<Desc/Clms Page number 1>
EMI1.1
La présente invention est relative à la préparation de
EMI1.2
84 -prégnène-ll c:"" ,17 , ,21-triol-.3, 20 dione (Composé ,épi-F) et de
EMI1.3
EMI1.4
son analogue (S, 1,4¯prée;nadiène. L'invention concerne plus spécia-
EMI1.5
lement un nouveau procédé de préparation du composé épi-F et de son
EMI1.6
analogue Li ,1,4 -prégnadiène par hydroxylation raicrobiolo;;ique de Li *-prégnène-17.:.,,?1-diol-3,20-dione (Composé S de Reichstein) ou de ß,t,l'-prédnadiène-17,,21-diol-3,20-one (désigné ci-après par Composé LiS) en utilisant le champignon Delacroixia coronata.
EMI1.7
Des procédés de conversion du Composé S de Reichstein
<Desc/Clms Page number 2>
en stéroïdes oxygénés en 11 et en particulier, le Composé F et le Composé épi-F, en utilisant un organisme différent de ceux utilisés suivant la présente invention ont déjà été décrits dans des brevets et dans la littérature. Par exemple, le brevet U.S.A. n 2.602.769 décrit l'utilisation de Cunninghamella blakesleana (ordre des @ucorales); une publication dans J. Amer . Chem.
Soc . 74, 2381 (1952) décrit un procédé qui utilise le Streptomyces fradiae ; le brevet U.S.A. n 2.658.023 décrit l'utilisation d'un champignon du genre Curvularia (ordre des Moniliales) , tandis qu'un champignon du genre Pestalôtia (ordre des Melanconiales) est utilisé dans le procédé du brevet U.S.A. n 2.721.163. L'importance de l'introduction d'oxygène dans la position 11 des stéroides est bien connue des chimistes spécialisés dans le domaine des stéroïdes.
En. particu- lier, en convertissant le Composé S en son dérivé 11-hydroxylé, dans le cas d'hydroxyle se trouvant stéraniquement en position Il,3 , on obtient l'hydrocortisone ou Composé F ; dansle cas d'hydroxyle entrant en position 11 Ó, on obtient le Composé épi-F qui peut facilement être converti en cortisone par des procédés chimiques.
En opposition aux connaissances résultant des brevets et de la littérature mentionnés ci-avant, on a trouvé suivant l'in- vention que le Composé S et le Composé CI S peuvent être convertis 1,4 en Composé épi-F et en son analogue ¯1, 4-prégnadiène avec un ren- dement pratiquement quantitatif,en utilisant le micro-organisme Delacroixia coronata. Ce micro-organisme appartient à l'ordre des Entomophtorales, classe des Phycomycetes. L'ordre-des Entomophto- rales est formé, d'une façon générale, par des espèces d'insectes parasites dont quelques-uns seulement ont pu être élevés en milieu artificiel.. Cet ordre des Entomophtorales a été peu étudié.
Cer- taines espèces qui appartiennent à cet ordre sont pathogènes même pour les hommes. Jusqu'à ce jour, personne n'a supposé qu'un champignon appartenant à l'ordre des Entomophtorales pouvait être utilisé en fermentation pour la conversion microbiologique de
<Desc/Clms Page number 3>
substances stéroïdes. L'adaptation à une vie presque toujours para- siticide donnant naissance à une spécificité enzymatique élevée de ces champignons, contrairement aux espèces appartenant aux autres ordres, tels que celui des Ilucorales, qui, ne convenant que pour une vie presque exclusivement saprophytique sur les substrats très différents, développaient les systèmes enzymatiques les plus riches et les plus variés.
Le Delacroixia coronata a été isolé pour la première fois en 1697 par Costantin qui le classait comme Entonophtoracée.
Costantin nommait ce nouveau champignon, Bondierella coronata. En 1899, Saccardo et Sydow changeaient ce nom en Delacroixia coronata, car le nom de Bondierella était déjà utilisé et valable, depuis 1895, pour un, autre genre.
Callaud isolait à nouveau le Delacroixia coronata en 1905. Ni Costantin ni Callaud ne furent capables d'infecter des insectes avec ce champignon qui apparemment préférait les insectes morts.
En 1950, Ciccarone isolait à nouveau le Delacroixia coronata d'un tubercule de pomme de terre sec qui contenait égale- ment des insectes morts, et confirmait sa classification en tant qu'espèce de l'ordre des Entomophtorales, très voisin du Conidiobolus et différant de celui-ci par l'absence de zygospores.
