DE2929872C2

DE2929872C2 - Verfahren zur Herstellung von hydrophilen, gelförmig oder geschäumten Biokatalysatoren mit hoher Beladung an enzymatisch aktiver Substanz

Info

Publication number: DE2929872C2
Application number: DE2929872A
Authority: DE
Inventors: Joachim Prof. Dr. Klein; Michael Dipl.-Chem. Kluge; Fritz Prof. Dr. 3300 Braunschweig Wagner
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1979-07-24
Filing date: 1979-07-24
Publication date: 1985-10-31
Also published as: DE2929872A1

Description

2. Verfahren zur Herstellung von hydrophilen, geschäumten Biokataiysatoren mit hoher Beladung an enzymatisch aktiver Substanz durch Polymereinschluß ganzer Zellen oder von Zellfragmenten unter Verwendung von flüssigem, hydrophilem Polyisocyanat, unter Abänderung des Verfahrens nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch folgende Verfahrensstufen:

1) Mischen einer wäßrigen Suspension ganzer Zellen oder Zellfragmenten mit einem Feststoffgehalt bis 30 Gew.-% mit flüssigem Polyisocyanat mit einem NOC-Gehalt von 7 bis lC/Gew.-°/o im Mischungsverhältnis wäßrige Phase : flüssiges Polyisocyanat von 0,3 :1 bis 7:1 (g/g),

2a) Eingießen des noch flüssigen Reaktionsgemisches in ein Reaktionsgefäß und Reaktion zur Bildung eines enzymatisch aktiven, hydrophilen Polyurethan-Netzwerkes in Blockform mit physikalischem Einschluß der gai: :en Zellen oder Zellfragmenten bei einer Reaktionstemperatur zwischen 0° C und 50⁰C, oder

2b) Eingießen des noch flüssigen Reaktionsgemisches in dünnflüssiges Paraffin und Reaktion zur Bildung eines aktiven hydrophilen Polyurethan-Netzwerkes als perlförmige Teilchen mit physikalischem Einschluß der ganzen Zeilen c ler Zellfragmenten bei einer Reaktionstemperatur zwischen 0° C und 50° C,

3) Waschen der Biokatalysatormasse mit Wasser oder physiologischer Salzlösung oder Neutrafisalion mil verdünnter, alkalischer Lösung zur Entfernung anhaftender COj-Mcngcn,

4) Abtrennen der Waschlösung und Ausführen des feuchten Biokatalysators.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe 2b die Einstellung eWs bestimmten Kornbereiches zwischen 0,1 bis 5 mm in Abhängigkeit von der Rührgeschwindigkeit und der Viskosität des dünnflüssigen Paraffins erfolgt.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß zur Einstellung der Dichte der Net/.werkstruktur des geschäumten Biokatalysators bis 0,4 kg/l ein Überdruck bis 300 kPa angewendet wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe 1) Kieselgel oder termisch erzeugtes S1O2 mit niedrigem Schüttgewicht in Mengen bis 30 Gew.-%, bezogen auf die Polyisocy-

anat-Komponente, zugesetzt wird. |

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe 1) festes NaCI in Mengen bis 80 Gew.-%. bezogen auf die Polyisocyanat-Komponente, zugesetzt wird.

Aufgabe der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung gelförmiger oder geschäumter Biokatalysatoren mit i

hoher Beladung an enzymatisch aktiver Substanz. |

jj 55 Der physikalische Einschluß von enzymatisch aktiver Substanz in polymere Netzwerke ist für verschiedene |

Polymere beschrieben.

Die vernetzende Copolymerisation von Vinylmonomeren, wie Acrylamid und N.N-Me;hylenbisacrylamid. führt nur zu Biokataiysatoren mit geringer enzymatischer Konzentration.

Ca-Alginate stellen kein kovalentes Netzwerk dar und lösen sich in Gegenwart von Phosphationen wieder auf. Der Einschluß in Epoxide gelingt nur durch einen mehrstufigen Prozeß. Während der langen Reaktionszeit von etwa 24 Stunden steht die enzymatisch aktive Substanz in Kontakt mit dem Epoxidhärter.

Es besteht Bedarf an Polymernetzwerken, die zum physikalischen Einschluß enzymatisch aktiver Substanz, geeignet sind und möglichst rasch und einfach zu einem Biokatalysator verarbeitet werden können. Polyurethane stellen eine für diese Aufgabe besonders geeignete Stoffklasse dar. Diese wurde bisher jedoch nur zum Einschluß von Enzymen benutzt. Die Fixierung ganzer Mikroorganismen ist noch nicht bekannt.

