DE2537993C2

DE2537993C2 - Neues Glukose-Isomerase-Produkt und Verfahren zu seiner Herstellung

Info

Publication number: DE2537993C2
Application number: DE2537993A
Authority: DE
Inventors: Shmuel M.Sc. PH.D. Målev Amotz; Tage Kjaer Herlev Nielsen; Niels Otto Lyngby Thiesen
Original assignee: Novo Industri AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1974-08-28
Filing date: 1975-08-26
Publication date: 1986-09-18
Also published as: FI53706B; ES440521A1; FI53706C; SU712026A3; FR2283148B1; FI752406A; FR2283148A1; DE2537993A1; MX3544E; DK143569C; AT344647B; GB1516704A; NL186914C; DK143569B; ATA666075A; JPS585036B2; NL7510075A; IT1041539B; JPS5151580A; DK385275A

Description

Die Erfindung betrifft die Gegenstände der Ansprüche 1 und 2. Die Ansprüche 3 bis 7 nennen Ausgestaltungen des Verfahrens nach Anspruch 2.

Es ist sert langem anerkannt daß die nur einmalige Verwendung von Enzymen zur Durchführung einer 35 gewünschten Enzym-Reaktion rat so übertrieben hohen Kosten für das Enzym verbunden ist, daß diese an den

hohen Kosten scheitert

Im einzelnen ist bekannt, daß Glukose enzymatisch zu einem viel süßeren Produkt isemerisieri werden kann,

das normalerweise ein Gemisch aus etwa 50 :50 Teilen Glukose und Fruktose darstellt, aber die Kosten für das Enzym sind hoch und das Isomerisationsverfahren muß so abgestimmt werden, daß es den Eigenschaften des Enzyms entspricht Da ein wiederverwendbares Enzym Hoffnungen auf ein billiges Varfahr<7 eröffnet, ist die Möglichkeit für eine mehrfache Wiederverwendung der Enzyme der Aufmerksamkeit nicht entgangen. So sind zahlreiche Vorschläge zur Stabilisierung und/oder Immobiliserung zelluloser und zellfreier Glukose-Isomerase-Enzyme gemacht worden.

Da die Wiederverwendung eines Enzyms seine Wiedergewinnung aus dem Reaktionsgemisch erfordert, werden lösliche Enzyme in der Regel unlöslich gemacht und mit einer Matrix beliebiger Art verbunden. Was nun die Glukose-Isomerase, ein intrazellulares Enzym, angeht, so ist das Enzym bereits an die Mikrobenzelle

gebunden oder in ihr Inneres eingeschlossen, aber ein Herauslösen des Enzyms und/oder ein Zerfall der Zelle muß in der Regel vermieden werden. Des weiteren sind Mikrobenzellen, besonders Bakterien, verhältnismäßig klein und größere Teilchen wären mehr erwünscht

Ein mit der Isomerisation von Glukose zusammenhängender Punkt von einiger Bedeutung ist die Forderung nach einer Sicherheit dafür, daß die zur Stabilisierung oder Einkapselung der Glukose-Isomerase enthaltenden Zellen verwendeten Reagentien die Stoffe nicht freisetzen, welche eine Beeinträchtigung des am Ende erhaltenen Glukose-Fructose-Syrups darstellen. Einige der frühe: vorgeschlagenen Immobilisierungs-Techniken können in der kommerziellen Technik nicht mehr angewandt werden, weil die Reagentien und die Reaktionsprodukte als nichttoxisch nicht akzeptiert wurden. Es sei jedoch bemerkt, daß die US-Patentschrift Nr. 37 79 869 die Stabilisierung von Glukose-Isomerase enthaltenden Bakterienzellen durch Reaktion mit Glutaraldehyd beschreibt. Auch andere Vorschläge zur Vernetzung verschiedener Enzyme durch eine Umsetzung mit Glutaraldehyd sind gemacht worden.

Es ist bekannt, daß Glutaraldehyd mit (amino)-stickstoffhaltigen Materialien, einschließlich Enzymen, reagiert. Ganze Zellen von Glukose-Isomerase-Mikroorganismen reagieren aber mit Glutaraldehyd zwecks Vernetzung zu Multizellen-Teilchen einfach nicht ausreichend. Vorschläge zum Vernetzen, Unlöslichmachen und Immobilisieren von Enzymen betragen den Einschluß eines aus einer anderen Quelle stammenden Reaktionsteilnehmers mit Glutaraldehyd (wie Albumin) für eine kovalente Bindung von Enzymen (siehe z. B. die britische Patentschrift Nr. 12 57 263). Unglücklicherweise verdünnt die Zugabe eines aus anderer Quelle stammenden Reaktionsteilnehmers in den erforderlichen Mengen die Glukose-Isomerase erheblich und erniedrigt die Aktivität je Produkteinheit proportional zur Verdünnung. Immobilisierte Produkte mit höherer Aktivität/Einheit können natürlich hergestellt werden, wenn die Glukose-Isomerase aus der Zelle entfernt und vor der Immobilisierung gereinigt wird. Die Verfahrenskosten jedoch und der verfahrensbedingte Aktivitätsverlust erhöhen die Kosten für ein

hochaktives Produkt außerordentlich. Diese Situation ist im Falle der Glukose-Isomerase besonders unangenehm. Die Isomerisation von Glukose im industriellen Maßstab verlangt sehr große Mengen an verhältnismäßig billigem Enzymprodukt von der höchstmöglichen Aktivität/Einheit. Stabilisierte Zellen würden diesen Anforderungen am besten entsprechen, aber die Beschaffung für den Einsatz, die Wiedergewinnung und die Wiederverwendung individueller Zellen im industriellen Maßstab bilden für den Techniker einen Alptraum. Ein anderer Nachteil bei der Verwendung ganzer Zellen besteht darin, daß der Transport der Substrate (Glukose und Fructose) durch die intakte Zellwand in sehr hohem Ausmaß zu Diffusionsproblemen führt. Es wurde gefunden, daß eine intakte Zelle von B. coagulans nur etwa ein Drittel der Aktivität zeigt, die nach einer vollständigen Lysierung der Zelle auftrat Wenn ein merklicher Faktor für die Wiederverwendung, z. B. 4 oder 5, erreicht werden kann, ist es auch möglich, eine etwas niedrigere Aktivität/Einheit in einem teilchenförmigen Produkt (größer als die Zellen von Mikroorganismen) in Kauf zu nehmen.

Die Erfindung betrifft ein enzymatisch/physikalisch stabiles, wasserunlösliches Glukose-Isomerase-Produkt aus Zellen von Mikroorganismen mit Glukose-Isomerase-Aktivität, hergestellt durch Umsetzung eines Zellkonzentrats von mindestens teilweise gebrochenen Zellen von Mikroorganismen, das von 0 bis 75% intakte Zellen und einen Gehalt an Tiockensubstanz von 3 bis 30 Gew.-°/o/Volumen enthält, mit 0,01 bis 1,0 Gewichtsteil Glutaraldehyd je Gewichtsteil Trockensubstanz im Konzentrat in Form eines zusammenhängenden, festen Produkts und anschließende Entwässerung und Formung des Glukose-Isomerase-Produkts.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung dieses enzymatisch/physikalisch stabilen, wasserunlöslichen Glukose-Isomerase-Produkts aus Zellen von Mirkoorganismen, wobei man ein Zellkonzentrat und Glutaraldehyd zur Reaktion bringt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein Zellkonzentrat von mindestens teilweise gebrochenen Zellen der Mikroorganismen, das 0 bis 75% intakte Zellen aufweist und "^:nen Gehalt an Trockensubstanz von 3 bis 30 Gew.-%/Vo!umen enthält, mit O₁O! bis 1,0 Gewichtstei! G!utar?ldehyd je Gewichtsteil Trockensubstanz im Konzentrat --ur Reaktion bringt und so ein zusammenhängendes, festes Produkt bildet, und danach entwässert und formt

Somit wurde jetzt gefunden, daß ein zusammenhängendes, festes Glukose-Isomerase-Produkt hergestellt werden kann, ohne daß der Enzymgehalt durch den Einschluß eines aus anderer Quelle stammenden Immobilisierungsmittels verdünnt wird. Es wurde festgestellt, daß die Zellen selbst mehr als genügend stickstoffhaltige (und vielleicht noch andere) Bestandteile enthalten, die mit Glutaraldehyd unter Bildung eines Gelprodukts reagieren. Diese Bestandteile müssen zunächst aus den Zellen der Mikroorganismen freigesetzt werden, danach aber dienen sie dieser Aufgabe, ohne daß eine Zwischenreinigung notwendig wäre.