La souche utilisée pour l'invention est la même que celle isolée par Ciccarone, déposée et enlistée sous la référence N.186 à la mycothèque du Laboratoire Cryptogamique Italien (ministère de l'Agriculture et des Forêts) à Pavie.
Le procédé de la présente invention peut être appliqué à la fois aux Composés S, ¯S et aux esters d'acide 21-carboxylique de ces Composés S et ¯ S, tels que le 21-acétate, le 21-propionate, etc ; dans tous les cas, le Composé épi-F ou son analogue 1,4 .prégnadiène sont obtenus en un rendement à peu près quantitatif, Suivant la nature de l'ester de départ, la composition du milieu
<Desc/Clms Page number 4>
nutritif, la température, etc, doivent être convenablement réglées.
EMI4.1
La Il,-! -Lydroxylation pour la conversion au Composé S ou # 6 en Composé épi-F ou en son analogue .:-..1,4¯prégnadiène est réalisée d'une façon générale par des procédés qui sont bien connus des microbiologistes.
Le Delacroixia coronata est cultivé sur un milieu de culture solide formé par des hydrolysats de protéines animales et végétales, des hydrates de carbone et des sels minéraux. Le pH le plus convenable pour la croissance de ce champignon est compris entre 6 et 7, et la meilleure température de croissance se. situe
EMI4.2
entre 25 et 3<¯>OC Dû-milieu de culture solide, le mycélium et, s'il y en a, les fructifications sont enlevés avec de l'eau stérile, et la suspension ainsi ootenueesb ensemencée dans un milieu végé- tatif liquide duquel sont prises des sous-cultures pour le milieu de fermentation.
Afin d'obtenir les meilleurs rendements de fermenta- tion, il est nécessaire qu'à la fois le milieu végétatif et le milieu de fermentation aient une composition particulière; de plus,
EMI4.3
la meilleure croissance ne de produit que o.m8 des conditions cors- venables de température, de pH et d'aération. Cependant, la con- version des stéroïdes se produit également, bien qu'avec des rende-
EMI4.4
ments plus bas, dans une ,';<11.1,,1e de conditions très variables.
Le milieu de culture croit contenir aes protéines ou des dérivés de protéines, tels que des protéines animales ou leurs hydrolysats, ou des extraits v4f;ct=>u:-:, tels que des extraits de mais, d'orbe et de ;:al::', ou dos farines 'fr,ét¯les (farine d'arachi- de, farine de soja, etc) et leurs extraits. Le doit contenir
EMI4.5
également des sources de carbone; ci, p prouvé que les meilleurs hydrates de c.l'lJOr1e boire le ;;ïucoe, le sucrose, l'amidon, les 0.e:;:- trines, etc. De uê.ie, les sels minéraux peuvent être iEtfY"'-";;;è"mt:3 - pour augmenter les xen4e.erts. Les anions les plus importants sont: Ka , K , 4; les cations les plus importants sont: S04 -, IIPO4
<Desc/Clms Page number 5>
Cl--, NO3; de même, des traces de métaux, tels que Mg++,Na+, Zn++, Fe++, etc,sont intéressants.
La température de fermentation peut varier entre 10 et 40 C, bien que les meilleurs rendements soient obtenus avec une température se rangeant entre 25 et 28 C, 8, Le pH de départ du milieu de culture peut varier entre 4 et S avec un rendement optimum à un pH de 6 à 7. Une aération a également une importance remarquable pour les rendements de croissance du mycélium et de fermentation. La culture végétative, après avoir été ensemencée, comme signalé ci-avant, avec la suspension de mycélium prise du milieu solide nutritif se développe en 20 à 72 heures.
De cette culture contenant le mycélium végétatif, on prend des inocula qui sont transférés à des flacons à secousses contenant le milieu 'de fermentation qui habituellement a la même composition que le milieu végétatif mais qui peut cependant être tout à, fait différent.
Après qu'une bonne croissance a été obtenue, c'est-à- dire, après 24 à 72 heures, on ajoute au milieu de culture, du Composé S ou 5% dissous dans un alcool aliphatique inférieur, de manière à obtenir une concentration de 1 à 2%, de Composé S ou ;¯¯ S dans le milieu de culture, de préférence 1 à ou Le milieu de fermentation est agité jusqu'à ce que le Composé S S soit converti en dérivé 11 -hydroxylé, à savoir en un temps vaiant de 5 à 20 heures. Le taux de conversion est déterminé par une chromatographie au papier réalisée, par exemple, chaque heure. La fermentation est arrêtée lorsque la chromatographie au papier mon- tre que, dans le milieu, il n'y a plus de composé de départ présent mais seulement le dérivé 11 -hydroxylé.
