FR2692593A1 - Procédé de production de sophorolipides acétyles sous leur forme acide à partir d'un substrat consistant et une huile ou un ester. - Google Patents

Abstract

On décrit un procédé de production en fed batch d'une composition de sophorolipides dans lequel on met en culture au moins une souche Candida bombicola dans un milieu de culture comprenant un sucre et un source d'azote et l'on soumet ladite souche cultivée dans une zone de réaction à une alimentation en un substrat approprié dans des conditions d'aération, de température, de pH, adéquates, et on réalise au moins une fois la séquence suivante: a) on effectue en continu l'alimentation de la souche en le substrat à un débit d'alimentation dans la zone réactionnelle compris entre 0,01 et 4 grammes par heure et par litre de volume réactionnel initial et pendant une durée d'alimentation tels que la concentration résiduelle en le substrat dans la zone réactionnelle soit maintenue à une valeur au plus égale à 18 grammes par litre de volume réactionnel initial pendant ladite durée d'alimentation; et b) on récupère la composition de sophorolipides produits; le procédé est caractérisé en ce que le substrat consiste essentiellement en au moins une huile animale, au moins une huile végétale et/ou au moins un ester de ladite huile, ledites huiles et ledit ester incorporant une chaîne linéaire aliphatique de 10 à 24 atomes de carbone.

Description

L'invention concerne un procédé de production avec alimentation continue

d'une composition de sophorolipides, comprenant une majeure partie d'acides

au moins en partie acétylés et la composition de sophorolipides ainsi obtenue.

Il a été mentionné dans les brevets US 3205150 et US 3312684 qu'une quantité de sophorolipides était produite par un procédé de fermentation mettant en jeu une culture de Torulopsis bombicola souche actuellement classée Candida bombicola. Il a par ailleurs été décrit dans la demande de brevet français de la Demanderesse sous le numéro d'enregistrement 90/16 211 un procédé de production de sophorolipides par fermentation avec alimentation continue

(fedbatch) en esters d'acides gras ou en huiles.

Les sophorolipides obtenus sont considérés comme étant un mélange de composés représentés par les formules ( 1) et ( 2), la formule ( 1) représentant

la forme acide et la formule ( 2) la forme lactone.

CH 12 OR

CH 20 R

H

CH,,OR

R 2 I

-COOH H

_ Z,ú O

o H

H H

CH 20 R O

Hko

H OH

( 1)

CH 2 OR

H H R 2 I

O CR H

çi L '3 R 3 C=O Dans ces formules, R représente l'hydrogène ou un groupe acétyle et R 2 l'hydrogène ou un reste alkyle comportant 1 à 9 atomes de carbone, lorsque R 3 est un reste hydrocarboné saturé à 7 à 16 atomes de carbone, ou bien R 2 représente l'hydrogène ou un groupe méthyle, lorsque R 3 est un reste

hydrocarboné insaturé à 13 à 17 atomes de carbone.

Jusqu'à présent, les procédés de préparation des produits décrivent un ensemble de nombreux homologues et la séparation de l'une des formes ( 2) principales (acide ou lactone) requiert par exemple des extractions par de l'alcool (EP B 209783) qui sont longues et coûteuses Par ailleurs, l'extraction par un solvant spécifique ne donne pas toujours de bons résultats car la solubilité de l'ensemble des homologues dans un solvant peut différer sensiblement, ce qui affecte la qualité des produits obtenus. D'autre part, les réactions de méthanolyse en présence de catalyseur acide ne donnent pas de meilleurs résultats et c'est très souvent un mélange d'acides ou

d'esters désacétylés qui est obtenu.

De plus, l'art antérieur (US 4197166) mentionne qu'il est extrêmement difficile de préparer par fermentation un produit désiré ayant un rapport

donné d'homologues.

Enfin, il est connu que les liaisons acétyles dans les sophorolipides sont chimiquement instables et sont très facilement hydrolysées par le chauffage ou le stockage prolongé au voisinage de la neutralité ou même à température ambiante dans des conditions faiblement alcalines, ce qui conduit à

l'obtention de la forme acide totalement désacétylée.