Die Freisetzung stickstoffhaltiger Bestandteile (wie von Proteinen und Nukleinsäuren) kann auf mechanischem Wege oder durch Autolyse bewirkt werden. Sie braucht nicht vollständig zu sein. Schon das Brechen von 25% Zellen (d. h. 75% Zellen bleiben intakt) kann ausreichend Reaktionsteilnehmer freisetzen, v/elche die Bildung eines zusammenhängenden, festen Produktes ermöglichen, das ein Gelprodukt sein kann. Das zusammenhängende Produkt wird entwässert und in eine unterteilte Form geeigneter Größe weit über 10 μΐη gestaltet.

Eine besondere Quelle von Mikroorganismen für die Glukose-Isomerase ist, wie angenommen wird, für die Erfindung nicht wesentlich, so lange die Glukose-Isomerase sich in intrazellularem Zustand befindet Es sind viele Mikroorganismen identifiziert worden, die Glukose-Isomerase-Aktivität ausüben. Jedoch erzergen viele (und vielleicht alle) bereits bekannten Quellen von Mikroorganismen für Glukose-Isomerase das Enzym intrazellular.

Die Zellen von Mikroorganismen können auf geeignetem Wsge, vornehmlich demjenigen, der sich am besten für die Erzeugung von Zellen mit hoher Glukose-Isomerase-Aktivität eignet, kultiviert werden. Die Zellen werden zweckmäßig von der Fermentierungsbrühe durch Filtration, Zentrifugieren oder dgl, abgetrennt und bilden dann ein Konzentrat, das 3 bis 30 Gew.-% Trockensubstanz/Volumen enthält. Die Gegenwart autolysierter und zerriebener Zellen und sogar von freiem Enzym im Zellkonzentrat ist wichtig, weil sie die Konzentration der Mikrobenzellen durch den Einsatz großtechnischer Vorrichtungen, wie selbstreinigenden Schlammzentrifugen, erlaubt. Verhältnismäßig strenge Behandlungsbedingungen, sogar durch Verzögerungen im Verfahren hervorgerufene Autolyse, sind gewöhnlich tragbar.

Wenn in der Praxis ein Zellenbruch, eine Autolyse oder dgl, im wesentlichen Ausmaß im Verlaufe der Wiedergewinnung und Konzentration nicht eintritt, dann wird ein Zellenbruch vorsätzlich bis zu dem Punkt herbeigeführt, bei welchem das Konzentrat nicht mehr als 75, vorzugsweise weniger als 60%, ganze (intakte) Zellen enthält. Vollständiges oder 10%iges Brechen der Zellen steht für die Praxis der Erfindung zur Vermeidung von Diffusions· Problemen durch die Zellwand und zur Erhaltung eines physikalisch möglichst stabilen Produktes frei.

Die Reaktion mit Glutaraldehyd wird in einer wässerigen Suspension von fncmentierten Zellen durchgeführt, wo ein Teil der freigesetzten, zellularen Bestandteile, die Glukose-Isomerase selbst eingeschlossen, sich in Lösung befindet. Demgemäß werden die Zellen erst dann zerrieben oder gebrochen, nachdem sie über den üblichen Gehalt im Fermentationsmedium konzentriert wurden. Für die Praxis bedeutet dies, daß der Mikroorganismus in der Regel als ein bakterielles Zellkonzentrat mit 3 bis etwa 10% Trockensubstanz aus seinem Wachstumsmedium, beispielsweise durch Zentrifugieren, abgetrennt wird. Danach wird gleichzeitig mit der Konzentration oder anschließend an diese das gewünschte Aufbrechen der Zellen, beispielsweise durch Autolyse oder Homogenisation, vorgenommen.

Für eine großtechnische Erzeugung von Zellen besteht der am häufigsten beschrittene Weg zur Konzentration darin, einen selbsreinigenden Separator einzusetzen. Für Einzeiheken geeigneter Behandlungs-Parameter siehe die britische Patentschrift Nr. 12 61 711 (auf Seite 2, Zeilen 91 bis 100).

Diese Separatoren werden zum Einsatz nur dann empfohlen, wenn das Ausmaß des Zellenbruchs wegen der starken, physikalische!. Kräfte nicht kritisch ist, die während der periodischen Entleerung des Korbes durch

zo ό/

dessen Löcher in der Peripherie auftreten, wenn die Zellen von dem hohen, im Korbe herrschenden Druck zur Außenatmosphäre gelangen.

Das Ausmaß des Zellenbruchs kann von einem Mikroorganismus zum anderen wegen der Größendifferenz und der Stärke der Zellwand verschieden sein.

Der auf die Korbwand ausgeübte Druck kann nach der Formel

P -γ αΛ^-r?)

veranschlagt werden, in welcher G das spezifische Gewicht des Einsatzes (in diesem Falle etwa 1030 kg/m³), ω die Rotationsgeschwindigkeit des Separators, r₂ den Korbradius und η den Radius vom Mittelpunkt zum Einsatzspiegel, der in dieser Maschine angenähert Null ist, bedeuten. Man findet, daß der Druck auf die umgebende Korbwand bei einem solchen Separator im Bereich von 50 bis 100 kp/cm² liegt.

Es ist bekannt, daß einige Mikroorganismen, insbesondere Bacillus Spezien, der Autolyse unterliegen. Für den Bacillus coagulans wurde gefunden, daß bei der Erzeugung eines Zellkonzentrats mit Hilfe des erwähnten, selbstreinigenden Separators mehr Glukose-Isomerase freigesetzt wird, wenn der Schlamm für wenige Stunden bei einer Temperatur von 10 bis 40° C gehalten wird.

Nach einer Lagerung von 3 bis 6 Stunden sind mehr als 80% der Zellen aufgebrochen oder lysiert.
Wie bereits erwähnt, so wurde gefunden, daß die Glukose-Isomerase-Aktivität einer Suspension von intakten Zellen eines Glukose-Isomerase erzeugenden B. coagulans nur etwa V₃ der Aktivität einer völlig lysierten Suspension beträgt, was durch eine Behandlung mit Lysozym bewirkt wird. Das zeigt die folgende Tabelle.

Aktivität in GINU/g

Frische Kulturbrühe ohne Kulturbrühe mit Lysozym-Zusatz

J₅ Lysozym-Zusatz 30 Min. bei 25" C 60Min.bei25°C

2,14 5,97 6,02

Das Lysozym war ein Sigma Grade I mit 25 000 Sigma Einheiteii/mg. Die Kulturbrühe wurde 20fach verdünnt und die verdünnte Suspension wurde mit 1,5 mg Lysozym pro Milliliter versetzt. Die Proben wurden dann nach 30 und 60 Minuten nach unserem Standard-Verfahren für nicht-immobilisierte Glukose-Isomerase analysiert. s. GINU steht für Glukose-Isomerase-Novo-Einheiten.

