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La présente invention est relative à la préparation de
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84 -prégnène-ll c:"" ,17 , ,21-triol-.3, 20 dione (Composé ,épi-F) et de
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son analogue (S, 1,4¯prée;nadiène. L'invention concerne plus spécia-
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lement un nouveau procédé de préparation du composé épi-F et de son
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analogue Li ,1,4 -prégnadiène par hydroxylation raicrobiolo;;ique de Li *-prégnène-17.:.,,?1-diol-3,20-dione (Composé S de Reichstein) ou de ß,t,l'-prédnadiène-17,,21-diol-3,20-one (désigné ci-après par Composé LiS) en utilisant le champignon Delacroixia coronata.
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Des procédés de conversion du Composé S de Reichstein
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en stéroïdes oxygénés en 11 et en particulier, le Composé F et le Composé épi-F, en utilisant un organisme différent de ceux utilisés suivant la présente invention ont déjà été décrits dans des brevets et dans la littérature. Par exemple, le brevet U.S.A. n 2.602.769 décrit l'utilisation de Cunninghamella blakesleana (ordre des @ucorales); une publication dans J. Amer . Chem.
Soc . 74, 2381 (1952) décrit un procédé qui utilise le Streptomyces fradiae ; le brevet U.S.A. n 2.658.023 décrit l'utilisation d'un champignon du genre Curvularia (ordre des Moniliales) , tandis qu'un champignon du genre Pestalôtia (ordre des Melanconiales) est utilisé dans le procédé du brevet U.S.A. n 2.721.163. L'importance de l'introduction d'oxygène dans la position 11 des stéroides est bien connue des chimistes spécialisés dans le domaine des stéroïdes.
En. particu- lier, en convertissant le Composé S en son dérivé 11-hydroxylé, dans le cas d'hydroxyle se trouvant stéraniquement en position Il,3 , on obtient l'hydrocortisone ou Composé F ; dansle cas d'hydroxyle entrant en position 11 Ó, on obtient le Composé épi-F qui peut facilement être converti en cortisone par des procédés chimiques.
En opposition aux connaissances résultant des brevets et de la littérature mentionnés ci-avant, on a trouvé suivant l'in- vention que le Composé S et le Composé CI S peuvent être convertis 1,4 en Composé épi-F et en son analogue ¯1, 4-prégnadiène avec un ren- dement pratiquement quantitatif,en utilisant le micro-organisme Delacroixia coronata. Ce micro-organisme appartient à l'ordre des Entomophtorales, classe des Phycomycetes. L'ordre-des Entomophto- rales est formé, d'une façon générale, par des espèces d'insectes parasites dont quelques-uns seulement ont pu être élevés en milieu artificiel.. Cet ordre des Entomophtorales a été peu étudié.
Cer- taines espèces qui appartiennent à cet ordre sont pathogènes même pour les hommes. Jusqu'à ce jour, personne n'a supposé qu'un champignon appartenant à l'ordre des Entomophtorales pouvait être utilisé en fermentation pour la conversion microbiologique de
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substances stéroïdes. L'adaptation à une vie presque toujours para- siticide donnant naissance à une spécificité enzymatique élevée de ces champignons, contrairement aux espèces appartenant aux autres ordres, tels que celui des Ilucorales, qui, ne convenant que pour une vie presque exclusivement saprophytique sur les substrats très différents, développaient les systèmes enzymatiques les plus riches et les plus variés.
Le Delacroixia coronata a été isolé pour la première fois en 1697 par Costantin qui le classait comme Entonophtoracée.
Costantin nommait ce nouveau champignon, Bondierella coronata. En 1899, Saccardo et Sydow changeaient ce nom en Delacroixia coronata, car le nom de Bondierella était déjà utilisé et valable, depuis 1895, pour un, autre genre.
Callaud isolait à nouveau le Delacroixia coronata en 1905. Ni Costantin ni Callaud ne furent capables d'infecter des insectes avec ce champignon qui apparemment préférait les insectes morts.
