Procédé de :préparation de 0M-prégnadiènes La présente invention a pour objet la préparation de 01,4-prégnadiènes.
Récemment, un certain nombre de stéroïdes des séries du prégnène et du prégnadiène, tels que l'hy drocortisone et la 1-déhydro-hydrocortisone sont devenus des agents thérapeutiques importants et sont devenus utiles comme intermédiaires pour la prépa ration d'autres stéroïdes utiles en thérapeutique.
Les nouveaux Al,4-prégnadiènes envisagés suivant l'inven tion sont utiles comme agents anti-inflammatoires dans le traitement de l'arthrite,. de l'asthme, des brû- lures, de la bursite, etc., et aussi dans le traitement des affections cutanées et des maladies du collagène. Ces composés sont utilisés en combinaisons avec des charges, excipients, etc., en tablettes, poudres, pilu les, etc.
Ils peuvent aussi âtre utilisés par voie par entérale, en solution ou en -suspension.
Suivant l'invention, on prépare les àl,4-prégna- diènes en soumettant un 04-prégnène à l'action enzy matique de microorganismes du genre Nocardia ou de l'espèce Corynebacterium simplex. Le procédé de la présente invention peut être illustré par l'équation schématique suivante, dans laquelle la formule 1 représente le 04-prégnène, et la formule II représente le A1,4-prégnadiène obtenu
EMI0001.0032
Dans ces formules, X est un atome d'hydrogène ou d'halogène,
Y est un, groupe méthylène, hydroxy- méthylène ou carbonyle, Z est un groupe méthylène, hydroxyméthylène ou alkanoyloxyméthylène infé rieur, R' est un atome d'hydrogène ou un groupe hydroxyle, et R est un atome d'hydrogène ou un groupe alcan.oyle inférieur. Dans certains composés préférentiels, X représente le fluor, Y représente CHOH, Z représente CHOR", R' représente OH,
R et R" sont des atomes d'hydrogène ou des radi caux alcanoyle. Pour la mise en oeuvre du présent procédé, on peut cultiver dans des conditions d'aérobiose, dans un milieu nutritif approprié contenant un 04-stéroïde de la série du prégnène, un champignon du genre Nocardia (Bergey, Manual, 6e édition), tel que le corallina ATCC 999 et ATCC 4273, (Culture Lederle No 13) ;
l'astérides ATCC 3308, le kerato- lyticus ATCC 12484, le transvalensis ATCC 12485, l'erythropolis ATCC 4277, le convuluta ATCC 4275, le gardneri ATCC 9604, le leishmanii ATCC 6855, l'opaca ATCC 4276,
le blackwelii ATCC 6846, le caviae ATCC 6848, le cuniculi ATCC 6864, le glo- berula ATCC 9356, le polychromogènes ATCC 3409, le sylvodifera ATCC 7372, le farcinica ATCC 3318 ou le sylvodifera ATCC 4919.
Pendant la croissance de l'organisme dans des conditions favo rables, deux atomes d'hydrogène s'éliminent du noyau stéroïde A, et l'on obtient ainsi une double liaison en position 1,2. Le mécanisme exact de cette déshydrogénation est obscur, mais celle-ci est le résultat des enzymes produites par l'organisme dans le processus de la croissance. Un milieu nutritif approprié contient généralement une source soluble de carbone, d'azote et de sels minéraux.
Comme sources de carbone, on emploie en général des sucres, tels que .le glucose, le saccharose, le maltose, le dextrose, le xylose et le galactose et aussi les alcools tels que le glycérol ou le mannitol ; l'amidon de mais; les acides organiques tels que l'acide citri que, l'acide malique et l'acide acétique ;
et divers produits naturels contenant des hydrates de carbone, tels que la liqueur de macération de maïs, la farine de soja, la farine de graine de coton, et de nombreu ses autres matières que l'on peut trouver et qui ont été utilisées antérieurement comme source de car bone dans les processus de fermentation. Générale ment, on peut utiliser différents corps ci-dessus, dans le milieu, avec de bons résultats.
Comme sources d'azote on peut utiliser certaines des matières citées ci-dessus, telles que la liqueur de macération de maïs, la farine de soja, la farine de graine de coton, etc., et diverses autres substances, telles que l'extrait de baauf, la caséine, la levure, des protéines digérées par enzymes, et les produits de dégradation, comprenant les peptones,
les acides aminés et beaucoup d'autres matières protéiques dis ponibles qui sont susceptibles d'entretenir la crois sance des champignons. Les sources inorganiques d'azote, comprenant l'urée, les sels d'ammonium, les nitrates, etc., peuvent être utilisées dans le milieu comme source d'azote assimilable pour fournir un milieu de croissance favorable à l'organisme.
Les éléments minéraux nécessaires à la fermen tation se trouvent généralement dans les matières brutes que l'on utilise souvent comme sources de carbone et d'azote, ou bien dans l'eau utilisée dans le procédé. Toutefois, il est en général à conseiller d'ajouter des quantités supplémentaires d'éléments minéraux à celles normalement présentes,
pour obte nir une croissance maximum de Nocardia. Il est avantageux- d'ajouter des cations et anions compre nant le sodium, le potassium, le calcium, le magné sium, les ions phosphate, sulfate, chlorure, le cobalt, le manganèse, et autres. L'usage d'oligo-éléments tels que le bore, le cuivre, le cobalt, le molybdène et le chrome est souvent désirable.
