DE4319540C2

DE4319540C2 - Verfahren zur Herstellung von acetylierten Sophorolipiden in Form ihrer Säuren, ausgehend von einem Substrat, das aus einem Öl oder einem Ester besteht

Info

Publication number: DE4319540C2
Application number: DE4319540A
Authority: DE
Inventors: Jeannune Lemal; Remy Marchal; Anne-Marie Davila; Caroline Sulzer
Original assignee: IFP Energies Nouvelles IFPEN
Current assignee: SOPHOR S.A., RUEIL-MALMAISON, FR
Priority date: 1992-06-18
Filing date: 1993-06-12
Publication date: 2003-08-14
Anticipated expiration: 2013-06-13
Also published as: FR2692593B1; FR2692593A1; DE4319540A1; US5900366A; JPH0662877A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren unter kontinuierlicher Versorgung zur Herstellung eines Gemisches von Sophorolipiden, die zum größten Teil Säuren enthält, die zumindest zum Teil acetyliert sind und die Zusammensetzung der so erhaltenen Sophorolipide.

Es wurde bereits in den Patenten US 3205150 und US 3312684 erwähnt, daß eine Vielzahl von Sophorolipiden durch einen Fermentationsprozeß hergestellt worden ist, der eine Kultur von Torulopsis bombicola einsetzt, ein Stamm, der gegenwärtig als Candida bombicola klassifiziert wird.

Der Stand der Technik wird ebenfalls im Patent US A-3445337 und in Journal of the Ameri can Oil Chemistry Society, Vol. 65, Nr. 9, Sept. 1988, 1460-1466, beschrieben.

Darüber hinaus ist in der französischen Patentanmeldung der Antragstellerin (FR 2670798) ein Verfahren zur Herstellung von Sophorolipiden durch Fermentation mit kontinuierlicher Versorgung (Fed-Batch) mit Estern von Fettsäuren oder mit Ölen beschrieben worden.

Die erhaltenen Sophorolipide werden als Mischung von Verbindungen betrachtet, die durch die Formeln (1) und (2) dargestellt sind, Formel (1) stellt die freie Säure dar, Formel (2) die Lactonform.

In diesen Formeln stellt R¹ einen Wasserstoff oder eine Acetylgruppe dar, R² einen Was serstoff oder einen Alkylrest, der 1 bis 9 Kohlenstoffatome umfaßt, während R³ ein gesät tigter Kohlenwasserstoffrest mit 7 bis 16 Kohlenstoffatomen ist, oder R² kann auch Was serstoff darstellen oder eine Methylgruppe, wenn R³ ein ungesättigter Kohlenwasserstof frest mit 13 bis 17 Kohlenstoffatomen ist.

Bis heute beschreiben die Verfahren zur Herstellung der Produkte eine Mischung zahlrei cher Homologer und die Abtrennung einer der Hauptformen (Säure oder Lacton) erfordert z. B. Extraktionen mit Alkohol (EP-B 209783), die langwierig und kostspielig sind. Darüber hinaus führt die Extraktion mit einem spezifischen Lösungsmittel nicht immer zu guten Re sultaten, da die Löslichkeit der Gesamtheit der Homologen in einem Lösungsmittel empfi ndlich variieren kann, was die Qualität der erhaltenen Produkte beeinflußt.

Auf der anderen Seite führen die Methanolysereaktionen in Gegenwart eines sauren Kata lysators nicht zu besseren Ergebnissen und es wird häufig ein Gemisch an deacetylierten Säuren oder Estern erhalten.

Darüber hinaus wird im Stand der Technik (US 4197166) erwähnt, daß es äußerst schwie rig ist, durch Fermentation ein erwünschtes Produkt mit einem gegebenen Verhältnis an Homologen zu erhalten.

Schließlich ist auch bekannt, daß die Acetylbindungen in den Sophorolipiden chemisch in stabil sind und sehr leicht durch Erwärmung oder längere Lagerung im nahezu neutralen Bereich oder sogar unter schwach alkalischen Bedingungen bei Raumtemperatur hydroly siert werden, was dazu führt, daß die völlig deacetylierte Form erhalten wird.

Es ist also äußerst schwierig, durch Fermentation oder auf chemischem Wege ein einziges Produkt zu erhalten, und noch vielmehr, ein acetyliertes Produkt zu erhalten.