Sofern Polyurethan über Diisocyanate hergestellt wird, ist dieses nicht zur Fixierung von Enzymen geeignet, weil keine ausreichende Festigkeit besteht. Polyisocyanate bilden zwar ein festes Polymernetzwerk, aber diese sind nicht zur Fixierung von wäßriger, enzymatisch aktiver Substanz geeignet, solange diese nicht zugleich mit

einem hohen NCO-Gehalt hydrophile Eigenschaften aufweisen. Dieser notwendige, technische Effekt wurde erstmalig für das Verfahren der Erfindung verwendet, um die Aufgabe der Erfindung zu lösen, welches den Polymereinschluß ganzer Zellen und von Zellfragmenten betrifft

Die Offenlegungsschrift 23 65 854 betrifft einen Biokntalysator in Form eines enzymhaltigen Polyurethans. Dieser Biokatalysator ist durch eine bestimmte Struktur gekennzeichnet mit endständigen Isocyanaigruppen. Dieser Biokatalysator beruht offen-^;chtUch auf der Umsetzung von einer oder mehreren Aminogruppen des Enzyms mit einer oder mehreren Isocyanatresten des Polyurethanpolymers.

Es liegt alto eine Bindung des Enzyms und kein nur physikalischer Einschluß gemäß dem Verfahren der Erfindung vor, der dadurch einen weiteren Freiheitsgrad ergibt.

In dieser Druckschrift ist auch kein definiertes, weites Mischungsverhältnis der wäßrigen Phase zum flüssigen Polyijocyanat beschrieben, sondern nur das Verhältnis 1 :1.

Dagegen beansprucht das Verfahren der Erfindung ein weites Verhältnis dieser Phasen, welches zum Einschluß von ganzen Zellen und von Zellfragmenten notwendig ist Dies gilt besonders deshalb, um eine gleichmäßge Verteilung der Phasen rasch zu bewirken.

Das Verfahren dieser Druckschrift arbeitet bei Raumtemperatur. Bei Einschluß ganzer Zellen und von t5 Zellfragmenten kommt es jedoch darauf an, die Reaktionszeit durch Anwendung höherer Temperatur abzukürzen, wenn ein geschäumter Biokatalysator hergestellt wird

Die Offenlegungsschrift 24 10 693 betrifft monomere Isocyanate. Diese haben den Nachteil, daß mit diesen in dem Biokatalysator die enzymatisch aktive Lebensfähigkeit stark herabgesetzt wird. Nach diesc^ Arbeitsweise tritt eine kovalenie Bindung des Enzyms an das Netzwerk des Bickatalysators ein und gerade kein physikaüscher Einschluß gemäß dem Verfahren der E-Jindung.

Dieses bekannte Verfahren führt auch zu einer Bindung des Enzyms an andere Zellen. Es wird die Bindung von Glucoseamylase an Zellen eines Schimmelpilzes genannt

Diese Arbeitsweise geht für den Einsatz von ganzen Zellen einen völlig anderen Weg. Die Zellen werden durch Hitzebehandlung bei 50° bis 100° C in ihrer enzymatischen Aktivität zerstört

Es heißt auch, daß durch diese Behandlung oder durch Anwendung von Säure oder Alkali die autolytische Aktivität der Zellen zerstört wird.

Dagegen enthalten die nach dem Verfahren der Erfindung in Biokatalysatoren eingeschlossene (janze Zellen oder Zellfragmente solche mit enzymatisch aktiver Substanz.

Dieser andere Weg dieser Druckschrift zum Einschluß von Zellen resultiert daher, daß diese nicht als Biokatalysator, sondern für eine andere Aufgabe dienen. Diese andere Aufgabe betrifft die Verwendung der eingeschlossenen Zellen als Matrix zur Bindung von Enzymen ohne eigene Aktivität.

Der Stand der Technik nach diesen beiden Offenlegungsschriften lehrt also die kovalente Bindung von Enzymen, die zu einem chemisch modifizierten Enzym führt.