Au lieu de prendre l'inoculum du milieu végétatif li- quide,-il est'possiole d'ensemencer ou inoculer avec la suspension obtenue directement de la culture sur un milieu de fermentation solide, avec la conséquence qu'on obtient des rendements élevés d'hydroxylation, bien qu'en un temps plus long.
<Desc/Clms Page number 6>
La conversion peut également se produire sous des con- ditions différentes de celles décrites.
Au lieu d'ajouter du Composé S ou ±\ S au bouillon de fermentation, il est possible de filtrer le milieu de fermentation à partir du mycélium..Le mycélium est à nouveau mis en suspension dans de l'eau de ville.ou de l'eau distillée contenant du Composé S ou Ci S, et la conversion est mise en oeuvre sous agitation dans une suspension aqueuse simple. Dans certains c-as, ce procédé rend les opérations suivantes d'extraction quelque peu plus faciles, car le milieu à extraire ne contient pas de protéines, d'hydrates de .carbone et de sous-produits de fermentation.
Le' composé 11 -hydroxylé est au moins extrait, soit du milieu de fermentation, soit de la suspension aqueuse, par un solvant non miscible dans l'eau, dans lequel le produit est so- luble, tel que le chloroforme,.le'tétrachlorure de carbone, le chlorure de méthylène, etc. Des extraits sont concentrés jusqu'à siccité sous le vide et le résidu est cristallisé dans un solvant convenable, tel que, par exemple, de l'acétone.
Les exemples suivants illustrent clairement l'inven- tion, bien qu'ils ne soient pas destinés à la limiter.
Exemple 1.
Une culture de Delcaroixia coronata est aise à croître dans un milieu d'agar-agar contenant:
EMI6.1
<tb> peptone <SEP> 1%
<tb>
<tb>
<tb> sucrose <SEP> 3%
<tb>
<tb>
<tb> FeSO4. <SEP> 7H20 <SEP> 0,05%
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> MgSO4. <SEP> 7H20 <SEP> 0,05%
<tb>
<tb>
<tb> NaNO2 <SEP> 0,1%
<tb>
à un pH de 6,2 et à une température de 28 C pendant 24 heures. Une partie de la culture ainsi obtenue est transférée à un milleu végé- tatif liquide contenant 1% de peptone et 3% de glucose dans de l'eau distillée stérile à un pH dé 6,3, et le Mélange est agité dans un
<Desc/Clms Page number 7>
agitateur alternatif à 204 tours par minute pendant 48 heures à
EMI7.1
28oc.
Dans 10 flacons contenant chacun 50ml d'un milieu de fermentation de la composition suivante: glucose: 4% peptone: 1,5% on ajoute 0,5ml de la suspension obtenue du milieu végétatif et le mélange est agité à nouveau pendant 48 heures. Après ce temps, le mycélium est très bien développé; ensuite, dans chaque flacon, on ajoute une soluticn de 0,05 de Composé S dans 1 ml de dinéthyl- formarnide et l'agitation est poursuivie pendant 10 heures à 28 C.
A la fin de la fermentation, le pH du milieu est de 6,2. Par une chromatographie au papier du milieu, seule une tache apparaît, cor- respondant au Composé épi-F, tandis que la tache correspondant au Composé S est presque entièrement disparue. Le rendement de con- version par rapport à la chromatographie est d'environ 94%.
Le contenu des dix flacons est combiné et extrait avec du tétrachlorure de carbone. L'extrait est concentré jusqu'à sic- cité et le résidu est recristallisé dans de l'acétone.
On obtient 0,25 g de Composé épi-F d'un point de fu- sion de 209-212 C. A partir d'une concentration dans de l'acétone, on obtient à nouveau 0,20 g de Compose épi-F d'un point de fusion de 206 -209 C; par recristallisatin des deux récoltes combinées à partir d'acétone, on obtient 0,30 g de produit d'un point de fu- sion de 213 -214 C.' Exemple 2
Une culture de Delacrcixia coronata est préparée sur un milieu solide, comme décrit à l'exemple 1.
Le mycélium obtenu est transféré sur un milieu liquide végétatif contenant:
<Desc/Clms Page number 8>
EMI8.1
<tb> peptone <SEP> 1%
<tb>
<tb> glucose <SEP> 3%
<tb>
liqueur de macération de mais 0,5%
EMI8.2
et maintenu sous agitation durant .3 heures à 2boy..