La croissance du champignon Nocardia ou du champignon Corynebacterium simplex peut se faire dans des conditions d'aérobiose, et l'on peut réaliser l'aération, dans des flacons par exemple, par agita tion sur une secoueuse alternative ou rotative, ou dans des bouteilles ou des cuves en envoyant sous pression de l'air stérile à travers le mélange de fer mentation.
Il est désirable d'insuffler de l'air stérile à travers le milieu à raison de 1/3 à 2 volumes d'air par volume de milieu et par minute. L'agitation dans les bouteilles ou dans les cuves de fermentation peut être assurée par un agitateur mécanique.
Le cham pignon Nocardia peut pousser à des températures de 5 à 450C, mais il est préférable de conduire le pro cédé à des températures de 25 à 370C. Le Coryne- bacterium simplex peut pousser à des températures de 10 à 450C, mais on l'utilise de préférence à une température de 25 à 38oC.
Pour préparer des inocula, on utilise avantageu sement 1,0 cm3 de suspension de cellules végétatives lavées de champignons du genre Nocardia ou de l'espèce Corynebacterium simplex, pour inoculer 100 em3 de bouillon stérile de soja à la trypticase,
dans un flacon Erlenmeyer de 500 cm3. Le bouillon de soja à la trypticase contient généralement 3 % de produit de digestion tryptique de protéines de soja, sous forme de poudre déshydratée (Baltimore Bacteriological Laboratories),
5 % de glycérine et 0,3 % d'extrait de boeuf (Armour), et ce mélange est avantageusement stérilisé pendant 15 minutes à une température de 120C (pression de vapeur de 6,75 kg). Après stérilisation, le pH est compris entre 7,4 et 7,7.
Après avoir inoculé le flacon, on peut le faire incuber à 370C, sur une secoueuse, pendant 4 à 8 heures environ. On peut utiliser ces inocula pour inoculer de grandes quantités de milieu stérile en bouteilles, et ces cultures en bouteille, après fermen tation, peuvent servir à inoculer de grandes quantités de milieu dans des cuves de fermentation.
Au lieu du bouillon de soja à la trypticase indiqué plus haut, on peut utiliser d'autres milieux, comme le montrent les exemples ci-après.
Les A4-stéroïdes de la série du prégnène qui peu vent être utilisés comme produits de départ dans le procédé selon la présente invention sont notamment le 3,20-dicéto-11[3,17a,21-trihydroxy-A4-prégnène (hydrocortisone), le 3,20-dicéto-11(3,21-dihydroxy- A4-prégnène (corticostérone), le 3,20-dicéto-17a,21- dihydroxy-A4-prégnène (substance S de Reichstein), le 3,20-dicéto-lla,17a,
21-trihydroxy-A4-prégnène (11-épi-hydrocortisone), le 3,20-dicéto-ll(3,16a,17a, 21-tétrahydroxy-A4-prégnène, le 3,20-dicéto-9a- fluoro-11(3,16a,17a,21-tétrahydroxy-A4-prégnène, le 3,11,20-tricéto-16 ,17 ,21-trihydroxy-A4-prégnène, le 3,11,20-tricéto-16 ,17 ,21-trihydroxy-A4-prégnène, le 3;11,20-tricéto-17a,21-dihydroxy-A4-prégnène, et leurs esters, etc. On ajoute généralement ces stéroï des à la fermentation, en solution ou sous forme finement divisée.
Selon un mode d'exécution particu lier, on dissout le stéroïde dans l'éthanol ou d'autres solvants miscibles à l'eau, et à l'ajouter au milieu de fermentation, au stade désiré du processus. Bien que le stéroïde précipite parfois de la solution quand on l'ajoute de cette façon, il se disperse dans tout le milieu sous forme de suspension fine et se trouve facilement à la disposition de l'organisme en vue de l'oxydation. La quantité de stéroïde ajoutée à la fer mentation peut varier considérablement, mais elle est généralement de l'ordre de 1/1o à 1 g par litre de milieu.
Pendant le processus de fermentation, il est par fois désirable d'ajouter des agents antimousses tels que les silicones, les huiles glycéridiques, etc. On ajoute ces composés de temps en temps, et dans les quantités voulues.
On fait généralement incuber pendant une durée de 16 à 40 heures environ, à une température d'en viron 32oC, les portions de 10 ce de milieu inoculé en tubes de secoueuse de 100 cm3. Au bout de ce temps, on ajoute, dans chaque tube, 2 mg de subs trat stérile (stéroïde A4-prégnène) dissous dans 0,2 cm3 d'éthan:
ol, et l'on poursuit la fermentation à environ 320C. On laisse 1a fermentation se poursuivre pendant un laps de temps suffisamment long pour réaliser la conversion maximum du A4-prégnène en A'@4-prégnadiène. Ce laps de temps peut varier de 1 à 72 heures. ou plus.
A la fin du processus de fermentation, on sépare du milieu de fermentation le A','-stéroïde de la série du prégnadiène obtenu, grâce à la méthode suivante qui décrit en particulier une fermentation sur 10 cm3. C'est là une méthode générale qui est applicable pour des fermentations à diverses échelles : on extrait à quatre reprises le contenu d'un tube de fer mentation, avec quatre volumes de chlorure de méthylène.