Il est donc extrêmement difficile par la fermentation ou la chimie d'obtenir

un seul produit et à fortiori un produit acétylé.

Par ailleurs, dans les applications pétrolières liées par exemple à la récupération assistée du pétrole, il est nécessaire de pouvoir créer des émulsions eau dans huile et donc de pouvoir disposer de produits émulsifiants plus hydrophobes qu'hydrophiles, ce qui ne peut être le cas des produits

acides désacétylés.

Il existe donc une demande dans l'industrie, pour des produits présentant une fonction acide gras et une structure saccharidique comportant des fonctions acétylées masquant les groupements hydroxyles très hydrophiles, notamment sur des produits obtenus par fermentation et comprenant une structure

saccharidique telle que le sophorose.

On a donc découvert un procédé de production en fedbatch d'une composition de sophorolipides comprenant une majeure partie d'acides au moins en partie acétylés dans des conditions particulièrement avantageuses et répondant aux inconvénients ci-dessus Plus particulièrement, on met en culture au moins une souche Candida bombicola ou Candida apicola dans un milieu de culture comprenant au moins un sucre et au moins une source d'azote dans des conditions appropriées telles que l'on produit ladite souche On soumet ensuite ladite souche à une alimentation en un substrat approprié dans des conditions d'aération, de température, de p H, adéquates et on réalise au moins une fois la 1 i O séquence suivante: a) On effectue en continu l'alimentation de la souche et ledit substrat à un débit d'alimentation dans la zone réactionnelle compris entre 0,01 et 4 grammes par heure et par litre de volume réactionnel initial et pendant une durée d'alimentation tels que la concentration résiduelle en ledit substrat dans la zone réactionnelle soit maintenue à une valeur au plus égale à 18 grammes par litre de volume réactionnel initial pendant ladite durée d'alimentation;

b) On récupère la composition de sophorolipides produits.

De manière plus précise, le substrat consiste essentiellement en au moins une huile animale, en au moins une huile végétale, et/ou au moins un ester de la dite huile, ledites huiles et ledit ester incorporant une chaîne linéaire

aliphatique de 10 à 24 atomes de carbone.

De manière préférée, l'alimentation en continu en substrat peut s'effectuer

selon un profil décroissant au cours du temps.

Selon une autre caractéristique du procédé selon l'invention, l'étape de récupération de la composition de sophorolipides fabriquée durant l'étape d'excrétion comprend la séparation de la souche du moût de fermentation contenant la composition de sophorolipides, la neutralisation à un p H voisin de la neutralité du moût et l'élimination de l'eau par chauffage et sous

pression réduite.

Selon une autre variante, l'étape de récupération de la composition de sophorolipides fabriquée durant l'étape d'excrétion comprend la séparation de la souche du moût de fermentation contenant la composition de sophorolipides et l'élimination de l'eau sous pression réduite Cette élimination de l'eau sous pression réduite est de préférence réalisée par lyophilisation. La-souche utilisée est avantageusement Candida bombicola CBS 6009 Elle peut provenir d'une culture réalisée ex- situ ou, selon une autre variante préférée, on peut soumettre directement la souche contenue dans le milieu de culture à 1 i O l'alimentation en substrat La productivité observée est alors excellente et le rendement en sophorolipides produits est très bon, par exemple au moins g/Il de sophorolipides par litre de milieu de culture La mise en oeuvre du procédé peut être réalisée de la façon suivante: on alimente en substrat en régulant le débit d'alimentation dans la zone réactionnelle dans les conditions opératoires précitées, on arrête l'alimentation en substrat lorsque la quantité totale de substrat injecté atteint environ au plus 280 g l 1 de volume réactionnel initial et on récupère la composition de sophorolipides

comme il a été indiqué ci-dessus.