Nach diesem Stand der Technik sind also Enzyme über NCO-Gruppen an die Matrix gebunden und nicht, wie nach dem Verfahren der Erfindung, nur physikalisch eingeschlossen. Die Offenlegungsschrift 26 25 544 geht ebenfalls einen anderen Weg. Diese Druckschrift beschreibt die Immobilisierung von Proteinen, Coenzymen, Enzymen, zusammen mit einem Coenzym für das Enzym. Dieses biologische Material wird in flüssiges Polyurethanpol >iners mit endständigen Isocyanatgruppen eingearbeitet In der Stufe B soll das Gemisch mit einem Härtungsmittel umgesetzt werden. Wesentlich ist. daß die M';chung vor dem Härten zu einem Film geformt wird. Die Härtung wird im dampfförmigem Zustand durchgeführt, wozu inerte Gas verwendet werden. Das erzeugte Produkt stellt keinen Biokatalysator mit biologischer Aktivität dar. Dieser soll vielmehr für die Hemmung oder Verhinderung der bakteriellen Zersetzung eines, einer enzymatischen Reaktion unterliegenden, Materials dienen. Sofern NCO-Gehalte aus den Offenlegungsschriften 23 65 854 und 26 25 544 abzuleiten S/nd, ergibt sie';, daraus kein technischer Lffekt im Sinne der Lehre des Verfahrens der Erfindung.

Die amerikanische Patentschrift 40 71 409 verwendet anorganische Zusatzmittel als Trägersubstanz, um über Kopplung mit Diisocyanat das Enzym an die anorganische Matrix zu binden.

Sofern das Verfahren der Erfindung feinteilige Füllstoffe, wie Kieselgel, verwendet, dienen diese dem technischen Zweck der Erhöhung der Porosität und der Permeabilität und damit einer anderen Verwendung. Sofern die Offenlegungsschrift 26 25 544 die Gelform erzeugt, so besteht diese aus einem Film. Diese dient der Herstellung einet, pharmazeutiscnen Produktes, welches auf einem anderen Weg Proteine immobilisiert zur Bindung an Enzyme.

Dagegen erzeugt das Verfahren der Erfindung die Gelform zur Herstellung von Biokatalysatoren. Die Gelform stellt also nach dem Verfahren der Erfindung eine andere Aufgabe mit einem anderen Lösungs'A-eg dar.

Die Lösung der Aufgabe der Erfindung ist in den Patentansprüchen 1 und 2 definiert. Die Maßnahmen der Unteransprüche stellen die bevorzugte Ausgestaltung dieses Lösungsweges dar.

Sofern in Stufe 2b des Verfahrens der Erfindung dünnflüssiges Paraffin verwendet wird, hat dieses vorzugsweise eine Viskosität von 0.02 Pa · s/25°C. Das in Stufe 2b abgetrennte Pt. affin kann, gegebenenfalls nach Ergänzung der Menge, in das Verfahren der Erfindung zurückgeführt wjrden.

Das Verfahren der Erfindung verwendet hydrophile Polyurethane zum physikalischen Einschluß enzymatisch aktiver Substanzen. Als Ausgangsstoffe werden hydrophile Polyisocyanate mit definiertem NCO-Gehalt eingesetzt, die als mehrfunktiorielle Prepolymere zum Aufbau des Polymernetzwerkes führen.

Die hydrophilen Eigenschaften gestatten ein Mischen des flüssigen Polyisocyanates mit einer wäßrigen Suspension der erczvmatisch aktiven Substanzen. Gegenüber diesem überraschenden technischen Effekt bestand offenbar ein erhebliches Vorurteil der Technik.

Handelsprodukte sind beispielsweise folgende:

Polyisocyanat NCO-Gcha!t

I Hypol FHP 2000 7-10 Gew.-%

II Hypol FHP3000 7-10Gew.-%

III FRL 2297 9,9Gew.-%

IV FRL 2235 3,6

III und IVsind»DesmodurT80-Typen« mit unterschiedlichem NCO-Gehalt.

Das Verfahren gemäß der Erfindung lehrt mit den Verfahrensstufen des kennzeichnenden Teiles der Ansprüche 1 und 2, Polyurethan-Netzwerke mit physikalischem Einschluß ganzer Zellen oder von Zellfragmenten in Blockform oder in Perlform als Biokatalysatoren zu erzeugen.

Die Reaktion zum Polyurethan verläuft unter so milden Bedingungen, daß die Fixierung vermehrungsfähiger ganzer Zellen überraschend möglich ist. Da das Überleben ganzer Zellen nach dem Verfahren der Erfindung gegeben ist, kann dieses insbesondere auch für Reaktionen eingesetzt werden, die unter gleichzeitiger Beteiligung mehrerer Enzyme aus lebensfähigen Mikroorganismen erfolgt.

