DE3201427A1

DE3201427A1 - Verfahren zur herstellung von fetten und oelen

Info

Publication number: DE3201427A1
Application number: DE19823201427
Authority: DE
Inventors: Dennis L. 63046 High Ridge Mo. Gierhart
Original assignee: Unilever Bestfoods North America
Current assignee: Unilever Bestfoods North America
Priority date: 1981-01-19
Filing date: 1982-01-19
Publication date: 1982-09-02
Also published as: CA1174619A; GB2091286B; JPH0418838B2; AU550547B2; NZ199218A; AR231307A1; GB2091286A; AU7864181A; JPS57144987A

Description

DR. A. VAN DER WERTH DR. FRANZ LEDERER R- F. MEYER-ROXLAU

DlPL-ING. C1934-1974) DIPL-CHEM. DIPL-ING.

8000 MDNCHEN 80 LUCILE-GRAHN-STRASSE 22

TELEFON: (0 89) 47 2947 TELEX: 624624 LEDER D

CPC International Inc. telegr, ledererpatent

International Plaza _{19# Januar 1982}

Englewood Cliffs, N.^J. 07632 3239

USA

Verfahren zur Herstellung von Fetten und ölen

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Fetten und Ölen, insbesondere an Triglyceriden reichen Fetten und ölen, aus mikrobiellen Quellen.

Es ist gut bekannt, daß Fette und öle durch Züchten eines Öl-synthetisierenden Mikroorganismus erzeugt werden können, wozu Algen, Bakterien, Schimmelpilze und Hefe gehören. Solche Mikroorganismen synthetisieren öle und Fette in ihrem gewöhnlichen Zeil-StoffWechselablauf. Ausgedehnte Forschung erfolgte in dem Bemühen, Mikroorganismen, Medien und Bedingungen festzustellen, die eine wirtschaftlich praktische ölerzeugung ermöglichen würden.

Ein Gebiet der Erzeugung von Fetten und ölen durch Fermentation, das besondere Aufmerksamkeit gefunden hat, ist das Gebiet der Erzeugung von Kakaobutter-Ersatzstoffen. Kakaobutter ist eine natürlich auftretende Substanz, die große Mengen 1,3-disubstituierter, 2-ungesättigter Triglyceride enthält. Diese Triglyceride umfassen 1-Stearoyl-2-oleoyl-3-palmitoyl-triglyceride und 1 , S-Dipalmitoyl^-oleoyl-triglyceride. Ein Verfahren zur Erzeugung von Triglyceriden, die reich an

den vorstehenden Verbindungen sind, ist in der US-PS 4 032 405

beschrieben.

Wie in dieser Patentschrift beschrieben, wird ein Kakaobutterersatz durch Züchten eines Mikroorganismus des Stammes Endomyces, Rhodotorula, Lipomyces oder Rhodosporidium unter aeroben Bedingungen, anschließendes Sammeln der Zellen und Isolieren der Fette und öle, die reich sind an 1,3-disubstituierten, 2-ungesättigten Triglyceriden, aus den Zellen erzeugt. Das bei dem Fermentationsverfahren dieser Patentschrift eingesetzte Medium umfaßt im allgemeinen eine Quelle für assimilierbaren Stickstoff und eine Kohlenstoffquelle, vorzugsweise in Form einer Aldose oder eines Di- oder Polysaccharids. Die anfallenden Zellen werden gesammelt und aus ihnen ein Gemisch der Fette und öle, die reich sind an 1,3-disubstituierten, 2-ungesättigten Triglyceriden, isoliert.

Verbesserungen des in der obigen Patentschrift beschriebenen Verfahrens sind in der anhängigen Patentanmeldung US-SN 904 099 (8.5.1979) beschrieben. Wie in dieser anhängigen Anmeldung beschrieben, ist gefunden worden, daß die Ausbeute an Fetten und ölen erhöht und die Verteilung der speziellen Fette und öle gesteuert werden kann, wenn das Fermentationsmedium eine Kohlenstoff-Nährstoffquelle in Form einer oder mehrerer Fettsäuren mit zwischen 10 und 20 Kohlenstoffatomen umfaßt. Beispielsweise ist gefunden worden, daß das Verhältnis gesättigter zu ungesättigten Säuregruppen von Glycerylölen durch Einsatz eben der Säuren, die den Fettsäureteil von Kakaobutter bilden, nämlich Palmitin-, Olein- und Stearinsäure, im Fermentationsmedxiam gesteuert werden kann.

