Procédé de préparation de stéroïdes 11(3-hydroxylés L'invention est relative à un procédé pour convertir un stéroïde non substitué en position 11 en dérivé 11(i-hydroxylé de ce stéroïde à l'aide de cultures choisies de microorganisrnes. Une réaction particulièrement utile, qui peut être effectuée par ce procédé, est la conver sion du composé S de Reichstein (17a-hydroxy- 11-désoxy-corticostérone) en composé F de Kendall (17a-hydroxy-corticostérone).
La préparation de stéroïdes biologiquement actifs, tels que la cortisone et le composé F, se fait avec de nombreuses difficultés sérieuses.- Un des problèmes les plus difficiles est l'intro duction d'atomes d'oxygène en des positions essentielles du noyau stéroïde, surtout en po sition 11 de ce noyau. Le composé S peut être obtenu par des voies synthétiques connues, à partir de divers stéroïdes de départ, d'origine naturelle et relativement économiques, tels que des stéroïdes du type végétal.
Par contre, le composé F est beaucoup plus difficile à obtenir et est un composé de grande valeur, qui est particulièrement utile pour le traitement de l'arthritisme rhumatismal et de certains états du corps humain. Tout procédé par lequel le composé S peut être converti en composé F avec un bon rendement et sans dépenses exces- sives a une valeur importante pour l'industrie pharmaceutique et pour le public en général.
Des méthodes ont déjà été proposées pour convertir le composé S en composé F au moyen de micro-organismes tout différents de ceux décrits ci-dessous pour la mise en oeuvre du procédé faisant l'objet de l'invention. Dans le brevet E. U.
A., no 2602769 on a décrit l'usage de Cunninghamella blakesleena (de l'ordre des Mucorales) et dans un article paru dans le Journal of the American Chemical Society (Vol. 77, p. 2381, 1952) on décrit un procédé dans lequel on utilise le Streptomyces fradiae. Un grand nombre de microorgansmes ont été essayés en ce qui concerne leur efficacité pour convertir le composé S en composé F.
La plu part des microorganismes ne donnent aucune réaction relative à la 11(3-hydroxylation. Un nombre considérable de cultures de microorga nismes, de l'ordre des Mucorales, ont été es sayées pour la même réaction mais quelques- unes seulement de celles-ci permettaient d'ob tenir un degré réduit de conversion.
Contrai rement aux méthodes publiées jusqu'ici et aux pauvres résultats obtenus avec les microorga nismes étudiés jusqu'ici, les microorganismes du genre Curvularia ont donné des résultats très favorables en ce qu'ils permettent de pré- parer des produits, tels que le composé F, avec des rendements atteignant 40 % ou davantage. Par ailleurs, on peut effectuer les réactions dans des conditions telles que les produits puissent être isolés assez aisément avec un de gré de pureté élevé.
Ceci permet, pour la pre mière fois, la préparation pratique, sur une grande échelle et par des méthodes biochimi ques, de substances telles que le composé F.
On a découvert qu'en mettant en contact sous des conditions d'aérobiose un composé stéroïde non substitué en position 11 avec des enzymes oxydantes produites par certains mi croorganismes choisis, on peut obtenir la 11(3- hydroxylation sélective de ces composés sté roïdes. Les organismes en question sont des souches oxygénantes de champignons du genre Curvularia, ce genre appartenant à l'ordre des Moniliales de la classe des Fungi imperfecti. Ces indications sont basées sur la classification de Saccardo, P.
A., Sylloge Fungorum, Vol. 8. Une valeur particulière ont les souches des es pèces Curvularia falcata, C. brachyspora, C. lunata, C. pallescens et d'autres espèces de ce genre. D'autres microorganismes du genre Cur- vularia peuvent être choisis pour effectuer le procédé, faisant l'objet de l'invention, en fai sant des essais simples qui sont décrits en dé tail plus loin.
On peut se procurer plusieurs de ces organismes dans les collections de culture publiques et d'autres peuvent être isolés à partir de matières naturelles, telles que du ter reau, par des méthodes normalisées bien con nues par les mycologues.
Comme décrit plus haut, on peut se ser vir du procédé faisant l'objet de l'invention pour convertir le composé S en composé F.
Toutefois, le procédé peut également être utilisé pour la 11(3-hydroxylation d'une variété d'autres stéroïdes non substitués en position 11 du noyau. Diverses chaînes latérales peuvent être présentes en position 17 du noyau et des groupements céto ou hydroxyle peuvent se trouver en position 3 du noyau. Les stéroïdes, utilisés comme supports pour la réaction, peu vent également comporter des liaisons doubles carbone-carbone en divers points du noyau, par exemple aux positions 3, 4 ou 5, 6.
Il est à noter que le rendement en produit hydroxylé varie, jusqu'à un certain degré, avec la nature du stéroïde utilisé comme matière initiale, avec la souche particulière de Curvularia utilisée et avec les conditions adoptées pour la réaction, c'est-à-dire la température, la durée, le<I>pH,</I> le milieu nutritif, le moment auquel le composé est ajouté au microorganisme, etc.
Par ailleurs un microorganisme oxygénant donné, appar tenant à l'espèce préférée, peut avoir des ef fets très variables sur des stéroïdes différents, c'est-à-dire qu'un bon rendement en dérivé 11(3-hydroxylé correspondant peut être obtenu quand on se sert d'une souche oxygénante don née et d'un stéroïde déterminé, alors qu'un autre stéroïde utilisé dans des conditions qui, à part cela, sont absolument identiques, se transforme en composé désiré avec un rendement qui est seulement modéré ou fai ble.