Selon une autre caractéristique du procédé et de l'alimentation en continu, la zone de réaction peut contenir en début de culture une concentration en substrat de 0,5 à 40 g l 1 de volume réactionnel initial, avantageusement de 1 à g l 1 et on procède à l'alimentation en continu de ladite souche en substrat après une période, par exemple, d'au plus 48 heures, c'est à dire lorsque la concentration en substrat est généralement comprise entre 0,1 et 15 g l-1 par litre de milieu réactionnel initial et de préférence entre 0,1 et 5 g 11 Selon une autre caractéristique avantageuse du procédé permettant d'obtenir de bons résultats, le débit d'alimentation en continu en substrat dans la zone réactionnelle peut être compris entre 0,5 et 3,0 g h 1 1 de volume réactionnel initial et de façon préférée entre 1,0 et 2,5 g h 1 et plus particulièrement entre 1,5 et 2,0 g h 1 11 Parmi les huiles et esters préférés, on peut citer: l'huile et les esters méthyliques ou éthyliques de l'huile de colza, de tournesol, de palme ou de soja On a obtenu d'excellents résultats avec ledits esters, et notamment une sélectivité en forme acide acétylée d'au moins 50 %, avantageusement au moins 60 %, par exemple 70 à 90 %. Le milieu de culture peut comprendre une source d'azote minéral (sous forme d'ions ammonium) et/ou azote organique, par exemple sous forme d'urée et/ou d'aminoacides tels que notamment l'extrait de levure, la peptone de soja, 1 i O des hydrolysats de caséine, de la liqueur de macération de maïs, des hydrolysats de gluten de blé, des extraits de viande L'addition d'éléments minéraux tels que par exemple le potassium, le sodium, le magnésium et d'oligo-éléments comme le fer, le manganèse, le molybdène sous forme de leurs sels (sulfates, phosphates, chlorures) peuvent permettre également

d'améliorer encore la croissance.

Le milieu de culture peut comprendre au moins un sucre tel que le glucose ou

le saccharose, et éventuellement au moins un ester décrit ci-avant.

De manière avantageuse, on pourra ajuster la quantité de sucre apportée en début de fermentation de telle façon que l'on couvre sensiblement les besoins énergétiques liés à la croissance de la souche, cette croissance étant limitée

par un apport calculé de source azotée.

Par exemple, la quantité de sucre peut être de I à 100 g/l par rapport au milieu de culture et de préférence de 20 à 80 g/I et plus particulièrement de 40 à 70 g/l La quantité d'azote est généralement ajoutée en fonction de la

quantité de cellules que l'on souhaite obtenir.

Les conditions de culture sont habituellement les suivantes: température: 18-

C; p H 3,0 à 8,0 Un bon niveau d'activité a été obtenu à une température comprise entre 20 et 30 'C et dans un intervalle de p H de 3, 0 à 5,0 et on observe d'excellents niveaux d'activité à une température comprise entre 22 et 280 C et à un p H de 3,5 à 4,0 La fermentation s'effectue le plus souvent en

3 5 conditions initiales d'asepsie et en aérobiose.

Selon une autre caractéristique du procédé, on peut introduire la souche contenue dans le milieu de culture dans la zone réactionnelle afin de la soumettre à l'alimentation en substrat, mais on peut aussi selon une autre caractéristique du procédé soutirer la souche du milieu de culture par des techniques connues de l'Homme de métier et l'introduire dans la zone

réactionnelle o on la soumet à l'alimentation en substrat.

Le procédé de production des sophorolipides est en règle générale mis en 1 i O oeuvre dans les conditions suivantes: température: 18 à 350 C; p H: 2,5 à 8,0 avantageusement 3,0 à 4,0; débit d'aération: O 2 à 2 VVM sous une pression

absolue de 1 à 5 bar et de préférence I à 2 bar (I bar = 0,1 M Pa).

Pendant toute la durée de la production, le p H est contrôlé et régulé à une valeur de consigne comprise dans la gamme décrite plus haut, par l'apport

d'une solution de soude ou de potasse par exemple.