Während das in der obigen anhängigen Anmeldung beschriebene Verfahren eine deutliche Verbesserung sowohl der Ausbeute als auch der Säureverteilung in Fett- und Öl-Fermentationsverfahren darstellt, besteht dennoch Raum genug für weitere Verbesserungen. So ist es wünschenswert, die Faktoren zu un-

320H27

tersuchen, die die Produktion von erzeugten Triglyceridölen beeinflussen, aber auch die Steuerung der Verteilung der Säurekomponente der Triglyceride selbst.

Somit ist es Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Erzeugung von Fetten und ölen durch Fermentation zu schaffen, bei dem die Ausbeuten an solchen Fetten und ölen drastisch erhöht sind. Im einzelnen soll die Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung von Fetten und ölen, insbesondere Fetten und Ölen, die an Triglyceriden reich sind, aus mikrobiellen Quellen schaffen, wobei die Ausbeute an den erwünschten gesättigten Fetten und ölen bei verkürzter Reaktionszeit erhöht ist, während die Ausbeute an weniger erwünschten ungesättigten Fetten und ölen herabgesetzt ist.

Die erfindungsgemäßen Konzepte liegen in einem Verfahren zur Erzeugung von Fetten und ölen und insbesondere Fetten und ölen, die an Triglyceriden reich sind, wobei Hefezellen, die Fette und öle zu synthetisieren vermögen, in einem Medium gezüchtet werden, das eine Emulsion von wenigstens einer Fettsäure mit 10 bis 20 Kohlenstoffatomen enthält. Es wurde gefunden, daß die Verwendung einer Emulsion der Fettsäurekomponente des Fermentationsmediums die Verfügbarkeit der Fettsäuren während ihrer Assimilation durch die Hefezellen erhöht, um damit die Ausbeuten an den erzeugten Fetten und ölen weiter zu steigern, während die Säureverteilung der die Triglyceride bildenden Säurekomponenten gesteuert wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich besonders gut zur Verwendung bei der Produktion von Fetten und ölen des Typs, der in Kakaobutter überwiegt. Es wurde gefunden, daß nach einer Ausführungsform die Produktion solcher öle beträchtlich gesteigert werden kann, wenn das Fermentationsmedium so zusammengestellt wird, daß es eine Emulsion von Palmitin-,

320U27

Olein- und Stearinsäure aufweist.

Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wurde gefunden, daß die Verwendung eines Desaturaseenzym-Inhibitors ein hohes Verhältnis von Stearin- zu Oleinsäureresten in den anfallenden Triglyceridölen fördert. Ohne die Erfindung auf eine Theorie beschränken zu wollen, wird angenommen, daß der Desaturaseenzym-Inhibitor dazu dient, den Einfluß der intrazellulären Desaturase minimal zu halten, die ihrerseits die Aufhebung der Sättigung der Stearinsäure verhindert. So führt die Verwendung des Desaturaseenzym-Inhibitors zu erhöhten Stearinsäuregehalten in den anfallenden Triglyceriden.

Während die Erfindung nachfolgend unter Bezugnahme auf die Erzeugung von Fetten und ölen des Typs, der in Kakaobutter überwiegt, d.h. von Triglyceriden, die 1 , S-Distearoyl^-oleoyltriglyceride, 1-Stearoyl-2-oleoyl-3palmitoyl-triglyceride und 1,3-Dipalmitoyl-2-oleoyl-triglyceride umfassen, beschrieben wird, wird dem Fachmann auf dem Gebiet klar sein, daß die erfindungsgemäßen Konzepte ebenso auf die Produktion anderer Fette und öle durch Fermentation angewandt werden können.

Die für die praktische Durchführung der Erfindung brauchr baren Mikroorganismen können als ölsynthetisierende Hefen charakterisiert werden; solche Hefen sind gut bekannt und stehen auf dem Fachgebiet zur Verfügung. Beispielsweise sind eine Reihe von ihnen in der US-PS 4 032 405 beschrieben, deren Offenbarungsgehalt durch diese Bezugnahme in die vorliegende Anmeldung aufgenommen wird. Besonders bevorzugt zur Verwendung bei der praktischen Durchführung der Erfindung sind die Arten der Gattung Rhodosporidium, Lipomyces, Candida, Endomyces, Saccharomyces, Rhodotorula, Trichosporon oder Torulopsis.

