JPH01160478A - 新規カンジダ・トロピカリス菌株およびそれを用いたジカルボン酸の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、Ｃ１２脂肪酸よるチルをα、ω−ジカルボン
酸に転化する能力を有する新規カンジダ・トロピカリス
菌株およびその突然変異種ならびに変異体、およびそれ
を用いたジカルボン酸の製法に関する。

［従来の技術］ １０個以上の炭素原子を有するジカルボン酸を有機化学
的製法により商業的規模で製造することは困難である。

これは、特に、二つの末端カルボキシル基以外に二重結
合や水酸基のような他の官能基を有するジカルボン酸に
あてはまる。

そこで、様々な微生物の代謝エネルギーを利用して、入
手容易な出発物質からジカルボン酸を製造する試みがな
されてきＩ；。すなわち、西ドイツ特許第２１　４０　
１３３号は、発酵条件下に、カンジダ属またはピチア（
ｐ　１ｃｈｉａ）属の酵母を、アルカン、第１アルカノ
ールまたはカルボン酸に作用させることを記載している
。例えばカンジダ・リポリチカ（Ｃａｎｄｉｄａ　１ｉ
ｐｏｌｙｔｉｃａ）の特別の菌株を用いた場合、形成さ
れたジカルボン酸には出発物質からみて炭素鎖減成があ
ったとしても極く僅かしかなく、新しい官能基の導入の
ような他の変化も起こらない。他の特別の微生物を用い
る同様の方法が、米国特許第３，９７５，２３４号およ
び同第４．３３９．５３６号、英国特許筒１．４０５．
０２６号、および、西ドイツ公開特許第２１６４　６２
６号、同第２８　５３　８４７号、同第２９　３７　２
９２号および同第２９　５１　１７７号に記載されてい
る。

米国特許第４．４７４．８８２号は、不飽和ジカルボン
酸に関する。それらは、カンジダ・トロピカリス種の菌
株を用いて、不飽和ＣＩ４〜０２２モノカルボン酸を転
化して得られる。不飽和ジカルボン酸は、二重結合の数
と位置が出発物質と同じである。

しかしながら、上述のいずれの方法でも所望のジカルボ
ン酸を極めて微量にしか生産できない。

すなわち、上記米国特許におけるジカルボン酸の収率は
、２日間の発酵期間で０．６５ｇ／βから多くとも１．
９６ｇ／１２である。そのような収率は、商業的方法に
とっては低すぎる。

未公開の西ドイツ特許出願第３７　２１　１１９゜６号
（日本国特許出願６３−１５９０４３号）は、炭素鎖長
１４の基質、例えばミリスチン酸メチルを特別に転化し
て１４個の炭素原子を有するジカルボン酸にすることの
できるカンジダ・トロピカリス突然変異種を記載してい
る。

この先行技術を鑑みると、ラウリン酸のエステル、例え
ばラウリン酸メチルを転化して相当するジカルボン酸に
することができ、より高分子量の同族体（Ｃ１４、Ｃ１
６、Ｃｌ８）よりもＣＩ！化合物番二ついてより高い転
化速度を提供する微生物を得ることが望ましい。更に、
商業的方法にとって充分な収率が望まれる。

［発明の開示１ すなわち、本発明は、ラウリン酸メチルをそれよりも高
級の同族体に比べて速い転化速度でσ。

ω−ジカルボン酸に転化する能力を有する寄託番号ＤＳ
Ｍ　４２７７　（ＤＣ２−Ｃ２００９Ｘブダペスト条約
により寄託）で寄託されたカンジダ・トロピカリス菌株
およびその突然変異種ならびに変異体に関する。

本発明はまた、少なくとも部分的にラウリン酸エステル
を含有する脂肪酸混合物を発酵転化して脂肪酸成分に同
数の炭素原子を有するジカルボン酸を得る方法であって
、ラウリン酸メチルをそれよりも高級の同族体に比べて
速い速度でα、ω−ジカルボン酸に転化する能力を有す
るカンジダ・トロピカリス菌株ＤＣ２−Ｃ２００９（Ｄ
ＳＭ４２７７）（ブダペスト条約により寄託）、その突
然変異種及び／又は変異体の存在下に転化を行うことを
特徴とする方法に関する。