Es wurde auch gefunden, daß zur Lösung der Aufgabe der Erfindung der Feststoffgehalt auf bis zu 30 Gew.-% begrenzt werden muß. Bei einem höheren Gehalt wird die Reaktion zum Polyurethan beeinträchtigt und dadurch die mechanische Stabilität verschlechtert.

Das Verfahren der Erfindung gestattet unterschiedliche Typen der Biokatalysatoren herzustellen.

Die Polyisocyanate I bis III mit hohem NCO-Gehalt bilden Polyurethanschaumstoffe. Das Polyurethan IV mit §!

geringerem NCO-Gehalt bildet Polyurethangel. W

Für die Typen I bis III kann das Mischungsverhältnis wäßrige Phase : flüssiges Polyisocyanat in einem weiten ||

Bereich variiert werden. Durch die Variation dieses Parameters kann die Dichte des Polyurethans und die ***'

Porosität der Schaumstoffe eingestellt werden.

Die A b b. 1 und 2 zeigen für 2 Typen von Polyurethan die Dichte in Abhängigkeit von diesem Mischungsverhältnis.
Durch den Mischungsvorgang nach Stufe 1 des Verfahrens der Erfindung wird die Reaktion gestartet. Für den

Ablauf der Reaktion ist keine Veränderung der Temperatur oder des pH-Wertes notwendig. Die Reaktion läuft |

bei pH 7 ab. Der erzeugte gelförmige oder geschäumte Biokatalysator ist im NCO-Gehalt definiert. Der |

NCO-Gehalt ist: i

χ 100 = NC.O-Gehalt

g hOlyisocyanat -------- ^

Dieser ist ausgedrückt in Gew.-°/o. Der NCO-Gehalt kann durch Darstellung eines Polyisocyanates oder durch Mischen von zwei Polyisocyanaten ,-nit höherem und mit niedrigerem NCO-Gehalt eingestellt werden. Nach dem Stand der Technik können bei hydrophoben Polyurethanen nur 0,03 bis 0,05 g H₂O je g Prepolymer verarbeitet werden, im äquivalenten Verhältnis. Dagegen wird nach dem Verfahren der Erfindung kein stöchiometrisches Verhältnis beim Einsatz von hydrophilen Polyisocyanaten in Stufe 1 notwendig. Es können vielmehr hydrophile Polyisocyanate innerhalb eines weiten Bereiches von 03 bis 7 g H2O pro g Polyisocyanat mit beliebiger Menge Wasser reagieren. Es werden nur etwa bis 10% der Wassermenge zur Deckung des stöchiometrischen Bedarfes benötigt Die übrige Menge bleibt im Biokatalysator enthalten. Es entsteht also kein Überschuß an Wasser, der aus dem Verfahren ausgeführt werden muß.

Dieser technische Effekt der Auswahl eines weiten Bereiches an Wasser je g Polyisocyanat in Stufe 1 des Verfahrens der Erfindung stellt einen erheblichen, technischen Vorteil gegenüber dem Stand der Technik dar. Die Reaktion nach dem Verfahren der Erfindung findet in den Stufen 2a oder 2b statt.

Das Verfahren der Erfindung gestattet unterschiedliche Typen herzustellen. Dies sind gelförmige oder geschäumte Biokatalysatoren und zwar jeweils in Blockform oder als perlförmiges Teilchen. Die Polyisocyanate I bis III bilden Polyurethanschaumsloffe und das Polyisocyanat IV mit geringerem NCO-Gehalt bildet Polyurethangel.

Bei der Reaktion in Stufe 2a und 2b wird zur Erzeugung gelförmiger Biokatalysatoren bei einer Reaktionstemperatur unter 10° C gearbeitet

Bei der Reaktion in Stufe 2a und 2b wird zur Erzeugung geschäumter Biokatalysatoren bei Temperaturen zwischen 0° und 50° C gearbeitet. Die obere Temperaturgrenze ist auch durch die thermische Belastbarkeit von Polyisocyanat gegeben.

Während der Reaktion in den Stufen 2a und 2b erwärmt sich das Reaktionsgemisch geringfügig.
Die A b b. 3 zeigt den Temperaturverlauf in 10 g Reaktionsgemisch bei zwei verschiedenen Temperaturen. Die Reaktionszeit ist kurz und beträgt nur bis 30 Minuten. Es ist dadurch ein rascher Durchsatz gegeben.