En 1950, Ciccarone isolait à nouveau le Delacroixia coronata d'un tubercule de pomme de terre sec qui contenait égale- ment des insectes morts, et confirmait sa classification en tant qu'espèce de l'ordre des Entomophtorales, très voisin du Conidiobolus et différant de celui-ci par l'absence de zygospores.
La souche utilisée pour l'invention est la même que celle isolée par Ciccarone, déposée et enlistée sous la référence N.186 à la mycothèque du Laboratoire Cryptogamique Italien (ministère de l'Agriculture et des Forêts) à Pavie.
Le procédé de la présente invention peut être appliqué à la fois aux Composés S, ¯S et aux esters d'acide 21-carboxylique de ces Composés S et ¯ S, tels que le 21-acétate, le 21-propionate, etc ; dans tous les cas, le Composé épi-F ou son analogue 1,4 .prégnadiène sont obtenus en un rendement à peu près quantitatif, Suivant la nature de l'ester de départ, la composition du milieu
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nutritif, la température, etc, doivent être convenablement réglées.
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La Il,-! -Lydroxylation pour la conversion au Composé S ou # 6 en Composé épi-F ou en son analogue .:-..1,4¯prégnadiène est réalisée d'une façon générale par des procédés qui sont bien connus des microbiologistes.
Le Delacroixia coronata est cultivé sur un milieu de culture solide formé par des hydrolysats de protéines animales et végétales, des hydrates de carbone et des sels minéraux. Le pH le plus convenable pour la croissance de ce champignon est compris entre 6 et 7, et la meilleure température de croissance se. situe
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entre 25 et 3<¯>OC Dû-milieu de culture solide, le mycélium et, s'il y en a, les fructifications sont enlevés avec de l'eau stérile, et la suspension ainsi ootenueesb ensemencée dans un milieu végé- tatif liquide duquel sont prises des sous-cultures pour le milieu de fermentation.
Afin d'obtenir les meilleurs rendements de fermenta- tion, il est nécessaire qu'à la fois le milieu végétatif et le milieu de fermentation aient une composition particulière; de plus,
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la meilleure croissance ne de produit que o.m8 des conditions cors- venables de température, de pH et d'aération. Cependant, la con- version des stéroïdes se produit également, bien qu'avec des rende-
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ments plus bas, dans une ,';<11.1,,1e de conditions très variables.
Le milieu de culture croit contenir aes protéines ou des dérivés de protéines, tels que des protéines animales ou leurs hydrolysats, ou des extraits v4f;ct=>u:-:, tels que des extraits de mais, d'orbe et de ;:al::', ou dos farines 'fr,ét¯les (farine d'arachi- de, farine de soja, etc) et leurs extraits. Le doit contenir
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également des sources de carbone; ci, p prouvé que les meilleurs hydrates de c.l'lJOr1e boire le ;;ïucoe, le sucrose, l'amidon, les 0.e:;:- trines, etc. De uê.ie, les sels minéraux peuvent être iEtfY"'-";;;è"mt:3 - pour augmenter les xen4e.erts. Les anions les plus importants sont: Ka , K , 4; les cations les plus importants sont: S04 -, IIPO4
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Cl--, NO3; de même, des traces de métaux, tels que Mg++,Na+, Zn++, Fe++, etc,sont intéressants.
La température de fermentation peut varier entre 10 et 40 C, bien que les meilleurs rendements soient obtenus avec une température se rangeant entre 25 et 28 C, 8, Le pH de départ du milieu de culture peut varier entre 4 et S avec un rendement optimum à un pH de 6 à 7. Une aération a également une importance remarquable pour les rendements de croissance du mycélium et de fermentation. La culture végétative, après avoir été ensemencée, comme signalé ci-avant, avec la suspension de mycélium prise du milieu solide nutritif se développe en 20 à 72 heures.