ブダペスト条約により寄託したカンジダ・トロピカリス
菌株ＤＣ２−Ｃ２００９は、公に入手できるカンジダ・
トロピカリス菌株ＡＴＣＣ２０３３６から、突然変異お
よび選択により得た。寄託した菌株に加えて、選択的に
ラウリン酸エステルをドデカンジカルボン酸に転化する
上記能力を有するなら、それらの突然変異種および変異
体も使用することができる。

このような突然変異菌株は、突然変異および選択、特に
多段突然変異および多段選択により得ることができる。

突然変異は、例えば、紫外線やＸ線のような高エネルギ
ー線照射により行うことができる。しかしながら、細胞
を突然変異誘導剤で処理して突然変異させることもでき
る。適当な突然変異誘導剤は、例えば、１−メチル−３
−ニトロ−１−ニトロソグアニジンのようなニトロソグ
アニジン化合物またはメタンスルホン酸エチルである。

より具体的には、従来技術の公開情報、例えば米国特許
第４，０２９，５４９号、第２欄、５７行以下およびそ
こに開示された参考資料を参照することができる。

本発明の方法に好適な突然変異種の調製のために、突然
変異誘導剤の濃度および接触時間は、出発群の１０〜９
９．９９９％が処理により不活性化されるように選択さ
れる。５０〜９９．９％の死滅率が好ましく選択される
。

突然変異処理後の、大きな微生物群からの本発明の方法
に好適な突然変異種の選択は、形成された突然変異種菌
株の改質された特性が選択に有利となる、または有利で
あると認識される培養条件下に行う。選択のために、突
然変異後に得られた微生物群を、例えば、本発明の方法
で唯一の炭素源として使用する基質を含有する最少培地
上で培養することができる。突然変異処理の結果として
存在する、炭素源上で成長する能力を喪失したこれらの
突然変異微生物は、分離培地での培養中に増殖すること
はできない。従って、それらは成長しない。突然変異処
理中にあまり損傷を受けず他の欠陥を被ることもなかっ
た突然変異種群の他の部分は、分離培地の炭素源により
成長することができる。従って、培養中に増殖が起こる
。分離を達成するために、分離培地は、成長していない
突然変異種菌株は損傷を受けることなく、成長している
菌株はその成長が原因で成長中に死滅するような効果を
有する物質を含有する。例えば、そのような分離は、例
えば、ニスタチン（１ｙ３ｔａｔｉｎ）のような抗生物
質の添加により可能である。

この段階における突然変異種分離のもう一つの可能性は
、細胞損傷性の、特に反応性の成分を、突然変異種群の
分離培地上で成長している部分に組み込むことである。

例えば、１２ｐを、成長している菌株に組み込むことが
好適である。これは、例えば、この選択工程に使用する
栄養液中にそのように放射性ラベルされた燐酸塩を用い
ることにより可能である。０ｐによる分離のために、栄
養液中にＮａＨ，”ＰＯ，を用いることが特に好適であ
る。

本発明の方法に必要な突然変異種菌株（欠陥ブロック突
然変異種菌株）を、例えばレダーバーブ法により、濃縮
した突然変異種から単離することができる。ここで用い
る手順、抗生物質濃縮法およびレダーバーゲスタンプ法
に関して、例えばジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・
ケミカル・ソサエティー（Ｊ　ｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔ
ｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　ＣｈｅｍｉｃａＩ　５ｏｃｉ
ｅｔｙ）　、第７０巻、４２６７頁（１９４８年）、デ
ービス（Ｄａｖｉｓ）　、　Ｂ、　Ｄ、　　（抗生物質
濃縮法）、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊｏ
ｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）　、第
６３巻、３９９頁（１９５２年）、レダーバーブｌ　Ｊ
％　レダーバーブ、Ｅ、Ｍ、（レダーバーブ法）が参照
される。