Unser Standard-Verfahren zur Messung der Gesamt-Aktivität eines Zellkonzentrats umfaßt eine Inkubation

mit Lysozym von einer Stunde nach einer 150—200-fachen Verdünnung. Wenn die Aktivität der Probe ohne Lysozym-Behandlung bestimmt ist, dann kann der Prozentgehalt der löslichen Aktivität unter der Annahme berechnet werden, daß die Aktivität intakter Zellen 35% vom Maximum beträgt Wenn zum Beispiel die Aktivität eines Schlammes nach Lysozym-Behandlung mit 135 GINU/g und ohne Lysozym-Behandlung mit 120 G'NU/g errniiteit wurde, dann ergibt sieh der Pfozertigehäli an löslichem Enzym ais A"aus der Gleichung:

Xx 1,35+(100-A) 1,35x0,35 = 120

Ein anderer Vorteil der Herbeiführung eines hohen Ausmaßes an Zellenbruch besteht darin, daß die physikalische Stabilität des Endprodukts sich umso mehr zu erhöhen scheint, je besser die Zellen gebrochen werden. Zur Sicherung der optimalen Voraussetzungen hierfür hat es sich als nützlich erwiesen, den Schlamm durch einen kommerziellen Homogenisator zu pumpen. Die Vorrichtung wird weiterhin zum Aufbrechen von Zellen verwendet (siehe Trans. Inst Chem. Engns, Bd. 49, 1971: P. J. Hetherington und J. Biol. Chem. 1968, 243, ρ 2579: Tarmy und Kaplan, ferner LH. Rees in Chemical Engineering, 13.Mai 1974). Verschiedene Methoden zum Zelienaufbruch sind bekannt, aber nur wenige sind für einen industriellen Einsatz geeignet. Eine andere, allgemeine und verhältnismäßig billige Methode zum Zerreiben der Zellen besteht in der Verwendung einer Kugelmühle, beispielsweise der in der Literatur von W. A. Bachofen Maschinenfabrik, Basel, Schweiz, beschriebenen (siehe Biotechn. and bioengineering, Bd. XV, ρ 129—142 (1973)).

Novo-Methode zur Bestimmung der Glukose-Isomerase-Aktivität

(Mit einer Standard-Abweichung bei den Resultaten im allgemeinen im Bereich von 5— 10⁰Zo.)

Prinzip

Glukose-Isomerase katalysiert die Isomerisation von Glukose zu Fructose. Die gebildete Fructose wird nach der Cystemcarbazo!-Methode für Ketosen gemessen.

Definition der Einheit

β Die Glukose Isomerase Novo Einheit (GINU) wird als die Menge des Enzyms definiert, welche die Bildung

ä von 1 Mikromol Fructose je Minute unter Standard-Bedingungen katalysiert, nämlich:

65 Temperatur: 65,0⁰C

Konzentration des Substrats: 5% Glukose

Konzentration des Puffers: 0,25 M Maleat-Puffer pH 6,50

Reaktionszeit: 20 Minuten

Die benötigte Apparatur besteht aus einem magnetischen Rührer, Wasserbädern (30,0°C und 65,0°C), einem pH-Meßgerät, Spektrophotometer (Beckmann Modell B mit Durchflußküvette), einer Stoppuhr und einem Rotamixer.

Die Reagentensind:

(1) Ein Puffer, pH 6,50 (0,25 M Maleat-Puffer, 0,1 M Magnesiumsulfat, 1,0% Kaliumchlorid).

Maleinsäure, Merck (29,0 g), NaOH (19,0 g), MgSO₄ · 7 H₂O (24,7 g), KCl (10,0 g) und deionisiertes Wasser auf 1000 ml.

Vtfenn alle Reagentien gelöst sind, wird der pH genau mit pH-Meßgerät kontrolliert und der Puffer durch Zusatz von In-NaOH oder In-HCl auf 6,50 eingestellt. Der Zusatz von NaOH bewirkt Fällung von Mg(OH)₂, der unter Rühren wieder gelöst wird. NaOH wird daher sehr langsam zugegeben.

(2) Glukose-Substrat- 10% Glukose (wasserfrei) (100 g), CoCl₂ · 6 H₂O (475 g) und pH 6,5 Puffer zu 1000 ml. Wenn die Reagentien sich gelöst haben, wird der pH-Wert erneut mit einem pH-Meßgerät kontrolliert und, wie oben beschrieben, auf 6,50 eingestellt.

Zur Konservierung des Substrats wird 0,1% (1,0 ml) Chloroform zugesetzt. Bis zum Bedarf wird es kühl gehalten.

(3) Perchlorsäure — etwa 0,1 M — HClO₄ (70%) (10 ml) und deionisiertes Wasser zu 1000 ml.

(4) L-Cystein-HCl-Lösung — 2,2% — Cystein-HCl (Monohydrat) (240 mg) und deionisiertes Wasser zu 10 ml. Die Lösung wird jeden Tag frisch bereitet.

(5) Carbazol-Lösung — 0,4% — Carbazö! (400 mg) und 9G%iges Äihanoi zu 100 ml. Diese Lösung wird kühl gehalten.

(6) Schwefelsäure - 80% GewiGew. - deionisiertes Wasser (300 ml) und H₂SO₄ (96%) (775 ml). Das Wasser wird im Eisbad gekühlt, gekühlte Schwefelsäure wird vorsichtig zugesetzt. Schutzbrille aufsetzen.

(7) Schwefelsäure — Carbazol-Reagens — Schwefelsäure 80% GewVGew. (100 ml) und Carbazol-Lösung 0,4% in Äthanol (1 ml). Jeden Tag frisch herstellen. Im Kühlschrank halten bis unmittelbar vor Gebrauch.

(8a) Fructose Standard I 20 m Molar (Vorratslösung) — Fructose (360 mg) und Perchlorsäure (0,1 M) zu 100 ml.

Diese Lösung wird kühl gehalten.
(8b) Fructose Standard Ulm Molar — Fructose Standard I (5,0 ml) und Perchlorsäure (0,1 M) zu 100 ml. Jeden Tag frisch herstellen und als Standard zur Fructose-Bestimmung benutzen.

Verfahren

Die Probe für die Analyse wird mit Puffer auf eine Konzentration zwischen 0,1 und 0,8 GINU/ml verdünnt. Dies gibt eine Extinktion zwischen 0,2 und 1,7 bei 560 nm.

35 a. Isomerisation

1. Aus der (den) verdünnten Probe(n) 1 ml-Mengen für die Testprobe (S) und die Bündprobe (B) abziehen. 10 χ 160 mm Teströhrchen verwenden.

2. Die Stoppuhr starten (T). Das Glukose-Substrat, die Test- und Blindproben in das Wasserbad von 65°C stellen und mit Glasstöpseln (Kjeldahl) verschließen.

3. Nach T=IO Minuten + 0 Sekunden 1,0 ml Glukose-Substrat zur ersten Probe zusetzen und schütteln. Nach T = 10 Minuten + 10 Sekunden Glukose-Substrat der zweiten Testprobe zusetzen und schütteln. Nach T=IO Minuten + 20 Sekunden usw. fortsetzen.

4. Nach T = 30 Minuten + 0 Sekunden 10,0 ml 0,1 M Perchlorsäure zur ersten Testprobe zugeben und vom Wasserbad entfernen. Nach T = 30 Minuten + 10 Sekunden 10,0 ml 0,1 M Perchlorsäure zur zweiten Testprobe zugeben und diese vom Wasserbad entfernen. Nach T = 30 Minuten + 20 Sekunden usw. fortfahren. Nach Entfernung der letzten Testprobe weiter 10,0 ml 0,1 M Perchlorsäure zu allen Blindproben · | zusetzen und diese vom Wasserbad entfernen. Zum Ende 1,00 ml Glukose-Substrat zu allen Bündproben zugeben.

5. Auf jeden Fall alle Proben und Blindproben energisch schütteln.

b. Bestimmung der Fructose

1. Aus den gekühlten und gut geschüttelten Proben 0,50 ml in 10x160 Teströhrchen abpipettieren. Zwei 55 I

Fructose-Standards (II) und zwei deionisierte Wasser-Blindproben einbeziehen. Die Wasser-Blindproben dienen als Bezugsproben bei der Messung der Extinktion.

Z Jedem Röhrchen 100 μΐ Cystein-HCl-Lösung zugeben. Schütteln und alle Röhrchen in ein Wasserbad von 30,0°C stellen.

3. Stoppuhr (T) starten und bei T = 0 Sekunden 3,0 ml gekühltes Schwefelsäure-Carbazol-Reagens in die erste Bezugsprobe geben und in einem Rotamixer völlig durchmischen (Schutzbrille aufsetzen). Bei T = 30 Sekunden 3,0 ml Schwefelsäure-Carbazol zur zweiten Bezugsprobe zusetzen usw. In Intervallen von 30 Sekunden fortfahren und dabei die Proben in dieser Reihenfolge behandeln: Blindproben, Testproben, Fructose-Standards.

