des pH-Wertes, erhalten wird; oder es kann ein Produkt verwendet werden, das erhalten wird durch Leiten einer wäßrigen Alkalisilicatlösung durch ein Ionenaustauschharz zum Austausch des Kations in der Lösung. Bevorzugte Beispiele derartiger Silicasole sind z. B. Snowtex-20, Snowtex-30 und Snowtex-40 (sämtliche stellen Produkte der Nissan Chemical Co., Ltd., dar, deren SiO₂-Gehalt auf 20 bis 40% eingestellt ist).

Dann wird das vorstehend genannte Gemisch mit einem pH von 3 bis 10 tropfenweise einem Gelierungsmittel in Form einer wäßrigen Lösung unter Rühren und unter Verwendung einer Düse mit einer kleinen Öffnung (z. B. einer spritzenähnlichen Injektionsvorrichtung), einer porösen Platte oder einem anderen geeigneten Mittel zugegeben; oder das genannte Gemisch wird als atomatisierte Teilchen auf das Gelierungsmittel gesprüht und mit diesem in Kontakt gebracht, wobei eine Atomisiervorrichtung verwendet wird, vorzugsweise eine Druckatomisiervorrichtung, um einen immobilisierten Mikroorganismus oder ein entsprechendes Enzym zu erhalten.

Als Gelierungsmittel können z. B. verwendet werden: Calciumchlorid, Aluminiumchlorid, Calciumacetat, Aluminiumsulfat und dergleichen, in Form einer üblicherweise ca. 1 bis 10%igen (G/V) wäßrigen Lösung.

Für den Fall, daß das Gemisch tropfenweise zu dem flüssigen Gelierungsmittel, wie vorstehend aufgeführt, unter Rühren zugegeben wird, weist das erhaltene immobilisierte Gel des Mikroorganismus oder Enzyms eine durchschnittliche Teilchengröße von 1 bis 5 mm auf; im Falle, daß das Gemisch atomisiert und in Kontakt mit dem Gelierungsmittel gebracht wird, kann ein fixiertes Gel erhalten werden, das eine im wesentlichen gleichförmige Teilchengröße aufweist, wobei die durchschnittliche Teilchengrösse 800 bis 900 Mikron nicht übersteigt. Je einheitlicher und kleiner die Teilchengröße ist, umso effizienter ist die Umsetzung mit dem Substrat.

Der immobilisierte Mikroorganismus oder das entsprechende Enzym, die gemäß der Erfindung erhalten worden sind, weisen eine hohe mechanische Festigkeit auf, neigen nicht ohne weiteres zur Quellung, was auf die Dual-Gelmatrixstruktur zurückzuführen ist; außerdem ist ihre Enzymaktivität nach der Behandlung nur in einem äußerst geringen Maße reduziert.

Die vorliegende Erfindung wird nun anhand von besonderen Ausführungsformen näher erläutert, die jedoch die Erfindung nicht beschränken sollen.

Beispiel 1

200 ml eines Nährmediums (pH 5,0), welches 2% (G/V) Glucose, 1% (G/V) Pepton und 1% (G/V) Hefeextrakt enthielt, wurde in einen 1 l Kolben gegeben und - nach Sterilisation in der üblichen Art und Weise - mit Saccharomyces cerevisiae IFO 0224 inokuliert; das Gemisch wurde dann 48 h bei 30°C kultiviert. 20 ml der erhaltenen Kulturlösung (10⁹ Zellen/ml) wurden zu einer Lösung, bestehend aus 100 ml Snowtex-40 und auf pH 7,0 durch Zugabe einer wäßrigen Salzsäurelösung eingestellt, und 100 ml einer 3%igen (G/V) wäßrigen Natriumalginat- Lösung zugegeben und daraufhin vermischt (pH des Gemisches: 7,0; SiO₂-Konzentration: 18% (G/V); Natriumalginat-Konzentration: 1,36% (G/V)). Das Gemisch wurde tropfenweise zu einer 5%igen (G/V) Lösung von Calciumchlorid unter Rühren und unter Verwendung einer Spritze (Durchmesser der Öffnung: 2mm; innerer Durchmesser: 20 mm) zugegeben, wobei eine globuläre immobilisierte Hefe erhalten wurde (im folgenden wird diese als immobilisierte Hefe von Beispiel 1 bezeichnet).

Als Kontrolle wurden 20 ml der genannten Hefekulturlösung (10⁹ Zellen/ml) zu 200 ml einer 1,5%igen (G/V) wäßrigen Natriumalignatlösung (pH des Gemisches: 7,0; Natriumalginatkonzentration: 1,36% (G/V)) zugegeben und vermischt, und das Gemisch wurde tropfenweise in eine 5%ige (G/V) Calciumchloridlösung unter Verwendung der gleichen Spritze, wie sie vorstehend beschrieben ist, gegeben, wobei eine als Kontrolle dienende globuläre immobilisierte Hefe erhalten wurde.