突然変異種を更に選択するために、当業者は、ラウリン
酸エステルをそれよりも高級の同族体より優先的に転化
する能力を考慮に入れるであろう。

当業者はまた、製造されるジカルボン酸の量を考慮に入
れるであろう。すなわち、フラスコ振盪条件下に、本発
明によりラウリン酸メチルからドデカンニ酸を、９６時
間の転化時間あたり少なくともｌ　Ｏｇ／Ｑの量で得る
ことができる。

本発明の突然変異種は、ラウリン酸そのものをドデカン
ニ酸に転化するものではない。それどころか、０．１重
量％以上の濃度においてさえ、ラウリン酸は細胞毒効果
を奏する。すなわち、ラウリン酸エステルの高い転化率
は、当業者にとって一層驚くべきものである。

本発明の方法にとって好ましい出発物質は、ラウリン酸
を多く含む脂肪酸混合物と０１〜Ｃ６アルコール、特に
０１〜Ｃ，モノアルコールとのエステル混合物である。

すなわち、特に好適な出発物質は、ヤシ油またはパーム
核油のメチルエステル、または縮合および蒸留法により
それらから製造されたラウリン酸メチルを比較的多量に
含有する留分である。同等に好適な出発物資は、少なく
とも部分的にラウリン酸エステルを含有する完全合成脂
肪酸エステル混合物である。これらの混合物からドデカ
ンニ酸が好ましく形成される。

全ての場合において、遊離ラウリン酸含量をできるだけ
少なく維持する必要がある。

本発明の方法で出発物質として使用することのできるモ
ノカルボン酸エステルの一つの群は、エチレンのオリゴ
マー化および相当する転化により得ることのできるカル
ボン酸エステルである。

使用するエステルのアルコール部分についてみれば、１
〜４個の官能基および１〜６個の炭素原子を有するアル
コールのエステルが好適であると言うことができる。モ
ノアルコールのエステルが好ましく、メタノールまたは
エタノールのような短鎖モノアルコールのエステルが特
に好ましい。

本発明の方法の実施に使用する発酵培地は、カンジダ属
、特にカンジダ・トロピカリス種の微生物の培養用の既
知の培地である。好適な発酵培地は通常の微量成分、窒
素源、および転化すべき基質とは異なる他の炭素源を含
有する。本発明において、微量成分は、アンモニウム、
カリウム、ナトリウム、マグネシウム、カルシウムおよ
びマンガンのカチオンと燐酸アニオン、硫酸アニオンお
よび塩酸アニオンとの塩であると解される。無機化合物
に加えて、ペグトン、酵母エキスまたはコーン浸漬液を
窒素源として使用することもできる。

発酵溶液は、炭素源として共基質も含有する。

共基質として、例えば酢酸ナトリウムを使用することが
できる。更に、グルコース、フルクトース、マルトース
、トレハロース等のような標準的糖類を共基質として使
用することができる。特に好ましい共基質は、グルコー
スおよびグリセロールである。

本方法の実施に関しては、二工程に分けて実施するのが
最良である。第１の工程においては微生物を培養し、そ
の目的のためにｐＨを７より低い値、例えば５．５〜７
の値に調節してそのｐＨ値を一定に保持し、共基質の量
を第」工程の終了時にほとんど完全に使い尽くされるよ
うに選択するのが望ましい。

第２の工程において、工程の最初にｐＨを７゜１〜８の
値、好ましくは約７．２に調節して、転化すべき脂肪酸
エステルを添加することができる。

第２の工程において、数時間、例えば４〜８時間の誘導
段階後に、細胞呼吸が害されないような量で共基質を添
加するのが最良である。この目的のために、好適な電極
により発酵溶液バッチの酸素含量をモニターすることが
できる。発酵期間中に、転化すべき出発物質を少しずつ
添加するのが最良である。

本発明により形成されたジカルボン酸は、部分的にモノ
エステルとして存在することがある・。既知のケン化法
により、モノエステルから遊離酸を得ることかでさる。

本発明の方法のもう一つの態様において、発酵培地中で
の分散を向上させるために、転化すべき出発物質に乳化
剤を添加するのが好ましい。すなわち、発酵培地基準で
合計０．１〜３重量％の乳化剤が存在すると、好ましい
結果が得られる。生理学的に適合性のある乳化剤が好適
であり、特に生理学的に適合性のある非イオン性乳化剤
が好適である。すなわち、例えば、糖エステル、または
ソルビタンエステル、エトキシ化糖エステル、エトキシ
化ソルビタンエステルあるいはアルキルグリコシドを使
用することができる。