On réunit les quatre extraits, puis on lave une fois la solution résultante avec une solution aqueuse à 2 % de bicarbonate de sodium saturée de chlorure de sodium, et ensuite on lave à deux repri ses avec une solution saturée de chlorure de sodium. Après lavage, on peut -sécher la solution de chlorure de méthylène sur du sulfate de magnésium anhydre et la filtrer.
On concentre le filtrat au bain-marie à la pression atmosphérique, jusqu'à un faible volume, et l'on transfère le concentré dans un flacon volu métrique de 10 ce, puis on complète à ce volume avec du chlorure de méthylène. On peut utiliser cette solution pour déterminer la teneur en stéroïde.
Dans les fermentations à grande échelle, on peut récupérer le ou les produits bruts de la liqueur de fermentation, par une simple extraction par solvant, en utilisant un solvant approprié non miscible à l'eau tel que les hydrocarbures inférieurs chlorés, les alcools, les esters, les cétones, etc. On peut procéder à une nouvelle purification et séparer les produits stéroïdes des extraits, par des méthodes connues. La séparation et la purification du mélange de stéroïdes nécessitent souvent l'usage de la chromatographie.
Pour identifier les stéroïdes présents dans la liqueur de fermentation soumise à l'extraction, on peut recourir à la chromatographie à bande de papier. Le système solvant utilisé est en général un système eau-méthanol-benzène, que l'on peut préparer en agitant environ 50 % d'eau et 50 % de méthanol avec du benzène, dans une ampoule à décantation, puis en laissant les deux couches se séparer.
On place généralement une portion de la couche infé rieure dans un cristallisoir ouvert, sur le fond d'un grand cylindre en verre. La couche supérieure est la phase solvant, et elle sert à remplir la cavité en forme d'auge à l'intérieur du cylindre.
On peut pré parer une solution étalon de stéroïde en dissolvant 10 mg de chacun des stéroïdes suivants dans 10 crri3 de chlorure de méthylène 3,20-dicé@to-11P,17a,21-trihydroxy-A4-prégnène ; 3,20-dicéto-11p-21,dshydroxy-A4-prégnène ; 3,20-dicéto-17a,21-dihydroxy-A4-prégnène ; 3,20-dicéto-1 la,17a,21-trihydroxy-A4-prégnène ; 3,20-dicéto-11(3,16a,17cz,21-tétrahydroxy-A4- prégnène; 16,21-diacéto-3,20-dicéto-11(3,16a,17a,21- tétrahydroxy-A4-prégnène ;
3,20-dicéto-9a-fluoro-11 p,16c1,17a,21-tétra- hydroxy-A4-prégnène; 16a,21-diacéto-3,20-dicéto-9a-fluoro-11(3,16a, 17a,21-tétrahydroxy-A4-p@régnène ; (D'autres stéroïdes peuvent servir dans la solu tion étalon lorsqu'ils sont appropriés).
On peut chromatographier simultanément au moins une solution courante de stéroïde chaque fois que l'on essaie une solution inconnue. On applique généralement .exactement 0,025 cm3 de la solution étalon de stéroïde pour essais, sur la bande de papier, à la ligne de départ, à 10 cm de l'extrémité supérieure de 1a bande, que l'on plie par-dessus le bord de l'auge et que l'on plonge dans la phase sol vant contenue à l'intérieur.
On peut développer alors la bande pendant 2 à 4 heures à environ 370C. De même, on peut appliquer 0,1 cm3 de la solution inconnue sur une autre bande, que l'on plie alors dans la même auge et que l'on développe simultané ment avec la bande étalon au stéroïde. L'auge per met de développer de nombreuses bandes simulta nément.
Après avoir développé convenablement les bandes de papier, on peut les enlever de l'appareil et on les sèche à l'air à environ 370C. Après séchage, on pulvérise généralement sur les bandes une solu tion alcaline de bleu tétrazolium qui fait apparaître la couleur aux points où les stéroïdes sont présents. On aligne des bandes à couleur développée avec au moins une bande étalon et l'on compare. On peut identifier les différents stéroïdes par leur position sur la bande.
Les AIA-stéroïdes obtenus par le procédé selon l'invention seront généralement plus polaires que les A4-stéroïdes correspondants. Il est entendu, de plus, que les A1@4-stéroides obtenus, une fois qu'ils ont été isolés et caractérisés, peuvent eux-mêmes servir- dans une solution étalon de stéroïdes afin d'améliorer le procédé.
Exemple 1 <I>Préparation</I> <I>du</I> 3,20-dicéto-11(3,17a,21-trihydroxy- AI#Lprégnadiène On lave une culture de Nocardia coralline (ATCC 999) sur extrait de levure et agar-agar en tube à essai, au moyen de 7 cm3 de solution saline stérile, et l'on obtient une suspension de cellules végétatives que l'on utilise pour inoculer 100 cm@@ de bouillon de soja stérile à la trypticase (décrit plus haut),
dans un flacon Erlenmeyer de 500 cm3. On fait incuber le flacon pendant 7 heures à 370C. On utilise alors cet inoculum pour inoculer un bouillon stérile de soja à la trypticase dans des tubes de secoueuse de 100 cm3. On utilise 1 cm3 d'inoculum pour inoculer chaque portion de 10 cm3 d'un milieu contenant 2 % de mélasse
(Grandma), 1 % d'extrait de baeuf (Difco), et 1 % de glucose dans chaque tube de secoueuse de 100 cm3. On fait incuber les tubes à 32oC pendant 40 heures.