Darüber hinaus ist es notwendig, bei petrochemischen Anwendungen, die z. B. mit der un terstützten Gewinnung von Erdöl verbunden sind, Emulsionen von Öl in Wasser herstellen zu können und also Emulgatoren, die mehr hydrophob als hydrophil sind, einzubringen, was bei den deacetylierten Säuren nicht der Fall sein kann.

Es besteht in der Industrie also eine Nachfrage nach Produkten, die eine Fettsäurestruktur und eine Saccharidstruktur besitzen und Acetylfunktionen, die die sehr hydrophilen Hy droxigruppen maskieren, umfassen, im besonderen bei Produkten, die durch Fermentation erhalten werden und eine Saccharidstruktur wie die Sophorose umfassen.

Aufgabe der Erfindung ist ein Verfahren mit verbesserter Produktivität und Ausbeute an Sophorolipid-Produkten.

Die Lösung erfolgt mit einem Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1. Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen dargestellt.

So wurde ein Fed-Batch-Verfahren unter besonders vorteilhaf ten Bedingungen zur Herstellung einer Mischung von Sophoroli piden entwickelt, die einen Großteil der Säuren zumindest teilweise acetyliert enthält. Gemäß der Erfindung wird ein Fed-Batch-Verfahren zur Herstellung einer Mischung von Sophorolipiden vorgeschlagen, bei dem der Stamm Candida bombicola CBS 6009 in ein Nährmedium, das eine Zucker- und eine Stickstoffquelle enthält, unter geeigneten Bedingungen, bei denen dieser Stamm kultiviert wird, gegeben wird. Der besagte kultivierte Stamm wird in eine Reaktionszone gebracht zu einer Versorgung mit einem Substrat unter geeigneter Belüftung, Temperatur und pH-Wert Bedingungen, wobei das Substrat mindestens ein tierisches Öl, mindestens ein pflanzliches Öl und/oder mindestens einen Ester des besagten Öls umfaßt, die besagten Öle und der besagte Ester eine lineare aliphatische Kette von 10 bis 24 Kohlenstoffatomen aufweisen und zumindest einmal die folgende Reaktionsfolge durchgeführt wird:

a) es wird eine kontinuierliche Versorgung des Stammes mit besagtem Substrat mit einem Durchsatz in der Reaktions zone, der zwischen einschließlich 0.01 und 4 Gramm pro Stunde und pro Liter des Ausgangsvolumens liegt, durch geführt und während einer Versorgungszeit, bei der die verbleibende Konzentration an besagtem Substrat in der Reaktionszone auf einem Wert gehalten wird, der höch stens gleich 18 Gramm pro Liter des Ausgangsreaktions volumens während der besagten Versorgungsdauer beträgt; und Erzeugen der Sophorolipide nach dem Aufbrauchen des Zuckers während der kontinuierlichen Zufuhr des Substrats und
b) die Mischung der Sophorolipidprodukte wird gewonnen mit einer acetylierten Säureform von mindestens 50% verglichen mit anderen Formen von Sophorolipiden.

Vorzugsweise wird die kontinuierliche Versorgung mit Substrat nach einem mit der Zeit ab nehmenden Profil durchgeführt.

Gemäß einem anderen Kennzeichen des erfindungsgemäßen Verfahrens umfaßt der Schritt zur Gewinnung der während der Exkretion gebildeten Mischung von Sophorolipiden die Abtrennung des Stammes aus der Fermentationsmaische, die die Mischung von So phorolipiden enthält, die Neutralisation der Maische auf einen pH-Wert in Nähe des Neu tralpunktes und die Eliminierung des Wassers durch Erwärmung und unter verringertem Druck.

Nach einer anderen Variante umfaßt der Schritt zur Gewinnung der während der Exkretion gebildeten Mischung von Sophorolipiden die Abtrennung des Stammes aus der Fermenta tionsmaische, die die Mischung von Sophorolipiden enthält, und die Eliminierung des Was sers durch verringerten Druck. Diese Eliminierung von Wasser wird bevorzugt durch Ge friertrocknung durchgeführt.