Dans un réservoir de fermentation de 10 litres, on transférait 4 litres d'un milieu de fermentation ayant la conposi- tion suivante:
EMI8.3
<tb> extrait <SEP> de <SEP> malt <SEP> 1,5%
<tb>
<tb> farine <SEP> de <SEP> soja <SEP> 1,5%
<tb>
<tb> amidon <SEP> 4%
<tb>
EMI8.4
NaZHP04 0, 02(J 1-lgS04 .7HZO 0-IJj
EMI8.5
<tb> KC1 <SEP> 0,08%
<tb>
Le pH après stérilisation était de 6,5.
Après ensemencement avec la suspension de mycélium à 2% obtenue du milieu végétatif, la moisissure est mise à croître pendant 24 heures à 26 C, sous agi- tation (500 tours/minute), en faisant barboter 1 volume d'air sté- rile par minute; ensuite, on ajoute une solution de 8 gr de ¯ !,4-
EMI8.6
prégnadiène-17 , ,21-diol-3,U-d.icne dans 200ml d'alcool méthylique, et l'agitation est poursuivie sous aération à 26 C pendant 12 heu- res. Le pH final est de 6,3; le rendement de conversion est de 85%.
Le contenu du réservoir de fermentation est filtré du mycélium, qui est ensuite extrait deux fois avec 2 litres de chloroforme. L'extrait au chloroforme est combiné-avec,le filtrat, et le mélange est énergiquement secoué. Au repos, la couche de chloroforme se sépare; elle est recueillie et séchée sur du sulfate de sodium.
La couche aqueuse est à nouveau extraite avec 2 litres additionnels de chloroforme et on la combine avec l'extrait précé- dent ; le chloroforme est évaporé sous le vide jusqu'à un volume d'environ 30-35ml. Après repos dans un réfrigérateur, les cristaux
<Desc/Clms Page number 9>
précités sont recueillis et séchés dans un four à 60 C.
EMI9.1
La fj 1,4- prégnadiéne-11 - i. ,17 ...'. , 21-t.riol-3 , 20-dione obtenue a un point de fusion de 222 -223 C, .;, D + 76 (C = 0,3,
20 méthanol).
Exemple 3
Un inoculum de Delacroixia coronata est préparé comme à l'exemple 1. Dans un réservoir de fermentation de 100 litres, on charge 50 litres de milieu de culture qui contient: peptone : 1% sucrose : 3% et on les ensemence avec 2% d'une sous-culture obtenue du milieu végétatif comme indiqué dans l'un des exemples ci-avant. Une croissance se produit sous agitation (150 tours/minute) et avec une aération de 0,4 volume d'air par minute à 27 C. Le mycélium est ensuite filtré et mis en suspension dans 50 litres d'eau distil- lée stérile dans un réservoir de fermentation de 100 litres.
On ajoute 50 g de Composé S dissous dans un litre de
EMI9.2
dimôthylforrnamide, et le milieu est conservé sous aération avec agitation à 27 C pendant 8 heures additionnelles. Après cette pé- riode, le rendement de conversion est de 100%.
Après extraction avec du chloroforme, comme indiqué à l'exemple 2, le rendement du Composé épi-F pur est de 61%.
Exemple 4
Un inoculum de Delacroixia coronata est préparé comme décrit à l'exemple 1.
Dans 'chacun de 20 flacons d'Erlenmeyer contenant 200 ml d'un milieu de fermentation avec:
EMI9.3
<tb> entrait' <SEP> de <SEP> levure <SEP> 0,3%
<tb>
<tb> sucrose <SEP> 1%
<tb>
EMI9.4
(lm4) 28 4 0,2
EMI9.5
<tb> NaHPO, <SEP> 0,08%
<tb>
2ml de la suspension de mycélium prise du milieu végétatif sont
<Desc/Clms Page number 10>
ensemencés, comme indiqué dans les exemples précédente. Le milieu est agité pendant 24 heures à 28 C: ensuite une solution de 0,1 g de 21-acétate de Composé S dans 2ml d'alcool méthylique est ajoutée à chaque flacon, et le mélange est agité à 28 C pendant 12 heures à 120 tours par minute. Après cette période, la conversion en Composé épi-F est pratiquement terminée et atteint environ 88%.
Par extraction avec du chloroforme et traitement comme indiqué dans les exemples précédents, on obtient un rendement d'en- viron 45% de Composé épi-F pur.
Lorsqu'on utilise comme produit de départ, du propiona- te de Composé S et qu'on pratique une fermentation pendant 18 heu- res à 26 C, le rendement est d'environ 50%.
Exemple 5
Un inoculum de Delacroixia coronata est préparé comme décrit à l'exemple 1.