Die Alkoholproduktivität wurde bestimmt, indem 65 g der genannten immobilisierten Hefe in eine mit einem Mantel versehene Säule (Innendurchmesser: 3 cm; Höhe: 15 cm) gegeben und diese auf 30°C gehalten wurde, dann ein flüssiges Medium (pH 3,3), welches 10% (G/V) Glucose, 0,1% (G/V) Hefeextrakt und 0,2% (G/V) Ammoniumsulfat enthielt, 20 Tage kontinuierlich bei Anwendung der absteigenden Methode (SV = 0,15) zur Alkoholfermentation durch die Säule geleitet wurde; die Alkoholkonzentration der Fermentationslösung wurde gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengestellt.

Tabelle 1

Wie aus Tabelle 1 ersichtlich ist, ist die Alkoholfermentierung der immobilisierten Hefe von Beispiel 1 ausgezeichnet im Vergleich mit der Kontrollprobe, ungeachtet der Langzeit-Retention. Außerdem zeigte das Gel der immobilisierten Hefe von Beispiel 1 nur einen geringen Quellungsgrad, wobei der Ausdehnungskoeffizient des Gels im Verlauf der Fermentierung nur 130% im Vergleich zu 185% der Kontrolle betrug.

Beispiel 2

100 ml einer Lösung, die erhalten wird durch Auflösen von Urease (Typ IX) in einer 0,05 M Phosphat-Pufferlösung, wurden zu einer Lösung aus 100 ml einer 2%igen (G/V) wäßrigen Natriumalginatlösung und 100 ml eines Silicasols (Snowtex- 30) gegeben, eingestellt auf pH 8,0 durch Zugabe wäßriger Slazsäurelösung, und vermischt (pH des Gemisches: 8,0; SiO₂- Konzentration: 14,3% (G/V); Natriumalginatkonzentration: 0,95% (G/V); das erhaltene Gemisch wurde unter Druck auf eine 5%ige (G/V) Calciumchloridlösung von Wagner Handy Painter W-170 (Zwei-fluid-Typ; Durchmesser der Düsenöffnung: 0,7 mm) unter einem Sprühdruck von 120 kg/cm² G aufgesprüht, wobei eine immobilisierte Urease erhalten wurde (durchschnittlicher Teilchendurchmesser: 350 Mikron).

Beispiel 3

10 g Leucinaminopeptidase-Präparation, die aus einer Kleiekultur von Aspergillus oryzae FERM P-1149 durch Ammoniumsulfat-Fraktionierung und weitere Reinigung der Fraktion mit DEAE-Cellulose erhalten wurde, wurden in 0,05 M Tris-Pufferlösung (pH 7,0) aufgelöst; die erhaltene Lösung wurde mit einer Lösung aus 20 g Gerbsäure in 200 ml 0,05 M Tris-Pufferlösung (pH 7,0) vermischt und in üblicherweise zentrifugiert, wobei das insolubilisierte Enzym erhalten wurde. Zu diesem insolubilisierten Enzym wurden 20 ml 0,05 M Tris-Pufferlösung (pH 7,0) zur Herstellung einer das insolubilisierte Enzym enthaltenden Flüssigkeit zugegeben.

Die genannte, das insolubilisierte Enzym enthaltende Flüssigkeit wurde zu einer Lösung aus 100 ml einer 4%igen (G/V) wäßrigen Natriumalginatlösung und 80 ml Silicasol (Snowtex-20 von Nissan Chemical Co., Ltd.), eingestellt auf pH 6,0 durch Zugabe von wäßriger Salzsäurelösung, zugegeben und vermischt (pH des Gemisches: 6,0; SiO₂-Konzentration: 8,0% (G/V); Natriumalginat- Konzentration: 2,0% (G/V)); das erhaltene Gemisch wurde tropfenweise in eine 5%ige (G/V) Calciumchloridlösung unter Rühren und unter Verwendung der gleichen Spritze, wie sie in Beispiel 1 verwendet wurde, zugegeben, wobei ein globuläres immobilisiertes Enzym erhalten wurde (Leucinaminopeptidase-Aktivität: 25.000 Einheiten/Gel (0,8 g)).

Die Enzymaktivität der Leucinaminopeptidase wurde nach dem Verfahren von Nakadai (Tadanobu Nakadai: Nippon Shoyu Kenkyujo Zasshi, 3, 99 (1977)) unter Verwendung von Leucin-p-nitroanilid als Substrat bestimmt.