Die Dauer der Reaktionszeit ist auch von der Auswahl des Polyisocyanates und von der Temperatur abhängig. Bei den Typen I bis III des Polyisocyanates bewirkt das bei der Reaktion frei werdende CO2 das Aufschäumen des Reaktionsgemisches und führt zur Ausbildung der offenporigen Schaumstrakiur. Bei der Type IV des ι \ 65 Polyisocyanates bewirkt der niedrigere NCO-Gehalt und der höhere Wassergehalt im Reaktionsgemisch bei Reaktionstemperaturen unter 10°C die Absorption des CO2. Der Biokatalysator kann als Block in bestimmter Form und Größe erzeugt werden durch die Vorgabe des Reaktionsgefäßes.

Die Erzeugung der Perlform erfolgt durch Eingießen in dünnflüssiges Paraffin in der Stufe 2b. Durch die

Auswahl der Viskosität des Paraffins und durch die unterschiedliche Rührgeschwindigkeit kann die Korngrößenverteilung gesteuert werden*

Das Verfahren der Erfindung wird alternativ auf einen Korngrößenbereich von 0,1 bis 5 mm eingestellt.

Untersuchungen der Schaumstoffe aus Polyurethan im Lichtmikroskop und im Rasterelektronenmikroskop lassen die offenzeilige Struktur erkennen. Die zahlreichen makroskopischen Hohlräume sind miteinander verbunden.

Dt* jjerlförmigc Biokütalysator zeigt in seinem Inneren die Schaumstoffstruktur..Dieser weist außen eine fast vollständig geschlossene Oberfläche auf. Das Verfahren der Erfindung wird alternativ in der Dichte der Netzwerkstruktur des geschitumten Biokatalysators durch Überdruck bis 300 kPa während der Reaktion auf 0,15 bis 0,4 kg/l eingestellt.

A b b. 4 zeigt die Dichte von Polyurethan in Abhängigkeit vom Druck während der Reaktion für die Type »Hypol FHP 3000«. Das Mischungsverhältnis beträgt 1 :1 in Stufe 1 des Verfahrens der Erfindung. Es entspricht 100 kPa dem Normaldruck. Die Fixierung des Mikroorganismus E. coli. ATCC 11 105 als ganze Zelle demonstriert Tabelle 1.

Die wäßrige Suspension der ganzen Zellen liegt in Stufe 1 als 20%ige Biofeuchtmasse vor. Spalte 1 zeigt verschiedene Handelstypen als Trägermaterial. Spalte 2 zeigt die erzeugte Form des Biokatalysators. Die Spalten 3 und 4 zeigen die Konzentration in g Biofeuchtmasse pro g Biokatalysator bzw. pro ml Biokatalysator. Die Kestaktivität ist als Verhältnis der Aktivität fixierter Mikroorganismen zur Aktivität der gleichen Menge frei suspendierter Mikroorganismen definiert Spalte 6 zeigt die Größe η kat/1 Biokatalysator als Anhaltspunkt für die Wirtschaftlichkeit des Biokatalysators.

Tabelle 1	Form	g BFM	g BFM	Restaktivität	nkat
Träger		g Katalysator	ml Katalysator	%	1 Katalysator

25

Hypol FH P 3000 Block 0,27 0.03 15 1800

Hypol FHR 3000 Block 0,50 0,08 25 9300

Hypol FHR3000 Perle 0,21 0.10 14 4300

FRL 2297 Block 0,50 0,11 7 22C0

FRL 2297 Block 0,10 0,02 48 3800

FRL 2235 Block 0,10 0,10 22 8300

FRL 2235 Perle 0,10 0,05 43 8300

Die maximale Konzentration an g Biofeuchtmasse pro g Biokatalysator beträgt für die Schaumstruktur etwa 0,5. Durch die starke Zunahme des Volumens bei der Reaktion in den Stufen 2a oder 2b des Verfahrens der Erfindung erfolgt ein Absinken der Konzentration auf etwa 0,1 g Biofeuchtmasse (BFM)/ml Biokatalysator.

Bei der Erzeugung des Polyurethans in Gelform erfolgt zwar keine Zunahme des Volumens, es ist aber eine geringere Ausgangskonzentration eingesetzt worden. Die maximale Restaktivität liegt bei 50%, und die höchste Effektivität bei etwa 15 000 η kat/1 Katalysator. Das Verfahren der Erfindung verwendet alternativ in Stufe 1 den Zusatz von löslichen oder unlöslichen mikrofeinen Zuschlagen. Es werden vorzugsweise Kieselgel oder thermisch erzeugtes S1O2 mit niedrigem Schüttgewicht bis zu 30 Gew.-% zugesetzt

Durch den Zusatz von thermisch erzeugter S1O2 kann bei Biokatalysatoren mit Schaumstruktur die mikroskopische Porosität und die Effektivität um 12% erhöht werden. Der Biokatalysator nach dem Verfahren der .Erfindung kann in der Praxis in unterschiedlichen Reaktortypen eingesetzt werden.