Dans chacun de 10 flacons d'Erlenmeyer contenant 100ml d'un milieu de fermentation avec:
EMI10.1
<tb> peptone <SEP> 0,8%
<tb>
<tb> dextrine <SEP> 1%
<tb>
<tb> sucrose <SEP> 2%
<tb>
<tb> farine <SEP> d'arachide <SEP> 1%
<tb>
<tb> MgSO4. <SEP> 7H20 <SEP> 0,05%
<tb>
<tb> NaNO3 <SEP> 0,1%
<tb>
<tb> ' <SEP> MnCl2 <SEP> 0,001
<tb>
<tb> FeSO4.7H20 <SEP> 0,001-
<tb>
2ml de la suspension de mycélium prise du nilieu végétatif sont ensemencés, comne indiqué dans les exemples précédents. Le mélange est agité pendant 24 heures à 27 C; ensuite, on ajoute une solution de 0,1 g de 2i-propionate de Composé S dans 2ml d'alcool éthylique, et le mélange est agité pendant 10 heures à 27 C à 150 tours par de minute. Le rendement de conversion est en moyenne/88%.
Par extrac-
<Desc/Clms Page number 11>
tion avec du chloroforme et traitement comme indiqué dans les exem- ples précédents, on obtient un rendement d'environ 52 de Composé épi-F pur.
EMI11.1
1-VIItDICiTIOIVS 1. Procédé de préparation d'un stéroïde facultativement -non saturé de la' classe comprenant le ,.i'-prêgnëne-11 .. , , 17 @ ,21-triol-3,20-dione et ses esters d'acides carboxyliques aliphatiques inférieurs, en partant d'un stéroide facultativement
EMI11.2
,' -non saturé de la classe comprenant le cl *-prênène-17 . 21-diol-3,20-di6ne et ses esters d'acides carboxyliques aliphatiques inférieurs, qui comprend la mise en contact de ce stéroïde avec une souche de Delacroixia coronata.
<Desc / Clms Page number 1>
EMI1.1
The present invention relates to the preparation of
EMI1.2
84 -Pregnene-11 c: "", 17,, 21-triol-.3, 20 dione (Compound, epi-F) and
EMI1.3
EMI1.4
its analogue (S, 1,4¯prée; nadiene. The invention relates more specia-
EMI1.5
a new process for the preparation of the epi-F compound and its
EMI1.6
analog Li, 1,4-prregnadiene by microbiological hydroxylation of Li * -pregnene-17. ,,? 1-diol-3,20-dione (Compound S of Reichstein) or of β, t, l ' -prednadiene-17,21-diol-3,20-one (hereinafter referred to as Compound LiS) using the fungus Delacroixia coronata.
EMI1.7
Reichstein Compound S Conversion Processes
<Desc / Clms Page number 2>
in steroids oxygenated at 11 and in particular, Compound F and Compound epi-F, using an organism different from those used according to the present invention have already been described in patents and in the literature. For example, U.S. Patent No. 2,602,769 describes the use of Cunninghamella blakesleana (order of @ucorales); a publication in J. Amer. Chem.
Soc. 74, 2381 (1952) describes a method which uses Streptomyces fradiae; U.S. Patent No. 2,658,023 describes the use of a fungus of the genus Curvularia (order Moniliales), while a fungus of the genus Pestalôtia (order Melanconiales) is used in the process of U.S. Patent No. 2,721,163. The importance of introducing oxygen into the 11-position of steroids is well known to chemists specializing in the steroid field.
In. in particular, by converting Compound S into its 11-hydroxylated derivative, in the case of hydroxyl being steranically in position II, 3, hydrocortisone or Compound F is obtained; in the case of hydroxyl entering the 11 Ó position, the epi-F Compound is obtained which can easily be converted to cortisone by chemical methods.
In opposition to the knowledge resulting from the patents and the literature mentioned above, it has been found according to the invention that Compound S and Compound CI S can be converted 1,4 into Compound epi-F and its analogue ¯ 1,4-Pregnadiene in practically quantitative yield, using the microorganism Delacroixia coronata. This microorganism belongs to the order Entomophtorales, class of Phycomycetes. The order Entomophthorales is formed, in general, by species of parasitic insects, of which only a few have been able to be reared in an artificial environment. This order Entomophthorales has been little studied.
Some species that belong to this order are pathogenic even to humans. Until now, no one has assumed that a fungus belonging to the order Entomophtorales could be used in fermentation for the microbiological conversion of
<Desc / Clms Page number 3>
steroid substances. The adaptation to an almost always parasiticidal life giving rise to a high enzymatic specificity of these fungi, unlike the species belonging to other orders, such as that of Ilucorales, which, being suitable only for an almost exclusively saprophytic life on substrates very different, developed the richest and most varied enzymatic systems.