本発明の方法において、他の助剤として抑泡剤を添加す
ることもできる。生物適合性の抑泡剤、例えば、ポリプ
ロピレングリコール系の抑泡剤が好ましい。要すれば、
他の漂準的助剤を添加してもよい。

本発明の方法により得られたジカルボン酸の鎖長は、使
用するエステルの酸成分の鎖長に対応する。Ｃ１２エス
テルへの高度の基質特異性故に、特に純粋なドデカンニ
酸（デカンジカルボン酸）が形成される。すなわち、上
記酸は工業用ラウリン酸メチルから純度９８％で得るこ
とができる。

発酵工程中に調製された飽和ジカルボン酸混合物を、直
接、多くの用途に用いることができる。

すなわち、例えばポリマー、特に樹脂の改質にこの混合
物を直接使用することができる。

以下の実施例は、カンジダ・トロピカリス菌株ＤＣ２−
Ｃ２００９（ＤＳＭ　　４２７７）を用いておこなった
。

［実施例］ 実施例１ １　培養条件および反応手順 １．１　　菌株貯蔵 麦芽エキス傾斜管および凍結乾燥剤 １．２　　フラスコ振盪（使用容積１００ｍ１）１．２
．１ 「予備培養　Ｉ」 振盪器内で、ｐＨ６のＹＭ液体培地（酵母／麦芽エキス
液体培地）〔デイフコ（Ｄｉｒｃｏ）製〕　１００ｍＱ
中、温度３０°Ｃ１振盪速度１５０　ｒ、ｐ、ｍ、とし
て２４時間傾斜管副次培養。

「予備培養　■」 酵母−窒素−ベース（デイフコ製）　　０．６７％酢酸
ナトリウム　　　　　　　　　　０．３％ペプトン　　
　　　　　　　　　　０．３％酵母エキス　　　　　　
　　　　　　０．５％グルコース　　　　　　　　　　
　　　２％を０．１Ｍホスフェート緩衝液に溶解。

ｐＨ７，２ ５００＋ｍＱエルレンマイヤーチケイン（ｃｈｉｃａｎ
ｅ）フラスコ中の１００−のバッチ。

接種材料は予備培養ＩのｌＯｍＱ。

グルコース全てが消費されるまで（約２４時間）、３０
℃、振盪速度１５０　ｒ、ｐ、ｍ、で培養。

１．２．２　　転化培養 酵母−窒素−ベース（デイフコ製＞　　０．６７％エト
キシ化ソルビタンモノオレエート ０．２％ ラウリン酸ンチル（工業用）　　　　４％を０．２Ｍホ
スフェート緩衝液に溶解 Ｈ８ ５００ｍｆｆエルレンマイエルチケインフラスコ中の５
０＋＋１１２のバッチ。

接種材料は予備培養■の５０ｍＱ０ 反応ｐＨ７，２゜ ３０°Ｃ１振とう速度１５０　ｒ、ｐ、ｍ、で培養。

グルコース不存在誘導段階（４〜８時間）誘導段階後、
グルコース０．５％を毎日添加。

毎日、ｐＨを７．２に調節。

毎日、試料採取。

９６時間の転化後、ドデカンニ酸の収率は１０ｇ／Ｑで
あった。

実施例２ ２　小規模発酵槽中での製造 ２、１　　小規模発酵（使用容積１．５Ｑ）装置ニブラ
ウン・ビオスタット（Ｂ　ｒａｕｎ　Ｂ　１ｏｓｔａｔ
）　Ｅ　（撹拌発酵槽） ２．２　予備培養 ヴイルツエ（Ｗｉｉｒｚｅ）液体培地１：１５０ｍＱ、
メルク（Ｍｅｒｃｋ）製〕中において２４時間傾斜管副
次培養。

