DE19547059A1 - Verfahren zur Herstellung von Difructosedianhydrid III - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Difructose­ dianhydrid III aus Inulin unter Verwendung des Enzyms Inulinase.

Difructosedianhydrid III wird auch als Di-D-Fructofuranose-2′,1 : 2,3′-dianhydrid oder auch abgekürzt als DFA III bezeichnet. Es handelt sich um ein Disaccharid, bei dem zwei Moleküle Fructose durch Kondensation über 1-2′- und 2-3′-Bin­ dungen miteinander verknüpft sind. Es ist seit einigen Jahrzehnten bekannt. Difructosedianhydrid III kann als kalorienarmer Süßstoff eingesetzt werden sowie für diätetische Nahrung. Es besteht daher ein Interesse an einer ent­ sprechenden Herstellung dieses Stoffes.

Nach einem Vorschlag von Tanaka et al. [Biochim. Biophys. Acta 284 (1972), 248] wird er unter Verwendung des Enzyms Inulinase aus Inulin gewonnen. Das Enzym Inulinase ist auch unter anderen Bezeichnungen bekannt, etwa als Fructosyltransferase oder Inulin-D-Fructotransferase, abgekürzt häufig als FTF. Inulin ist ein zur Gruppe der Fructane zählendes Polysaccharid.

Zur Herstellung von Difructosedianhydrid III aus Inulin muß also entsprechendes Enzym bereitgestellt werden.

Zur Gewinnung dieses Enzyms ist es bekannt, verschiedene Bakterienstämme einzusetzen, die in einer wäßrigen Nährlösung als Biomasse fermentiert wer­ den; das Fermentieren von Biomasse entspricht dabei dem Anzüchten von Zellen bzw. Bakterien.

In einer wäßrigen Nährlösung, die eine Vielzahl von Nährsalzen und eine C-Quelle enthält, werden in den bekannten Verfahren bei einem pH-Wert von 7 über 12 bis 40 Stunden die Zellen angezüchtet; während dieser Anzucht bzw. dem Wachsen der Zellen bzw. Bakterien entstehen in diesen die gewünschten Enzyme Inulinase und werden während der Fermentation ausgeschüttet, so daß extrazelluläre Enzyme entstehen. Die Enzyme gelangen so in die sie umge­ bende Lösung mit den Nährstoffen und bilden ein gleichmäßiges Gemisch. Nach etwa 40 Stunden ist der Prozeß abgeschlossen, d. h. die C-Quelle ist ver­ braucht, alle möglicherweise entstehenden Enzyme sind entstanden und befin­ den sich in der Lösung zusammen mit der Bakterienfeuchtmasse, den Nährsal­ zen und etwaigen Resten der C-Quelle.

Es wird anschließend die Biomasse bzw. Bakterienfeuchtmasse mit den Zellen abgetrennt und verworfen; übrig bleibt eine Lösung mit den Enzymen und ge­ ringen Mengen an C-Quelle, ferner bleiben noch die Nährsalze und Wasser.

Im nächsten Schritt wird diese Lösung versetzt mit Inulinlösung und bei 30 bis 60°C zur Reaktion gebracht; die gerade erzeugten Enzyme Inulinase wandeln nun dieses Inulin um in Difructosedianhydrid III. Es entsteht nun eine Mischung, in der neben den Enzymen und dem gewünschten Endprodukt Difructosedian­ hydrid evtl. noch nicht verbrauchtes Inulin, Nährsalze und Wasser enthalten sind.

In einem dritten Verarbeitungsschritt wird die so entstehende Mischung erneut aufgearbeitet. Dabei wird das vorhandene Enzym abgetötet und zerstört (z. B. mittels thermischer Belastung desaktiviert), um an das eigentlich gewünschte Endprodukt Difructosedianhydrid III heranzukommen und es zu isolieren.

Als Verbesserung hierzu wird in der DE 689 15 584 T2 vorgeschlagen, das als C-Quelle hier ebenfalls schon mit eingesetzte Inulin zu einem weiteren Zweck zu nutzen. Schon bei der Anzucht der Zellen in der Biomasse wirken diese durch das Ausschütten der cellulären Enzyme Inulinase natürlich nun auch auf das sie umgebende Inulin, obwohl dessen Hauptzweck in diesem ersten Schritt eigent­ lich nur seine Funktion als C-Quelle für die Enzymentstehung ist. Auch hier wird bei pH-Wert 7 und bei 27 bis 37°C über 12 bis 40 Stunden angezüchtet.