Delacroixia coronata was first isolated in 1697 by Costantin who classified it as Entonophtoracea.
Costantin named this new fungus, Bondierella coronata. In 1899, Saccardo and Sydow changed this name to Delacroixia coronata, because the name Bondierella had already been used and valid, since 1895, for another genus.
Callaud isolated Delacroixia coronata again in 1905. Neither Costantin nor Callaud were able to infect insects with this fungus, which apparently preferred dead insects.
In 1950, Ciccarone again isolated Delacroixia coronata from a dry potato tuber which also contained dead insects, and confirmed its classification as a species of the order Entomophtorales, very close to Conidiobolus and differing of the latter by the absence of zygospores.
The strain used for the invention is the same as that isolated by Ciccarone, deposited and enlisted under the reference N.186 in the mycothèque of the Italian Cryptogamic Laboratory (Ministry of Agriculture and Forests) in Pavia.
The process of the present invention can be applied to both S, ¯S Compounds and 21-carboxylic acid esters of these S and ¯ S Compounds, such as 21-acetate, 21-propionate, etc; in all cases, Compound epi-F or its 1,4-prregnadiene analogue are obtained in an approximately quantitative yield, depending on the nature of the starting ester, the composition of the medium
<Desc / Clms Page number 4>
nutrient, temperature, etc., must be properly regulated.
EMI4.1
The He, -! Hydroxylation for conversion to Compound S or # 6 to Compound epi-F or its analogue: - .. 1,4¯pregnadiene is generally carried out by methods which are well known to microbiologists.
Delacroixia coronata is cultivated on a solid culture medium formed by hydrolysates of animal and vegetable proteins, carbohydrates and mineral salts. The most suitable pH for the growth of this fungus is between 6 and 7, and the best temperature for growth is. locates
EMI4.2
between 25 and 3 <¯> OC Dû-solid culture medium, the mycelium and, if any, the fruiting bodies are removed with sterile water, and the suspension thus obtained is seeded in a liquid vegetative medium from which subcultures are taken for the fermentation medium.
In order to obtain the best fermentation yields, it is necessary that both the vegetative medium and the fermentation medium have a particular composition; Furthermore,
EMI4.3
the best product growth is only o.m8 under severe conditions of temperature, pH and aeration. However, steroid conversion also occurs, although with
EMI4.4
lower, in a, '; <11.1,, 1e of very variable conditions.
The culture medium is believed to contain proteins or protein derivatives, such as animal proteins or their hydrolysates, or extracts v4f; ct => u: - :, such as extracts of corn, orb and;: al :: ', or back flours' fr, et¯les (peanut flour, soy flour, etc.) and their extracts. The must contain
EMI4.5
also sources of carbon; Here, p proved that the best hydrates of C.lJOr1e drink ;; ïucoe, sucrose, starch, 0.e:;: - trines, etc. Hence, mineral salts can be iEtfY "'-" ;;; è "mt: 3 - to increase xen4e.erts. The most important anions are: Ka, K, 4; the most important cations are : S04 -, IIPO4
<Desc / Clms Page number 5>
Cl--, NO3; likewise, traces of metals, such as Mg ++, Na +, Zn ++, Fe ++, etc., are of interest.
The fermentation temperature can vary between 10 and 40 C, although the best yields are obtained with a temperature ranging between 25 and 28 C, 8. The starting pH of the culture medium can vary between 4 and S with an optimum yield at pH 6-7. Aeration is also of remarkable importance for mycelial growth and fermentation yields. The vegetative culture, after being inoculated, as mentioned above, with the suspension of mycelium taken from the solid nutrient medium develops in 20 to 72 hours.
From this culture containing the vegetative mycelium, inocula are taken which are transferred to shake flasks containing the fermentation medium which usually has the same composition as the vegetative medium but which may however be quite different.
After good growth has been obtained, that is, after 24 to 72 hours, Compound S or 5% dissolved in a lower aliphatic alcohol is added to the culture medium, so as to obtain a concentration from 1 to 2%, of Compound S or; ¯¯ S in the culture medium, preferably 1 to or The fermentation medium is stirred until the Compound SS is converted into an 11-hydroxylated derivative, namely into a time ranging from 5 to 20 hours. The conversion rate is determined by paper chromatography performed, for example, every hour. The fermentation is stopped when the paper chromatography shows that in the medium there is no more starting compound present but only the 11-hydroxy derivative.