La présence d'un groupement hydroxyle en position 21 d'un stéroïde du type prégnène peut être particulièrement utile pour fournir un bon rendement en composé 11(3-hydroxy. Comme les stéroïdes du type cortical possè dent un tel groupement hydroxyle, le procédé est particulièrement utile pour préparer les composés 11(3-hydroxylés de cette série.
Parmi les produits qui peuvent être convertis en pro duits 11(3-hydroxylés correspondants on peut citer le composé S et la 11-désoxy-corticosté- rone. Diverses méthodes peuvent être utilisées pour déterminer la quantité des produits ob tenus par ces procédés. Par exemple, si l'on se sert d'un stéroïde avec une chaine latérale ap propriée, la proportion du produit obtenu peut être évaluée en déterminant l'effet sur des sou ris adrénalectomisées ou en se basant sur le nombre d'éosinophiles qui se trouvent dans le sang des animaux ayant servi aux essais.
Par ailleurs, les produits purs, obtenus par la réac tion d'hydroxylation, peuvent être isolés com me décrit ci-dessous.
L'efficacité d'un microorganisme particu lier pour le procédé faisant l'objet de l'inven tion, peut être déterminée en cultivant le mi- coorganisme dans un milieu nutritif approprié contenant des hydrates de carbone, des sels, des sources d'azote organique, etc. Le stéroïde, à l'état solide ou en solution dans un solvant approprié tel que l'acétone ou l'éthanol, est ajouté, dans des conditions stériles, .au micro organisme cultivé et le mélange est agité et aéré pour provoquer la croissance du micro organisme et l'oxydation du stéroïde. Le sté roïde peut être ajouté quand le milieu est en semencé, dans des conditions stériles, avec une culture du microorganisme ou après que la croissance de l'organisme a commencé.
Dans certains cas il peut être bon d'ajouter le sté roïde après que la croissance du microorga nisme a commencé dans le milieu nutritif et sous des conditions d'aérobiose. Ceci convient tout particulièrement quand, pendant les pha ses initiales de la croissance du microorga nisme, il existe une tendance à la formation de sous-produits non voulus à partir du sté roïde de départ. L'acétate ou un autre ester du stéroïde peut être utilisé à la place de l'al cool lui-même bien que ceci puisse parfois être la cause d'une diminution appréciable du ren dement en produit hydroxylé.
Suivant une variante, on peut utiliser des préparations d'enzymes obtenues à partir de la culture d'un organisme approprié du genre Curvularia pour la mise en oeuvre du procédé. Une autre méthode, très efficace, consiste à cultiver le microorganisme sur un milieu nu tritif approprié dans des conditions d'aérobiose et en l'absence du stéroïde. La culture mycé- lienne peut ensuite être séparée par filtration du bouillon et peut, si on le désire, être lavée à l'eau distillée. Le mycélium est alors mis en suspension dans de l'eau distillée contenant le stéroïde de départ.
L'agitation et l'aération du mélange sont continuées pendant une période comprise entre environ 12 et 48 heures après quoi on récupère les produits résultant de la réaction. Ce procédé présente l'avantage que le stéroïde peut être aisément récupéré car les diverses matières nutritives, utilisées à l'origine, pour obtenir la croissance du microorganisme sont alors absentes ainsi que les diverses matiè res excrétées par les organismes, au cours de leur croissance, pendant la période initiale.
Avec certaines souches du genre Curvularia on obtient, par cette méthode, des rendements totaux, encore meilleurs en produits hydroxy- lés que dans le cas où le stéroïde est ajouté, au début ou à une période intermédiaire détermi née, à l'ensemble du bouillon de fermentation. D'autres méthodes, bien connues des chimistes qui s'occupent des enzymes, peuvent être utili sées pour la mise en oeuvre du procédé d'oxy dation en question. La proportion des produits et la vitesse d'oxydation ainsi que la nature des sous-produits formés peuvent varier suivant que l'on se sert de l'ensemble du bouillon de fermentation ou du mycélium lavé et isolé.
En général, une concentration qui ne dé passe pas 1 à 2 % en poids de produit de dé part est adoptée pour la mise en oeuvre du pro cédé, mais parfois on peut juger qu'il est plus favorable d'utiliser d'autres concentrations. Comme la solubilité de la matière initiale dans l'eau est très limitée, un excès de la matière peut être lentement converti en produit hy- droxylé. Toutefois, le degré de substitution du stéroïde, quand il est ajouté au système d'oxy dation, c'est-à-dire au microorganisme en cours de croissance ou aux enzymes,, ne paraît pas affecter fortement le rendement et la nature des produits dans des conditions qui, à part cela, restent identiques.
Si l'on ajoute une so lution du stéroïde dans un solvant miscible à l'eau au système de fermentation aqueux, le stéroïde est généralement précipité à l'état fi nement divisé en présence d'un grand excès d'eau. Ceci ne paraît pas améliorer d'une ma nière appréciable la vitesse de la réaction com parativement à celle obtenue par l'addition de cristaux secs et relativement grands du sté roïde.
Quand le traitement d'oxydation est termi né, le produit peut être récupéré hors du mé lange par extraction à l'aide d'un solvant ap proprié et non miscible à l'eau. Des hydro carbures inférieurs chlorés, des cétones et des alcools peuvent être utilisés à cet effet. Ceux-ci comprennent le chloroforme, le chlorure de méthylène, le trichloroéthane, le dichlorure d'éthylène, etc. L'usage du dichlorure d'éthy lène chaud, c'est-à-dire à une température comprise entre environ 40o et environ 800, convient tout particulièrement à l'extraction des stéroïdes.