Nach der Anzucht der Biomasse wird bei diesem Verfahren genau das auf diese Weise schon entstandene Difructosedianhydrid III herausisoliert, alle übrigen Bestandteile verworfen. Man erhält nur etwa 10% Ausbeute bezogen auf das eingesetzte Inulin, da der größte Teil des Inulins von den Bakterien metabolisiert wird.

Eine weitere Verbesserung wird in der DE 689 16 301 T2 vorgeschlagen. Dort wird festgestellt, daß das ständige Abtöten der Enzyme eigentlich kontrapro­ duktiv ist und zu wirtschaftlichen Nachteilen führt, weil sie dann regelmäßig in weiteren Schritten erneut hergestellt werden müssen. Es wird dort vorgeschla­ gen, die Enzyme in der Lösung nach dem Entfernen der Biomasse an einen Ionenaustauscher zu fixieren bzw. festzukleben und sie so zurückzuhalten und evtl. mehrfach einzusetzen. Dieses erfordert ebenfalls zusätzliche Verfahrens­ schritte. Ähnliche Vorschläge finden sich in der JP 02-115 193 A2 und der JP 01-285 195 A2.

Aufgabe der Erfindung gegenüber den bekannten Erfindungen ist es, ein weite­ res, noch effektiveres Verfahren zur Herstellung von Difructosedianhydrid vor­ zuschlagen.

Die Lösung dieser Aufgabe besteht in einem Verfahren mit folgenden Schritten:

• - Anzüchten von Zellen bzw. Fermentieren von Biomasse in einer C-Quelle,
• - Abbrechen dieses Prozesses vor Ausschütten nennenswerter Mengen des Enzyms Inulinase aus den Zellen,
• - Trennen der angezüchteten Zellen mit dem darin enthaltenen Enzym von der umgebenden Nährlösung,
• - Hineingeben der abgetrennten, angezüchteten Zellen mit dem darin enthal­ tenen Enzym als Eduktlösung in eine Inulinlösung.

Durch diese Maßnahmen können völlig überraschend die Probleme des Stan­ des der Technik gelöst werden. Zwar werden zunächst ähnlich wie im Stand der Technik die Zellen angezüchtet. Dieser Fermentationsprozeß wird jedoch ab­ gebrochen, bevor er die im gesamten Stand der Technik gewünschte Ausschüt­ tung der Enzyme aus den Zellen in die Umgebung vornimmt: Die Enzyme sind also unverändert in den Zellen enthalten.

Wird jetzt die anfermentierte, aber noch nicht fertig fermentierte Biomasse mit den in den Zellen enthaltenen Enzymen von der umgebenden Nährlösung ge­ trennt, wird das Wachstum abrupt gestoppt.

Das Hineingeben der Biomasse in eine Inulinlösung führt auch nicht dazu, daß die angezüchteten Zellen weiter wachsen oder auch nur dazu, daß sie Enzyme nunmehr frei geben; die Enzyme bleiben unverändert in den Zellen.

Gleichwohl können sie aber auf das umgebende Inulin ihren enzymatischen Einfluß geltend machen und dieses in Difructosedianhydrid III umwandeln.

Da sie diese enzymatische Wirkung als Biokatalysator ausüben, können sie im Batch-Betrieb wiederholt eingesetzt werden.

Gemäß der Erfindung entfällt damit jeder Schritt, der ein Abtöten oder thermi­ sches Deaktivieren der Enzyme bewirkt, was sonst erforderlich ist. Da sich die Enzyme die ganze Zeit über in den Zellen befinden, sind sie immobilisiert und die jeweils interessierenden Inulinmengen können ihnen zugeführt werden. Es wirken also ruhende Zellen als Biokatalysator. Zusammengefaßt wird also zu­ nächst ähnlich dem Stand der Technik die Biomasse angezüchtet, wobei aller­ dings der pH-Wert bevorzugt nicht bei pH 7 konstant gehalten wird, sondern während des Fermentationsvorganges auf etwa pH 3 bis pH 4 gesenkt wird.

Während aber im Stand der Technik diese Fermentation voll durch reagiert, wird sie gemäß der Erfindung zu einem bestimmten Zeitpunkt abgebrochen. Dieser Zeitpunkt liegt bevorzugt im Bereich um 9 Stunden, und zwar recht genau bei 9 ± 2 Stunden, ja sogar 9 ± ½ Stunde.