Instead of taking the inoculum of the liquid vegetative medium, it ispossiole to inoculate or inoculate with the suspension obtained directly from the culture on a solid fermentation medium, with the consequence that high yields are obtained. hydroxylation, although over a longer time.
<Desc / Clms Page number 6>
The conversion can also take place under conditions different from those described.
Instead of adding Compound S or ± \ S to the fermentation broth, it is possible to filter the fermentation medium from the mycelium. The mycelium is again suspended in tap water. Or distilled water containing Compound S or Ci S, and the conversion is carried out with stirring in a simple aqueous suspension. In some cases, this process makes the subsequent extraction operations somewhat easier, since the medium to be extracted does not contain proteins, carbohydrates and fermentation by-products.
The 11-hydroxy compound is at least extracted, either from the fermentation medium or from the aqueous suspension, with a water-immiscible solvent, in which the product is soluble, such as chloroform. carbon tetrachloride, methylene chloride, etc. Extracts are concentrated to dryness in vacuo and the residue is crystallized from a suitable solvent, such as, for example, acetone.
The following examples clearly illustrate the invention, although they are not intended to limit it.
Example 1.
A culture of Delcaroixia coronata is easy to grow in an agar-agar medium containing:
EMI6.1
<tb> peptone <SEP> 1%
<tb>
<tb>
<tb> sucrose <SEP> 3%
<tb>
<tb>
<tb> FeSO4. <SEP> 7H20 <SEP> 0.05%
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> MgSO4. <SEP> 7H20 <SEP> 0.05%
<tb>
<tb>
<tb> NaNO2 <SEP> 0.1%
<tb>
at a pH of 6.2 and at a temperature of 28 C for 24 hours. Part of the culture thus obtained is transferred to a liquid vegetable medium containing 1% peptone and 3% glucose in sterile distilled water at a pH of 6.3, and the mixture is stirred in a medium.
<Desc / Clms Page number 7>
reciprocating agitator at 204 revolutions per minute for 48 hours at
EMI7.1
28oc.
In 10 flasks each containing 50 ml of a fermentation medium of the following composition: glucose: 4% peptone: 1.5%, 0.5 ml of the suspension obtained from the vegetative medium is added and the mixture is stirred again for 48 hours. After this time, the mycelium is very well developed; then, in each flask, a solution of 0.05 of Compound S in 1 ml of dinethylformarnide is added and stirring is continued for 10 hours at 28 ° C.
At the end of the fermentation, the pH of the medium is 6.2. By chromatography on the medium paper, only one stain appears, corresponding to Compound epi-F, while the stain corresponding to Compound S has almost entirely disappeared. The conversion efficiency with respect to chromatography is about 94%.
The contents of the ten vials are combined and extracted with carbon tetrachloride. The extract is concentrated to dryness and the residue is recrystallized from acetone.
This gives 0.25 g of Compound epi-F with a melting point of 209-212 C. From a concentration in acetone, again 0.20 g of Compose epi-F is obtained. with a melting point of 206 -209 C; by recrystallization of the two combined crops from acetone, 0.30 g of product with a melting point of 213 -214 C. is obtained. Example 2
A culture of Delacrcixia coronata is prepared on a solid medium, as described in Example 1.
The mycelium obtained is transferred to a vegetative liquid medium containing:
<Desc / Clms Page number 8>
EMI8.1
<tb> peptone <SEP> 1%
<tb>
<tb> glucose <SEP> 3%
<tb>
0.5% corn maceration liqueur
EMI8.2
and kept under stirring for .3 hours at 2boy.
Into a 10 liter fermentation tank, 4 liters of fermentation medium having the following composition were transferred:
EMI8.3
<tb> extract <SEP> of <SEP> malt <SEP> 1.5%
<tb>
<tb> <SEP> soy flour <SEP> <SEP> 1.5%
<tb>
<tb> starch <SEP> 4%
<tb>
EMI8.4
NaZHP04 0.02 (J 1-lgS04 .7HZO 0-IJj
EMI8.5
<tb> KC1 <SEP> 0.08%
<tb>
The pH after sterilization was 6.5.
After inoculation with the 2% mycelium suspension obtained from the vegetative medium, the mold is grown for 24 hours at 26 C, with stirring (500 revolutions / minute), by bubbling 1 volume of sterile air. per minute; then, we add a solution of 8 gr of ¯!, 4-
EMI8.6
Pregnadiene-17,21-diol-3, U-d.icne in 200 ml of methyl alcohol, and stirring is continued with aeration at 26 ° C. for 12 hours. The final pH is 6.3; the conversion efficiency is 85%.