L'extrait du produit oxydé et des matières initiales n'ayant pas réagi peuvent être concentrés jusqu'à un faible volume ou jusqu'à siccité pour obtenir un produit solide. La purification du produit peut se faire de dif férentes manières. La plus efficace est là sépa ration, par chromatographie, du produit d'avec les matières initiales et d'avec d'autres pro duits, tels que des substances plus fortement oxydées, qui peuvent être formés au cours de la réaction. Des adsorbants, tels que du gel de silice ou d'autres matières adsorbantes ap propriées, sont particulièrement utiles à cet ef fet.
On a découvert qu'une colonne de gel de silice traité avec un alcool inférieur, plus spé cialement l'éthanol, est particulièrement utile pour la séparation des stéroïdes.
Les stéroïdes bruts peuvent être amenés sur des colonnes d'adsorbants, tels que du gel de silice, en solution concentrée dans du chloro forme ou du chlorure de méthylène. La colonne peut ensuite être lavée avec des quantités addi tionnelles du solvant pour enlever certaines impuretés telles que des graisses et des pig ments. Le mélange adsorbé est ensuite séparé par l'addition graduelle d'un mélange du sol vant et d'un faible pourcentage, par exemple de 1 à 5 0/0, d'un alcool inférieur (méthanol, éthanol, etc.). Les matières peuvent être sé parées et les composés séparés peuvent être récupérés graduellement hors de la colonne en utilisant des mélanges de solvants qui ont une polarité graduellement croissante.
Par exemple un mélange de chlorure de méthylène et une quantité réduite mais graduellement croissante d'éthanol est très utile.
Des fractions de la matière récupérée hors des colonnes chromatographiques peuvent être examinées, en ce qui concerne la nature du produit, en soumettant des petites portions des solutions à des analyses sur papier chromato- graphique. Des méthodes qui sont particuliè rement utiles pour effectuer ce genre de sépa ration et d'analyse sont décrites en détail dans le brevet E. U. A. no 2602769 et dans un arti cle de Shull et autres publié dans les Archives of Biochemistry, Vol. 37 p. 186 (1952). Ces méthodes sont également très utiles pour es- Bayer des nouvelles souches de microorganis mes en vue de déterminer leur efficacité pour le procédé faisant l'objet de l'invention.
La fermentation peut se faire sur une petite échel le, avec le stéroïde, par exemple le composé S ou un dérivé approprié du composé S comme support et l'extrait total du mélange de fer mentation peut être concentré et soumis à l'essai au papier chromatographique. En utili sant des échantillons connus du composé S, du composé F ou d'autres produits apparentés, à titre de comparaison, il est possible de dé terminer si le microorganisme choisi convient au procédé en question.
Des chromatogrammes décroissants sur pa pier, obtenus à l'aide de papier traité avec une solution à 35 % de glycol propylénique et dé- veloppé avec un mélange de 78 volumes de to luène et 22 volumes de dioxane, peuvent être utilisés pour l'évaluation rapide de diverses souches des microorganismes préférés.
Une telle séparation peut être terminée en une pé riode aussi courte que trois heures et le chro- matogramme sur papier, après avoir été séché, peut être examiné à la lumière ultraviolette pour déterminer la position des diverses ma tières, telles que les composés S et F, par leur fluorescence. Les zones dans lesquelles les di verses substances se présentent, peuvent être marquées et découpées dans la feuille ou bande de papier. La matière peut ensuite être récu pérée à l'aide d'un solvant, tel que l'éthanol, et obtenue sous la forme d'une matière solide et pratiquement pure par évaporation. Une ana lyse quantitative d'un mélange de ce genre peut être faite de cette manière.
La quantité des pro duits isolés peut être déterminée, par exemple, en mesurant le spectre d'absorption dans l'ul tra-violet de solutions de ces matières. Parti culièrement utiles sont les caractéristiques d'absorption de ces composés quand ils sont dissous dans l'acide sulfurique concentré.
Après séparation des produits de réaction par chromatographie à l'aide d'une colonne, les fractions désirées peuvent être mélangées et concentrées jusqu'à un petit volume. Le pro duit peut ensuite être cristallisé dans un solvant approprié, tel que l'acétate d'éthyle. Un pro- duit, préparé par l'application du procédé en question, peut être comparé à des échantillons d'un composé F authentique et on a constaté qu'ils sont identiques à tous les points de vue. De la corticostérone, préparée par le procédé selon l'invention, a également été comparée à un échantillon normalisé et on a constaté qu'elle est identique à celui-ci.
Les exemples ci-dessous illustrent l'inven tion.
<I>Exemple 1</I> Un microorganisme provenant de la col lection du Quartermaster Corps à Philadel phie et désigné là-bas comme Curvularia fal- cata QM <I>120 h,</I> a été cultivé sur un milieu de culture à base d'agar. La titulaire ayant toute fois établi que cet organisme appartient à l'es pèce C. lunata plutôt qu'à l'espèce C.
falcata, elle le désignera ci-après par Curvularia lunata (QM <I>120 h.).</I> Une culture vivante de cet or ganisme a été déposée à la Fermentation Divi sion of thé Northern Régional Research Labo- ratory à Peoria (Illinois) et y a été enregistrée sous la référence NRRL-2380. L'organisme est séparé, par rinçage,
de la souche d'agar dans des conditions stériles et cultivé dans un mi lieu stérile ayant la composition suivante
EMI0005.0022
extrait <SEP> de <SEP> malt <SEP> 5 <SEP> 0/0
<tb> saccharose <SEP> 1
<tb> nitrate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 0,2
<tb> chlorure <SEP> de <SEP> potassium <SEP> 0,05
<tb> sulfate <SEP> de <SEP> magnésium <SEP> heptahydraté <SEP> 0,05
<tb> sulfate <SEP> ferreux <SEP> heptahydraté <SEP> 0,05
<tb> biphosphate <SEP> acide <SEP> de <SEP> potassium <SEP> 0,1 Eau distillée réglée à un<I>pH</I> de 7,0 avec de la potasse caustique, reste.