Solche öl-synthetisierenden Hefen sind gut bekannt und können

, 320H27

nach herkömmlichen Techniken aus ursprünglichen Quellen, wie Blättern, Pflanzenstengeln und dgl., isoliert werden. Es ist im allgemeinen jedoch bequemer, solche Hefen von verschiedenen Kultur-Aufbewahrungs/Hinterlegungsstellen zu beziehen, z.B. der American Type Culture Collection. Aus wirtschaftlichen Gründen wird es im allgemeinen vorgezogen, eine ölsynthetisierende Hefe zu verwenden, die die Neigung zur Synthese und Speicherung großer ölmengen hat. Hefen, die die Fähigkeit haben,20 % öl, vorzugsweise wenigstens 30 % öl auf einem Standard-Kulturmedium (wie Glukose, Ammoniumsalzen und Mineralien) anzusammeln, werden im allgemeinen bevorzugt.

Das Wachstums- und/oder Fermentationsmedium, das die Nährstoffe für das Züchten der besonderen, einzusetzenden Hefeart liefert, hängt etwas von der speziell zur Verwendung beim erfindungsgemäßen Verfahren gewählten Hefe ab. Im allgemeinen sind solche Medien verdünnte wässrige basische Lösungen, die Nährstoffquellen für Kohlenstoff und Stickstoff enthalten, im allgemeinen in Mengen von weniger als 6 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht des Mediums. Bevorzugte Medien werden im allgemeinen so eingestellt oder gepuffert, daß der pH im Bereich zwischen etwa 4,0 und 9,0 und vorzugsweise zwischen 5 und 8,5 liegt, wie es für optimale Hefezüchtung üblich ist.

Als Stickstoff-Nährstoffquelle kann irgendeine aus einer Vielzahl herkömmlicher stickstoffhaltiger Verbindungen verwendet werden, wie sie häufig als Nährstoffe für mikrobielles Wachstum verwendet werden. Bevorzugte Stickstoffverbindungen umfassen Asparagin, Glutamin, Peptone und dgl. Außerdem können andere stickstoffhaltige Verbindungen, wie Ammoniumsalze und Harnstoff,ebenso verwendet werden.

Im allgemeinen dient die Stickstoff-Nährstoffquelle zur Förderung des Wachstums der Hefen, während die oben erwähnte Kohlenstoff-Nährstoffquelle zur Förderung der Fettansammlung in Hefezellen dient. Damit sind hohe Stickstoff/Kohlenstoff-

Verhältnisse nützlich für die Wachsturnsförderung der Zellen, während hohe Kohlenstoff/Stickstoff-Verhältnisse die Fettansammlung maximal gestalten.

Ein stickstoffhaltiger Nährstoff, der sich besonders zur Verwendung bei der praktischen Durchführung der Erfindung eignet, ist Maisquellflüssigkeit, die wässrige Flüssigkeit, die sich beim herkömmlichen Naßmahlen von Mais bildet, wobei trockener Mais in warmer verdünnter Schwefelsäure eingeweicht wird. Maisquellflüssigkeit setzt sich aus etwa 25 Gew.-% rohem Protein (8 Gew.-% Stickstoff) sowie kleinen Mengen Asche, Zucker und anderen vorteilhaften Kulturbestandteilen zusammen. Während Maisquellflüssigkeit alleine als billige,aber doch vollständige Stickstoff-Nährstoffquelle verwendet werden kann, kann sie mit weiteren herkömmlichen Stickstoff-Nährstoff quellen, wie sie dem Fachmann gut bekannt sind, zusammengestellt werden.

Das Medium sollte auch irgendein oder mehrere der bekannten essentiellen Stoffwechsel-Mineralsalze aufweisen, darunter Salze des Kaliums, Natriums, Calciums, Magnesiums, Eisens oder dgl. Außerdem sind ebenso Sekundär-Nährstoffe, wie Vitamine und Aminosäuren, wünschenswert, insbesondere, wenn die Hefezüchtung lange dauert.

Das bei der praktischen Durchführung der Erfindung eingesetzte Fermentationsmedium enthält auch gemäß einem wichtigen erfindungsgemäßen Konzept eine Kohlenstoffquelle. Wie oben kurz beschrieben wurde, sollte das Fermentationsmedium eine vorherrschende Menge an einer oder mehreren Fettsäuren mit 10 bis 20 Kohlenstoffatomen enthalten. Da, wiederum ohne die Erfindung auf eine Theorie festlegen zu wollen, angenommen wird, daß die Hefezellen die Fettsäuren in ihrem Stoffwechsel nutzen, stellt der Fettsäuregehalt des Fermentationsmediums bevorzugt wenigstens 10 % und noch bevorzugter 40 % oder mehr

320 H27

der gesamten Kohlenstoffquelle. So sind die Fettsäuren, soweit sie zum Modifizieren des Stoffwechsels der Hefezellen zur Produktion von Triglyceridölen mit einem speziellen Fettsäuregehalt dienen, durch die Gegenwart anderer Kohlenstoff-Nährstoff quellen im Fermentationsmedium nicht maskiert.