Der verwendete Stamm Candida bombicola CBS 6009 kann von einer Kultur stammen, die ex-situ erzeugt wurde oder, gemäß einer anderen bevorzugten Varian te, kann der Stamm, der im Nährmedium enthalten ist, direkt mit Substrat versorgt werden. Die beobachtete Produktivität ist übrigens hervorragend und die Ausbeute an den Sophoro lipid-Produkten ist sehr gut, z. B. mindestens 80 g/l Sophorolipide pro Liter des Nährmedi ums. Die Durchführung des Verfahrens kann auf folgende Art geschehen: es wird mit Substrat versorgt und dabei der Durchsatz bei der Versorgung in der Reaktionszone inner halb der vorher genannten Arbeitsbedingungen einreguliert, die Versorgung mit Substrat wird beendet, wenn die Gesamtmenge an zugeführtem Substrat einen Wert von höchstens etwa 280 g/l des Anfangsreaktionsvolumens erreicht und dann wird die Mischung an So phorolipiden, so wie oben beschrieben, gewonnen.

Gemäß einem anderen Kennzeichen des Verfahrens und der kontinuierlichen Versorgung kann die Reaktionszone zu Beginn eine Substratkonzentration von 0,5 bis 40 g/l des An fangsreaktionsvolumens enthalten, vorteilhafterweise von 1 bis 25 g/l, und die kontinuier liche Versorgung des besagten Stammes mit Substrat wird nach einer Frist, von z. B. höch stens 48 Stunden, aufgenommen, das heißt, wenn die Konzentration an Substrat im allge meinen zwischen 0,1 und 15 g/l pro Liter des Anfangsreaktionsvolumens liegt und vor zugsweise zwischen 0,1 und 5 g/l.

Gemäß einem anderen vorteilhaften Kennzeichen des Verfahrens, das es erlaubt, gute Er gebnisse zu erzielen, kann der Durchsatz bei der kontinuierlichen Versorgung mit Substrat in der Reaktionszone zwischen 0,5 und 3,0 g/(h.l) des Ausgangsreaktionsvolumens liegen und vorzugsweise zwischen 1,0 und 2,5 g/(h.l) und ganz besonders zwischen 1,5 und 2,0 g/(h.l) liegen.

Unter den bevorzugten Ölen und Estern können die folgenden genannt werden:
das Öl oder die Methyl- oder Ethylester von Rapsöl, Sonnenblumenöl, Palmöl oder Sojaöl. Mit den besagten Estern wurden hervorragende Ergebnisse erzielt und im besonderen eine Selektivität in Bezug auf die acetylierte Form von mindestens 50%, vorteilhafterweise von mindestens 60%, z. B. 70 bis 90%.

Das Nährmedium kann eine mineralische Stickstoffquelle umfassen (in Form von Ammoni umionen) und/oder organischen Stickstoff, z. B. in Form von Harnstoff und/oder Aminosäu ren wie z. B. Hefeextrakt, Pepton von Soja, Hydrolysate von Kasein, Maisquellwasser, Hy drolysate von Weizengluten, Fleischextrakte. Die Zugabe von mineralischen Elementen, wie z. B. Kalium, Natrium, Magnesium oder von Spurenelementen wie Eisen, Mangan, Molybdän, in Form ihrer Salze (Sulfate, Phosphate, Chloride), kann es ebenfalls ermögli chen, das Wachstum noch weiter zu steigern.

Das Nährmedium kann mindestens einen Zucker, wie z. B. Glucose oder Saccharose und eventuell einen Ester, der oben beschrieben wurde, enthalten.

Vorteilhafterweise kann die verwendete Menge Zucker zu Beginn der Fermentation zuge geben werden, so daß der Bedarf an Energie, der mit dem Wachstum des Stammes ver knüpft ist, gedeckt ist, wobei dieses Wachstum durch den berechneten Anteil der Stick stoffquelle begrenzt wird.

Zum Beispiel kann die Menge an Zucker zwischen 1 und 100 g/l, bezogen auf das Nähr medium, liegen, und vorzugsweise zwischen 20 und 80 g/l und ganz besonders zwischen 40 und 70 g/l. Die Menge an Stickstoff wird im allgemeinen als Funktion der Menge an Zel len, die man erhalten möchte, zugegeben.