A ce moment, on ajoute dans chaque tube 2 mg de 3,20-dicéto-11(3,17a,21- trihydroxy-Al-prégnène dissous dans 0,2 cm@ d'étha nol. On continue alors l'incubation pendant encore 24 heures.
On extrait à quatre reprises les 10 cm3 de liqueur de l'un des tubes ci-dessus, chaque fois avec 40 cm3 de chlorure de méthylène. On réunit les extraits et on les évapore jusqu'à siccité sous vide. On reprend le résidu dans 2 cm3 d'acétone, et l'on analyse un échantillon approprié par les techniques à bande de papier décrites ci-dessus.
Le chromato- gramme sur bande de papier indique la présence du 3,20-dicéto-11P,17a,21-trihydroxy-Al>4-prégnadiène. Exemple 2 <I>Préparation</I> <I>du</I> 3,20-dicéto-11(3,17a,21-trihydroxy- AI,4-prégnadiène On lave une culture de Nocardia sp. (ATCC 12483) sur agar-agar en tube à essais,
au moyen de 5 cm3 de solution salinde stérile. On utilise 2 cm3 de la suspension obtenue pour inoculer 100 cm3 de bouillon stérile de soja à la trypticase dans un flacon Erlenmeyer de 500 cm3. On fait incuber le mélange en agitant à 37 C pendant 8 heures,
et l'on utilise la culture obtenue pour inoculer des tubes contenant du bouillon stérile de soja à la tryp-ticase. On utilise 1/2 cm3 de la culture de 8 heures pour inoculer 10 cm3 de milieu dans un tube de 100 cm3. On incube les tubes inoculés à 320C en agitant pendant 16 heures.
Dans chaque tube, on ajoute 2 mg de 21- acéto-3,20-dicéto-11(3,17a,21-trihydroxy-A4-prégnène, dissous dans 0,2 cm3 d'éthanol. On fait incuber les tubes encore 1 1/2 à 5 heures -et l'on récolte.
La chromatographie sur bande de papier indique que le substrat s'est converti en 3,20-dicéto-11(1,17a,21-tri- hydroxy-Al>4-prégnadiène. On observe encore, sur les bandes de papier, à mesure que le temps croît, l'ap parition de 3,20-dicéto-11(3,17a,21-trihydroxy-A4- prégnène, et que sa quantité augmente aux dépens du 21-acéto-3,20-dicéto-11(3,17a,21-trihydroxy-Al- prégnène, suivi par l'apparition en quantité croissante de 3,20-dicéto-11(3,17a,21-trihydroxy-Al@4-prégna- diène.
Exemple 3 <I>Préparation</I> <I>du</I> 3,20-dicéto-11(i,16a,17a,21-tétrahydroxy- AI J-prégnadiène On lave une culture de Corynebacterium sim- plex sur soja à la trypticase et agar-agar en tube à essais, au moyen de 5 cm-3 d'eau stérile,
et l'on dis tille la suspension de cellules obtenue pour inoculer 100 cm3 de bouillon stérile de soja à la trypticase dans un flacon Erlenmeyer de 50 em3. On fait incu ber ce mélange avec agitation à 37 C pendant 8 heu res.
On prend 25 flacons Erlenmeyer de 500 cm3, contenant chacun 100 cm3 de bouillon stérile de soja à la trypticase, sans glycérol, et on les inocule chacun avec 1 cm3 de l'inoculum vieux de 8 heures. On fait incuber ces flacons à 32oC pendant 40 heu res.
Au bout de ce temps, on ajoute dans chaque flacon 40 mg de 3,20-dicéto-11(3,lla,17a,21-tétra- hydroxy-A4-prégnène dissous dans 4 cm@ d'éthanol et l'on continue la fermentation pendant 8 heures à 320C. On réunit le contenu des vingt-cinq flacons et l'on obtient une liqueur à pH 8,1.
On réunit les liqueurs après récolte, on extrait une fois avec 3 litres de chlorure de méthylène et trois fois avec deux litres chaque fois de chlorure de méthylène. On lave une fois l'extrait réuni avec une solution saline saturée et l'on évapore jusqu'à siccité sous pression réduite. On obtient 509 mg de résidu huileux, on le dissout dans 1,5 cm,, de la phase sta tionnaire du système, 3 parties d'acétate d'éthyle, 2 parties d'éther de pétrole (90-100C), 3 parties de méthanol, 2 parties d'eau, et l'on mélange avec 3 g de terre d'infusoires.
On entasse alors cette terre d'infusoires imprégnée en haut d'une colonne de verre de 1,5 X 35 cm contenant 25 g de terre d'in fusoires imprégnée de 12,5 em3 de la phase station naire du système ci-dessus. On élue le composé désiré avec la phase mobile du système ci-dessus et l'on obtient 207 g de solide brut.
On cristallise celui- ci dans un mélange d'acétone et d'éther de pétrole (60-70 C) pour obtenir 56 mg de produit à point de fusion de 195-200 C (bloc Kôfler). La recristalli- sation dans le même couple de solvants élève le point de fusion à 202-205C (bloc) ; point de fusion (par méthode capillaire) 229-231,JC. Spectre ultraviolet
EMI0004.0127
241 mou (E 14.500).
Spectre infrarouge 3412, 1718, 1667, 162.2, 1612 (palier), 1098,
EMI0005.0001
1072 cm-1.