Des portions de cent millilitres de ce milieu sont versées dans des flacons de trois cents mil lilitres. A chaque flacon on ajoute 50 mg de composé S dissous dans un petit volume d'acé tone. Pendant ces opérations, le mélange de fermentation est maintenu sous des conditions stériles. Le mélange est ensuite agité pendant une période de sept jours à une température d'environ 28,). Les contenus des flacons sont mélangés et le mélange est extrait avec plu sieurs portions de bichlorure d'éthylène en se servant chaque fois d'un cinquième du volume de la phase aqueuse.
Le mélange des extraits au bichlorure d'éthylène est séché sur du sul fate de sodium anhydre et concentré sous vide, jusqu'à un volume de 1 à 2 ml ; un échantillon de cette solution est chromatographié sur pa pier en se servant d'un premier système de sol- vants contenant 50 % en volume d'éther et 50 % en volume
d'hexane et d'un second sys- tème de solvants formé par un mélange eau- benzène. -On a constaté que le produit obte nu contient le composé F en comparant avec des chromatogrammes sur papier obtenus avec un échantillon d'un composé F authentique, utilisé comme repère.
On a également obtenu des indications au sujet de la présence de produits plus fortement oxydés.
Le concentrai au dichlorure d'éthylène est placé sur une colonne chromatographique cons tituée par du gel de silice mélangé avec un petit volume d'éthanol (un ml de solvant par g de gel de silice). La colonne est développée à l'aide d'un mélange de 97 volumes de chlo rure de méthylène et 3 volumes d'éthanol à 95 0/0. Le produit fourni par la colonne est re cueilli sous la forme de petites fractions, ayant un même volume, qui sont examinées périodi quement à l'aide de papier chromatographique afin de séparer les fractions contenant le pro duit désiré.
Toutes ces fractions sont combinées et concentrées sous vide jusqu'à siccité pour obtenir le produit solide. On a constaté que ce produit est le composé F en le comparant à un échantillon connu de la même matière. <I>Exemple 2</I> Une culture de Curvularia lunata (QM <I>120 h)</I> est cultivée dans des flacons contenant le même milieu que celui décrit dans l'exem ple 1.
Cent ml de cet inoculum sont ajoutés à deux litres du milieu suivant
EMI0005.0067
Saccharose <SEP> 1 <SEP> 0/0
<tb> Tryptone <SEP> Difco <SEP> 1
<tb> Nitrate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 0,2
<tb> Biphosphate <SEP> acide <SEP> de <SEP> potassium <SEP> 0,1
<tb> Sulfate <SEP> de <SEP> magnésium <SEP> heptahydraté <SEP> 0,05
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> potassium <SEP> 0,05
<tb> Sulfate <SEP> ferreux <SEP> heptahydraté <SEP> 0,001 Le<I>pH</I> de ce mélange est rendu égal à 7 avec de l'acide sulfurique et 0,25 fl/o de carbonate de calcium sont ajoutés avant que le mélange soit stérilisé.
Le milieu inoculé est aéré avec un débit d'environ 0,5 à 1 volume d'air par volume de solution et par minute à 27-280 pendant 24 heures. Pendant cette période, le mélange est agité à une vitesse d'environ 1700 Vin. Un demi-gramme du composé S, non estérifié, est dissous dans 20 ml d'éthanol à 95 0/0. La solution est ajoutée au mélange de fermentation dans des conditions stériles. La culture est ensuite poursuivie pendant en core 24 heures, exactement dans les mêmes conditions que celles décrites plus haut.
La totalité du mélange de fermentation est sortie de la cuve de fermentation. Le mélange est extrait deux fois avec un volume égal de bichlorure d'éthylène à 700. Les extraits sont mélangés et évaporés jusqu'à siccité. Les ma tières solides sèches sont dissoutes dans un pe tit volume de chlorure de méthylène et la so lution est amenée sur une colonne de gel de silice. Cette colonne a été préparée préalable ment en traitant chaque gramme de gel de silice avec 1 ml d'éthanol à 95 0/0.
Ce mé lange est mis en suspension dans du chlorure de méthylène et est versé dans une colonne chromatographique. Après que le stéroïde brut a été introduit dans la colonne il est lavé avec plusieurs portions de chlorure de méthylène, pour enlever les graisses et les pigments. La colonne est ensuite développée en y ajoutant un mélange de 97 volumes de chlorure de méthy lène et 3 volumes d'éthanol. Le produit récu péré est subdivisé en une série de petites frac tions. Des portions de celles-ci sont analysées par chromatographie sur papier et les fractions contenant le même composé sont combinées. On a constaté que la matière qui sort en pre mier lieu de la colonne est le composé S récu péré. Cette matière peut être isolée et utilisée à nouveau.
La matière qui quitte la colonne en deuxième lieu est un stéroïde non identifié. La matière quittant la colonne en troisième lieu est récupérée et on constate qu'il s'agit du com posé F. En séparant le solvant des fractions mélangées contenant le composé F on obtient un rendement dépassant 35 % d'un produit sec qui peut être facilement purifié davantage.
<I>Exemple 3:</I> Une culture de Curvularia lunata (QM <I>120 h)</I> comme celle utilisée pour l'exemple 1, est cultivée sur le même milieu que celui dé crit dans l'exemple 1 sous des conditions d'aé robiose. Le mycélium fourni par deux litres de ce mélange et obtenu après une croissance de 22 heures est filtré, il est lavé avec un pe tit volume d'eau distillée et est ensuite mis en suspension dans deux litres d'eau distillée.