Dieser ist in Perlenform oder nach mechanischer Zerkleinerung für den Einsatz in Festbettreaktoren und in Rührreaktoren geeignet

Beim Einsatz als Festbett ist die Elastizität des Biokatalysators zu berücksichtigen. Bei hohem Differenzdruck wird die Schüttung des Biokatalysators komprimiert. Diese nimmt unter vermindertem Differenzdruck wieder das Ausgangsvolumen ein.

A b b. 5 zeigt den schematischen Aufbau der Meßapparatur. j

A b b. 6 zeigt den Druckverlust einer Schüttung aus perlförmigem Polyurethan mit Schaumstruktur.

A b b. 7 zeigt den Druckverlust einer Schüttung aus perlförmigem Polyurethan mit Gelstruktur.

A b b. 8 zeigt den Druckverlust an blockförmigem Polyurethan mit Schaumstruktur auf Basis der Handelstypen I: Hypol FHP 3000. II: Hypol FHR 2000. HkFRL 2297.

A b b. 9 zeigt die Meßapparatur zur Aufnahme von Kraft-Zeit-Kurven.

A bb. 10 zeigt ein Kraft-Zeit-Diagramm einer Polyurethanperle auf Basis der Handelstype FHP 3000 unter Belastung und Entlastung.

Aus den Abbildungen ergibt sich:

Die Schüttung aus perlförmigem Polyrethan in Schaumform wird durch den bei der Messung auftretenden Differenzdruck nicht komprimiert

Die in A b b. 6 gezeigte Zunahme des Fließwiderstandes mit höherer Strömungsgeschwindigkeit muß daher als Obergang vom laminaren zum turbulenten Fließen angesehen werden. Bei perlförmigen Polyurethangelen kommt es nach A b b. 7 bei geringem Differenzdruck zur Kompression der Schüttung, so daß der Einsatz vorzugsweise in gerührten Reaktionen erfolgt Polyurethanschaumstoff kann auch unzerkieinert als blockförmiger Festbettreaktor eingesetzt werden. Nach dem Entfernen der nicht porösen Deckschicht gewährleistet die offenzeilige Struktur einen Durchfluß, wie A b b. 8 zeigt In dieser Form ist der Biokatalysator für Reaktionen geeignet, bei denen Gase entstehen. Die Reißfestigkeit des Polyurethans verhindert die Zerstörung des Trägers,

und die Schaumstruktur gestattet eine Gasabsonderung an einer großen Hläche. Durch die offenzellige Struktur ist die Austragung der Gase aus dem Biokatalysator möglich.

Die Elastizität der Polyurethanschaumstoffe ist mit einer Kraftmeßapparatur nachgewiesen. Es wird dazu eine Schaumstoffperle, d = 1 mm, auf einen Kraftaufnehmer gesetzt. Ein Stempel preßt mit konstanter Vorschubgeschwindigkeii die Perle auf den Kraftaufnehmer. Die auf die Perle wirkende Kraft wird gemessen und als Kraft-Zeit-Diagramm aufgezeichnet, wie A b b. 9 zeigt.

Ein Bruch des Materials macht sich durch eine zahnartige Diskontinuität im Diagramm bemerkbar. Das Diagramm in A b b. 10 läßt keinen Bruch bei Belastung erkennen. Bei Entlastung wird vielmehr das ursprüngliche Volumen wieder eingenommen, das Material ist vollständig elastisch.

Ausführungsbeispiel 1
Biokatalysator mit Schaumform

Stufe 1:10 g hydrophiles Polyisocyanat,Typ»Hypol FHP 3000«, oder »Hypol FHP 2000«, oder Typ »FRL 2297« (»Desmodur T 80« mit 9,9% NCO) werden mit 10 g Biofeuchtmasse Exoli ATCC 11 105, Wassergehalt 80 Gew.-%, eine Minute intensiv bei Raumieriipcräiüf gemischt. DaS mischungsverhältnis von enzymatisch aktiver Suspension : flüssigem Polyisocyanat beträgt 1 :1 (g/g),

μ Stufe 2a: Das flüssige Reaktionsgemisch wird in ein Reaktionsgefäß gegossen, das etwa die fünffache Volumenmenge der Reaktionsmischung fassen kann.