De cette culture contenant le mycélium végétatif, on prend des inocula qui sont transférés à des flacons à secousses contenant le milieu 'de fermentation qui habituellement a la même composition que le milieu végétatif mais qui peut cependant être tout à, fait différent.
Après qu'une bonne croissance a été obtenue, c'est-à- dire, après 24 à 72 heures, on ajoute au milieu de culture, du Composé S ou 5% dissous dans un alcool aliphatique inférieur, de manière à obtenir une concentration de 1 à 2%, de Composé S ou ;¯¯ S dans le milieu de culture, de préférence 1 à ou Le milieu de fermentation est agité jusqu'à ce que le Composé S S soit converti en dérivé 11 -hydroxylé, à savoir en un temps vaiant de 5 à 20 heures. Le taux de conversion est déterminé par une chromatographie au papier réalisée, par exemple, chaque heure. La fermentation est arrêtée lorsque la chromatographie au papier mon- tre que, dans le milieu, il n'y a plus de composé de départ présent mais seulement le dérivé 11 -hydroxylé.
Au lieu de prendre l'inoculum du milieu végétatif li- quide,-il est'possiole d'ensemencer ou inoculer avec la suspension obtenue directement de la culture sur un milieu de fermentation solide, avec la conséquence qu'on obtient des rendements élevés d'hydroxylation, bien qu'en un temps plus long.
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La conversion peut également se produire sous des con- ditions différentes de celles décrites.
Au lieu d'ajouter du Composé S ou ±\ S au bouillon de fermentation, il est possible de filtrer le milieu de fermentation à partir du mycélium..Le mycélium est à nouveau mis en suspension dans de l'eau de ville.ou de l'eau distillée contenant du Composé S ou Ci S, et la conversion est mise en oeuvre sous agitation dans une suspension aqueuse simple. Dans certains c-as, ce procédé rend les opérations suivantes d'extraction quelque peu plus faciles, car le milieu à extraire ne contient pas de protéines, d'hydrates de .carbone et de sous-produits de fermentation.
Le' composé 11 -hydroxylé est au moins extrait, soit du milieu de fermentation, soit de la suspension aqueuse, par un solvant non miscible dans l'eau, dans lequel le produit est so- luble, tel que le chloroforme,.le'tétrachlorure de carbone, le chlorure de méthylène, etc. Des extraits sont concentrés jusqu'à siccité sous le vide et le résidu est cristallisé dans un solvant convenable, tel que, par exemple, de l'acétone.
Les exemples suivants illustrent clairement l'inven- tion, bien qu'ils ne soient pas destinés à la limiter.
Exemple 1.
Une culture de Delcaroixia coronata est aise à croître dans un milieu d'agar-agar contenant:
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<tb> peptone <SEP> 1%
<tb>
<tb>
<tb> sucrose <SEP> 3%
<tb>
<tb>
<tb> FeSO4. <SEP> 7H20 <SEP> 0,05%
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> MgSO4. <SEP> 7H20 <SEP> 0,05%
<tb>
<tb>
<tb> NaNO2 <SEP> 0,1%
<tb>
à un pH de 6,2 et à une température de 28 C pendant 24 heures. Une partie de la culture ainsi obtenue est transférée à un milleu végé- tatif liquide contenant 1% de peptone et 3% de glucose dans de l'eau distillée stérile à un pH dé 6,3, et le Mélange est agité dans un
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agitateur alternatif à 204 tours par minute pendant 48 heures à
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28oc.
Dans 10 flacons contenant chacun 50ml d'un milieu de fermentation de la composition suivante: glucose: 4% peptone: 1,5% on ajoute 0,5ml de la suspension obtenue du milieu végétatif et le mélange est agité à nouveau pendant 48 heures. Après ce temps, le mycélium est très bien développé; ensuite, dans chaque flacon, on ajoute une soluticn de 0,05 de Composé S dans 1 ml de dinéthyl- formarnide et l'agitation est poursuivie pendant 10 heures à 28 C.