On ajoute un demi-gramme du composé S à ce mélange. Cette préparation est agitée et aérée avec un débit d'un demi volume d'air par volume de mélange et par minute pendant 16 heures. Le mélange est ensuite extrait trois fois avec un demi volume de chloroforme. Le mélange des extraits au chloroforme est con centré jusqu'à un petit volume et le mélange des stéroïdes est séparé par chromatographie sur une colonne de gel de silice.
On obtient un rendement d'environ 35 % en composé F pur. En outre, environ 10 % du composé S, utilisé comme matière initiale, sont récupérés à l'état pur.
<I>Exemple 4:</I> Une culture, fournie par les Philadelphia Laboratories du Quartermaster Corps sous la désignation Curvularia sp QM <I>371d,</I> est cul tivée dans des flacons sous des conditions d'aérobiose sur le milieu décrit dans l'exem ple 1.
Cet organisme a par la suite été défini tivement identifié comme appartenant à l'es pèce C. pallescens et sera donc désigné ci- après comme étant le Curvularia pallescens (QM 371d). Une culture vivante de cet orga nisme a été déposée à la Fermentation Division of thé Northern Régional Research Laboratory à Peoria (Illinois) et y a été enregistrée sous le no NRRL - 2381.
Après une période de crois sance de 24 heures, on utilise 100 ml de ce mélange pour ensemencer deux litres du milieu décrit dans l'exemple 2. Après que le mélange de deux litres a continué à croître sous des conditions d'aérobiose pendant 24 heures, on ajoute un demi-gramme du composé S au mé lange de fermentation dans des conditions sté riles. Le mélange est agité à 28o pendant en core 20 heures en étant aéré et remué dans toute sa masse. Le mélange est sorti du réci pient dans lequel la fermentation a eu lieu et est extrait trois fois, avec un demi volume de chloroforme chaque fois. Les extraits sont mélangés et concentrés jusqu'à un petit vo lume. Le mélange est alors placé sur une co lonne de gel de silice qui a été préparée de la manière indiquée plus haut.
La colonne de gel de silice est lavée avec du chlorure de mé thylène et est ensuite développée avec une so lution d'éthanol dans du chlorure de méthy lène. On récupère d'abord un peu de matière initiale (composé S) puis le produit 11(3-hy- droxyte, c'est-à-dire le composé F. Le produit isolé est purifié et son point de fusion, ainsi que ses autres propriétés physiques, sont comparés à ceux d'un échantillon synthétique pur. On constate que ces matières sont identiques.
Par ailleurs, le composé F préparé de cette ma nière est essayé en ce qui concerne son activité biologique en déterminant la teneur en glyco- gène du foie de souris adrénalectomisées. On constate qu'il est très efficace, ce qui est une autre preuve de la nature du produit. <I>Exemple S</I> Une culture de Curvularia lunata (QM <I>120 h)</I> est cultivée comme décrit dans l'exem ple 1 excepté que l'on utilise la 11-désoxy-cor- ticostérone à la place du composé S.
Quand la fermentation est terminée, le produit brut est extrait à l'aide de méthyl-isobutyl-cétone et le solvant est ensuite chassé sous vide. Le pro duit résiduel est essayé en ce qui concerne son activité biologique, en déterminant la teneur en glycogène du foie de souris adrénalecto- misées et le résultat positif montre l'introduc tion d'un groupe 11(3-hydroxyle dans le sté roïde. La purification par chromatographie sur colonne, comme décrite plus haut, donne avec un rendement approximatif de 28 % un composé cristallisé ; on constate qu'il s'agit de la corticostérone par ses constantes physi ques.
Process for the preparation of 11 (3-hydroxylated steroids The invention relates to a process for converting an unsubstituted steroid in position 11 to the 11 (i-hydroxylated derivative of this steroid using selected cultures of microorganisms. A particularly reaction) useful, which can be effected by this method, is the conversion of Reichstein's compound S (17α-hydroxy-11-deoxy-corticosterone) to Kendall's compound F (17α-hydroxy-corticosterone).
The preparation of biologically active steroids, such as cortisone and compound F, takes place with many serious difficulties. One of the most difficult problems is the introduction of oxygen atoms into essential positions of the steroid nucleus, especially in position 11 of this nucleus. Compound S can be obtained by known synthetic routes, from various starting steroids, of natural origin and relatively inexpensive, such as steroids of the plant type.
On the other hand, compound F is much more difficult to obtain and is a very valuable compound which is particularly useful for the treatment of rheumatic arthritis and certain conditions of the human body. Any process by which compound S can be converted to compound F with good yield and without excessive expense has great value for the pharmaceutical industry and for the public in general.
Methods have already been proposed for converting compound S into compound F by means of microorganisms quite different from those described below for carrying out the process forming the subject of the invention. In E. U.
A., No. 2602769 the use of Cunninghamella blakesleena (from the order Mucorales) has been described and in an article published in the Journal of the American Chemical Society (Vol. 77, p. 2381, 1952) a process is described. in which Streptomyces fradiae is used. A large number of microorganisms have been tried with regard to their effectiveness in converting compound S to compound F.
Most microorganisms do not give any reaction related to 11 (3-hydroxylation. A considerable number of cultures of microorganisms, of the order Mucorales, have been tested for the same reaction but only a few of these. These made it possible to obtain a reduced degree of conversion.
Contrary to the methods published so far and to the poor results obtained with the microorganisms studied so far, the microorganisms of the genus Curvularia have given very favorable results in that they allow the preparation of products, such as the compound F, with yields reaching 40% or more. On the other hand, the reactions can be carried out under conditions such that the products can be isolated quite easily with a high degree of purity.
This allows, for the first time, the practical preparation, on a large scale and by biochemical methods, of substances such as compound F.