Die Kultivierungsbedingungen sind gewöhnlich die folgenden: Temperatur: 18 bis 35°C, pH 3,0 bis 8,0. Ein gutes Niveau der Aktivität wurde bei einer Temperatur zwischen einschließ lich 20 und 30°C und einem pH-Wert-Bereich von 3,0 bis 5,0 beobachtet und hervorra gende Aktivitätsniveaus werden bei einer Temperatur zwischen einschließlich 22 und 28°C und einem pH-Wert von 3,5 bis 4,0 beobachtet. Die Fermentation wird meistens unter aseptischen Anfangsbedingungen und aerob durchgeführt.

Gemäß einem anderen Kennzeichen des Verfahrens kann der Stamm im Nährmedium ent halten in die Reaktionszone eingebracht werden, so daß er mit Substrat versorgt wird, aber ebenso kann, gemäß einem anderen Kennzeichen des Verfahrens, der Stamm aus dem Nährmedium mit Techniken, die dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind, abgezo gen werden und in die Reaktionszone eingeführt werden, wo er mit Substrat versorgt wird.

Das Verfahren zur Herstellung von Sophorolipiden wird nach einer allgemeinen Regel unter den folgenden Reaktionsbedingungen durchgeführt: Temperatur 18 bis 35°C, pH-Wert: 2,5 bis 8,0, vorteilhafterweise 3,0 bis 4,0; Luftdurchsatz: 0,2 bis 2 VVM bei einem Absolutdruck von 1 bis 5 bar und vorteilhafterweise 1 bis 2 bar (1 bar = 0,1 MPa).

Während der gesamten Herstellungsdauer wird der pH-Wert kontrolliert und auf einen vor schriftsgemäßen Wert einreguliert, der im weiter oben beschriebenen Bereich liegt, und zwar z. B. durch Zugabe einer Soda- oder Kaliumcarbonatlösung.

Die Menge an eingesetzten Zellen, bezogen auf das Ausgangsreaktionsvolumen, beträgt gewöhnlich zwischen 1 und 100 g Trockengewicht pro Liter und vorzugsweise zwischen 10 und 30 g Trockengewicht pro Liter.

Gemäß einem besonders vorteilhaftem Kennzeichen kann zumindest der Schritt der Vorkul tur des Stammes, bevor er in die Kultur gegeben wird, in einem Vornährmedium durchgeführt werden, das folgendes beinhaltet: mindestens eine Stickstoffquelle und mindestens eine Kohlenstoffquelle, die aus der Gruppe gewählt wird, die zumindest ein Kohlenhydrat umfaßt, mindestens einen Ester einer gesättigten oder ungesättigten Fettsäure mit 10 bis 24 Kohlenstoffatomen, mindestens einen gesättigten oder ungesättigten aliphatischen Kohlenwasserstoff mit 10 bis 20 Kohlenstoffatomen, mindestens eine aliphatische Säure mit 10 bis 20 Kohlenstoffatomen, mindestens einen aliphatischen Alkohol mit 10 bis 20 Koh lenstoffatomen und ihre Mischungen; der Anteil an Kohlenhydrat ist bei höchstens 20%, bezogen auf das Vornährmedium und der Anteil an Ester, Kohlenwasserstoff, Alkohol und/oder Säure liegt, bezogen auf Gewicht, bei höchstens 0,5%; und das Nährmedium wird mit dem Vornährmedium angeimpft.

Vorteilhafterweise kann das Vornährmedium mindestens ein Kohlenhydrat und mindestens eine Kohlenstoffquelle enthalten, die aus der Gruppe gewählt werden, die die oben definier ten Ester, Kohlenwasserstoffe, Alkohole und Säuren umfaßt.

Gemäß einem Kennzeichen des Verfahrens kann man den Schritt oder die Schritte der Vorkultur bei einer Temperatur zwischen 18 und 40°C und vorzugsweise zwischen 20 und 30°C über jeweils eine Zeitspanne von 12 bis 72 Stunden und im besonderen 24 bis 36 Stunden durchführen.

Gemäß einem anderen vorteilhaften Kennzeichen des Verfahrens können der Fettsäu reester, der aliphatische Kohlenwasserstoff und die aliphatische Säure einen Gewichtsan teil von 0,1 bis 0,30%, bezogen auf das Vornährmedium und das Kohlenhydrat einen Ge wichtsanteil von 2 bis 12%, bezogen auf das Vornährmedium, besitzen.