4. Bei T = 30 Minuten + 0 Sekunden das Spektrophotometer auf 100% Transmission bei 560 nm mit der ersten Bezugsprobe calibrieren. Bei T = 30 Minuten 4- 60 Sekunden die Einstellung des Spektrophotometers mit der zweiten Bezugsprobe kontrollieren. Bei T = 30 Minuten -f 60 Sekunden die Extinktion der ersten Blindprobe ablesen usw.

Ol

c. Berechnung
Die Aktivität wird aus der folgenden Formel errechnet:

(S-B)xl2x Vxf ^,_K„,,

^G1NU/g

wo bedeuten:

S= Extinktion der Testprobe

B = Extinktion der Blindprobe

12 = Milliliter der Probe nach Isomerisation

std = Extinktion des Fructose-Standards

20 = Faktor zur Umwandlung von 20 Minuten in 1 Minute

w = g der gezogenen Probe

V = Volumen in Millilitern, in welchen wgelöst ist

f = Verdünnungsfaktor

d. Beispiel

1,00 g Enzym wird in einem Puffer gelöst und zu 100 ml ergänzt. Von dieser Lösung wird 1 ml gezogen und zu 100 ml aufgefüllt. Die Analyse wird, wie oben beschrieben, durchgeführt. Es bedeuten:

S = 0,365

B= 0,128

S-B =0,237

std = 1,162

std χ 20 x w
_ 0,237 χ 12 χ 100 χ 100

1,162 χ 20 χ 1
= 1224 GINU/g

Es wird auf J. Biol. Chem., 192 (1951), ρ 583 (Z. Dische and E. Bohrenfreund) Bezug genommen.
Des Zeilkonzentrat enthält nach Immobilisierun⁰' und ^uervsrbindun⁰" ΐηίο!^σβ der R.esktion niit O
yd von 0—75% ganze Zellen und einen Gehalt an Trockensubstanz von 3—30 Gew.-%. Was immer an Glukose-Isomerase in löslicher Form freigesetzt wurde, das verbleibt im Konzentrat und gelangt in das Enzym-Produkt.

Im Rahmen dieser Erfindung ist Trockensubstanz der Rückstand, der beim Trocknen bei 105° C über 16 Stunden zurückbleibt Die Trocknung über 24 Stunden bei 60°C unter Vakuum ergibt eine alternative Messung des Gehaltes an Trockensubstanz.

Die Menge des mit dem Zellkonzentrats umgesetzten Glutaraldehyds ist wichtig. Zu wenig Glutaraldehyd macht das Produkt für industrielle Zwecke ungeeignet und zuviel läßt die Aktivität/Einheit im Endprodukt absinken. Der erfindungsgemäße Bereich der Verhältnisse des Trockengewichts von Glutaraldehyd zu Trockensubstanz im Ausgangsmaterial wurde mit 0,01 ; 1, vorzugsweise von 0,04 :0,4 und insbesondere von 0,05 :0,3 gefunden. Der relative, anzuwendende Teil von Glutaraldehyd kann im Rahmen der obigen Angaben von Mikroorganismus zu Mikroorganismus variieren und sogar eine Anpassung erfordern, damit er den Anlagen für unterschiedliche, großtechnische Glukose-Isomerationen entspricht

Das Glutaraldehyd kann in der Form einer kommerziell konzentrierten (beispielsweise 25°/oigen) Glutaraldehyd-Lösung dem Zellkonzentrat zugesetzt werden; die Mischung wird intensiv durchgerührt, um eine gleichmäßige Dispersion des Glutaraldehyds sicherzustellen.

Die Reaktion zur Querverbindung und das Verfahren zur Gewinnung des Produkts gemäß der Erfindung ist weiter Variationen fähig.

Nach einer bevorzugten Ausführungsform ist das Ausgangsmaterial entweder eine konzentrierte, autolysierte Fermentationsbrühe oder ein homogenisiertes Konzentrat und das Glutaraldehyd wird in einer solchen Menge zugegeben und die Temperatur bei der Zugabe so ausgewählt, daß das Gemisch befähigt wird, innerhalb einer Stunde zu gelieren.

Nach einer anderen, bevorzugten Ausführungsform wird das Ausgangsmaterial, das entweder ein autolysiertes Konzentrat oder ein Homogenisat ist, vor dem Zusatz von Glutaraldehyd mit einem Flockungsmittel behandelt, um Aggregate zu bilden und die Querverbindung zu fördern.

Nach einer weiteren, bevorzugten Ausführungsform wird das Querverbindungsgemisch gefroren, damit ein inhomogenes Gel entsteht, das ein poröses Produkt ergibt Als Ausgangsmaterial kann jede Enzymform eingesetzt werden und die Bedingungen für den Schritt zur Vernetzung brauchen nicht so ausgewählt zu werden, daß vor dem Gefrieren ein Gelieren möglich wird. Nach dem Gefrieren wird das Gel bei einer Temperatur oberhalb des Gefrierpunkts aufgetaut Dies erlaubt-'ie Fortsetzung der Vernetzungsreaktion und die Bildung des porösen Produkts.

Die Realisierung der Erfindung umfaßt somit im Rahmen der Patentansprüche zahlreiche Alternativen. Hierzu wird auf die eirrage Figur der Begleitzeichnung bezug genommen, die an einem Beispiel eine graphische Darstellung dafür zeigt, wie das Grundverfahren variiert werden kann und zu unterschiedlichen Formen der Erfindung führt.

Aus der Zeichnung ist ersichtlich, daß eine Zellen-Kulturbrühe (10) stetig, in geeigneter Weise durch Zentrifugieren (Stufe 12), auf 12% Trockensubstanz konzentriert wird, und wenn der Wunsch hierzu besteh·*, unter Bedingungen, die zu dem benötigten, wesentlichen Ausmaß an Zellenbruch, vorzugsweise mehr als 50'%, führen, das normal durch 6stündige Autolyse begünstigt wird. In einer (und der bevorzugten) Variation können die Zellen einer vollkommenen Homogenisation (Schritt 14) in einen Zustand von 100% Zellenbruch unterworfen werden. Wie bereits ausgeführt wurde, setzt der Bruch der Zellen aus diesen die Bestandteile frei, die mit Glutaraldehyd reagieren; ein völliger Zerfall ergibt einen homogeneren Schlamm mit einer Möglichkeit für gleichmäßigere Verteilung der Vernetzungs-Brücken und eine Ersparnis an dem Vernetzungsmittel.

Nach einer bevorzugten Ausführungsform wird das Homogenisat oder das autolysierte Konzentrat mit Glutaraldehyd behandelt (Schritt 16); das Gemisch läßt man in Ruhe bei Raumtemperatur stehen, bis die ganze Masse gelisrt ist. Das Gel wird noch im weichen Zustand (etwa wie Vanillesoße oder Kremkäse) granuliert ts (Schritt 18) und gegebenenfalls gewaschen. Danach wird das Gel getrocknet (Schritt 20), vorteilhaft bei nur schwach erhöhten Temperaturen, z. B. von 30 bis 50° C, zu einem Trockensubstanzgehalt von 88%. Das Produkt kann dann gewaschen und wiedergetrocknet werden (Schritt 22). Die granulierten, hochaktiven Produkte, die erhalten werden, stellen ein bevorzugtes Produkt gemäß der Erfindung dar. Nach einer bevorzugten Ausführungstorm des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Granulierung des Giukose-Isomerase-Produkts durch Extrusion vorgenommen.

Die Härte des granulierten Produkts kann durch Anpassung der zu Beginn zugesetzten Menge des Glutaraldehyd-Reaktionsteilnehmers und/oder das Ausmaß der Auswaschung gesteuert werden. Die Waschung entfernt nichtumgesetztes Glucaraldehyd und ergibt ein etwas weicheres Produkt Offensichtlich setzen die Fraktionen das Härten des Produkts beim Trocknen fort. Die letzte Waschung (Schritt 22) bezweckt in der Hauptsache die Entfernung sehr feiner Teilchen.