The contents of the fermentation tank are filtered from the mycelium, which is then extracted twice with 2 liters of chloroform. The chloroform extract is combined with the filtrate and the mixture is vigorously shaken. At rest, the chloroform layer separates; it is collected and dried over sodium sulfate.
The aqueous layer is again extracted with an additional 2 liters of chloroform and combined with the previous extract; the chloroform is evaporated in vacuo to a volume of about 30-35ml. After resting in a refrigerator, the crystals
<Desc / Clms Page number 9>
above are collected and dried in an oven at 60 C.
EMI9.1
The fj 1,4- pregnadiene-11 - i. , 17 ... '. , 21-t.riol-3, 20-dione obtained has a melting point of 222 -223 C,.;, D + 76 (C = 0.3,
Methanol).
Example 3
An inoculum of Delacroixia coronata is prepared as in Example 1. In a 100 liter fermentation tank, 50 liters of culture medium are loaded which contains: peptone: 1% sucrose: 3% and they are inoculated with 2% d 'a subculture obtained from the vegetative medium as indicated in one of the examples above. Growth occurs with stirring (150 rpm) and with aeration of 0.4 volume of air per minute at 27 C. The mycelium is then filtered and suspended in 50 liters of sterile distilled water in a 100 liter fermentation tank.
50 g of Compound S dissolved in one liter of
EMI9.2
dimôthylforrnamide, and the medium is kept under aeration with stirring at 27 ° C. for 8 additional hours. After this period, the conversion efficiency is 100%.
After extraction with chloroform, as indicated in Example 2, the yield of pure Compound epi-F is 61%.
Example 4
An inoculum of Delacroixia coronata is prepared as described in Example 1.
In each of 20 Erlenmeyer flasks containing 200 ml of a fermentation medium with:
EMI9.3
<tb> entered '<SEP> of <SEP> yeast <SEP> 0.3%
<tb>
<tb> sucrose <SEP> 1%
<tb>
EMI9.4
(lm4) 28 4 0.2
EMI9.5
<tb> NaHPO, <SEP> 0.08%
<tb>
2ml of the mycelium suspension taken from the vegetative medium are
<Desc / Clms Page number 10>
seeded, as indicated in the previous examples. The medium is stirred for 24 hours at 28 C: then a solution of 0.1 g of 21-acetate of Compound S in 2 ml of methyl alcohol is added to each flask, and the mixture is stirred at 28 C for 12 hours at 120 revolutions per minute. After this period, the conversion to Compound epi-F is practically complete and reaches about 88%.
By extraction with chloroform and treatment as indicated in the previous examples, a yield of about 45% of pure Compound epi-F is obtained.
When using Compound S propionate as a starting material and fermenting for 18 hours at 26 ° C, the yield is about 50%.
Example 5
An inoculum of Delacroixia coronata is prepared as described in Example 1.
In each of 10 Erlenmeyer flasks containing 100ml of fermentation medium with:
EMI10.1
<tb> peptone <SEP> 0.8%
<tb>
<tb> dextrin <SEP> 1%
<tb>
<tb> sucrose <SEP> 2%
<tb>
<tb> peanut <SEP> flour <SEP> 1%
<tb>
<tb> MgSO4. <SEP> 7H20 <SEP> 0.05%
<tb>
<tb> NaNO3 <SEP> 0.1%
<tb>
<tb> '<SEP> MnCl2 <SEP> 0.001
<tb>
<tb> FeSO4.7H20 <SEP> 0.001-
<tb>
2 ml of the mycelium suspension taken from the vegetative nilieu are inoculated, as indicated in the preceding examples. The mixture is stirred for 24 hours at 27 C; then a solution of 0.1 g of 2i-propionate of Compound S in 2 ml of ethyl alcohol is added, and the mixture is stirred for 10 hours at 27 C at 150 revolutions per minute. The conversion efficiency is on average / 88%.
By extrac-
<Desc / Clms Page number 11>
Treatment with chloroform and treatment as indicated in the previous examples gives a yield of about 52 of pure Compound epi-F.
EMI11.1
1-VIItDICiTIOIVS 1. A process for the preparation of an optionally unsaturated steroid of the class comprising, .i'-prene-11 ...,, 17 @, 21-triol-3,20-dione and its esters. lower aliphatic carboxylic acids, optionally starting with a steroid
EMI11.2
, '-unsaturated class comprising the cl * -prenene-17. 21-diol-3,20-diene and its esters of lower aliphatic carboxylic acids, which comprises contacting this steroid with a strain of Delacroixia coronata.