EMI0005.0003
<I>Analyse</I>
<tb> Calculée <SEP> pour <SEP> C21Hz80 <SEP> (376,44)
<tb> C <SEP> 67,00 <SEP> 0/0 <SEP> ; <SEP> H <SEP> 7,50 <SEP> %
<tb> Effective <SEP> : <SEP> C <SEP> 66,80 <SEP> 0/0 <SEP> ; <SEP> H <SEP> 7,62 <SEP> 0/0. Les propriétés physiques et chimiques du com posé sont celles du 3,20-dicéto-11(3,16a,17a,21- tétrahydroxy-Ah4-prégnadiène.
D'une manière analogue à celle des exemples susmentionnés, on peut obtenir les àl,4-prégnadiènes mentionnés dans le tableau suivant en utilisant les matières premières et les microorganismes mention nés dans ledit tableau.
EMI0005.0009
Tableau
<tb> Exemple <SEP> Microorganisme <SEP> employé <SEP> Matière <SEP> première <SEP> employée <SEP> Produit <SEP> final <SEP> résultant
<tb> 4 <SEP> Nocardia <SEP> sp. <SEP> (ATCC <SEP> 12483) <SEP> 3,20-dicéto-11(3,17a,21-tri- <SEP> 3,20-dicéto-11(3,17a,21-trihydroxy hydroXy-04-prégnène <SEP> Al,4-prégnadiène
<tb> 5 <SEP> Nocardia <SEP> gardneri <SEP> (ATCC <SEP> 9604) <SEP> 3,20-dicéto-11(3,17a,21-tri- <SEP> 3,20-dicéto-11(3,17a,21-trihydroxy hydroxy-A4-prégnène <SEP> AIJ-prégnadiène
<tb> 6 <SEP> Nocardia <SEP> gardneri <SEP> (ATCC <SEP> 9604) <SEP> 3,20-dicéto-11(3,16a,17a, <SEP> 3,20-dicéto-11(3,16a,17a,21-tétra 21-tétrahydroxy-A4- <SEP> hydroxy-Al>4-prégnadiène
<tb> prégnène
<tb> 7 <SEP> Nocardia <SEP> corallina <SEP> (ATCC <SEP> 999) <SEP> 3,20-dicéto=11(3,21- <SEP> - <SEP> 3,20-dicéto-11(3,
21-dihydroxy dihydroxy-A4-prégnène <SEP> A1,4-prégnadiène
<tb> 8 <SEP> Nocardia <SEP> leishmanii <SEP> (ATCC <SEP> 6855) <SEP> 3,20-dicéto-11(3,16a,17a, <SEP> 3,20-dic6ta-11(3,16a,17a,21-tétra 21-tétrahydroxy-A4- <SEP> hydioxy-Al,4-prégnadiène
<tb> prégnène
<tb> 9 <SEP> Nocardia <SEP> leishmanii <SEP> (ATCC <SEP> 6855) <SEP> 3,20-dicéto-1 <SEP> 1p,17a,21-tri- <SEP> 3,20-dic6to-11(3,17a,21-trihydroxy hydroxy-A4-prégnène <SEP> Al,'-prégnadiène
<tb> 10 <SEP> Nocardia <SEP> sp.
<SEP> (ATCC <SEP> 12483) <SEP> 3,20-dicéto-11(3,21- <SEP> 3,20-dicéto-11(3,21-dihydroxy dihydroxy-A4-prégnène <SEP> Al,4-prégnadiène
<tb> 11 <SEP> Nocardia <SEP> Corallina <SEP> (ATCC <SEP> 999) <SEP> 3,20-dicéto-17a,21- <SEP> 3,20-dicéto-17a,21-dihydroxy dihydroxy-A4 <SEP> prégnène <SEP> Ah4-prégnadiène
<tb> 12 <SEP> Nocardia <SEP> caviae <SEP> (ATCC <SEP> 6848) <SEP> 3,20-d-icéto-1 <SEP> 1(3,17a,21-tri- <SEP> 3,20-dicéto-11(3,17a,21-trihydroxy hydroxy-A4-prégnène <SEP> Ah4-prégnadiène
<tb> 13 <SEP> Nocardia <SEP> caviae <SEP> (ATCC <SEP> 6848) <SEP> 3,20-dicéto-1 <SEP> 1(3,16a,17a, <SEP> 3,20-dicéto-11(3,16a,17a,21-tétra 21-tétrahydroxy-A4- <SEP> hydroxy-A',4-prégnadiène
<tb> prégnène
<tb> 14 <SEP> Nocardia <SEP> sp.
<SEP> (ATCC <SEP> 12483) <SEP> 3,20-dicéto-17a,21- <SEP> 3,2,0-dicéto-17a,21-dihydroxy dihydroxy-A4 <SEP> prégnène <SEP> A1,4-prégnadiène
<tb> 15 <SEP> Nocardia <SEP> corallina <SEP> (ATCC <SEP> 999) <SEP> 3,20-dicéto-11a,17a,21- <SEP> 3,20-dicéto-11a,17a,21-trihyd.roxy trihydroxy-A4-prégnène <SEP> A1.4-prégnadiène
<tb> 16 <SEP> Nocardia <SEP> convoluta <SEP> (ATCC <SEP> 4275) <SEP> 3,20-dicéto-11(3,16a,17a, <SEP> 3,20-dicéto-11(3,16a,17a,21-tétra 21-tétrahydroxy-A4- <SEP> hydroxy-AM-prégnadiène
<tb> prégnène
<tb> 17 <SEP> Nocardia <SEP> convoluta <SEP> (ATCC <SEP> 4275) <SEP> 3,20-dicéto-11(1,17a,21-tri- <SEP> 3,20-dicéto-11(3,17a,21-trihydroxy hydroxy-A4-prégnène <SEP> A1,4-prégnadiène
<tb> 18 <SEP> Nocardia <SEP> sp.