Die trocknen Teilchen des Produkts besitzen eine außerordentliche dimensionale Stabilität und strukturelle Härte, während sie gleichzeitig einen hohen Anteil der ursprünglichen Enzym-Aktivität aus den Mikrobenzellen zurückhalten. Das teilchenförmige Glukose-Isomerasis-Produkt gemäß der Erfindung ist zu einer mehrfachen Wiederverwendung bei der Konversion von Glukose zu Fructose im Batch oder in Kolonnenreaktoren befähigt

Vorteile bei der Behandlung bieten sich durch eine alternative Behandlungsfolge an, nach welcher das Zellkonzentrat, vorzugsweise nach einem Autolyse-Schritt, mit einem Flockungsmittel zur Agglomerierung der Zellen und Zelltrümmer behandelt und danach mit Glutaraldehyd (Schritt 24) zur Reaktion gebracht wird. Gut ist es auch, zuerst den Glutaraldehyd und dann unmittelbar nach dem Glutaraldehyd oder gerade vor der Filtration des gebrochenen Gels das Flockungsmittel zuzugeben. Nach der Gelierung wird das Gel zur Entfernung von etwas Wass.er, Flockungsmittel und/oder ni chtumgesetztem Glutaraldehyd gewaschen und filtriert. Zur Filtration kann beinahe jeder Filter-Typ eingesetzt werden. Es zeigte sich, daß Büchnerfilter bei Herstellungen im Laboratorium., die nornia! rnü Vakusünfilirstion verlaufen, brauchbar sind. Ebenso zeigte sich, daß für großtechnische Erzeugung eine Platten- und Rahmenfilterpresse nützlich sind. Die eingesetzte Presse war eine Rahmenpresse mit einer Rahmentiefe von 1,5 cm. Auch das verwendete Filtertuch isi ganz unkritisch. Für den Transport der Suspension zur Presse kann der Pumpen-Typ, wie in der Technik bekannt, wichtig sein. Geeignet sind Pumpen, die das Einsatzprodukt nicht zerstören. In dieser Stufe wurde der Gehalt an Trockensubstanz in der gelierten Masse von beispielsweise 11% auf 30% gesteigert. Danach wird der Filterkuchen granuliert (Schritt 28) und (Schritt 30) beispielsweise auf 88% Trockensubstanz getrocknet Es resultieren hohe Enzym Aktivität und widerstandsfähige Teilchen. Ein grundsät2Ücher Vorteil der Flockung des Zellkonzentrats besteht darin, daß ein Ge! anfällt, das sich weiter entwässern läßt was die Belastung der Trocknungsanlagen herabsetzt. Als geeignete Flockungsmittel erwiesen sich EC25 der Drew Chemicals und Superfloc C521 der Cyanamid International.

Ein anderer Vorteil, eine physikalische Entwässerung mit Hilfe eines Filtrations-Schrittes durchzuführen, ist, daß der Filterkuchen mit einem niedrigeren Wassergehalt sich leichter granulieren läßt als das Gel, das vor der Trocknung nur in unregelmäßige Klumpen gebrochen werden kann. Der Filterkuchen kann in einem Oszillations-Granulator granuliert werden.

Eine andere Methode zur Herstellung von Partikeln aus dem Filterkuchen ist die Extrusion des Kuchens durch eine Platte mit Löchern des gewünschten Durchmessers. In diesem Zusammenhang wurde festgestellt daß Achsial-Extruder sich geeignet zeigen, aber grundsätzlich kann jeder Extruder mit der richtigen Lochgröße brauchbar sein. Der Durchmesser der Löcher in der Extruder-Siebplatte kann etwa 200 μ bis 2 mm oder noch mehr betragen. Zu große Durchmesser sind wegen der damit verbundenen Diffusionsprobleme weniger erwünscht. Andererseits, ergeben zu kleine Durchmesser Teilchen, die beim Einsatz in Festbett-Reaktoren zu einem übermäßigen Druckabfall in großtechnischen Kolonnen führen.

Vorteile bei der Verfahrensdurchführung und im Produkt werden von einer alternativen Behandlungsfolge geboten, die ein Gefrieren des mit Glutaraldehyd behandelten Zellkonzentrats (Schritt 32) umfaßt.

Das Gefrieren kann nach oder vor der Gelierung, unmittelbar nach dem Vermischen von Konzentrat und Glutaraldehyd durchgeführt werden, in welchem Falle sich die Reaktion nach dem Schmelzen (Schritt 34) vervollständigt Dabei tritt immer Synärese auf. Die Wäsche mit Wasser und die Entfernung von Wasser hinterlassen ein Produkt das an Trockensubstanz etwas konzentrierter ist beispielsweise 30% Trockensubstanz enthält Danach wird das Produkt getrocknet z.B. auf 88% Trockensubstanz. Das Gefrieren erzeugt ein blättriges, schuppiges Produkt, das von Natur etwa elastisch, faserig und/oder beinahe schwammig ist Im Vergleich zu den granulierten Produkten ist das aus dem Gefrierverfahren kommende Produkt fast frei von

übermäßig feinen Teilchen. Es wird angenommen, daß bei der Prozeß-Variation, bei der gefroren wird, eine größere Ausbeute an Gesamt-Enzym-Aktivität auftritt und so wird beim Gesamtverfahren eine Gefrierstufe bevorzugt eingeschaltet

Noch eine andere Arbeitsweise nach der Erfindung umfaßt das Gefriertrocknen des gefrorenen Reaktionsprodukts (Stufe 40). Die Gefriertrocknung setzt jedoch eine teuere Vakuum-Ausrüstung voraus, ebenso verhältnismäßig hohe 3etriebskosten.

Da jede Vakuumtrocknung Verarbeitungskosten bedingt, bietet das durch Gefrieren und Flocken unterstützte Entwässern manche Vorteile. Wie im Diagramm bemerkt, kann das vernetzte, gewaschene Produkt (auf einem Filter) ausgepreßt werden, um einen Teil des ursprünglich vorhandenen Wassers zu entfernen, wobei dann ein to Produkt mit mindestens 30% Trockensubstanz verbleibt Solch ein Produkt kann gegebenenfalls zur Isomerisation von Glukose verwendet werden. Eine gewisse Trocknung erhält jedoch den Vorzug und das bevorzugte Produkt enthält mindestens 80% Trockensubstanz.

Der Ausgangs-Mikroorganismus für die Glukose-Isomerase für die Durchführung der Erfindung ist nicht kritisch. Eine bevorzugte Quelle für Glukose-Isomerase stellt jedoch der B. coagulans, ein bekannter Erzeuger dieses Enzym, dar. Hier verdient der atypische B. coagulans den Vorzug, der in der US-PS 39 79 261 beschrieben ist Dieser Mikroorganismus bricht leicht auf und setzt sowohl Enzym in löslicher Form als auch reaktive Bestandteile, wie Proteine und Nukleinsäuren, frei. In der Praxis können gegebenenfalls die Zelltrümmer aus einem homogenisierten Konzentrat entfernt werden, damit ein lösliches Enzym und lösliche, reaktive Zeilbestandteile, die sich im Filtrat oder Zentrifugat in Lösung befinden, zur Bildung eines querverbundenen Produkts zur Reaktion gebracht werden können.

Typische, als Beispiele genannte Stämme sind NP.RL B-5649 bis B-5666.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel I

Herstellung eines Konzentrats und seine Immobilisierung

Isomerase enthaltende Zellen des Bacillus NRRL B 5656 wurden kultiviert, die Zellen dann aus der Fermentationsbrühe durch Zentrifugieren auf einer Zentrifuge mit selbstreinigendem Korb gewonnen und der pH-Wert auf 63 eingestellt Überschlägig enthielt das Konzentrat angenähert 10 Gew.-%/Volumen an Trockensubstanz und etwa 40% intakte Zellen.

Zu 1 kg Konzentrat wurden 38 ml käuflicher Glutaraldehyd 50% zugesetzt; zur Vermischung des Glutaraldehyds mit dem Konzentrat wurde ausreichend durchgemischt Die Reaktionsmasse wurde dann bei Raumtemperatur in Ruhe stehen gelassen. Nach einer Stunde gelierte das Reaktionsgemisch zu einer zusammenhängenden Masse mit angenähert der Konsistenz von Quark. Die Masse wurde durch leichtes Rühren aufgebrochen end mit zwei Volumen deionisiertem Wasser gewaschen: das Wasser wurde abgezogen.