Beispiel 4

800 ml eines flüssigen Mediums (pH 7,2), welches 12% (G/V) Natriumchlorid, 3% (G/V) Glucose, 1% (G/V) Fleischextrakt, 1% (G/V) Hefeextrakt, 0,1% (G/V) Natriumthioglykolat und 0,58% (G/V) Essigsäure enthielt, wurde in einen 1 l Kolben gegeben und - nach Sterilisierung in üblicher Weise - mit Pediococcus halophilus FERM P-6420 inokuliert; das Medium wurde dann 24 h bei 30°C kultiviert. Die erhaltene Kulturlösung wurde in üblicher Weise zentrifugiert und 20-fach konzentriert. 10 ml dieser konzentrierten Lösung (2×10¹⁰ Zellen/ ml) wurden zu einer Lösung bestehend aus 100 ml einer 3%igen (G/V) wäßrigen Natriumalginatlösung und 50 ml Silicasol (Snowtex-40), eingestellt auf pH 7,0 durch Zugabe wäßriger Salzsäurelösung, gegeben und vermischt (pH des Gemisches: 7,0; SiO₂-Konzentration: 12,5% (G/V); Natriumalginat- Konzentration: 1,9% (G/V)); das erhaltene Gemisch wurde tropfenweise in eine 5%ige (G/V) Calciumchloridlösung unter Rühren und unter Verwendung der gleichen Spritze, wie sie in Beispiel 1 verwendet wurde, zugegeben, wobei gluboläre immobilisierte Milchsäurebakterien erhalten wurden.

70 g der genannten immobilisierten Milchsäurebakterien wurden in eine mit einem Mantel versehene Säule gefüllt (Innendurchmesser: 3 cm; Höhe: 15 cm), die auf 30°C gehalten wurde; ein flüssiges Medium (pH 7,2), welches 1% (G/V) Fleischextrakt, 1% (G/V) Polypepton, 1% (G/V) Hefeextrakt, 1% (G/V) Glucose, 0,1% (G/V) Natriumthioglykolat und 15% (G/V) Kochsalz enthielt, wurde insgesamt 30 Tage lang über die genannte Säule geleitet, wobei man sich der absteigenden Methode (SV = 0,1) zur Milchsäurefermentierung bediente. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengestellt.

Tabelle 2

Wie aus Tabelle 2 zu ersehen, weisen die immobilisierten Milchsäurebakterien, die in Beispiel 4 erhalten worden sind, eine ausgezeichnete Milchsäure-Fermentierung auf, ungeachtet der Langzeit-Retention.

Claims (13)

1. Verfahren zur Herstellung eines immobilisierten Mikroorganismus oder Enzyms, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Ausgangsmikroorganismus oder -enzym mit einem Alginat und Silicasol in Gegenwart von Wasser unter Erhalt eines flüssigen Gemisches mit einem pH-Wert von 3 bis 10 vermischt, und das Gemisch mit einem Gelierungsmittel in Form einer wäßrigen Lösung in Kontakt bringt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Ausgangsmikroorganismus ein Bakterium, Hefe oder einen Schimmelpilz darstellt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym ein Enzym darstellt, das mit Tannin oder einem multifunktionellen Vernetzungsagens insolubilisiert oder an einem unlöslichen Träger adsorbiert wurde, oder eine Suspension desselben in Wasser, einer Pufferlösung oder einem hydrophilen organischen Lösungsmittel.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Tannin Gerbsäure oder Pyrogalloltannin verwendet wird.

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß als multifunktionelles Vernetzungsagens ein Polyaldehyd oder ein Isocyanat verwendet wird.

6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der unlösliche Träger Aktivkohle, Silicagel, sauren Ton, poröses Glas oder einen Ionenaustauscher darstellt.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Alginat Natriumalginat, Kaliumalginat oder Ammoniumalginat verwendet wird.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Alginatkonzentration in dem flüssigen Gemisch 0,5 bis 3,5% (G/V) beträgt.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die von dem Silicalsol herrührende SiO₂-Konzentration in dem flüssigen Gemisch 0,5 bis 35% (G/V) beträgt.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Gelierungsmittel Calciumchlorid, Aluminiumchlorid, Calciumacetat oder Aluminiumsulfat verwendet wird.

11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Kontakt des flüssigen Gemisches mit dem Gelierungsmittel durch tropfenweise Zugabe des flüssigen Gemisches in das Gelierungsmittel unter Rühren oder durch Sprühen des Gemisches auf das Gelierungsmittel erfolgt.

12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Silicasol einen Teilchendurchmesser des Silicacolloids von 1 nm bis 100 nm aufweist, das Lösungsmittel Wasser darstellt, und der pH im Bereich von 2 bis 11 liegt.

13. Immobilisierte Mikroorganismen oder Enzyme, dadurch gekennzeichnet, daß sie nach dem Verfahren von Anspruch 1 erhalten werden.