Besonders interessante Ergebnisse wurden mit einer Konzentration des Kohlenhydrates von 6 bis 10 Gew.-% im Vornährmedium erzielt.

Gemäß einem anderen vorteilhaften Kennzeichen des Verfahrens kann die Kohlenstoff quelle aus der Gruppe gewählt werden, die die besagten Fettsäureester mit 16 bis 18 Koh lenstoffatomen, die besagten Alkohole mit 16 bis 18 Kohlenstoffatomen und die besagten Säuren mit 16 bis 18 Kohlenstoffatomen beinhaltet.

Die Stickstoffquelle, die beim Vorkultivierungsschritt verwendet wird, ist im allgemeinen eine mineralische Stickstoffquelle in Form von Ammoniumionen und/oder organischem Stick stoff, wie weiter oben für das Nährmedium ausgeführt.

Die Vermehrung des Stammes wird im allgemeinen durch Animpfen eines geringen Volu mens der Vorkultur aus einem Röhrchen mit Agar-Agar, das zur Aufbewahrung desselben Stammes dient, durchgeführt.

Dieses Medium zur Vorkultur wird nach einer Inkubationszeit auf einem Schütteltisch in ei nen Produktionsreaktor überführt, in dem die Durchführung des Verfahrens nach dem Ar beitsablauf durchgeführt werden kann, der bereits in der französischen Patentanmeldung der Antragstellerin FR 2692593 beschrieben worden ist.

Mit dem erfindungsgemäßem Verfahren erhält man im allgemeinen mehr als 55% der So phorolipidsäuren in acetylierter Form und vorzugsweise mindestens 60%, z. B. 60 bis 70%. Die Durchführung der Vorkultivierungsphase erlaubt es, die Selektivität zu erhöhen.

Die Charakterisierung der Strukturformen der Sophorolipide wird bevorzugt durch Hochlei stungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) des erhaltenen Gemisches durchgeführt, unter Verwendung von z. B. einem Refraktrometrie-Detektor.

Die Acetylierungsquote der Säuren wird in der Regel durch Hochleistungs-Flüssigkeit schromatographie (HPLC) bestimmt, unter Verwendung von z. B. einem Lichtdiffusions-De tektor.

Beispiel 1

Der verwendete Stamm ist die Hefe Candida bombicola CBS 6009, die durch monatliches Umsetzen auf Agar-Agar folgender Zusammensetzung konserviert wird:

Pepsisches Pepton (Biothon BIOMERIEUX)	10,0 g/l
Hefeextrakt	5,0 g/l
Ethylester von Raps	15,0 g/l
Agar-Agar	30,0 g/l

Die Vermehrung des Stammes wird auf dem folgenden Vornährmedium durchgeführt:

Glucose	60,0 g/l
(NH₄)₂SO₄	4,0 g/l
KH₂PO₄	1,0 g/l
MgSO₄ × 7H₂O	0,5 g/l
getrocknetes Maisquellwasser	5,0 g/l
Ethylester von Raps	20,0 g/l

Zur Herstellung dieses Mediums zum Vorkultivieren werden bei 120°C 25 Minuten lang die Glucose, der Ethylester des Rapses, MgSO₄ × 7H₂O zusammen in der Hälfte des benötig ten Wassers sterilisiert, ebenso wie das KH₂PO₄ und das (NH₄)₂MgSO₄ und das getrock nete Maisquellwasser zusammen in der zweiten Hälfte des Wassers unter den selben Ste rilisationsbedingungen sterilisiert. Das Medium zum Vorkultivieren wird nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur durch Mischen der beiden Lösungen hergestellt.