La quantité de cellules mises en jeu par rapport au volume réactionnel initial est habituellement de 1 g à 100 g de poids sec par litre et de préférence de 10 à

30 g de poids sec par litre.

Selon une caractéristique particulièrement avantageuse, on peut réaliser au moins une étape de préculture de la souche avant sa mise en culture dans un milieu de préculture contenant: au moins une source d'azote, et au moins une source de carbone choisie dans le groupe comprenant au moins un hydrate de carbone, au moins un ester d'acide gras saturé ou insaturé de 10 à 24 atomes de carbone, au moins un hydrocarbure aliphatique saturé ou insaturé de 10 à 20 atomes de carbone, au moins un acide aliphatique de 10 à 20 atomes de carbone, au moins un alcool aliphatique de 10 à 20 atomes de carbone, et leurs mélanges; la proportion d'hydrate de carbone étant au plus égale à 20 % par rapport au milieu de préculture et la proportion pondérale d'ester, d'hydrocarbure, d'alcool et/ou d'acide étant au plus égale à 0,5 %;

3 5 et on ensemence le milieu de culture avec le milieu de préculture.

De manière préférée, le milieu de préculture peut comprendre au moins un hydrate de carbone et au moins une autre source de carbone choisie dans le groupe comprenant les esters, les hydrocarbures, les alcools et les acides

définis ci-avant.

Selon une caractéristique du procédé, on peut effectuer la ou les étapes de préculture à une température de 18 à 40 'C et de préférence de 20 à 30 'C, durant une période de temps de 12 à 72 heures chacune et plus

particulièrement de 24 à 36 heures.

Selon une autre caractéristique avantageuse du procédé, l'ester d'acide gras, l'hydrocarbure aliphatique, l'alcool aliphatique, l'acide aliphatique peut être dans une proportion pondérale de 0,1 à 0,30 % par rapport au milieu de préculture et l'hydrate de carbone dans une proportion pondérale de 2 à 12 %

par rapport au milieu de préculture.

On a obtenu des résultats particulièrement intéressants avec une concentration pondérale en hydrate de carbone de 6 à 10 % dans le milieu de préculture. Selon une autre caractéristique avantageuse du procédé, la source de carbone peut être choisie dans le groupe comprenant lesdits esters d'acides gras de 16 à 18 atomes de carbone, lesdits hydrocarbures de 16 à 18 atomes de carbone, ledits alcools de 16 à 18 atomes de carbone et lesdits acides de 16 à 18 atomes de

carbone.

La source d'azote utilisée dans l'étape de préculture est généralement une source d'azote minéral sous forme d'ions ammonium et/ou azote organique

comme décrit ci-avant pour le milieu de culture.

La propagation de la souche est généralement réalisée par ensemencement d'un milieu de préculture en petit volume à partir d'un tube gélosé utilisé

pour la conservation de cette même souche.

Ce milieu de préculture, après une période d'incubation sur table d'agitation est ensuite transféré dans un réacteur de production dans lequel la mise en oeuvre du procédé peut être réalisée selon le protocole opératoire déjà décrit

dans la demande de brevet français de la Demanderesse (EN 90/16211).

Par le procédé selon l'invention, on obtient généralement plus de 55 % de sophorolipides acides sous forme acétylée et de préférence au moins 60 % par exemple 60 à 70 % La mise en oeuvre de la phase de préculture permet

d'augmenter la sélectivité.

La caractérisation des formes structurales des sophorolipides est habituellement effectuée par chromatographie liquide haute performance (HPLC) du mélange obtenu, équipée d'un détecteur par exemple réfractométrique. Le taux d'acétylation des formes acides est en règle générale déterminé par chromatographie liquide haute performance, équipée d'un détecteur par

exemple à diffusion de lumière.