Die Gel-Stücke wurden dann in einen Vakuum-Trommeltrockner gebracht, wo die Masse von etwa 1 kg Gewicht bei 50⁰C auf ein Gewicht von etwa 130 g entwässert wurde. Im Verlauf der Entwässerung gingen die weichen Gel-Stücke in ein zähes, in der Dimension stabiles Material über. Die entwässerten Stücke wurden dann 40 in Teilchen von weniger als 1 mm Durchmesser zerkleinert Die Ausbeute an Enzym war von Verfahrensansatz

Ϊ zu Verfahrensansatz verschieden und betrug 50 bis 60% der anfänglichen Aktivität Etwa 15% des Produkts

stellten aber übermäßig feines Material (mit einer Teilchengröße im Bereich von 1 bis 70 μπι) dar.

Beispiel II

Immobilisierung durch Gefrieren

1 kg Zellschlamm wurde wie ^;ji Beispiel I (40% intakte Zellen) hergestellt. Beispiel I wurde dann wiederholt bis auf den Schritt der Bereitung eines Gemisches aus Glutaraldehyd-Zellkonzentrat und einer gelierten Masse.

Danach wurde das Gel (in seinem Behälter) in tiefe Kälte verbracht und über Nacht stehen gelassen. Am nächsten Tag wurde das Gel bei Raumtemperatur aus dem gefrorenen Zustand aufgetaut; es wurde eine wäßrige Masse erhalten. Unter Rühren wurde noch mehr Wasser zugegeben und dann wurde das Wasser abgezogen. Das Produkt wurde dann in einem Trommeltrockner auf ein Gewicht von etwa 130 g getrocknet. Das Endprodukt bestand aus schwammigen, etwas schuppig erscheinenden Teilchen. Die Ausbeute an erkennbarer Aktivität variierte mit 60 bis 70% von Verfahrensansatz zu Verfahrensansatz. Feinteiliges hatte sich aber nicht gebildet.

Beispiel III
Immobilisierung mit einem Flockungsmittel

1550 Liter einer Kufturbrühe aus einer Fermentation des Glukose-Isomerase erzeugenden Bacillus coagulans NRRL B 5656 würden durch Zentrifugieren bei 10⁰C konzentriert und ergaben einen Schlamm mit etwa 12 g Trockengewicht (105° C) je 100 ml Konzentrat

11 kg dieses'Konzentrats (pH 7,9) wurden bei 20⁰C über 3 Stunden unter leichtem Rühren stehen gelassen, um den Zellen des Bacillus coagulans die Autolyse zu ermöglichen. Der pH-Wert wurde mit verdünnter Essigsäure auf 6,5 eingestellt. Dem Schlamm mit 83% der ursprünglichen Aktivität in löslicher Form wurden 330 ml 50%iger Glutaraldehydlösung zugegeben; es wurde eine Konzentration von etwa 1,5% Glutaraldehyd

GewTVoI. im Reaktionsgemisch erhalten. Nach einer Stunde wurde das teilweise vernetzte Gel nach Zusatz von 20 Litern deionisiertem Wasser heftig gerührt. Zu der so erhaltenen Suspension wurden 80 ml einer 3O°/oigen

Lösung von Drewfloc EC 25 gegeben, um eine klare Lösung zu gewinnen. Das Wort »Drewfloc« ist ein Warenzeichen. Die Suspension wurde filtriert, um möglichst viel Wasser abzutrennen. Der Filterkuchen wurde im Vakuum bei 35°C getrocknet, der getrocknete Filterkuchen wurde auf eine Teilchengröße von weniger als

300 μπι gemahlen. Die Aktivität wurde durch Isomerisation mit einem sprühgetrockneten Pulver bestimmt, das

aus dem Konzentrat hergestellt war, das als Beziigsmittel diente. Die Bedingungen waren: pH = 7,0,65°C 0,1 g

CoSO₄ - 7 H₂O je Liter und 2,0 g MgSO₄ · 7 H₂O je Liter, 40% Glukose GewJGew. Der Einsatz wurde mit ge

Stickstoff durchgespült. Die erkennbare Aktivität des immobilisierten Enzyms betrug 70% mehr als das Ben- |

zugsmittel. Nach Gebrauch wurde das immobilisierte Enzym abfiltriert und wiederverwendet Dies wurde fünf Mal durchgeführt, und nach fünf aufeinander folgenden Wiederverwendungen zeigte die Aktivität keinen

merklichen Abfall

Ein zweiter Teil des autolysierten Zellkonzentrats wurde mit 20 ml 30%igem Drewfloc EC 25 je kg Schlamm behandelt, woran sich die Reaktion mit 1,4% Gew/Vol. Glutaraldehyd anschloß. Es wurden praktisch die gleichen Ergebnisse erhalten.

Beispiel IV

Homogenisat (vernetzt)

12 Liter des nach Beispiel III hergestellten Schlamms wurden homogenisiert, um durch Aufbrechen der Zellen freies Enzym und andere intrazellulare Proteine zu erhalten. Bei einem pH-Wert von etwa 7,5 wurde das homogenisierte Zellkonzentrat durch einen Homogenisator mit einer einstufigen Homogenisierungs-Regelanordnung gepumpt Der Druckverlust betrug 400 kg/cm². Das Homogenisat mit mehr ais 95% Aktivität in löslicher Form wurde mit 40 ml/Liter einer Lösung von 50% GewYGew. Glutaraldehyd zur Reaktion gebracht, um eine Konzentration von etwa 2,0% Gew7Gew. Glutaraldehyd in der Lösung zu ergeben. Nach einer Reaktion von einer Stunde bei Raumtemperatur wurde das Gel mechanisch gebrochen, mit 20 Litern deionisiertem Wasser verdünnt und gemäß Beispiel I weiter behandelt. Das anfallende Produkt war zufriedenstellend.

Beispiel V

Zusatz von Flockungsmittel zu einem Homogenisat nach dem Zusatz von Glutaraldehyd

12 I iter eines Schlamms, der nach der Beschreibung in Beispiel III erzeugt wurde, wurden unter den Voraussetzungen nach Beispiel IV homogenisiert Mehr als 95% der Aktivität erwiesen sich als löslich. Zu dem Homogenisat von einem pH-Wert von 7,0 und einer Temperatur von 15°C wurde eine Lösung von 50% f

GewiGew. Gluiaraidehyd hinzugefügt, um eine Konzentration von 2,0% Gew/Gew. Giutaraidehyd in der Lösung zu ergeben. Nach einer Reaktionszeit von einer Stunde wurde das Gel mechanisch gebrochen, mit zwei Volumen Wasser verdünnt und der pH-Wert wurde auf 7,5 eingestellt Es wurden 150 ml Drewfloc EC 25 30% GewVGew. zugesetzt, um in der Suspension eine klare Wasserphase zu gewinnen. Das Gemisch wurde in einer Platten- und Rahmenpresse filtriert; die Rahmentiefe betrug 15 mm. Der Filterkuchen wurde mn Druckluft belüftet, um einen Teil des freien Wassers zu entfernen. Der belüftete Filterkuchen wurde in einem Achsial-Extruder extrudiert, der mit einer Siebplatte mit Löchern von 0,8 mm versehen war. Das Produkt wurde in einem Wirbelbett-Trockner mit einer Lufttemperatur am Eintritt von 50⁰C getrocknet.

300 g davon wurden in eine ummantelte Kolonne verbracht; bei einer Temperatur von 6O⁰C und bei einem pH-Wert von 7,2 wurde eine 40% Gew/Gew. Lösung von Glukose mit einer Geschwindigkeit von 1 Liter/Std. durch die Kolonne gepumpt. Die Konversion betrug 43%. Die Glukoselösung enthielt 0,1 g COSO4 ■ 7 H₂O und 2,0 MgSO₄ -7 H₂O je Liter.

Beispiel VI &

Herstellung eines Konzentrats aus einer Fermentatior.jbrühe und ihre Immobilisierung

1000 Liter Brühe aus einer Fermantation des Glukose-lsomerase enthaltenden B.coagulans NRRL B 5656 wurden bei 10⁰C durch Zentrifugieren in einem selbstreinigenden Separator konzentriert, um einen Schlamm mit 12 g Trockengewicht je 100 ml Konzentrat und 56% löslichem Enzym zu ergeben. 20 Liter des Konzentrats wurden mit gepufferter 20% Gew^Gew. wässeriger Essigsäure mit einem pH-Wert von 3,5 behandelt, um den pH-Wert des Konzentrats auf 63 zu senken. Dann wurden 800 ml 50% Gew7Gew. wässerige Glutaraldehydlö- |

sung zugegeben, das Gemisch wurde intensiv gemischt und bei 20° C über 45 Minuten gelieren gelassen.