Ein 200 ml-großer Erlenmeyerkolben, der 30 ml Vornährmedium enthält, wird angeimpft. Nach einer Inkubationszeit von 40 Stunden bei 25°C auf einem Schütteltisch wird das ge samte Medium, das im Erlenmeyerkolben enthalten ist, in einen Fernbachkolben von 2 l Größe überführt, der 200 ml eines Mediums enthält, dessen Zusammensetzung mit derje nigen im Erlenmeyerkolben identisch ist. Dieser zweite Schritt zum Vorkultivieren wird wie der erste Schritt unter Schütteln bei 25°C durchgeführt. Die Fermentation zur Produktion wird mit dem Nährmedium in einem Reaktor mit einer Kapazität von vier Litern durchge führt, der ein Reaktionsvolumen von zwei Litern beinhaltet. Die Bewegung des Mediums er folgt durch eine RAYNERI-Turbine, deren Rotationsgeschwindigkeit auf 1000 Umdrehun gen pro Minute festgelegt ist. Die Belüftung erfolgt mit 0,5 v. v. m. Luft unter Atmosphären druck. Das Nährmedium besitzt die selbe Zusammensetzung, wie dasjenige, das zur Durch führung der Vorkultivierung eingesetzt worden ist, mit Ausnahme des Raps-Ethylesters, der kontinuierlich vom Zeitpunkt des Animpfens an, mit einer Versorgungsgeschwindigkeit von 1,5 Gramm pro Stunde und pro Liter des Mediums zugefügt wird.

Das Animpfen des Reaktors geschieht mit dem gesamten Inhalt des Fernbachkolbens. Nach der Selbst-Säuerung der Kultur wird der pH-Wert des Mediums durch die kontrollierte Zugabe von 4 N Sodalösung über ein pH-Meter-gesteuertes Magnetventil konstant auf ei nem Wert von 3,5 gehalten.

Das Kultivieren dauert 144 Stunden. Die Wachstumsphase des Stammes dauert etwa 24 Stunden, am Ende dieser Periode ist die Glucose aufgebraucht und das einzige Substrat besteht nun aus dem Raps-Ethylester, der kontinuierlich zugeführt wird. Am Schluß der Fermentation werden die Zellen der Hefemaische durch Zentrifugieren entfernt und die flüssige Phase gefriergetrocknet. Auf diese Weise erhält man pro Liter Medium 116 g eines Feststoffes, der 102 g Sophorolipide enthält. Die Analyse der Strukturformen der Sophoro lipide wird mit Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) bestimmt, mit einer 15 cm langen Hypersil C-18-Säule (Interchim, Montlucon, Frankreich) und einem Refraktions detektor. Das Lösungsmittel, das zum Eluieren verwendet wird, ist ein Gemisch aus Ace tonitril und Wasser im Verhältnis 70 : 30 (Vol/Vol) mit einem Durchsatz von 0,7 ml/min. Die acetylierten oder nichtacetylierten Formen der Sophorolipide werden zuerst eluiert, gefolgt von den Sophorolipiden in Lactonform. Um die Acetylierungsquote der sauren Vertreter zu bestimmen, wird HPLC durchgeführt, mit einer Säule, die identisch mit der vorher genann ten ist, und einem Lichtdiffusions-Detektor. Die Auftrennung der Säuren wird durch einen Acetonitril/Wasser-Gradienten beim Eluieren erreicht. Das Eluierungsgemisch enthält zu Beginn der Analyse 98% Wasser. Das Einschalten des linearen Gradienten führt zu einer Zusammensetzung des Elutionsmittels mit einem Wassergehalt von 30% nach 48 Minuten. Die Zusammensetzung der Mischung wird dann 14 weitere Minuten lang konstant gehalten. Auf diese Weise wird bestimmt, daß die Mischung der Sophorolipide aus 88 g/l in Form der Säuren besteht (das entspricht 86,2% Sophorolipide, gesamt) und daß unter diesen die acetylierte Form 77 g pro Liter des ursprünglichen Nährmediums ausmacht (das sind 87% der gesamten sauren Formen). Die Ausbeute an Sophorolipiden bezogen auf die beiden Kohlenstoffquellen Glucose und Raps-Ester beträgt 31,8%.

Beispiel 2 (vergleichbar mit Beispiel 1)

Beispiel 1 wird wiederholt, wobei während der Exkretionsphase 4 Zugaben von Glucose in fester Form durchgeführt werden, von denen jede gleich 50 g pro Liter des Mediums ist. Diese Zugaben werden nach 24, 48, 72 und 96 Stunden der Kultivierung, respektive, durchgeführt. Unter diesen Bedingungen erhält man 255 g/l (Menge bezogen auf das Aus gangsvolumen) eines Feststoffes, der 241 g/l an Sophorolipiden enthält. Die Säure-Form entspricht 71 g/l (30,7% der Gesamtsophorolipide) und davon beträgt der Anteil in acety lierten Formen 56 g/l (79% der Säure-Form). Die Ausbeute an Sophorolipiden in ihrer Säure-Form bezogen auf die beiden Kohlenstoffquellen, Glucose und Rapsöl-Ester, beträgt 14,9%.