A la fin de la fermentation, le pH du milieu est de 6,2. Par une chromatographie au papier du milieu, seule une tache apparaît, cor- respondant au Composé épi-F, tandis que la tache correspondant au Composé S est presque entièrement disparue. Le rendement de con- version par rapport à la chromatographie est d'environ 94%.
Le contenu des dix flacons est combiné et extrait avec du tétrachlorure de carbone. L'extrait est concentré jusqu'à sic- cité et le résidu est recristallisé dans de l'acétone.
On obtient 0,25 g de Composé épi-F d'un point de fu- sion de 209-212 C. A partir d'une concentration dans de l'acétone, on obtient à nouveau 0,20 g de Compose épi-F d'un point de fusion de 206 -209 C; par recristallisatin des deux récoltes combinées à partir d'acétone, on obtient 0,30 g de produit d'un point de fu- sion de 213 -214 C.' Exemple 2
Une culture de Delacrcixia coronata est préparée sur un milieu solide, comme décrit à l'exemple 1.
Le mycélium obtenu est transféré sur un milieu liquide végétatif contenant:
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<tb> peptone <SEP> 1%
<tb>
<tb> glucose <SEP> 3%
<tb>
liqueur de macération de mais 0,5%
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et maintenu sous agitation durant .3 heures à 2boy..
Dans un réservoir de fermentation de 10 litres, on transférait 4 litres d'un milieu de fermentation ayant la conposi- tion suivante:
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<tb> extrait <SEP> de <SEP> malt <SEP> 1,5%
<tb>
<tb> farine <SEP> de <SEP> soja <SEP> 1,5%
<tb>
<tb> amidon <SEP> 4%
<tb>
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NaZHP04 0, 02(J 1-lgS04 .7HZO 0-IJj
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<tb> KC1 <SEP> 0,08%
<tb>
Le pH après stérilisation était de 6,5.
Après ensemencement avec la suspension de mycélium à 2% obtenue du milieu végétatif, la moisissure est mise à croître pendant 24 heures à 26 C, sous agi- tation (500 tours/minute), en faisant barboter 1 volume d'air sté- rile par minute; ensuite, on ajoute une solution de 8 gr de ¯ !,4-
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prégnadiène-17 , ,21-diol-3,U-d.icne dans 200ml d'alcool méthylique, et l'agitation est poursuivie sous aération à 26 C pendant 12 heu- res. Le pH final est de 6,3; le rendement de conversion est de 85%.
Le contenu du réservoir de fermentation est filtré du mycélium, qui est ensuite extrait deux fois avec 2 litres de chloroforme. L'extrait au chloroforme est combiné-avec,le filtrat, et le mélange est énergiquement secoué. Au repos, la couche de chloroforme se sépare; elle est recueillie et séchée sur du sulfate de sodium.
La couche aqueuse est à nouveau extraite avec 2 litres additionnels de chloroforme et on la combine avec l'extrait précé- dent ; le chloroforme est évaporé sous le vide jusqu'à un volume d'environ 30-35ml. Après repos dans un réfrigérateur, les cristaux
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précités sont recueillis et séchés dans un four à 60 C.
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La fj 1,4- prégnadiéne-11 - i. ,17 ...'. , 21-t.riol-3 , 20-dione obtenue a un point de fusion de 222 -223 C, .;, D + 76 (C = 0,3,
20 méthanol).
Exemple 3
Un inoculum de Delacroixia coronata est préparé comme à l'exemple 1. Dans un réservoir de fermentation de 100 litres, on charge 50 litres de milieu de culture qui contient: peptone : 1% sucrose : 3% et on les ensemence avec 2% d'une sous-culture obtenue du milieu végétatif comme indiqué dans l'un des exemples ci-avant. Une croissance se produit sous agitation (150 tours/minute) et avec une aération de 0,4 volume d'air par minute à 27 C. Le mycélium est ensuite filtré et mis en suspension dans 50 litres d'eau distil- lée stérile dans un réservoir de fermentation de 100 litres.