Durch dieses Abbrechen stellt sich heraus, daß die Enzyme in den Zellen der Biomasse zwar schon entstanden sind, sich jedoch noch in den Zellen befinden und noch nicht in die umgebende Lösung ausgeschüttet wurden. Es handelt sich also um intracelluläre Enzyme, nicht um extracelluläre Enzyme wie im Stand der Technik. Es wird daher im Gegensatz zum Stand der Technik nicht etwa die Biomasse verworfen, sondern es wird vielmehr die Biomasse weiterge­ nutzt und statt dessen die Lösung mit den Restbestandteilen der C-Quelle (auch als C-Quelle wird bevorzugt eine Inulinlösung eingesetzt), Nährsalzen usw. verworfen oder abgetrennt.

Bei Messungen stellte sich darüber hinaus noch heraus, daß die Aktivität in 20 g der Biofeuchtmasse in diesem Verfahren unerwartet so hoch ist, wie im Stand der Technik bei einem ganzen Liter Lösung.

Die Biofeuchtmasse mit den enthaltenen Enzymen wird erfindungsgemäß nun in eine Inulinlösung gegeben, bevorzugt mit einer Konzentration von 1% bis 40%, besonders bevorzugt von 15% ± 5%. Bei diesen Bedingungen ist keine Anzucht bzw. Weiterzucht der Zellen möglich, weil keine Nährlösung mehr vorhanden ist. Dadurch entfalten die intracellulären Enzyme die gewünschte katalysatorische Wirkung auf die sie umgebende reine Inulinlösung und setzen das Inulin in Difructosedianhydrid III um, ohne dabei zerstört zu werden oder sich mit Inulin oder dem Difructosedianhydrid III zu vermischen. Statt einer nur einmaligen Benutzung der Enzyme wie im Stand der Technik werden diese also dauernd nutzbar, ohne ständig neu gezüchtet werden zu müssen.

Es gibt einen unerwartet steilen Peak bei ziemlich genau 9 Stunden Verfah­ rensdauer, bei dem die Menge der gebildeten intracellulären Enzyme pro Volu­ men ein extrem hohes Maximum erreicht, also auch eine besonders hohe Aktivi­ tät entsteht.

Auch wenn man die Bedingungen nicht optimiert, ist aber die erfindungsgemäße Idee, die Enzyme Inulinase als intrazelluläre Enzyme einzusetzen, noch sinnvoll und nützlich, da sie eine Wiederverwendung der Enzyme in relativ beliebiger Anzahl bzw. Zeitdauer erlaubt.

Als besonders geeignet haben sich Zellen von Arthrobacter-ureafaciens ATCC 21124 erwiesen.

Der Immobilisierungsgrad kann noch weiter dadurch verbessert werden, daß die angezüchteten Zellen der abgetrennten, fermentierten Biomasse zusätzlich mit Alginat durch ionotrope Gelbildung immobilisiert und/oder quervernetzt werden, vorzugsweise mittels Glutardialdehyd.

In beiden Fällen konnte eine leichtere Abtrennung des Katalysators von der Produktlösung, sogar eine kontinuierliche Prozeßführung und eine Erhöhung der Katalysatorstabilität erzielt werden. Es ist möglich, die Inulinlösung in diesen Fällen kontinuierlich über die immobilisierte Biomasse hinwegströmen zu lassen.

Als Inulinlösung kann neben oder anstatt einer reinen Inulinlösung auch ein flüssiger Extrakt von Pflanzen mit einem hohen Inulingehalt eingesetzt werden, insbesondere von Zichorie oder Jerusalem Artichoke (Helianthus tuberosus), ggf. nach Abtöten der Biomasse.

Die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Enzyme besitzen ge­ genüber extracellulären Enzymen auch eine höhere Thermostabilität; es wurden auch überraschend hohe Standzeiten erzielt.

Bei alternativer Wahl eines Batch-Betriebes konnte die aktive Biofeuchtmasse mit den enthaltenen Enzymen wiederholt mit Inulinlösung zur Reaktion gebracht, nach Beendigung der Reaktion wieder abgetrennt und erneut in einer weiteren Reaktion eingesetzt werden.

Dabei und auch bei kontinuierlichem Betrieb erfolgt bevorzugt die Umsetzung der Biofeuchtmasse mit der Inulinlösung bei 30 bis 60°C in einem pH-Bereich von 4,0 bis 7,0; die höchste Aktivität der intracellulären Enzyme wurde bei pH 5,5 und 60°C festgestellt. Die Enzyme sind über einen großen Bereich von pH 4,0 bis pH 10,0 über längere Zeit stabil, bei 60°C über 4 Stunden und bei 45°C über 72 Stunden. Bevorzugt wird daher zur Optimierung von Aktivität und Stabilität die Reaktion bei 45°C und pH 5,5 durchgeführt.