Die als Kohlenstoffquelle bei der praktischen Durchführung der Erfindung eingesetzte η-Fettsäure oder -säuren kann bzw. können aus irgendeiner einer Vielzahl bekannter Quellen erhalten werden. Beispielsweise kann Palmitinsäure (C..,:O), Stearinsäure (C„_o:0) oder Oleinsäure (C₁₀:1) im Handel erhal-

Io Io

ten werden, entweder in Form der freien Säure oder von Salzen, wie des Natriumsalzes. Diese üblicheren Fettsäuren können alleine oder im Gemisch mit anderen eingesetzt werden. Mehrfach ungesättigte Fettsäuren, wie Linolsäure (C.g:2), Linolensäure (C₁₀:3) und andere Fettsäuren mit 16 bis 20 Kohlenstoff-

I 0

atomen können auch in reiner Form erhalten werden, sind aber leichter erhältlich in der billigeren Form handelsüblicher Gemische, wie als Seifen-Vorratsmaterial.

Die Zusammensetzung der verwendeten Fettsäure ist insoweit von Bedeutung, als jede Fettsäure eine einzigartige Verschiebung im öl-synthetisierenden Stoffwechsel einer gegegebenen Hefeart auslöst. Wenn ein Fettsäuregemisch verwendet wird, besteht der kombinierte Einfluß in einer Wechselwirkung zu einem Stoffwechselgemisch von Triglyceriden, die die verschiedenen, im Fermentationsmedium vorhandenen Fettsäuren enthalten.

Eine genaue Voraussage der genauen Ausbeute in der Öl-Zusammensetzung jedoch, zu erhalten aus irgendeiner speziellen Fettsäure-Kohlenstoffquelle, beruht weitgehend auf empirischer Grundlage. Herkömmliche Analysenmethoden erlauben die Bestimmung der Ausbeute in der Zusammensetzung von ölen, die aus irgendwelchen speziellen Kohlenstoffquellen erzeugt wur-

-.-.:. ^:-Λ::. 320 U27 Υ~ to

den,und somit ermöglicht die Routineversuchsdurchführung die rasche Identifizierung von Fettsäure-Kohlenstoffquellen, die sich für die Produktion eines besonderen Öls eignen.

Gewisse Verallgemeinerungen in Form allgemeiner Regeln sind jedoch bestimmt worden. Beispielsweise führt die Gegenwart einer Fettsäure einer gegebenen Kohlenstofflänge in der Kohlenstoffquelle gewöhnlich zu einer Erhöhung des Anteils an Triglyceridestern,die diese Fettsäure als Komponente des Triglycerids enthalten. Ähnlich ist der Grad der Sättigung und/oder Unsättigung (und besonders der mehrfachen Unsättigung) in dem erzeugten öl direkt mit dem entsprechenden Sättigungswert der als Kohlenstoffquelle eingesetzten Fettsäurezusammensetzung verknüpft. So fördert die Verwendung von Palmitin-, Olein- und Stearinsäure als Kohlenstoffquelle die Bildung von Ölen, die denen in Kakaobutter sehr ähnlich sind.

Die Bedingungen, unter denen die Hefe gezüchtet wird, um Fette und öle nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zu erzeugen, unterscheiden sich nicht von den aufdem Gebiet der Fermentationssysteme allgemein angewandten. Im allgemeinen ist die bei der praktischen Durchführung der Erfindung zur Erzeugung solcher Fette und Öle eingesetzte Hefe die gleiche wie bei herkömmlichen, die gleiche Hefeart verwendenden Verfahren.

Das Fermentationsmedium weist einen solchen stickstoffhaltigen Nährstoff auf, daß die Menge an im Medium enthaltenem Stickstoff im Bereich von 0,005 bis 1 Gew.-% Stickstoff liegt, während der Kohlenstoff-Nährstoff im Fermentationsmedium im allgemeinen im Bereich von 0,1 bis 5 Gew.-% Kohlenstoff liegt. Die Temperatur, bei der die Fermentation durchgeführt wird, liegt im allgemeinen im Bereich von etwa 20 bis 40°C, wobei höhere Temperaturen in diesem Bereich die Pro-

duktion gesättigter öle begünstigen, während tiefere Temperaturen in dem Bereich die Produktion ungesättigter öle begünstigen.

Ähnlich kann Sauerstoff einen gewissen Einfluß auf das Wachstum der Hefezellen haben. Im allgemeinen wurde gefunde, daß aerobe Züchtung der Hefezellen die Endausbeute an von den Mikroorganismen erzeugtem öl erhöht.