Beispiel 3

Beispiel 1 wird wiederholt, wobei die Menge an Raps-Ethylester, der bei den beiden Vorkul turschritten eingesetzt wird, verringert wird. Diese wird von 20 g/l auf 2 g/l verringert. Unter diesen Bedingungen erhält man 115 g/l (Menge bezogen auf das Ausgangsvolumen) eines Feststoffes, der 99 g/l an Sophorolipiden enthält. Die Menge in Säure-Form entspricht dabei 89 g/l (90% der Geamtsophorolipide), von denen 74 g/l als acetylierte Säuren (das sind 88 % der Säure-Form) vorliegen. Die Ausbeute an Sophorolipiden in ihrer Säure-Form bezo gen auf die beiden Kohlenstoffquellen, Glucose und Raps-Ester, beträgt 30,4%.

Beispiel 4

Beispiel 1 wird wiederholt, wobei der Raps-Ethylester durch Sonnenblumen-Methylester er setzt wird. Am Ende dieses Versuches erhält man 114 g/l eines Feststoffes, der 98 g/l an Sophorolipiden enthält. Die Menge in Säure-Form entspricht dabei 84 g/l (85% der Ge amtsophorolipide), von denen 74 g/l als acetylierte Säuren (das sind 88% der Säure-Form) vorliegen. Die Ausbeute an Sophorolipiden in ihrer Säure-Form bezogen auf die beiden Kohlenstoffquellen, Glucose und Raps-Ester, beträgt 30,4%.

Beispiel 5

Beispiel 1 wird wiederholt, wobei der Durchsatz an zugeführtem Raps-Ethylester von 1,5 auf 1,9 g/(h.l) erhöht wird. Am Ende dieses Versuches erhält man 137 g/l eines Feststof fes, der 120 g/l an Sophorolipiden enthält. Die Menge in Säure-Form entspricht dabei 97 g/l (80% der Gesamtsophorolipide), von denen 82 g/l als acetylierte Säuren (das sind 84% der Säure-Form) vorliegen. Die Ausbeute an Sophorolipiden in ihrer Säure-Form bezogen auf die beiden Kohlenstoffquellen, Glucose und Rapsöl-Ester, beträgt 41.0%.

Claims

1. Fed-Batch-Verfahren zur Herstellung einer Mischung von Sophorolipiden, bei dem der Stamm Candida bombicola CBS 6009 in ein Nährmedium, das eine Zucker- und eine Stickstoffquelle enthält, unter geeigneten Bedingungen, bei denen dieser Stamm kultiviert wird, gegeben wird, und der besagte kultivierte Stamm in eine Reaktionszone gebracht wird zu einer Versorgung mit einem Substrat unter geeigneter Belüftung, Temperatur und pH-Wert Bedingungen, wobei das Substrat mindestens ein tierisches Öl, mindestens ein pflanzliches Öl und/oder mindestens einen Ester des besagten Öls umfasst, die besagten Öle und der besagte Ester eine lineare aliphatische Kette von 10 bis 24 Kohlenstoffatomen aufweisen und zumindest einmal die folgende Reaktionsfolge durchgeführt wird:

a) es wird eine kontinuierliche Versorgung des Stammes mit besagtem Substrat mit einem Durchsatz in der Reaktionszone, der zwischen einschließlich 0.01 und 4 Gramm pro Stunde und pro Liter des Ausgangs volumens liegt, durchgeführt und während einer Ver sorgungszeit, bei der die verbleibende Konzentration an besagtem Substrat in der Reaktionszone auf einem Wert gehalten wird, der höchstens gleich 18 Gramm pro Liter des Ausgangsreaktionsvolumens während der besagten Versorgungsdauer beträgt; und Erzeugen der Sophorolipide nach dem Aufbrauchen des Zuckers während der kontinuierlichen Zufuhr des Substrats und
b) die Mischung der Sophorolipidprodukte wird gewonnen mit einer acetylierten Säureform von mindestens 50% verglichen mit anderen Formen von Sophorolipiden.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem der Schritt zur Gewinnung der Mischung von Sophorolipiden die Abtrennung des Stammes von der Fermentationsmaische, die die Mi schung der Sophorolipide enthält, umfaßt, die Neutralisation der Maische auf einen pH-Wert in der Nähe des Neutralpunktes und die Eliminierung von Wasser durch Erwärmung und unter reduziertem Druck.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem der Schritt der Gewinnung der Mischung von Sophorolipiden die Abtrennung des Stammes von der Fermentationsmaische, die die Mi schung der Sophorolipide enthält, umfaßt, und die Eliminierung von Wasser unter reduziertem Druck.