Die Reaktion verläuft ohne Veränderung des pH-Wertes etwa bei pH 7 ab. Es tritt für etwa 10 Minuten eine Erwärmung des Reaktionsgemisches um höchstens 10⁰C ein. Das bei der Reaktion frei werdende CO2 läßt das Reakiionsgemisch aufschäumen. Nach 20 Minuten ist die Reaktion beendet. Es liegt ein enzymatisch aktiver Schaumstoff als Biokatalysator vor. Dieser wird mechanisch auf die geforderte Korngröße zerkleinert.

Stufe 3: Der Biokatalysator wird 12 Stunden in physiologischer NaCl-Lösung bei Raumtemperatur gewaschen, um anhaftendes CO2 zu entfernen.

Stufe 4: Der Biokatalysator wird abgetrennt und im feuchten Zustand ausgeführt Die Waschlösung wird ausgeführt. Der erzeugte Biokatalysator wird einem Aktivitätstest unterworfen.

Der immobilisierte Mikroorganismus Exoli ATCC 11 105 enthält das Enzym Penicillin-G-Acylase. Es hydrolysiert Penicillin G zu 6-Amino-Pennicillansäure und Phenylessigsäure (Phenylethansäure), 6-Amino-Pennicillansäure dient als Ausgangsprodukt für semi-synthetische Penicilline.

Durch pH-Titration der bei der Reaktion freigesetzten Phenylessigsäure bei pH 7,8 und 37°C mit 0,01 NaOH wird die Reaktionsgeschwindigkeit der enzymatischen Hydrolyse im Rührreaktor gemessen. Die Substratkonzentration beträgt 2,5 g Penicillin G in 50 ml destilliertem Wasser (5%). Es werden 5 bis 10 ml zerkleinerter Biokatalysator verwendet. Der Biokatalysator in Schaumform besitzt eine Konzentration von 0,08 g Biofeuchtmasse (BFM)/ml Biokatalysator. Die Aktivität beträgt 13,3 η kat/mi Biokatalysator. Die Restaktivität beträgt 25%.

Ausführungsbeispiel 2

Perlförmiger Biokatalysator
45

Stufe 1: Es werden 15 g Biofeuchtmasse des Mikroorganismus Ecoli ATCC 11 105, Wassergehalt 80 Gew.-%, in 10 ml destilliertem Wasser suspendiert und dann 1 Minute mit 25 g flüssigem hydrophilen Polyisocyanai, Typ »Hypol FHP 3000« oder »Hypol FHP 2000«, oder »FRL2297« (»Desmodur T 80« mit 93% NCO) gemischt. Das Mischungsverhältnis enzymatisch aktiver Substanz: flüssgem Polyisocyanat beträgt 1 :1 so (g/g).

Stufe 2b: Das flüssige Reaktionsgemisch wird in ein Becherglas mit 21 dünnflüssigem Paraffin mit einer dynamischen Viskosität bei 25" C von 0,02 Pa · s gegossen und mit einem Blattrührer mit etwa 4000 U/min gerührt. Die Reaktionszeit beträgt 30 Minuten. Es werden kugelförmige Teilchen mit einer Korngrößenverteilung von 03 bis 3 mm erzeugt, die aus Polyurethan in Schaumform bestehen,
55 Der Biokatalysator wird von dem Paraffin abgetrennt und dieses in das Verfahren zurückgeführt

Stufe 4: Der Biokatalysator wird abgetrennt und im feuchten Zustand ausgeführt Die Waschlösung wird ausgeführt Der erzeugte Biokatalysator wird einem Aktivitätstest unterworfen. Es werden folgende Werte ermittelt:

Konzentration 0,01 g BFM/ml Katalysator

Aktivität 43 η kat/ml Katalysator

Restaktivität 14%.

Ausführungsbeispiel 3
Biokatalysator mit Gelform

Stufe 1:30 g Polyisocyanat, Typ »FRL 2235«, (Desmodur T 80 mit 3,6 Gew.-% NCO), wird bei Raumtemperatur 5 mit einer wäßrigen Suspension von +5⁰C mit einem Gehalt von 20 g E.coli ATCC 11 105 mit einem Wassergehalt von 80% in 150 g destilliertem Wasser intensiv etwa 100 Sekunden gemischt. Das Mischungsverhältnis enzymatisch aktive Substanz : flüssigem Polyisocyanat beträgt 5,67 :1 (g/g).