Exemple 1

La souche utilisée est la levure Candida bomnbicola CBS 6009 qui est conservée par des repiquages mensuels sur le milieu gélosé de composition suivante Peptone pepsique (Biothione BIOMERIEUX) 10 g/Il Extrait de levure 5 g/1 Ester éthylique de colza 15 g/1 Gélose 30 g/1 La propagation de la souche est effectuée sur le milieu de préculture suivant: Glucose 60 g/l (NH 4) 2 SO 4 4 g/l KH 2 PO 4 1 g/1 Mg SO 4, 7 H 20 0 5 g/l Liqueur séchée de macération de maïs 5 g/l Ester éthylique de colza 20 g/l Pour la préparation de ce milieu de préculture, on stérilise ensemble à 120 'C pendant 25 minutes le glucose, l'ester éthylique de colza, Mg SO 4, 7 H 20 dans la moitié de l'eau nécessaire, tandis que KH 2 PO 4, (NH 4)2 SO 4 et la liqueur de macération de maïs, sont stérilisés, avec le même barème de stérilisation, dans l'autre moitié d'eau Le milieu de préculture est reconstitué, après

refroidissement à la température ambiante, par mélange des deux solutions.

On ensemence une fiole d'Erlenmeyer de 200 ml de capacité contenant 30 ml de milieu de préculture Après 40 heures d'incubation sur table d'agitation, à 1 i O la température de 250 C, on transfère la totalité du milieu contenu dans la fiole d'Erlenmeyer dans une fiole de Fernbach d'une capacité de 2 litres contenant 200 ml d'un milieu dont la composition est identique à celle de la fiole d'Erlenmeyer Cette deuxième étape de préculture est accomplie comme la première étape sous agitation à la température de 250 C La fermentation de production est effectuée avec le milieu de culture dans un réacteur de quatre litres de capacité contenant un volume réactionnel de deux litres L'agitation du milieu est provoquée par une turbine RAYNERI dont la vitesse de rotation est fixée à 1000 tours/min L'aération est de 0,5 v v m d'air sous pression atmosphérique Le milieu de culture a la même composition que celui employé pour la chaîne de préculture à l'exception de l'ester éthylique de colza qui est ajouté en continu, dès l'ensemencement à une vitesse d'alimentation de 1,5

gramme par heure et par litre de milieu.

L'ensemencement du réacteur est effectué avec la totalité du contenu de la fiole de Fernbach Après auto-acidification de la culture, le p H du milieu est maintenu constant à la valeur de 3,5 par une addition de soude 4 N contrôlée

avec une électrovanne asservie à un p Hmètre.

La culture dure 144 heures La phase de croissance de la souche dure environ 24 heures et à l'issue de cette période, le glucose est épuisé et le substrat unique est alors constitué par l'ester éthylique de colza qui est fourni en continu En fin de fermentation, ou élimine les cellules de la souche de levure par centrifugation et on lyophilise la phase liquide On récupère ainsi, par

litre de milieu, 116 g d'un solide renfermant 102 g de sophorolipides.

L'analyse des formes structurales des sophorolipides est effectuée par chromatographie liquide haute performance (CLHP) avec une colonne Hypersil C-18 de 15 cm de longueur (Interchim, Montluçon, France) et un détecteur réfractométrique Le solvant utilisé pour l'élution est un mélange d'acétonitrile et d'eau dans le rapport 70:30 (v/v) à un débit de 0,7 ml/min Les formes acides des sophorolipides acétylées ou non, sont éluées en tête, suivies par les formes lactones Pour déterminer le taux d'acétylation des formes acides, on utilise une CLHP équipée d'une colonne identique à la précédente et un détecteur à diffusion de lumière La résolution des formes acides est obtenue avec un gradient d'élution acétonitrile/eau Le mélange éluant contient 98 % d'eau au début de l'analyse L'intervention du gradient linéaire amène la composition de l'éluant à 30 % d'eau après 48 minutes La composition du mélange est ensuite maintenue constante pendant 14 minutes supplémentaires On détermine ainsi que le mélange de sophorolipides est constitué par 88 g/l de formes acides (soit 86,2 % des sophorolipides totaux) et que, parmi celles-ci, les formes acétylées représentent 77 g par litre de milieu de culture initial (soit 87 % des formes acides totales) Le rendement en sophorolipides formes acides par rapport aux deux sources de carbone,

glucose et ester de colza est de 31,8 %.