<SEP> (ATCC <SEP> 12483) <SEP> 3,20-dicéto-11a,17a,21- <SEP> 3,20-dicéto-11a,17a,21-trihydroxy trihydroxy-A4-prégnène <SEP> Al,4-prégnadiène
<tb> 19 <SEP> Nocardia <SEP> corallina <SEP> (ATCC <SEP> 999) <SEP> 3,20-dicéto-1 <SEP> 1(3,16 ,17a, <SEP> 3,20-dicéto-11(3,16a,17a,21-t6tra 21-tétrahydroxy-A4- <SEP> hydroxy-A',4-prégnadiène
<tb> prégnène
<tb> 20 <SEP> Nocardia <SEP> globerula <SEP> (ATCC <SEP> 9356) <SEP> 3,20-dicéto-11(3,17a,21-tri- <SEP> 3,20-dicéto-11(3,17a,21-trihydroxy hydroxy-A4-prégnène <SEP> Al,4-prégnadiène
<tb> 21 <SEP> Nocardia <SEP> globerula <SEP> (ATCC <SEP> 9356) <SEP> 3,20-dicéto-11(3,16a,17a, <SEP> 3,20-dicéto-11(3,16a,17a,21-tétra 21-tétrahydroxy-A4- <SEP> hydroxy-Al@4-prégnadiène
<tb> prégnène
<tb> 22 <SEP> Nocardia <SEP> corallina <SEP> (ATCC <SEP> 999) <SEP> 16a,21-diacéto-3,20-di- <SEP> 3,20-dicéto-11(3,16a,17a,
21-tétra céto-11(3,17a-dihydr- <SEP> hydroxy-A1,4-prégn.adiène
<tb> oxy-A4-prégnène
<tb> 23 <SEP> Nocardia <SEP> sp. <SEP> (ATCC <SEP> 12483) <SEP> 3,2.0-dicéto-11(3,16a,17a, <SEP> 3,20-dic6to-11(3,16a,17a.,21-tétra 21-tétrahyd'roxy-A4- <SEP> hydroxy-Al, <SEP> -1-prégnadiène
<tb> prégnène
EMI0006.0001
Tableau <SEP> (suite)
<tb> Exemple <SEP> Microorganisme <SEP> employé <SEP> Matière <SEP> première <SEP> employée <SEP> Produit <SEP> final <SEP> résultant
<tb> 24 <SEP> Nocardia <SEP> polychromogènes <SEP> 3,20-dicéto-11(3,16a,17a, <SEP> 3,20-dicéto-11U),16a,17a,21-tétra (ATCC <SEP> 3409) <SEP> 21-tétrahydroxy-A4- <SEP> hyd,roxy-Al <SEP> @4-prégnadiène
<tb> prégnadiène
<tb> 25 <SEP> Nocardia <SEP> polychromogènes <SEP> 3,20-dicéto-11(3,17a,21-tri- <SEP> 3,20-dicéto-11(3,17a,21-trihydroxy (ATCC <SEP> 3409)
<SEP> hydroxy-A4-prégnène <SEP> A1,4-prégnadiène
<tb> 26 <SEP> Nocardia <SEP> corallina <SEP> (ATCC <SEP> 999) <SEP> 3,20-dicéto-9a-fluoro- <SEP> 3,20-dicéto-9a-fluoro-11P,16a,17a.,
<tb> 1l(3,16a,17a,21-tétra- <SEP> 21-tétrahydroxy-Al@4-prégnadiène
<tb> hydroxy-A4-prégnène
<tb> 27 <SEP> Nocardia <SEP> corallina <SEP> (ATCC <SEP> 999) <SEP> 16,21-diacéto-3,20-dicéto- <SEP> 16,21-diacéto-3,20-dicéto-9cz 11(3,16a,17a,21-tétra- <SEP> fluoro-11(3,16a,17a,21-tétra hydroxy-A4-prégnène <SEP> hydroxy-A',4-prégnadiène
<tb> 28 <SEP> Nocardia <SEP> sylvodifera <SEP> (ATCC <SEP> 7372) <SEP> 3,20-dicéto-11(3,17a,21-tri- <SEP> 3,20-dcéto-11(3,17a,21-trihydroxy hydroxy-A4-prégnène <SEP> AIA-prégnadiène
<tb> 29 <SEP> Nocardia <SEP> sp.