Konnte die Fermentation einmal für die gewünschte Zeitspanne ablaufen, im allgemeinen einen bis sieben Tage und vorzugs- ^ weise zwei bis fünf Tage, werden die Hefezellen vom Fermentationsmedium in herkömmlicher Weise abgetrennt und ihr Ölgehalt entfernt. Beispielsweise können die Zellen zuerst, z.B. durch Gefrieren oder Hydrolyse, aufgebrochen und dann das öl aus den Zelltrümmern mit einem geeigneten Lösungsmittel, vorzugsweise einem flüchtigen Lösungsmittel,um das anschließende Entfernen des Lösungsmittels aus dem öl zu erleichtern, extrahiert werden.

Wie oben bemerkt, ist es ein wichtiges Konzept der Erfindung, daß die im Fermentationsmedium vorhandenen Fettsäuren in emulgierter Form vorhanden sind. Dies wird bevorzugt durch Zugabe eines Emulgators zum Fermentationsmedium erreicht, der

mit den verwendeten Fettsäuren kompatibel ist und den Stoffwechsel der Hefezellen nicht in nachteiliger Weise beeinträchtigt. Im allgemeinen sind bei der praktischen Durchführung der Erfindung eingesetzte Emulgatoren ionische oder nicht-ionische Emulgatoren mit einem HLG über 15.

Für diesen Zweck bevorzugt sind Emulgatoren in Form von Fettsäurederivaten von Sorbit und Sorbitanhydriden. Besonders bevorzugt sind nicht-ionische Emulgatoren, wie solche, die unter der Handelsbezeichnung "Tween" (der Atlas Chemical Industries Inc.) auf dem Markt sind, die Polyoxyäthylen-Derivate von Fettsäurepartialestern von Sorbitanhydriden sind, und solche, die unter der Handelsbezeichnung "Span" auf dem

320H27

Markt sind, die Fettsäurepartialester von Sorbitanhydriden sind. Beide Arten von Emulgatoren sind von der nationalen Behörde für die Nahrungsmittelverwendung zugelassen; es wurde überraschenderweise gefunden, daß sie den Stoffwechsel der Hefezellen bei der Bildung von Fetten und ölen nicht in nachteiliger Weise beeinträchtigen.

Im allgemeinen muß nur die zum Emulgieren der im Fermentationsmedium vorhandenen Fettsäuren ausreichende Menge an Emulgator verwendet werden. Diese Menge liegt im allgemeinen im Bereich von 0,0001 bis 1 %, bezogen auf das Gewicht des Fermentationsmediums.Die Emulsion wird bevorzugt durch Zugabe des Emulgators zur Fettsäure oder den Fettsäuren und anschließendes ausreichendes Rühren zur Bildung eines praktisch homogenen Fermentationsmediums erzeugt, wobei die weiteren Komponenten des Fermentationsmediums zum Zeitpunkt des Rührens bereits zugesetzt worden sind oder auch nicht.

Bei der bevorzugten Praxis der Erfindung wird die Emulsion durch Erwärmen der Fettsäure mit einem Puffer auf einen pH im Bereich von 7 bis 9 gebildet, worauf die Fettsäure im Autoklaven behandelt wird, um sie, wenn nötig, zu sterilisieren. Dann wird der Emulgator zugesetzt, und das anfallende Gemisch wird homogenisiert. Die Emulsion wird sodann rasch abgekühlt, mit einer Geschwindigkeit, die zum Kristallisieren von Stearinsäureteilchen sehr geringer Größen ausreicht. Erfindungsgemäß wurde gefunden, daß Teilchengrößen unter 10 um besonders geeignet sind, zu gewährleisten, daß die Fettsäure oder -säuren beim Fermentationsvorgang wirksam genutzt wird bzw. werden.

Als Kohlenhydrat wird bevorzugt ein solches aus der Gruppe der Aldosen (z.B. Glucose, Hexose, Pentose usw.), der Disaccharide, wie Maltose, Saccharose usw., und der Oligosaccharide, bevorzugt solcher, die aus der Hydrolyse von

"" >" -^:- -'·^:- 320U27

Stärke stammen, verwendet. Glycerin kann ebenfalls vorteilhaft eingesetzt werden.