Das so gebildete Gel wurde in 40 Litern deionisiertem Wasser dispergiert und in einer Filterpresse filtriert; der Filterkuchen wurde mit Druckluft in der Filterpresse belüftet, um überschüssiges Wasser zu entfernen. Der teilweise getrocknete Filterkuchen (11,6 kg) wurde in einem Oszillationsgranülator mit einem Sieb Nr. 18 granuliert und in einem Trockenofen bei einer Temperatur von 35°C getrocknet; es fielen 2,3 kg sehr zäher Teilchen an, die ihre physikalischen Eigenschaften beibehielten, auch nachdem sie in einem 40% Gew./Gew. Glukosesyrup bei einer Temperatur über wenige Tage gerührt worden waren.

Eine Probe der Körnchen (im Größenbereich von 88 bis 300 μ) wurde dann über 20 Stunden bei 65°C in einem wässerigen Medium gerührt, das aus 40% GewVGew. Glukose, 0,1% Gew/Vol. MgSO₄ · 7 H₂O und 0,01% J

Gew./Vol. COSO4 · 7 H₂O bei einem pH-Wert von 6,6 bestand; sie ergab 63% der erkennbaren Aktivität eines

sprühgetrockneten Pulvers aus dem ursprünglichen Konzentrat, getestet unter identischen Bedingungen.

Ein wie oben aus dem gleichen Schlamm hergestellter und vernetzter Filterkuchen wurde mit einem Achsial-Extruder mit einer Siebgröße von 0,5 mm extrudiert und in einem Wirbelbett mit einer Lufttemperatur am Einlaß von 60⁰C getrocknet woraus zylindrische Teilchen mit sehr naher Größenverteilung erhalten wurden. Beim Test, wie oben beschrieben, zeigten sie 52% erkennbare Aktivität, verglichen mit dem sprühgetrockneten Bezugspulver.

Ein Teil des gleichen Zellkonzentrats wurde mit Glutaraldehyd bei einem pH-Wert von 6,3 vermischt um eine Konzentration von 1,2% zu erhalten, und in Schalen gegossen,"die in einen Trockenofen mit Luftumwälzung bei 50⁰C gestellt wurden. Die erhaltenen Kuchen wurden in einem Mörser zerrieben und wie oben beschrieben «o getestet 48% der erkennbaren Aktivität verglichen mit dem sprühgetrockneten Bezugspulver, wurden erhalten.

10 Liter des gleichen Zellkonzentrats wurden in einem Homogenisator bei 395 bar homogenisiert; das Homogenisat besaß mehr als 95% der Aktivität in löslicher Form.

100 ml des Homogenisats wurden 20 Minuten mit 5 ml 20% Gew/Gew. Glutaraldehydlösung bei einem pH-Wert von 6,8 gerührt, als 1 cm dicke Schicht auf einer Oberfläche ausgebreitet, bei einer Temperatur von is 20⁰C getrocknet und in einem Mörser zu 11,6 g Teilchen zerrieben. Die Teilchen wurden 20 Minuten in 200 ml deionisiertem Wasser gerührt und getrocknet; es wurden 6,7 g zäher Teilchen erhalten.

Die zähen Teilchen wurden in eine ummantelte Kolonne verbracht die bei einer Temperatur von 65⁰C gehalten wurde; in diese wurde eine Beschickung aus 40% Gew/VoL Glukose und 0,1% Gew/Vol. MgSO₄ · 7 H2O mit einem pH-Wert von 7,8 mit 45 ml/Std. eingeführt Nach 44 Stunden zeigte sich eine Konversion von 45.2%.

Beispiel VIl
Gefrieren des Konzentrats

1000 Liter Brühe aus einer Fermentation des Glukose-Isomerase enthaltenden B. coagulans wurden durch Zentrifugieren auf einem Separator bei 10⁰C konzentriert und ergaben einen SQhlamm mit 12 g Trockengewicht je 100 ml Schlammkonzentrst Dieser Schlamm wurde der Autolyse über 8 Stunden bei einer Temperatur von 15° C bei einem pH-Wert von 7,2 überlassen. Als lösliche Aktivität wurden 48% gefunden.

10 Liter des autolysierten Schlammkonzentrats wurden auf 5° C herabgekühlt, intensiv mit 30OmI 30% GewVGew. Glutaraldehydlösung vermischt, in eine Schale gegossen und in eine Temperatur von -2O⁰C zum Frieren eingebracht Nach Beendigung der Gefrierbehandlung wurde das gefrorene Konzentrat bei einer Temperatur von 20°C.-.ufget£-.t; die gebildete, schwammige Masse wurde in 20 Litern deionisiertem Wasser dispergiert, in einer Korhzentrifuge mit groben Filtertuch filtriert, in einem Oszillationsgranulator mit einem Sieb von 2,794 mm Maschenweit - granuliert und in einem Wirbelbett-Trockner mit einer Temperatur von 6O⁰C am Einlaß zu faserigen, porösen Körnern getrocknet

Eine Probe der Körner (im Größenbereich von SS bis 300 μΐή) wurde 20 Stunden bei einer Temperatur von 65° C in einem wässerigen Medium gerührt, das aus 40% GewYGew. Glukose, 0,2% Gew/Vol. MgSO₄ · 7 H₂O und 0,01% Gew/Vol. CoSO₄ · 7 H₂O mit einem pH-Wert von 6,6 bestand; es wurden 79% der erkennbaren Aktivität eines sprühgetrockneten Pulvers des ursprünglichen Konzentrats, getestet unter itientischen Bedingungen, erhalten.

Körner, die, wie oben beschrieben, aber unter Auslassung des Trocknungs-Schritts hergestellt wurden, waren weniger hart, aber sehr zäh. Sie zeigten 81 % der erkennbaren Aktivität.

Beispiel VIII

Unterschiedliche Enzym-Konzentrationen

3 Teile, jeder von 100 ml, des Homogenisats nach Beispiel VI mit mehr als 95% löslichem Enzym, wurden in der folgenden Weise behandelt:

(a) mit 10 ml 20% Gew/Vol. Glutaraldehyd bei einem pH-Wert von 6,8 vermischt;
(b) wie (a), aber zuerst mit 100 ml deionisiertem H2O verdünnt;

(c) wie (a), aber zuerst mit 200 ml deionisiertem H2O verdünnt.

Alle wurden bei einer Temperatur von — 18°C gefroren, dann bei einer Temperatur von 200⁰C aufgetaut; das jeweils gebildete, schwammige Material wurde in 300 ml deionisiertem Wasser dispergiert, filtriert, bei einer Temperatur von 20⁰C getrocknet und granuliert. Jeweils 5 g wurden in einer ummantelten Kolonne bei 65°C, einem pH-Wert von 7,8 bei einer Fließgeschwindigkeit von 30 ml/Std. einer 40% Gew./Gew. Glukoselösung mit 0,1 % GewyVol. MgSO₄ · 7 H₂O und 0,01 % Gew./Vol. CoSO₄ · 7 H₂O nach 20 Stunden getestet. Es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:

% Konversion

(a) 46,4

(b) 45,8

(c) 47,4

Beispiel IX
Vergleich zwischen unterschiedlichen Ausmaßen des Zellaufbruchs

Es wurden ein Konzentrat (60% Zellbruch) und ein Homogenisat (mehr als 95% Zellbruch) wie nach Beispiel VI hergestellt.