<SEP> (ATCC <SEP> 12483) <SEP> 3,20-dicéto-9a-fluoro- <SEP> 3,20-dicéto-9a.-fluoro-11(3,16a,17a,
<tb> 11(3,16a,17a,21-tétra- <SEP> 21-tétrahydroxy-Al@4-prégnadiène
<tb> hydroxy-A4-prégnène
<tb> 30 <SEP> Nocardia <SEP> astéroïdes, <SEP> souche <SEP> isolée <SEP> 3,20-dicéto-11(3,17a,21-tri- <SEP> 3,20-dicéto-11(3,17cx,21-trihydroxy A-3163 <SEP> (ATCC <SEP> 3308) <SEP> hydroxy-A4-prégnène <SEP> AIJ-prégnadiène
<tb> 31 <SEP> Nocardia <SEP> astéroïdes <SEP> (ATCC <SEP> 3308) <SEP> 3,20-dicéto-11(3,16a,17a, <SEP> 3,20-dicéto-11(3,16a,17a,21-tétra 21-tétrahydroxy-A4- <SEP> hydroxy-@\1.4-prégnadiène
<tb> prégnène
<tb> 32 <SEP> Nocardia <SEP> astéroïdes, <SEP> souche <SEP> isolée <SEP> 3,20-dicéto-11P,17a,21-tri- <SEP> 3,20-dicéto-1113,17a,21-trihydroxy No.
<SEP> E-20 <SEP> (ATCC <SEP> 3308) <SEP> hydroxy-A4-prégnène <SEP> AM-prégnadiène
<tb> 33 <SEP> Nocardia <SEP> farcinica <SEP> (ATCC <SEP> 3318) <SEP> 3,20-dicêto-11(3,17cc,21-tri- <SEP> 3,20-dicéto-11(P,17a,21-trihydroxy hydroxy-A4-prégnène <SEP> A1.4-prégnadiène
<tb> 34 <SEP> Nocardia <SEP> erythropolis, <SEP> souche <SEP> iso- <SEP> 3,20-dicéto-11(3,17a,21-tri- <SEP> 3,20-dicéto-11(3,17a,21-trihydroxy lée <SEP> A-8845 <SEP> (ATCC <SEP> 4277) <SEP> hydroxy-A4-prégnène <SEP> A1-4-prégnadiène
<tb> 35 <SEP> Nocardia <SEP> blackwelii <SEP> (ATCC <SEP> 6846) <SEP> 3,20-dicéto-11.(3,17a,21-tri- <SEP> 3,20-dicéto-11(3,17a,21-trihydroxy hydroxy-M-prégnène <SEP> AL4-prégnadiène
<tb> 36 <SEP> Nocardia <SEP> transvalensis, <SEP> souche <SEP> 3,20-dicéto-11(3,17a,21-tri- <SEP> 3,20-dicéto-11(3,17a,21-trihydroxy isolée <SEP> E-42 <SEP> (ATCC <SEP> 12485)
<SEP> hydroxy-A4-prégnène <SEP> ALI-prégnadiène
<tb> 37 <SEP> Nocardia <SEP> cuniculi <SEP> (ATCC <SEP> 6864) <SEP> 3,20-dicéto-11(3,16a,17a, <SEP> 3,20-dicéto-11(3,16v.,17a,21-tétra 21-tétrahydroxy-A4- <SEP> hydroxy-Al--1-prégnadiène
<tb> prégnène
<tb> 38 <SEP> Nocardia <SEP> keratolyticus, <SEP> souche <SEP> 3,20-dicéto-11P,17a,21-tri- <SEP> 3,20-dicéto-11(3,17a,21-trihydroxy isolée <SEP> E-43 <SEP> (ATCC <SEP> 12484) <SEP> hydroxy-A4-prégnène <SEP> A1,4-prégnadiène
<tb> 39 <SEP> Nocardia <SEP> cuniculi <SEP> (ATCC <SEP> 6864) <SEP> 3,20-dione-11(3,17a,21- <SEP> 3,20-dicéto-11(3,17a,21-trihydroxy trihydroxy-A4-prégnène <SEP> Al.4-prégnadiène
<tb> 40 <SEP> Nocardia <SEP> corallina, <SEP> souche <SEP> isolée <SEP> 3,20-dicéto-11(3,17a,21-tri- <SEP> 3,20-dicéto-11(3,17a,21-trihydroxy No.
<SEP> 13 <SEP> (ATCC <SEP> 999) <SEP> hydroxy-A4-prégnène <SEP> AIA-prégnadiène
<tb> 41 <SEP> Nocardia <SEP> opaca <SEP> (ATCC <SEP> 4276) <SEP> 3,20-dicéto-11F),17a,21-tri- <SEP> 3,20-dicéto-11p,17a,21-trihydroxy hydroxy-A4-prégnène <SEP> ,\','-prégnadiène
<tb> 42 <SEP> Nocardia <SEP> corallina, <SEP> souche <SEP> isolée <SEP> 3,20-dicéto-11P,17a.,21-tri- <SEP> 3,20-dicéto-11(3,17a,21-trihydroxy 228 <SEP> (ATCC <SEP> 4273) <SEP> hydroxy-A4-prégnène <SEP> AL4-prégnadiène
<tb> 43 <SEP> Nocardia <SEP> sylvodifera <SEP> 3,20-dicéto-11(3,16a,17a, <SEP> 3,20-dicéto-11(3,16a,17a,21-tétra (ATCC <SEP> 4919) <SEP> 21-tétrahydroxy-A4- <SEP> hydroxy-Al-4-prégnadiène
<tb> prégnène
<tb> 44 <SEP> Nocardia <SEP> corallina <SEP> (ATCC <SEP> 999) <SEP> 16,21-diacéto-3,20-di- <SEP> 3,20-dicéto-11(3,16a,17a,21-tétra céto-11(3,16a,17a,
21- <SEP> hydroxy-A1.4-prégnadiène
<tb> tétrahydroxy-A4-prégnène Exemple 45 <I>Préparation</I> <I>du</I> 3,20-dicéto-11(3,16a,17a,21-tétrahydroxy- Ahl-prégnadiène On réunit les liqueurs provenant d'une fermen tation comme celle décrite à l'exemple 1, ci-dessus, après récolte, et l'on extrait par 7 portions de 2 litres de chlorure de méthylène et l'on évapore les extraits réunis jusqu'à siccité sous pression réduite. On obtient 1,585 g d'un semi-solide brut que l'on chro matographie. On réunit les fractions contenant le composé désiré, et l'on évapore jusqu'à siccité pour donner 601 mg de résidu cristallin.