Gemäß einer weiteren Ausfuhrungsform der Erfindung wurde gefunden, daß es häufig wünschenswert ist, in das Fermentationsmedium einen Desaturaseenzym-Inhibitor einzubringen. Wie oben beschrieben und ohne die Erfindung auf eine Theorie festlegen zu wollen, wird angenommen, daß der Desaturaseenzym-Inhibitor dazu dient, den Einfluß des Desaturaseenzyms während der Fermentation minimal zu halten und so das Verhältnis gesättigter ,-S) öle zu ungesättigten Ölen erhöht.

Ein solcher Desaturaseenzym-Inhibitor, der eingesetzt worden ist, ist Sterculinsäure, das Cyclopropanderivat von Stearinsäure (mit Cyclopropenring), die sich in Baumwollsamenöl findet. Dem Fachmann wird klar sein, daß andere Inhibitoren ebenso verwendet werden können. Im allgemeinen ist die Menge eines solchen Inhibitors diejenige, die zum Hemmen des Enzyms Desaturase ausreicht, und sie liegt normalerweise im Bereich von 0,001 bis 0,5 Gew.-%, vorzugsweise von 0,01 bis 0,2 Gew.-%.

Nachdem die erfindungsgemäßen Grundkonzepte beschrieben worden sind, wird nun auf die folgenden Beispiele Bezug genommen, die der Veranschaulichung, keineswegs der Einschränkung der praktischen Durchführung der Erfindung dienen. In diesen Beispielen sind alle Prozentsätze auf das Gewicht bezogen, sofern nicht anders angegeben.

Beispiel 1

Dieses Beispiel veranschaulicht die praktische Durchführung der Erfindung bei der Nutzung von Stearinsäure.

320H27

Eine Emulsion wurde hergestellt, indem zuerst 1 g Stearinsäure auf etwa 80 C erwärmt und dann eine Lösung von Kaliumphosphat mit einem pH von 6 bis 7 mit ihr gemischt wurde. Das erhaltene Gemisch wird dann 15 min auf 120°C erhitzt, um die Fettsäure zu sterilisieren. Danach wurde 0,01 % eines Gramms des Emulgators Tween 20 zugesetzt, und das erhaltene Gemisch wurde rasch gekühlt, um Stearinsäurekristalle mit Größen im Bereich von 1 bis 10 um auszufällen. Die anfallende milchige Suspension hatte einen pH von 6 bis 7, war stabil und zeigte keine Koaleszenz. Diese Emulsion wurde dann mit einem Fermentationsmedium gemischt, so daß das erhaltene Fermentationsmedium folgende Gesamtzusammensetzung hatte:

Pepton	0,5 %
Hefeextrakt	0,1 %
Glucose	2,0 %
K₂HPO₄	0,1 %
Antibiotikum	10 g/ml
Emulgator (Tween 20)	0,01 %
Stearinsäure	1 ,0 %
H₂O	100 ml

Das Mittel hatte einen pH von 5,5 bis 6,0.

Das Fermentationsmedium (Probe I) wurde dann bei 28 C mit Hefezellen von R. toruloides beimpft, gezüchtet auf einem Nährmedium, das 5 % Glucose, 5 % Pepton und 1 % Hefeextrakt enthielt.

Zur gleichen Zeit wurde ein zweites Medium (Probe II) ebenso zusammengestellt, mit der Ausnahme, daß die Menge an Glucose auf 4 % erhöht wurde. Ein weiteres Medium, Probe III, wurde ebenso hergestellt, mit der Ausnahme, daß es keine Glucose enthielt und der Stearinsäuregehalt 4 Gew.-% betrug.

320U27

Proben II und III wurden mit dem gleichen Inokulum bei 28°C beimpft. Die Fermentation der Proben I, II und III konnte

in einem Schüttelkolben bei 200 UpM 6 Tage bei 28°C ablaufen.

Eine weitere Probe (IV) wurde zusammengestellt, beimpft und wie in Beispiel I fermentiert, mit der Ausnahme, daß der pH nach 2,5 Tagen auf 7,5 eingestellt wurde. Die Zellen jeder
Probe wurden dann geerntet und das öl gewonnen und analysiert.

Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten:

/i.