Jeweils 200 ml davon wurden 20 Minuten mit 8 ml 50% Gew7Gew. Glutaraldehydlösung gemischt, bei einer Temperatur von —20° C gefroren, bei einer Temperatur von 20° C aufgetaut; das so gebildete Produkt wurde abgepreßt, aufgebrochen, 20 Minuten in 1 Liter deionisiertem Wasser gerührt, durch einen Büchnertrichter filtriert, auf de-,n Filter abgepreßt, erneut in 1 Liter deionisiertem Wasser dispergiert, erneut filtriert, bei einer Temperatur von 20° C getrocknet und granuliert Je 5 g des Granulats wurden in Kolonnen wie in Beispiel VI bei einer Fiießgeschwindigkeit von 30 ml je Stunde getestet Nach 20 Stunden wurden folgende Ergebnisse erhalten:

% Konversion

Konzentrat 40,0

Homogenisat 45,1

Bei der Härteprüfung nach Abschluß des Versuchs erwiesen sich die Partikeln aus dem Konzentrat als weich, die Partikeln aus dem Homogenisat jedoch waren zäh.

Ein Verfahrensansatz aus praktisch nicht gebrochenen Zellen von Arthrobacter B 3726 wurde 'se der gleichen Weise behandelt; es zeigte sich aber, daß eine zufriedensieiiende Immobilisierung unmöglich war, da stabile, geformte Körper nicht erzeugt werden konmen.

B e i s ρ i e 1 X

Vergleich zwischen unterschiedlichen Ausmaßen des Zellenaufbruchs

Es wurde ein Konzentrat »a« mit 56% Zellbruch und die Hälfte davon »b« mit mehr als 95% Zellbruch wie in Beispiel VI hergestellt

Jeweils 200 ml davon wurden mit 8 ml 50% GewVGew. Glutaraldehydlösung 20 Minuten gemischt, bei einer Temperatur von — 20° C gefroren und bei einer Temperatur von 20° C aufgetaut; das so gebildete, schwammige Produkt wurde abgepreßt, aufgebrochen, 20 Minuten in 1 Liter deionisiertem Wasser gerührt, durch einen Büchnertrichter filtriert, auf dem Filter abgepreßt, erneut in 1 Liter deionisiertem Wasser dispergiert, erneut filtriert, bei einer Temperatur von 20° C getrocknet und granuliert Je 5 g wurden in Kolonnen wie in Beispiel VI mit 40% GewVGew. Glukose bei einer Fließgeschwindigkeit von 30 ml/Std. getestet Nach 20 Stunden wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:

% Konversion

(a) 40,9

(b) 45,1

Bei der Härteprüfung nach Versuchsabschluß erwiesen sich (a) als weich, (b) aber als zäh.

45 Beispiel XI

Bedarf an Glutaraldehyd, Konzentrat und Homogenisat

Es wurde wie in Beispiel X, aber mit unterschiedlichen Glutaraldehydkonzentrationen, Körner aus dem Konzentrat (55% Zellbruch) und dem Homogenisat (96% Zellbruch) hergestellt; sie wurden 20 Stunden in deionisiertem Wasser bei einer Temperatur von 60° C gerührt und nach der folgenden Methode auf ihre Härte überprüft: die Partikel wurden zwischen zwei Fingern so fest wie möglich ausgepreßt und die Ergebnisse nach der folgenden Skala ausgedrückt:

Skala	Einzelheiten
1	vollkommen »teigig«
2	»teigig«
	bis zu einem wesentlichen Grad
3	»teigig«
	nur bis zu einem geringen Grad
4	nicht »teigig«, zäh
5	sehr zäh
6	außerordentlich zäh

Die geringste, für industrielle Zwecke vermutlich geeignete Härte wird mit 3 oder 4 angesehen.

Corner ergäbe	25 37 :n die folgenden R	993 esultate	Homogenisat	Wirkung des Auftauens
% Glutar- aldehyd	Härteskala Konzentrat		2-3 4 5 6
1,0 1,5 2,0 2,5	+ 1 2 3-4
⁺ zu weich zum Granulieren.
	XIl

Beispiel

Ein wie in Beispiel VI hergestelltes, unhomogenisiertes Konzentrat mit 56% löslichem Enzym wurde in zwei Teile geteilt: eine Hälfte wurde bei einer Temperatur von 3°C mit 10 ml 20% Gew7Gew. Glutaraldehydlösung je 100 ml Konzentrat bei einem pH-Wert von 6,8 Ober 2 Minuten gerührt, in einem Äthanol/Trockeneis-Bad gefroren, bei einer Temperatur von 20⁰C tauen gelassen, in deionisiertem Wasser dispergiert, durch einen Büchnertrichter filtriert, auf dem Filter ausgepreßt und bei einer Temperatur von 20° C getrocknet. Die andere Hälfte wurde in der gleichen Weise behandlet, aber nicht aufgetaut, sondern gefrierbetrocknet. 5 g Partikeln aus jedem Prozeß wurden dann wie in Beispiel VI mit einer Fließgeschwindigkeit von 30 ml/Std. getestet. Nach J₅ 20 Stunden wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:

Prozeß % Konversion

(a) Gefrieren, Tauen 37,8

(b) Gefriertrocknen 35,6

Ein homogenisiertes Konzentrat (200 ml), hergestellt wie in Beispiel VI₁ mit mehr als 95% löslichem Enzym wurde in der gleichen Art behandelt, gefroren und aufgetaut; es entstanden 19,1 g zähe Partikeln, die beim Test nach 20 Stunden bei einer Fließgeschwindigkeit von 24 ml/Std. eine Konversion von 42,4% von 40% Gew7Gew. Glukosesyrup zeigten.

Beispiel XIII
Einzelheiten des Gefrierens

Ein homogenisiertes Konzentrat mit 93% löslichem Enzym wurde, wie in Beispiel XlI, mit Glutaraldehyd umgesetzt, unter Rühren in einem Äthanol/Trockeneis-Bad gefroren und dann aufgetaut. Die erhaltenen Partikeln glichen den vergleichbaren Partikeln aus dem Homogenisat nach Beispiel XII.

Ein gleiches Präparat wurde durch Zusatz von Trockeneis zu dem querverbundenen Gemisch gefroren. Es gefror in nur wenigen Minuten. Die erhaltenen Partikeln waren weniger faserig und mehr porös.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Ein enzymatisch/physikalisch stabiles, wasserunlösliches Glukose-Isomeres-Produkt aas Zellen von Mikroorganismen mit Glukose-Isomerase-Aktivität, hergestellt durch Umsetzung eines Zellkonzentrats von mindestens teilweise gebrochenen Zellen von Mikroorganismen, das von 0 bis 75% intakte Zellen und einen Gehalt an Trockensubstanz von 3 bis 30 Gew.-%/Volumen enthält, mit 0,01 bis 1,0 Gewichtsteil Glutaraldehyd je Gewichtsteil Trockensubstanz im Konzentrat in Form eines zusammenhängenden, festen Produkts und anschließende Entwässerung und Formung des Glukose-Isomerase-Produkts.

2. Verfahren zur Herstellung des enzymatisch/physikalisch stabilen, wasserunlöslichen Glukose-Ijomerase-Produkts gemäß Anspruch 1 aus Zellen von Mikroorganismen, wobei man ein Zellkonzentrat und Glutaraldehyd zur Reaktion bringt, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Zellkonzentrat von mindestens teilweise gebrochenen Zellen der Mikroorganismen, das 0 bis 75% intakte Zellen aufweist und einen Gehalt an Trockensubstanz von 3 bis 30 Gew.-%/VoIumen enthält, mit 0,01 bis 1,0 Gewichtsteil Glutaraldehyd je Gewichtsteil Trockensubstanz im Konzentrat zur Reaktion bringt und so ein zusammenhängendes, festes Produkt bildet, und danach entwässert und formt

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man 0,05 bis 03 Gewichtsteile Glutaraldehyd je Gewichtsteil Trockensubstanz im Konzentrat verwendet

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet daß das Aufbrechen der Zellen durch Autolyse oder durch Homogenisation eines Zellkonzentrats erfolgt

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet daß man zum Entwässern und Formea Ji an sich bekannter Weise das zusammenhängende, feste Produkt mit Wasser wäscht, das gewaschene Produkt filtriert und granuliert und dann auf einen Gehalt an Trockensubstanz von mindestens SO Gew.-% trocknet

6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das so erhaltene Zellkonzentrat zur Agglomerierung der Zellen und Zelltrümmer noch mit einem Flockungsmittel behandelt wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6. dadurch gekennzeichnet daß man das zusammenhängende, feste Produkt vor dem Entwässern und Formen zusätzlich gefriert und wieder auftaut