Stufe 2a: Das flüssige Reaktionsgemisch wird in ein Reaktionsgefäß gegossen. Das bei der Reaktion entstehende CO2 wird vollständig in Wasser gelöst Es entsteht ein massives Gel. Die Reaktion ist nach 10 Minuten 10 beendet. Das entstandene Gel wird mechanisch zerkleinert

Stufe 3: Der Biokatalysator wird 12 Stunden in physiologischer NaCl-Lösung bei Raumtemperatur gewaschen um anhaftendes CO2 zu entfernen.

Stufe 4: Der Biokatalysator wird abgetrennt und im feuchten Zustand ausgeführt. Die Waschlösung wird ausgeführt. 15

Die Abbildungen zeigen

A b b. 1 Dtchte des Polyurethans in Abhängigkeit vom Mischungsverhältnis Wasser : Polyisocyanat bei dem

hiandelsprodukt »Hypol FHP 3000«, 20

Abb.2 Dichte des Polyurethans in Abhängigkeit vom Mischungsverhältnis Wasser :Polyisocyanat bei dem Handelsprodukt »FRL 2297«,

A b b. 3 Temperaturverlauf in 10 g Reaktionsgemisch aus 5 g »Hypol FHP 3000« und 5 g Wasser, .Abb.4 Dichte von Polyurethan in Abhängigkeit vom Druck während der Reaktion am Beispiel »Hypol FHP 3000«. Mischungsverhältnis g H2O. :g Polyisocyanat = ! : 1. 100 kPa entspricht dem Normal- 25 druck,

A b b. 5 Schematischer Aufbau der Meßapparatur. Pumpe (1); Strömungsmengenmesser (2); Ventil (3); Manometer (4); Schüttung (5); Wassergefäß (6);

A b b. 6 Druckverlust einer Schüttung aus perlförmigem Polyurethanschaumstoff,

A b b. 7 Druckverlust einer Schüttung aus perlförmigem Polyurethangel, 30

A b b. 8 Druckverlust an blockförmigem Polyurethanschaumstoff:

I = »Hypol FHP 3000«;

II = »Hypol FHR 2000«;

III = »FRL 2297«.

A b b.9 Meßapparatur zur Aufnahme von Kraft-Zeit-Kurven Schreiber (1); Meßverstärker (2); Stempel (3); 35

Kraftmeßdose (41
A b b. 10 Kraft-Zeit-Diagramm einer Polyurethanperle aus »Hypol FHP 3000« unter Belastung und Entlastung.

Hierzu 5 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von hydrophilen, gelförraigen Biokatalysatoren mit hoher Beladung an enzymatisch aktiver Substanz durch Polymereinschluß ganzer Zellen oder von Zellfragmenten unter Ver-Wendung von flüssigem, hydrophilem Polyisocyanat, gekennzeichnet durch folgende Stufen:

1) Mischen einer wäßrigen Suspension ganzer Zellen oder von Zellfragmenten mit einem Feststoffg^halt bis 30 Gew.-°/o mit flüssigem Polyisocyanat mit einem NCO-Gehalt von 3,6 Gew.-% im Mischungsverhältnis wäßrige Phase : flüssiges Polyisocyanat von 0,3 :1 bis 7 :1 (g/g),

ίο 2a) Eingießen des noch flüssigen P.eaktionsgemisches in ein Reaktionsgefäß und Reaktion zur Bildung eines enzymatisch aktiven, hydrophilen Polyurethan-Netzwerkes in Blockform mit physikalischem Einschluß der ganzen Zellen oder Zellfragmente bei einer Reaktionstemperatur unter 10° C oder
2b) Eingießen des noch flüssigen Reaktionsgemische-^ in dünnflüssiges Paraffin und Reaktion zur Bildung eines enzymatisch aktiven, hydrophilen Polyurethan-Netzwerkes als perlförmige Teilchen mit physikalischem Einschluß der ganzen Zellen oder Zellfragmente bei einer Reaktionstemperatur unter 10 C₁

3) Waschen der Biokatalysatormasse mit Wasser oder physiologischer Salzlösung oder Neutralisation mit verdünnter, alkalischer Lösung zur Entfernung anhaftender CO^Mengen,

4) Abtrennung der Waschlösung und Ausführen des feuchten Biokatalysators.