Exemple 2 (comparatif de l'exemple 1).

On répète l'exemple 1 en procédant durant la phase d'excrétion, à 4 additions de glucose sous forme solide, chacune d'elles étant égale à 50 g par litre de milieu Ces additions sont effectuées après respectivement, 24, 48, 72 et 96 heures de culture Dans ces conditions, on obtient 255 g/l (quantité rapportée au volume initial) d'un solide renfermant 241 g/l de sophorolipides Les formes acides en représentent 71 g/I ( 30,7 % des sophorolipides totaux) et parmi celles-ci les formes acétylées sont de 56 g/l ( 79 % des formes acides) Le rendement en sophorolipides formes acides par rapport aux deux sources de

3 O carbone, glucose et ester de colza est de 14,9 %.

Exemple 3

On répète l'exemple 1 en diminuant la quantité d'ester éthylique de colza mise en oeuvre dans les deux étapes de la préculture Celle-ci est diminuée de 20 g/l à 2 g/l Dans ces conditions, on obtient 115 g/Il (quantité rapportée au volume initial) d'un solide renfermant 99 g/l de sophorolipides Les formes acides en représentent 89 g/l ( 90 % des sophorolipides totaux) et parmi celles-ci les formes acétylées sont de 78 g/l ( 87 % des formes acides) Le rendement en sophorolipides formes acides par rapport aux deux sources de carbone glucose

1 O et ester de colza est de 32,2 %.

Exemple 4

On répète l'exemple 1 en remplaçant l'ester éthylique de colza, par l'ester 1 5 méthylique de tournesol On obtient à la fin de l'essai 114 g/l d'un solide renfermant 98 g/l de sophorolipides La quantité de sophorolipides sous forme acide est de 84 g/l (soit 85 % des sophorolipides totaux) dont 74 g/l d'acides acétylés (soit 88 % des formes acides) Le rendement en sophorolipides formes acides par rapport aux deux sources de carbone, glucose et ester de colza est de

30,4 %.

Exemple 5

On répète l'exemple 1 en augmentant le débit d'injection de l'ester éthylique de colza de 1,5 à 1,9 g/h l On obtient à la fin de l'essai 137 g/l d'un solide renfermant 120 g/l de sophorolipides Les formes acides en représentent 97 g/l ( 80 % des sophorolipides totaux) dont 82 g/l d'acides acétylés ( 84 % des acides totaux) Le rendement en sophorolipides formes acides par rapport aux

deux sources de carbone, glucose et ester dc colza est de 41,0 %.

Claims (15)

REVENDICATIONS

1 Procédé de production en fed batch d'une composition de sophorolipides dans lequel on met en culture au moins une souche Candida bombicola ou Candida apicola dans un milieu de culture comprenant un sucre et un source d'azote dans des conditions appropriées telles que l'on produit ladite souche et l'on soumet ladite souche cultivée dans une zone de réaction à une alimentation en un substrat approprié dans des conditions d'aération, de température, de p H adéquates, et on réalise au moins une fois la séquence suivante: a) On effectue en continu l'alimentation de la souche en ledit substrat à un débit d'alimentation dans la zone réactionnelle compris entre 0,01 et 4 grammes par heure et par litre de volume réactionnel initial et pendant une durée d'alimentation tels que la concentration résiduelle en ledit substrat dans la zone réactionnelle soit maintenue à une valeur au plus égale à 18 grammes par litre de volume réactionnel initial pendant ladite durée d'alimentation; et b) On récupère la composition de sophorolipides produits caractérisé -en ce que le substrat consiste essentiellement en au moins une huile animale, au moins une huile végétale et/ou au moins un ester de ladite huile, ledites huiles et ledit ester incorporant une

chaîne linéaire aliphatique de 10 à 24 atomes de carbone.