２．３　発酵槽培養 ２．３．１　　媒体 グルコース　　　　　　　　　　　３％酵母エキス　　
　　　　　　　　０．３％コーン浸漬液　　　　　　　
　０．１％（ＮＨ４）！Ｓ０．　　　　　　　０．２％
ＮＨ，Ｎｏ３　　　　　　　　０．１％ＮａＨｚＰ０４
　　　　　　　　　０．１％に２ＨＰ０．　　　　　　
　　　０．１５％Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ２００，０５％ ＫＣＱ　　　　　　　　　　　　　Ｏ，０５％ＭｎＣＱ
、　　　　　　　　　　　０．０５％Ｚｎ５Ｏ，−７Ｈ
２００，０１％ Ｆｅ５０．・７ＨｚＯＯ，００５％ ビオチン　　　　　　　　　　　０．０００１％エトキ
シ化ソルビタンモノオレエート ０．２％ ｐＨ６，０ ２，３，２手順 空気流量１　ｖｖｍ、撹拌速度９００　ｒ、ｐ、＋ｎ−
、ポリプロピレングリコール系抑泡剤、ｐＨ自動制御、
ｐ０２電極を使用。グルコース全てが消費されるまで成
長（２４〜３０時間）。

ｐＨを６．０から７．２に上昇させ、同時にラウリン酸
メチル２％添加。

発酵中卒連続的に基質を添加。

要すれば、共基質（グルコース）を細胞呼吸に適合させ
て添加するが、早くとも４〜８時間の誘導段階後である
。

毎日、試料採取。

１２０時間転化した後、ドデカンニ酸の収率は４０　ｇ
／Ｑであった。

実施例３ 使用する突然変異種の選択性を決めるために、カンジダ
・トロピカリス菌株ＤＣ２−Ｃ２００９（ＤＳＭ　４２
７７）を用いて多くの異なる基質を転化した。以下の収
率が得られた。

特許出願人　ヘンケル・コマンディットゲゼルシャフト
・アウフ・アクチェン

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ラウリン酸メチルをそれよりも高級の同族体に比べ
   て速い転化速度でα，ω−ジカルボン酸に転化する能力
   を有する、寄託番号ＤＳＭ４２７７で寄託されたカンジ
   ダ・トロピカリス菌株およびその突然変異種ならびに変
   異体。 ２、少なくとも部分的にラウリン酸エステルを含有する
   脂肪酸混合物を発酵転化して脂肪酸成分に同数の炭素原
   子を有するジカルボン酸を得る方法であって、ラウリン
   酸メチルをそれよりも高級の同族体に比べて速い速度で
   α，ω−ジカルボン酸に転化する能力を有するカンジダ
   ・トロピカリス菌株ＤＣ２−Ｃ２００９（ＤＳＭ４２７
   ７）、その突然変異種及び／又はその変異体の存在下に
   転化を行うことを特徴とする方法。 ３、ラウリン酸を多く含む脂肪酸混合物とＣ＿１〜Ｃ＿
   ６アルコール、好ましくはモノアルコールとのエステル
   を出発物質として使用する特許請求の範囲第２項記載の
   方法。 ４、ヤシ油もしくはパーム核油のメチルエステルまたは
   完全合成ラウリン酸メチル混合物及び／又はそれらの留
   出物もしくは濃縮物を出発物質として使用する特許請求
   の範囲第２項または第３項記載の方法。 ５、第１工程で、ｐＨを７より低く５．５より高い一定
   値として、大部分の共基質が消費されるまでカンジダ・
   トロピカリス菌株ＤＣ２−Ｃ２００９を培養し、その後
   、ｐＨを７．１〜８の値に上昇させ、脂肪酸混合物を一
   度にまたは繰り返して添加し、数時間の誘導段階後に、
   細胞呼吸が損なわれない量で共基質を添加する特許請求
   の範囲第２〜４項のいずれかに記載の方法。 ６、乳化剤、抑泡剤、および要すれば他の助剤を発酵媒
   体に添加する特許請求の範囲第２〜５項のいずれかに記
   載の方法。