La cristallisation dans l'acétone et l'éther de pétrole donne 278 mg de produit à point de fusion de 229-231 C. La recris- tallisation dans le même couple de solvants élève le point de fusion à 231-2320C[a]D +77 C (méthanol). Spectre ultraviolet : @ma- : 241-242 mu, (E 14.800).
etnanel Spectre infrarouge :vmBx' : 3436, 1715, 1664, 1621, 1603, 1129, 1063 cm-'.
EMI0007.0009
<I>Analyse</I>
<tb> Calculée <SEP> pour <SEP> ,1H.,,70,; <SEP> (376,44)
<tb> C <SEP> 67,00 <SEP> @/o <SEP> ; <SEP> H <SEP> 7,50 <SEP> %
<tb> Effective <SEP> : <SEP> C <SEP> 66,82 <SEP> % <SEP> ; <SEP> H <SEP> 7,27 <SEP> <B>%</B>. Le produit est identique à un échantillon de 3,20 -dicéto-11 p,16a,17a,21-tétrahydroxy-A1 @4-prégna- diène.
Exemple 46 <I>Préparation</I> <I>du 16,</I> 21-diacéto-3,20-dicéto-9a-f luoro-11(p- 16cx,17u" 21-tétrahydroxy-AI#4-prégnadiène On lave une culture sur agar-agar en tube à essais, au moyen de 5 cm3 de solution saline stérile, on obtient une suspension de spores de Coryne- bacterium simplex,
que l'on ajoute à 100 cmil de bouillon stérile de soja à la trypticase dans un flacon Erlenmeyer de 500=2. On fait incuber le mélange à 320C pendant 8 heures. On utilise 1<I>ce</I> de cette culture pour inoculer chacun des dix flacons conte nant chacun 100 ce de bouillon stérile de soja à la trypticase. On fait incuber les dix flacons avec agita tion à 320C pendant 16 heures.
On ajoute dans cha que flacon 20 mg de 16,21-diacéto-3,20-dicéto-9a- fluoro-11(3,16a,17a,21-tétrahydroxy-A4-prégnène, dis sous dans 2 cm3 d'éthanol et l'on réunit le contenu des flacons. On extrait la solution globale à plusieurs reprises par un grand volume de chlorure de mé thylène, on lave avec une solution saline saturée, et l'on évapore sous pression réduite. On dissout le résidu dans le méthanol, on traite par le charbon activé, on filtre sur de la terre d'infusoires et l'on évapore à nouveau pour donner 277 mg d'huile, qu'on acétyle pendant une nuit.
La chromatographie, sur bande de papier, indique des quantités approxi mativement égales de substrat et d'un produit plus polaire (16,21-diacéto-3,20-dicéto-9a-fluoro-11(1, 16u,17a,21-tétrahydroxy-Al,4-prégnadiène), ainsi que de très petites quantités de deux produits moins polaires. Par chromatographie de partage de 0,25 g du résidu (colonne de terre d'infusoires ; système 2 parties d'acétate d'éthyle, 3 parties d'éther de pétrole (90-1000C), 3 parties de méthanol et 2 par ties d'eau), on sépare les produits moins polaires et le substrat. Le produit désiré, à polarité maximum, reste sur la colonne et on l'élue avec 500<I>ce</I> de méthanol.
On prend le résidu (90 mg) obtenu par évaporation du méthanol et on le répartit à nouveau sur de la terre d'infusoires (système : 3 parties d'acé tate d'éthyle, 2 parties d'éther de pétrole (90-1000C), 3 parties de méthanol et 2 parties d'eau) et l'on évapore sous pression réduite la fraction contenant le produit désiré (déterminé par spectre d'absorption d'ultraviolet), pour donner 18 mg de solide.
La cris tallisation dans un mélange acétone-éther de pétrole donne 13 mg d'aiguilles incolores de 16,21-diacéto- 3,20- dicéto-9a-fluoro-11(3,16a,17a,21-tétrahydroxy- A1,4-pr6gnadiène ; point de fusion (bloc Kdfler) : environ 150-2400C, avec perte apparente de solvant à 1500C. La recristallisation dans l'acétone et l'éther de pétrole ne change pas le point de fusion. Spectre ultraviolet : ImaY- : 239 mu (s 15.200). Spectre ale. abs.
dans l'acide sulfurique: RH sè9: 2,61, 308, 387 mu. On prépare la 2,4-bis-dinitrophénylhydrazone du composé ci-dessus et l'on détermine son spectre d'absorption d'ultraviolet : ImHCLa : 258, 300 (in flexion), 312 (inflexion) et 400 mu.