Probe

Ergebnisse - Beispiel 1

III

IV

mg neutrales Öl	200	2	X 225	217	X 388	X 407	350	469	X 542 %
% Umwandlung auf Lipid-Basis	20%	7	23%	22%	39%	21%	17%	47	54,28
% Umwandlung auf Basis Lipid CH O	7%	4	8%	8%	13%	_	_	16%	18
C:12	O,	2	0,3	O,3		O,l	0,1	0,1	0,1
C:14	0,		1/Q	1,2		0,4	0,3	0,6	0,5
C:16:O	17,	3	22,8	20,6		13,2	10	15,4	13
C:16:l	4,	7	1,0	4,4		0,5	0,3	0,5	' 2,1
C:18:O	32	6	29,8	24,3		49,2	48	39,6	35,2
C:18:l	31,	9	32,2	32,0		25,7	25	31,4	35,2
C:18:2	5,	9	1,3	6,3		4,0	9,9	4,7	7,4
C:2O	0,	O	0,6	0,7		0,8	0,7	0,7	0,6
C:18.3	0,		0,3	0,7		0,3	1,9	0,6	1,4
C:22	0,	5	1,0	1,4		0,6	0,6	0,8	O,7
Unbekanntes	4,	6	7,1	4,6		4,9	3,6	4,5	3,0
Gesättigt, insgesamt	54	3	58	52		65	59,7	58,3	. 51
einfach ungesättig tes, insgesamt	35,	33,2	36,4		26	24,8	31,9	37,8
mehrfach unge sättigtes, insgesamt	6,	1,6	7,0		4,3	11,8	5,4	8,8
Jod. theoretisch	42,	32	44		30	43	37	48,6

Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß die Gegenwart von
Kohlenhydraten im Fermentationsmedium zur Erhöhung der Gehalte an Palmitin- und Oleinsäure auf Kosten der Stearinsäuregehalte dient. Außerdem führt die Einstellung des pH-Werts des Ferraentationsmediums auf über 7 zu erhöhter Umwandlung.

320U27

Beispiel 2

Dieses Beispiel veranschaulicht die Bedeutung der Bildung des Emulgators im verwendeten Fermentationsmedium gemäß der praktischen Ausführung der Erfindung.

Bei diesem Beispiel wurden mehrere Fermentationsmedien hergestellt, mit der Ausnahme, daß die in Beispiel 1 beschriebene Arbeitsweise variiert wurde, ausgenommen wie folgt: Das in diesem Beispiel verwendete Fermentationsmedium bestand aus O,O2 % Kaliumphosphat, 0,02 % Tween 20 oder Tween 80, das mit Stearinsäure wie folgt eingesetzt wurde:

A Stearinsäure (keine Homogenisierung, kein rasches Abkühlen, kein Emulgator)

B 0,02 % Tween 20 (kein Homogenisieren oder rasches Abkühlen)

C Stearinsäure homogenisiert (kein Homogenisieren oder rasches Abkühlen)

D Stearinsäure homogenisiert mit Tween 80 (kein rasches Abkühlen)

E Stearinsäure, homogenisiert mit Tween 20 (kein rasches Abkühlen)

F Stearinsäure homogenisiert mit Tween 20 und rasches Abkühlen

G Stearinsäure homogenisiert bei pH 4,5, aber ohne rasches Abkühlen

Alle obigen Proben wurden mit R. toruloides beimpft, gezüchtet in einem 5 1-Fermentator bei 28°C während 48 h. Die Fettbildungsphase erfolgte auf einem Schüttelinkubator bei 32°C und 260 UpM. 1gR. toruloides wurde zu 100 ml Lipidmedien gegeben. Nach Herstellen von Emulsionen wurde visuell beobachtet und wie folgt wiedergegeben:

Probe Beobachtung

A Große Stearinsäureklumpen

B wie A

C kleine Stearinsäureteilchen

D wie C

E wie C

F keine Teilchen beobachtet

G wie C

Unmittelbar vor der Gewinnung aus den Lipidmedien wurde mikroskopisch untersucht, mit folgenden Ergebnissen:

Probe ■ Beobachtung

A + B wenig oder keine Lipid-Ansammlung

C-E 10-20 % Lipid-Ansammlung

F 20-40 % Lipid-Ansammlung

G 10-20 % Lipid-Ansammlung

Die visuellen Betrachtungen der obigen Beispiele vor dem Beimpfen zeigen, daß die Proben A-E und G visuell zu beobachtende Teilchen enthalten, was beweist, daß sie größer als 1 bis 2 um waren. Die mikroskopische Untersuchung unmittelbar vor der Gewinnung zeigte, daß, je größer die Teilchengröße war, umso geringer die Lipidansammlung war. Die Proben A und B wurden nicht homogenisiert und hatten somit die größten Teilchen. Mit abnehmender Teilchengröße (d.h. Proben C bis E einschließlich) wurden größere Zell-Lipidkügelchen beobachtet.