2 Procédé selon la revendication 1 dans lequel l'étape de récupération de la composition de sophorolipides comprend la séparation de la souche du moût de fermentation contenant la composition de sophorolipides, la neutralisation à un p H voisin de la neutralité du moût et l'élimination de

3 l l'eau par chauffage et sous pression réduite.

3 Procédé selon la revendication 1 dans lequel l'étape de récupération de la composition de sophorolipides comprend la séparation de la souche du moût de fermentation contenant la composition de sophorolipides et

3 5 l'élimination de l'eau sous pression réduite.

4 Procédé selon l'un des revendications 1 à 3, dans lequel on arrête

l'alimentation en substrat lorsque la quantité totale de substrat injecté atteint au plus 280 g 1-1 de volume réactionnel initial.

Procédé selon l'une des revendications I à 4, dans lequel on met en

oeuvre la production de sophorolipides à une température de 18 à 350 C, à un p H de 2,5 à 8, en présence d'un excès de sucre et dans lequel on aère la

1 i O zone de réaction à un débit de 0,2 à 2 v v m sous une pression de 1 à 5 bar.

6 Procédé selon l'une des revendications I à 5, dans lequel le substrat

consiste en au moins une huile de colza, de tournesol, de palme et/ou de

soja, et/ou au moins un ester des dites huiles.

7 Procédé selon l'une des revendications l à 6 dans lequel la souche est

Candida bombicola CBS 6009.

8 Procédé selon l'une des revendications I à 7, dans lequel le débit de

-1 -1 substrat dans la zone de réaction est compris entre 1,0 et 3,0 g l h de

volume réactionnel initial.

9 Procédé selon l'un des revendications I à 8, dans lequel la souche

provient d'une culture réalisée ex-situ.

Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, dans lequel on soumet ladite

souche contenue dans le milieu de culture à l'alimentation en substrat.

1 i 1 Procédé selon l'un des revendications l à 10, dans lequel la zone de

réaction contient en début de culture une concentration en substrat de 0, 5 à 40 g 1-1 de volume réactionnel initial et on procède à l'alimentation en continu de ladite souche en substrat lorsque la concentration initiale en substrat est de 0,1 à 15 g l

12 Procédé selon l'une des revendications 1 à 11, dans lequel la quantité de

cellules mises en jeu par rapport au volume réactionnel est de 1 g à 100 g

de poids sec par litre.

13 Procédé selon l'une des revendications 1 à 12 dans lequel, avant l'étape de

mise en culture, on effectue au moins une étape de préculture de la souche dans des conditions de préculture appropriées dans un milieu de préculture contenant au moins une source d'azote, et au moins une source 1 i O de carbone choisie dans le groupe comprenant au moins un hydrate de carbone, au moins un ester d'acide gras saturé ou insaturé de 10 à 24 atomes de carbone, au moins un hydrocarbure aliphatique saturé ou insaturé de 10 à 20 atomes de carbone, au moins un alcool aliphatique de à 20 atomes de carbone, au moins un acide aliphatique de 10 à 20 atomes de carbone et leurs mélanges; la proportion d'hydrate de carbone étant au plus égale à 20 %, de préférence comprise entre 2 et 12 % par rapport au milieu de préculture; et la proportion pondérale d'ester, d'hydrocarbure, d'alcool et/ou d'acide étant inférieure à 0,5 %, de préférence comprise entre 0,1 et 0,3 % par rapport au milieu de préculture, et on ensemence le milieu de culture avec le milieu de préculture. 14 Procédé selon la revendication 13 dans lequel le milieu de préculture comprend comme source de carbone un hydrate de carbone et au moins une autre source de carbone choisie dans le groupe des esters, des

hydrocarbures, des alcools et des acides de la revendication 13.

Composition de sophorolipides contenant une majeure partie d'acides au moins en partie acétylés, obtenus par le procédé selon l'une des

revendications 1 à 14.

16 Composition selon la revendication 15 dans laquelle la proportion d'acides

acétylés est supérieure à 50 % et de préférence supérieure à 60 %.