It has been found that by contacting under aerobic conditions a steroid compound unsubstituted in position 11 with oxidizing enzymes produced by certain selected microorganisms, the selective 11 (3-hydroxylation of these steroid compounds can be obtained. The organisms in question are oxygenating strains of fungi of the genus Curvularia, this genus belonging to the order of Moniliales of the class Fungi imperfecti. These indications are based on the classification of Saccardo, P.
A., Sylloge Fungorum, Vol. 8. Of particular value are the strains of the species Curvularia falcata, C. brachyspora, C. lunata, C. pallescens and other species of this genus. Other microorganisms of the genus Curvularia can be chosen to carry out the method, which is the object of the invention, by carrying out simple tests which are described in detail below.
Many of these organisms can be obtained from public culture collections and others can be isolated from natural materials, such as soil, by standard methods well known to mycologists.
As described above, the process forming the subject of the invention can be used to convert compound S into compound F.
However, the process can also be used for the 11 (3-hydroxylation of a variety of other steroids unsubstituted at the 11-position of the ring. Various side chains can be present at the 17-position of the ring and keto or hydroxyl groups can occur. found in nucleus position 3. Steroids, used as supports for the reaction, may also contain carbon-carbon double bonds at various points in the nucleus, for example at positions 3, 4 or 5, 6.
It should be noted that the yield of hydroxylated product varies, to a certain extent, with the nature of the steroid used as starting material, with the particular strain of Curvularia used and with the conditions adopted for the reaction, i.e. - say temperature, time, <I> pH, </I> nutrient medium, when the compound is added to the microorganism, etc.
Furthermore, a given oxygenating microorganism, belonging to the preferred species, can have very variable effects on different steroids, that is to say that a good yield of the corresponding 11 (3-hydroxylated derivative can be obtained. when one uses a donated oxygenating strain and a specific steroid, while another steroid used under conditions which other than that are absolutely identical turns into the desired compound in a yield which is only moderate or weak.
The presence of a hydroxyl group at position 21 of a pregnene-type steroid can be particularly useful in providing a good yield of compound 11 (3-hydroxy. Since cortical-type steroids have such a hydroxyl group, the process is particularly useful for preparing the 11 (3-hydroxy compounds of this series.
Among the products which can be converted to the corresponding 11 (3-hydroxylated products there may be mentioned compound S and 11-deoxy-corticosterone. Various methods can be used to determine the amount of the products obtained by these methods. For example, if a steroid with an appropriate side chain is used, the proportion of the product obtained can be evaluated by determining the effect on adrenalectomized mice or based on the number of eosinophils present. in the blood of test animals.
Furthermore, the pure products obtained by the hydroxylation reaction can be isolated as described below.
The effectiveness of a particular microorganism for the process which is the subject of the invention can be determined by culturing the microorganism in a suitable nutrient medium containing carbohydrates, salts, nitrogen sources. organic, etc. The steroid, in the solid state or in solution in a suitable solvent such as acetone or ethanol, is added, under sterile conditions, to the cultured microorganism and the mixture is stirred and aerated to induce the growth of the. microorganism and steroid oxidation. The steroid can be added when the medium is in seed, under sterile conditions, with a culture of the microorganism or after growth of the organism has started.
In some cases it may be appropriate to add the steroid after the growth of the microorganism has started in the nutrient medium and under aerobic conditions. This is especially suitable when, during the initial stages of the growth of the microorganism, there is a tendency for the formation of unwanted by-products from the starting steroid. Acetate or other ester of the steroid can be used in place of alcohol itself although this can sometimes cause an appreciable decrease in the yield of hydroxy product.
Alternatively, enzyme preparations obtained from the culture of a suitable organism of the genus Curvularia can be used for carrying out the process. Another very efficient method consists in cultivating the microorganism on a suitable nutrient medium under aerobic conditions and in the absence of the steroid. The mycelial culture can then be separated by filtration from the broth and can, if desired, be washed with distilled water. The mycelium is then suspended in distilled water containing the starting steroid.
Stirring and aeration of the mixture is continued for a period of between about 12 and 48 hours after which the products resulting from the reaction are recovered. This process has the advantage that the steroid can be easily recovered because the various nutrients, originally used, to obtain the growth of the microorganism are then absent as well as the various materials excreted by the organisms during their growth. , during the initial period.
With certain strains of the genus Curvularia one obtains, by this method, total yields, even better in hydroxylated products than in the case where the steroid is added, at the beginning or at a determined intermediate period, to the whole of the broth. fermentation. Other methods, well known to chemists dealing with enzymes, can be used for carrying out the oxidation process in question. The proportion of the products and the rate of oxidation as well as the nature of the by-products formed may vary depending on whether the whole of the fermentation broth or the washed and isolated mycelium are used.
In general, a concentration which does not exceed 1 to 2% by weight of starting product is adopted for the implementation of the process, but sometimes it may be judged that it is more favorable to use other concentrations. . Since the solubility of the starting material in water is very limited, an excess of the material can be slowly converted to hydroxylated product. However, the degree of substitution of the steroid, when it is added to the oxidation system, that is to say to the growing microorganism or to the enzymes, does not appear to strongly affect the yield and the nature of the products. under conditions which, other than that, remain the same.
If a solution of the steroid in a water-miscible solvent is added to the aqueous fermentation system, the steroid is generally precipitated in a finely divided state in the presence of a large excess of water. This does not appear to improve the rate of the reaction appreciably compared to that obtained by the addition of dry and relatively large crystals of the steroid.
When the oxidation treatment is complete, the product can be recovered from the mixture by extraction with a suitable solvent which is immiscible with water. Chlorinated lower hydrocarbons, ketones and alcohols can be used for this purpose. These include chloroform, methylene chloride, trichloroethane, ethylene dichloride, etc. The use of hot ethylene dichloride, that is to say at a temperature between about 40 ° and about 800, is very particularly suitable for the extraction of steroids.