Bei Immobilisierung mit Alginat erhöhten sich die Standzeiten weiter auf mehr als 900 Stunden bei 45°C und pH 5,5.

Im folgenden werden einige bevorzugte Ausführungsformen und Reaktionsbei­ spiele aufgeführt:

1. Beispiel

Ein Kulturmedium (100 m) bestehend aus 6 g/l Inulin, 2 g/l Dinatriumhydrogen­ phosphat, 1 g/l Kaliumdihydrogenphosphat, 1 g/l Ammoniumnitrat, 0,5 g/l Mag­ nesiumsulfat, 0,01 g/l Eisensulfat, 0,03 g/l Calciumsulfat, 0,5 g/l Hefeextrakt, das auf pH 7,0 eingestellt wurde, wurde im Autoklaven 20 Minuten bei 120°C sterilisiert. Die sterile Lösung wurde mittels einer Platinimpföse mit dem Bakte­ rium (Arthrobacter ureafaciens oder Arthrobacter ilicis) angeimpft und die ange­ impfte Lösung 10 Stunden bei 27°C in einem Schüttelschrank bei 150 Upm in­ kubiert. Nach Beendigung der Kultivierung wurden die Zellen durch Zentrifu­ gation abgetrennt.

Der zeitliche Verlauf der Anzucht von Arthrobacter ureafaciens ATCC 21124 ist in der beigefügten Figur beispielhaft dargestellt. Nach rechts ist die Zeit in Stun­ den während der Anzucht angegeben, darüber ist die Aktivität BTM in u/g BTM aufgetragen.

Es zeigt sich, daß ein erstaunlich scharf begrenztes Maximum der Aktivität bei etwa 9 Stunden nach Versuchsbeginn auftritt und die Aktivität bei längerer Dauer sehr deutlich abnimmt. Mit diesem Verlauf ist vor der Erfindung nicht zu rechnen gewesen, da bei einer erfolgreichen Anzucht im Regelfall die Aktivität mehr oder weniger kontinuierlich zunehmen sollte. Im vorliegenden Fall wird diese besondere Entwicklung nun erfindungsgemäß ausgenutzt.

Die Biofeuchtmasse (1 g) wurde zu 50 ml 15%iger Inulinlösung, die mit 0,02 M Phosphatpuffer auf pH 5,5 gepuffert wurde, gegeben. Die Reaktion erfolgte 4 Stunden bei 40°C. Nach Reaktionsende wurde die Biomasse mittels Zentrifuga­ tion abgetrennt und erneut zu 50 ml Inulinlösung (auf pH 5,5 gepuffert) gege­ ben. Die Reaktion erfolgte wieder 4 Stunden bei 40°C. Anschließend wurde noch eine dritte Reaktion unter identischen Reaktionsbedingungen durchge­ führt. In den drei Reaktionslösungen wurden die gebildete Menge an DFA-III durch High Performance Liquid Chromatography bestimmt.

In der 1. Reaktion wurden 3,97 g DFA-III, in der 2. Reaktion 3,95 g DFA-III und in der 3. Reaktionslösung 3,94 g DFA-III produziert.

2. Beispiel

Die Biomasse wurde in einem 15 l Fermenter unter sterilen Bedingungen über zwei Vorkulturen angezüchtet. Die Anzucht der Vorkulturen und der Hauptkultur erfolgten wie in Beispiel 1 beschrieben. Nach Beendigung der Hauptkultur wurde die aktive Biomasse (120 g) durch Zentrifugation abgetrennt und zu 6 l 15%iger Inulinlösung gegeben. Nach 4 Stunden bei 40°C waren 480 g DFA-III gebildet worden. Die Reaktion wurde mit derselben Biomasse mehrfach wie­ derholt.

3. Beispiel

Die Biomasse wurde in einem 3000 l Fermenter unter sterilen Bedingungen über vier Vorkulturen angezüchtet. Die Anzucht der Vorkulturen und der Hauptkultur erfolgten wie in Beispiel 1 beschrieben. Nach Beendigung der Hauptkultur wurde die aktive Biomasse (28 kg) durch Zentrifugation abgetrennt und zu 720 l 15%iger Inulinlösung gegeben. Nach 4 Stunden bei 40°C waren 57,2 kg DFA-III gebildet worden. Die Reaktion wurde mit derselben Biomasse mehrfach wieder­ holt.