4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem die Versorgung mit Substrat angehalten wird, wenn die Gesamtmenge an zugesetztem Substrat einen Wert von höchstens 280 g/l des Ausgangsreaktionsvolumens erreicht.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem die Herstellung der Sophorolipide bei einer Temperatur zwischen 18 und 35°C und einem pH-Wert von 2,5 bis 8 durchgeführt wird und bei dem die Reaktionszone mit einem Durchsatz von 0,2 bis 2 v. v. m. unter einem Druck von 1 bis 5 bar belüftet wird.

6. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem das Substrat aus mindestens einem Öl von Raps, Sonnenblume, Palme und/oder Soja und/oder mindestens einem Ester der besagten Öle besteht.

7. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem der Durchsatz an Substrat in der Reaktionszone zwischen 1,0 und 3,0 g/(l.h) des Ausgangsreaktionsvolumens beträgt.

8. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem der Stamm ex-situ kultiviert wurde.

9. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem der besagte Stamm im Nährmedium kontinuierlich mit Substrat versorgt wird.

10. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem die Reaktionszone am Anfang der Kultur eine Substratkonzentration von 0,5 bis 40 g/l des Ausgangsreaktionsvolumens enthält und eine kontinuierliche Versorgung des besagten Stammes mit Substrat durchgeführt wird, wenn die Ausgangskonzentration an Substrat zwischen 0,1 und 15 g/l liegt.

11. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem die Menge der eingesetzten Zellen, bezogen auf das Reaktionsvolumen, zwischen 1 g und 100 g Trockengewicht pro Liter liegt.

12. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem vor dem Schritt der Kultivierung zumindest ein Schritt der Vorkultivierung des Stammes unter geeigneten Bedingungen der Vorkultivierung in einem Medium zur Vorkultivierung durchgeführt wird, das mindestens eine Stickstoffquelle und mindestens eine Kohlenstoffquelle enthält, die aus der Gruppe gewählt wird, die mindestens ein Kohlenhydrat, mindestens einen Ester einer gesättigten oder ungesättigten Fettsäure mit 10 bis 24 Kohlenstoffatomen, mindestens einen gesättigten oder ungesättigten aliphatischen Kohlenwasserstoff mit 10 bis 20 Kohlenstoffatomen, mindestens einen aliphatischen Alkohol mit 10 bis 20 Kohlenstoffatomen, mindestens eine aliphatische Säure mit 10 bis 20 Kohlenstoffatomen und ihre Mischungen enthält, wobei der Anteil an Kohlenhydrat bei höchstens 20%, vorzugsweise zwischen einschließlich 2 und 12%, bezogen auf das Vornährmedium liegt; und der Anteil an Ester, Kohlenwasserstoff, Alkohol und/oder Säure unter 0,5%, vorzugsweise zwischen 0,1 und 0,3% bezogen auf das Vornährmedium liegt, und das Nährmedium mit dem Vornährmedium angeimpft wird.

13. Verfahren gemäß Anspruch 12, bei dem das Vornährmedium als Kohlenstoffquelle ein Kohlenhydrat und mindestens eine andere Kohlenstoffquelle umfaßt, die aus der Gruppe der Ester, der Kohlenwasserstoffe, der Alkohole und der Säuren aus Anspruch 12 ausgewählt wird.

14. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem das Sophorolipid mindestens 60% der acetylierten Säureform aufweist.

15. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem das Sophorolipid mindestens 70%-90% der acetylierten Säureform aufweist.

16. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem der Zucker Glukose ist.