The extract of the oxidized product and unreacted starting materials can be concentrated to low volume or to dryness to obtain a solid product. The purification of the product can be done in different ways. This is most effective in the separation, by chromatography, of the product from the starting materials and from other products, such as more strongly oxidized substances, which may be formed during the reaction. Adsorbents, such as silica gel or other suitable adsorbent materials, are particularly useful for this purpose.
It has been found that a column of silica gel treated with a lower alcohol, more especially ethanol, is particularly useful for the separation of steroids.
Crude steroids can be fed onto columns of adsorbents, such as silica gel, in concentrated solution in chloroform or methylene chloride. The column can then be washed with additional amounts of the solvent to remove certain impurities such as fats and pigments. The adsorbed mixture is then separated by the gradual addition of a mixture of the solvent and a small percentage, for example 1 to 5%, of a lower alcohol (methanol, ethanol, etc.). The materials can be separated and the separated compounds can be gradually recovered from the column using mixtures of solvents which have gradually increasing polarity.
For example a mixture of methylene chloride and a reduced but gradually increasing amount of ethanol is very useful.
Fractions of the material recovered from the chromatographic columns can be examined for the nature of the product by subjecting small portions of the solutions to chromatographic paper analyzes. Methods which are particularly useful for carrying out this kind of separation and analysis are described in detail in E. U. A. Patent No. 2602769 and in an article by Shull et al published in Archives of Biochemistry, Vol. 37 p. 186 (1952). These methods are also very useful for testing new strains of microorganisms with a view to determining their efficacy for the method forming the subject of the invention.
The fermentation can be done on a small scale, with the steroid, for example compound S or a suitable derivative of compound S as a carrier and the total extract of the fermentation mixture can be concentrated and subjected to the paper test. chromatographic. By using known samples of compound S, compound F or other related products for comparison it is possible to determine whether the selected microorganism is suitable for the process in question.
Decreasing chromatograms on paper, obtained using paper treated with a 35% propylene glycol solution and developed with a mixture of 78 volumes of toluene and 22 volumes of dioxane, can be used for the evaluation. fast of various strains of preferred microorganisms.
Such a separation can be completed in a period as short as three hours, and the chromatogram on paper, after being dried, can be examined under ultraviolet light to determine the position of various materials, such as the S and S compounds. F, by their fluorescence. The areas in which the various substances are present can be marked and cut out from the sheet or strip of paper. The material can then be recovered with a solvent, such as ethanol, and obtained as a solid and substantially pure material by evaporation. A quantitative analysis of such a mixture can be done in this way.
The amount of the isolated products can be determined, for example, by measuring the ultraviolet absorption spectrum of solutions of these materials. Particularly useful are the absorption characteristics of these compounds when dissolved in concentrated sulfuric acid.
After separation of the reaction products by column chromatography, the desired fractions can be mixed and concentrated to a small volume. The product can then be crystallized from a suitable solvent, such as ethyl acetate. A product, prepared by the application of the method in question, can be compared to samples of an authentic compound F and have been found to be identical in all respects. Corticosterone, prepared by the process according to the invention, was also compared to a standardized sample and found to be identical to it.
The examples below illustrate the invention.
<I> Example 1 </I> A microorganism from the collection of the Quartermaster Corps in Philadelphia and designated there as Curvularia falcata QM <I> 120 h, </I> was cultured on a medium of agar-based culture. The licensee having nevertheless established that this organism belongs to the species C. lunata rather than to the species C.
falcata, it will hereinafter refer to as Curvularia lunata (QM <I> 120 h.). </I> A living culture of this organism has been deposited at the Fermentation Division of the Northern Regional Research Laboratory in Peoria (Illinois) and was registered there under the reference NRRL-2380. The body is separated, by rinsing,
of the agar strain under sterile conditions and cultivated in a sterile medium having the following composition
EMI0005.0022
extract <SEP> from <SEP> malt <SEP> 5 <SEP> 0/0
<tb> sucrose <SEP> 1
<tb> <SEP> sodium <SEP> nitrate <SEP> 0.2
<tb> <SEP> potassium <SEP> chloride <SEP> 0.05
<tb> <SEP> magnesium <SEP> sulfate <SEP> heptahydrate <SEP> 0.05
<tb> sulfate <SEP> ferrous <SEP> heptahydrate <SEP> 0.05
<tb> Biphosphate <SEP> potassium <SEP> <SEP> <SEP> 0.1 Distilled water set to <I> pH </I> of 7.0 with caustic potash, remainder.
One hundred milliliter portions of this medium are poured into three hundred milliliter flasks. To each vial is added 50 mg of compound S dissolved in a small volume of acetone. During these operations, the fermentation mixture is maintained under sterile conditions. The mixture is then stirred for a period of seven days at a temperature of about 28%. The contents of the vials are mixed and the mixture is extracted with several portions of ethylene dichloride, each time using one fifth of the volume of the aqueous phase.
The mixture of ethylene bichloride extracts is dried over anhydrous sodium sulfate and concentrated in vacuo, to a volume of 1 to 2 ml; a sample of this solution is chromatographed on paper using a first system of solvents containing 50% by volume of ether and 50% by volume
hexane and a second solvent system formed by a water-benzene mixture. - It was found that the product obtained contains compound F by comparing with chromatograms on paper obtained with a sample of an authentic compound F, used as a benchmark.
Indications were also obtained regarding the presence of more strongly oxidized products.
The ethylene dichloride concentrate is placed on a chromatographic column consisting of silica gel mixed with a small volume of ethanol (one ml of solvent per g of silica gel). The column is developed using a mixture of 97 volumes of methylene chloride and 3 volumes of 95% ethanol. The product supplied by the column is collected in the form of small fractions, having the same volume, which are examined periodically using chromatographic paper in order to separate the fractions containing the desired product.