On ajoute 50 g de Composé S dissous dans un litre de
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dimôthylforrnamide, et le milieu est conservé sous aération avec agitation à 27 C pendant 8 heures additionnelles. Après cette pé- riode, le rendement de conversion est de 100%.
Après extraction avec du chloroforme, comme indiqué à l'exemple 2, le rendement du Composé épi-F pur est de 61%.
Exemple 4
Un inoculum de Delacroixia coronata est préparé comme décrit à l'exemple 1.
Dans 'chacun de 20 flacons d'Erlenmeyer contenant 200 ml d'un milieu de fermentation avec:
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<tb> entrait' <SEP> de <SEP> levure <SEP> 0,3%
<tb>
<tb> sucrose <SEP> 1%
<tb>
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(lm4) 28 4 0,2
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<tb> NaHPO, <SEP> 0,08%
<tb>
2ml de la suspension de mycélium prise du milieu végétatif sont
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ensemencés, comme indiqué dans les exemples précédente. Le milieu est agité pendant 24 heures à 28 C: ensuite une solution de 0,1 g de 21-acétate de Composé S dans 2ml d'alcool méthylique est ajoutée à chaque flacon, et le mélange est agité à 28 C pendant 12 heures à 120 tours par minute. Après cette période, la conversion en Composé épi-F est pratiquement terminée et atteint environ 88%.
Par extraction avec du chloroforme et traitement comme indiqué dans les exemples précédents, on obtient un rendement d'en- viron 45% de Composé épi-F pur.
Lorsqu'on utilise comme produit de départ, du propiona- te de Composé S et qu'on pratique une fermentation pendant 18 heu- res à 26 C, le rendement est d'environ 50%.
Exemple 5
Un inoculum de Delacroixia coronata est préparé comme décrit à l'exemple 1.
Dans chacun de 10 flacons d'Erlenmeyer contenant 100ml d'un milieu de fermentation avec:
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<tb> peptone <SEP> 0,8%
<tb>
<tb> dextrine <SEP> 1%
<tb>
<tb> sucrose <SEP> 2%
<tb>
<tb> farine <SEP> d'arachide <SEP> 1%
<tb>
<tb> MgSO4. <SEP> 7H20 <SEP> 0,05%
<tb>
<tb> NaNO3 <SEP> 0,1%
<tb>
<tb> ' <SEP> MnCl2 <SEP> 0,001
<tb>
<tb> FeSO4.7H20 <SEP> 0,001-
<tb>
2ml de la suspension de mycélium prise du nilieu végétatif sont ensemencés, comne indiqué dans les exemples précédents. Le mélange est agité pendant 24 heures à 27 C; ensuite, on ajoute une solution de 0,1 g de 2i-propionate de Composé S dans 2ml d'alcool éthylique, et le mélange est agité pendant 10 heures à 27 C à 150 tours par de minute. Le rendement de conversion est en moyenne/88%.
Par extrac-
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tion avec du chloroforme et traitement comme indiqué dans les exem- ples précédents, on obtient un rendement d'environ 52 de Composé épi-F pur.
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1-VIItDICiTIOIVS 1. Procédé de préparation d'un stéroïde facultativement -non saturé de la' classe comprenant le ,.i'-prêgnëne-11 .. , , 17 @ ,21-triol-3,20-dione et ses esters d'acides carboxyliques aliphatiques inférieurs, en partant d'un stéroide facultativement
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,' -non saturé de la classe comprenant le cl *-prênène-17 . 21-diol-3,20-di6ne et ses esters d'acides carboxyliques aliphatiques inférieurs, qui comprend la mise en contact de ce stéroïde avec une souche de Delacroixia coronata.