4. Beispiel Immobilisierung der ruhenden Zellen durch ionotrope Gelbildung mit Alginat und Ca²⁺-Ionen

Die ruhenden Zellen (Biofeuchtmasse:BFM), die einen Trockensubstanzgehalt von 10-20% aufweisen, werden in einer 3%igen Na-Alginatlösung suspen­ diert. Die Suspension wird mittels einer Immobilisierungsapparatur nach Hackel als kleine Tropfen in eine 2%ige CaCl₂-Lösung überführt. Dadurch werden die Na⁺-Ionen des Alginats gegen Ca²⁺-Ionen ausgetauscht, so daß das Alginat schlagartig geliert und stabile, wasser­ unlösliche Kugeln (Perlen) bildet. Der so erstellte Biokatalysator (Katalysatorfeuchtmasse: KFM) kann nun zur Umsetzung von Inulin zu Difructo­ sedianhydrid III eingesetzt werden. Bei der Beladung des Katalysators, die sich aus dem Verhältnis BFM/KFM ergibt, wurden Beladungen von 5-30% reali­ siert.

Die Stabilität des Katalysators kann durch Quervernetzung der Biofeuchtmasse vor der Immobilisierung mittels Calciumalginat mit Glutardialdehyd erhöht wer­ den.

5. Beispiel

Immobilisierung der ruhenden Zellen durch Quervernetzung mit Glutardialdehyd. Die Quervernetzung der Bakterienzellmasse erfolgt durch Zugabe von Glutar­ dialdehyd zu einer Suspension von 20 mg Biotrockenmasse in 1 ml 0,1 m wäß­ rigen Phosphatpufferlösung bis zu einer Glutardialdehydkonzentration von 0,5. Die Suspension wird 3,5 Stunden bei 20°C gerührt und mehrmals mit Wasser gewaschen.

Claims (12)

1. Verfahren zur Herstellung von Difructosedianhydrid III aus Inulin unter Ver­ wendung des Enzyms Inulinase, gekennzeichnet durch folgende Schritte:

• - Anzüchten von Zellen bzw. Fermentieren von Biomasse in einer C-Quelle
• - Abbrechen dieses Prozesses vor Ausschütten nennenswerter Mengen des Enzyms Inulinase aus den Zellen
• - Trennen der angezüchteten Zellen mit dem darin enthaltenen Enzym von der umgebenden Nährlösung
• - Hineingeben der abgetrennten, angezüchteten Zellen und dem darin ent­ haltenen Enzym als Eduktlösung in eine Inulinlösung.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Abbrechen des Fermentierungsprozesses nach 9 ± 2 Stunden er­ folgt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Abbrechen des Fermentierungsprozesses nach 9 Stunden ± ½ Stunde erfolgt.

4. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als C-Quelle ebenfalls eine Inulinlösung, allerdings mit Zusatz von Nähr­ salzen, verwendet wird.

5. Verfahren nach einem der vorstehende Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die abgetrennte, fermentierte Biomasse mit den angezüchteten Zellen und dem darin enthaltenen Enzym in eine Inulinlösung mit einer Konzentra­ tion von 1% bis 40%, insbesondere von 15% ± 5% gegeben wird.

6. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die abgetrennte, fermentierte Biomasse mit den angezüchteten Zellen und dem darin enthaltenen Enzym als immobilisierte, ruhende Masse ange­ ordnet wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die angezüchteten Zellen der abgetrennten, fermentierten Biomasse zusätzlich mit Alginat durch ionotrope Gelbildung immobilisiert und/oder quervernetzt werden, vorzugsweise mittels Glutardialdehyd.

8. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß eine Biomasse aus Zellen von Arthrobacter ureafaciens, insbesondere von Arthrobacter ureafaciens ATCC 21124, verwendet werden.

9. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert während der Fermentation auf einen Wert zwischen pH 3 und pH 4 abgesenkt wird.

10. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion der abgetrennten, fermentierten Biomasse mit der Inulinlö­ sung bei 30 bis 60°C, insbesondere bei 45°C, durchgeführt wird.

11. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion der abgetrennten, fermentierten Biomasse mit der Inulinlö­ sung bei pH 4,0 bis pH 10,0, insbesondere bei pH 5,5, durchgeführt wird.

12. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die fermentierte und/oder immobilisierte Biomasse mehrfach eingesetzt wird.