All of these fractions are combined and concentrated in vacuo to dryness to obtain the solid product. This product was found to be compound F by comparing it to a known sample of the same material. <I> Example 2 </I> A culture of Curvularia lunata (QM <I> 120 h) </I> is cultivated in flasks containing the same medium as that described in example 1.
One hundred ml of this inoculum are added to two liters of the following medium
EMI0005.0067
Sucrose <SEP> 1 <SEP> 0/0
<tb> Tryptone <SEP> Difco <SEP> 1
<tb> Nitrate <SEP> of <SEP> sodium <SEP> 0.2
<tb> Biphosphate <SEP> <SEP> potassium <SEP> <SEP> 0.1 acid
<tb> <SEP> Magnesium <SEP> <SEP> Heptahydrate <SEP> 0.05
<tb> <SEP> potassium <SEP> chloride <SEP> 0.05
<tb> Sulfate <SEP> ferrous <SEP> heptahydrate <SEP> 0.001 The <I> pH </I> of this mixture is made equal to 7 with sulfuric acid and 0.25 fl / o of calcium carbonate are added before the mixture is sterilized.
The inoculated medium is aerated with a flow rate of approximately 0.5 to 1 volume of air per volume of solution per minute at 27-280 for 24 hours. During this period, the mixture is stirred at a speed of approximately 1700 Vin. Half a gram of compound S, unesterified, is dissolved in 20 ml of 95% ethanol. The solution is added to the fermentation mixture under sterile conditions. The culture is then continued for a further 24 hours, exactly under the same conditions as those described above.
All of the fermentation mixture has left the fermentation tank. The mixture is extracted twice with an equal volume of 700 ethylene bichloride. The extracts are mixed and evaporated to dryness. The dry solids are dissolved in a small volume of methylene chloride and the solution is taken to a column of silica gel. This column was prepared beforehand by treating each gram of silica gel with 1 ml of 95% ethanol.
This mixture is suspended in methylene chloride and is poured into a chromatographic column. After the crude steroid has been introduced into the column it is washed with several portions of methylene chloride, to remove fats and pigments. The column is then developed by adding thereto a mixture of 97 volumes of methylene chloride and 3 volumes of ethanol. The recovered product is subdivided into a series of small fractions. Portions of these are analyzed by paper chromatography and fractions containing the same compound are combined. It has been found that the material which first comes out of the column is the recovered compound S. This material can be isolated and used again.
The second material that leaves the column is an unidentified steroid. The material leaving the column in the third place is recovered and it is found that it is the compound F. By separating the solvent from the mixed fractions containing the compound F one obtains a yield exceeding 35% of a dry product which can be obtained. easily purified further.
<I> Example 3: </I> A culture of Curvularia lunata (QM <I> 120 h) </I> like that used for example 1, is grown on the same medium as that described in example 1 under aerobic conditions. The mycelium supplied by two liters of this mixture and obtained after a growth of 22 hours is filtered, it is washed with a small volume of distilled water and is then suspended in two liters of distilled water.
Half a gram of compound S is added to this mixture. This preparation is stirred and aerated with a flow rate of half a volume of air per volume of mixture and per minute for 16 hours. The mixture is then extracted three times with half a volume of chloroform. The mixture of the chloroform extracts is concentrated to a small volume and the mixture of steroids is separated by chromatography on a column of silica gel.
A yield of approximately 35% of pure compound F is obtained. In addition, about 10% of the compound S, used as starting material, is recovered in the pure state.
<I> Example 4: </I> A culture, supplied by the Philadelphia Laboratories of the Quartermaster Corps under the designation Curvularia sp QM <I> 371d, </I> is grown in flasks under aerobic conditions on the medium described in Example 1.
This organism was subsequently definitively identified as belonging to the species C. pallescens and will therefore be referred to below as Curvularia pallescens (QM 371d). A living culture of this organism has been deposited with the Fermentation Division of the Northern Regional Research Laboratory in Peoria, Illinois, and registered there as NRRL - 2381.
After a 24 hour growth period, 100 ml of this mixture is used to inoculate two liters of the medium described in Example 2. After the two liter mixture has continued to grow under aerobic conditions for 24 hours. half a gram of compound S is added to the fermentation mixture under sterile conditions. The mixture is stirred at 28o for a further 20 hours while being aerated and stirred throughout. The mixture is taken out of the container in which the fermentation has taken place and is extracted three times, with half a volume of chloroform each time. The extracts are mixed and concentrated to a small volume. The mixture is then placed on a column of silica gel which has been prepared as indicated above.
The silica gel column is washed with methylene chloride and then developed with a solution of ethanol in methylene chloride. A little initial material is first recovered (compound S) then product 11 (3-hydroxyte, that is to say compound F. The isolated product is purified and its melting point, as well as its other physical properties, are compared to those of a pure synthetic sample and it is found that these materials are identical.
On the other hand, the compound F prepared in this manner is tested for its biological activity by determining the glycogen content of the liver of adrenalectomized mice. It is found to be very effective, which is further proof of the nature of the product. <I> Example S </I> A culture of Curvularia lunata (QM <I> 120 h) </I> is grown as described in Example 1 except that 11-deoxy-corticosterone is used. instead of the compound S.
When fermentation is complete, the crude product is extracted with methyl isobutyl ketone and the solvent is then removed in vacuo. The residual product is tested for its biological activity by determining the glycogen content of the liver of adrenalectomized mice and the positive result shows the introduction of an 11 (3-hydroxyl group into the steroid. Purification by column chromatography, as described above, gives with an approximate yield of 28% a crystalline compound; it is noted that it is corticosterone by its physi cic constants.