320 H27

Die Analysenergebnisse sind in der folgenden Tabelle wiedergegeben:

Probe Neutralöl (mg)

A - (keine Homogenisierung) 50,2 mg B - (keine Homogenisierung - 0,02% Tween 20) 54,7

C - (Homogenisierung - kein Emulgator) 103,O

D - (Homogenisierung - Tween 80) 100,1 E - (Homogenisierung - Tween 20 -

kein rasches Abkühlen) 106,9 F - (Homogenisierung - Tween 20 -

rasches Abkühlen) 139,7

G - (Homogenisierung - Tween 20 - pH 4,5) 93,7

Die im folgenden Beispiel gezeigten Ergebnisse veranschaulichen, daß eine gute Emulsion für eine wirksame Nutzung von Stearinsäure wesentlich ist. Die zur Bildung einer guten Emulsion beitragenden Paktoren sind geeignete Homogenisierung, ein geeigneter Gehalt an Emulgator, ein neutraler pH-Wert und rasches Abkühlen ifi einer Eispackung. Die Verwendung eines Emulgators ohne Erwärmen oder Schmelzen der Fettsäure mit Homogenisierung und raschem Abkühlen ist nicht sonderlich wirksam, wie die Daten zeigen, mit Fettsäure-Kohlenstoff quellen mit hohen Schmelzpunkten. Aus diesem Grunde wurde das Emulsionsverfahren gemäß der Erfindung entwickelt.

Von Bedeutung für die Struktur und die Schmelzeigenschaften von Kakaobutter ist der Grad der Unsättigung in B-Position. In Tabelle 2 sind die B-Positionsdaten für eine gegebene Probe aufgeführt. Dies ist die stereospezifische Methode unter Verwendung von Pankreas-Lipase. Luddy F.E. et al. JAOCS, Band 41, S. 693, 1964.

ϊ'*''^}λ'^:" 320U27

Tabelle 2

FSZ des Triglycerids B-Stellung

0,33

⁴'⁷ 1,2

0,78

2,9 72
16

1,5

0,3

Diese Daten zeigen, daß die Fettsäurezusammensetzung (FSZ) nahezu passend gemacht werden kann und Triglycerid mit fast den gleichen Verhältnissen an gesättigten/ungesättigten Verbindungen wie in Kakaobutter biosynthetisiert wird.

Es ist klar, daß verschiedene Änderungen und Abwandlungen in Einzelheiten der Arbeitsweise und Zusammenstellung vorgenommen werden können, ohne den Erfindungsgedanken zu verlassen, wie er insbesondere in den Ansprüchen definiert ist.

C:14	0,4
C:16	26,1
C:16:1	2,2
C:17	1,4
C:unbek.	0,4
C:18	28,7
C:18:1	31,5
C:18:2	7,2
C:18:3	1,0
C:22	_

Claims

3239 Patentansprüche

1. Verfahren zur Erzeugung von Fetten und ölen, dadurch gekennzeichnet, daß zur Synthese der Fette und öle fähige Hefezellen in einem Medium, das eine Emulsion von wenigstens einer Fettsäure mit 10 bis 20 Kohlenstoffatomen enthält, gezüchtet und die Fette und Öle aus den gezüchteten Zellen abgetrennt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Emulsion durch Erwärmen der Fettsäure zusammen mit einem Emulgator und anschließendes Homogenisieren des anfallenden Gemischs gebildet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Emulsion der Fettsäure und des Emulgators vor dem Einbringen in das Fermentationsmedium rasch abgekühlt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Hefezellen aerob gezüchtet werden.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Hefezellen in Gegenwart eines Desaturase-Inhibitors gezüchtet werden.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der pH auf einen Wert über 7 erhöht wird, nachdem die Fermentationsreaktion teilweise durchgeführt worden ist.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine auch ein Kohlenhydrat enthaltende Emulsion verwendet wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß. die Fettsäure wenigstens 5O Gew.-% der Kohlenstoff-Nährstoff quelle im Fermentationsmedium ausmacht.

9. Verfahren zur Erzeugung von Fetten und Ölen, wie sie charakteristischerweise in Kakaobutter gefunden werden, gekennzeichnet durch Züchten zur Synthese der Fette und Öle befähigter Hefezellen in einem Medium, das eine Emulsion von wenigstens einer Fettsäure mit 10 bis 20 Kohlenstoffatomen enthält, und Trennen der Fette und Öle von den gezüchteten Zellen.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß ein Stearinsäure/Palmitinsäure-Gemisch verwendet wird.

11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß ein Stearinsäure/Palmitinsäure/Oleinsäure-Gemisch verwendet wird.

12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Hefezelle eine Art der Gattung aus der Gruppe Rhodosporidium, Lipomyces, Candida, Endomyces, Saccharomyces, Rhodotorula, Trichosporon oder Torulopsis eingesetzt wird.