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et leur application en thérapeutique.
La présente invention concerne des sels et esters de l'acide libre correspondant à la lactone appelée Monacoline K, les procédés pour leur préparation et leur
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La demande de brevet britannique n[deg.] 8 005 748, au nom de la présente Demanderesse, décrit la Monacoline K et sa préparation au moyen de microorganismes du genre Monascus, en particulier la souche 1005 (FERM 4822) de Monascus ruber. Cette demande britannique divulgue l'activité précieuse et inattendue de la Monacoline K comme
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britannique ultérieure n[deg.] 8 007 240 décrit la préparation de la Monacoline K par culture de divers autres microorganismes du genre Monascus. Il a maintenant été trouvé que les sels et les esters de l'acide libre,dont la Monacoline K est la lactone présentent une activité anti-hypercholes-
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comparable ou supérieur. Par souci de commodité, ces composés sont dénommés, dans le présent mémoire, "sels ou esters de Monacoline K". Il est bien entendu que cette expression se réfère aux sels et esters de l'acide dont la Monacoline K est la lactone.
Les sels et esters de la Monacoline K objet de la présente invention répondent à la formule :
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dans laquelle :
- R représente un groupe alkyle substitué ou non substitué ou un atome de métal ; et - n est 1 ' Inverse de la valence du groupe ou atome représenté par R.
L'invention concerne aussi un procédé de préparation des sels et esters de la Monacoline K. par salification ou estérification de la Monacoline A ou d'un dérivé réactif de celle-ci.
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la Monacoline K, et séparation dudit sel de Monacoline A à partir du milieu de culture.
Les sels de Monacoline K auxquels la présente invention s'applique sont les sels métalliques et, de préférence, les sels des métaux alcalins, comme les sels de sodium ou de potassium, les sels de métaux alcalinoterreux comme les sels de calcium ou de magnésium, les sels des métaux du Groupe lira de la Classification périodique des éléments, comme le sel d'aluminium, et les sels des métaux de transition des Groupes Ib, IIb et VIII de la Classification périodique des éléments, comme les sels de fer, de nickel, de cobalt, de cuivre et de zinc. Parmi ces sels métalliques, les sels de métaux alcalins, les sels de métaux alcalino-terreux et le sel d'aluminium sont ceux que l'on préfère, les sels de sodium, de calcium et d'aluminium étant tout particulièrement appréciés.
Les sels de Monacoline K peuvent être facilement convertis en la Monacoline K elle-même, ou en l'acide
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Monacoline K:résultante ou l'acide correspondant peut être à nouveau transformé en un sel en présence d'une substance alcaline, par exemple un hydroxyde ou un carbonate de métal alcalin. Ces transformations peuvent être effectuées quantitativement, de manière répétée. Il a été trouvé que la transformation de la Monacoline K, ou de l'acide correspondant, en sel métallique ou réciproquement, est
<EMI ID=9.1> substances. La valeur de pH déterminante est d'environ 5,0.
Pourvu que des ions métal soient disponibles, la Monacoline
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inférieur à 5,0, la Monacoline K elle-même, l'acide correspondant à la Monacoline K ou un mélange de ces deux subs-
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Les esters de Monacoline K selon la présente invention sont ceux des composés de la formule précitée pour lesquels R représente un groupe alkyle substitué ou non substitué.. Lorsque R représente un groupe alkyle non substitué, celui-ci peut être un groupe à chaîne
droite ou à chaîne ramifiée, ayant de préférence jusqu'à
8 atomes de carbone. Comme exemples de tels groupes alkyle représentés.par R, on peut citer les groupes méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, butyle et hexyle.
Lorsque R représente un groupe alKyie substitué, le substituant peut être choisi, comme il est bien connu dans cette technique, dans une gamme étendue de groupes et atomes, comprenant notamment les groupes aryle, les groupes acyle (en particulier les groupes arylcarbonyle), les groupes alcoxy, les atomes d'halogènes et les groupes hydroxy. Les substituants particulièrement préférés sont les groupes aryle et les groupes arylcarbonyle, c'est-à-dire ceux où R représente un groupe aralkyle ou un groupe arylcarbonylalkyle.
Lorsque R représente un groupe aralkyle, celui-ci est de préférence un groupe benzyle substitué ou non substitué. Les groupes benzyle substitués comportent de préférence un ou plusieurs substituants choisis parmi les groupes alkyle, les groupes alcoxy et les atomes d'halogènes. Comme exemples de tels groupes benzyle, on peut
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benzyle, 2-bromobenzyle, 3-bromobenzyle ou 4-bromobenzyle.
Lorsque R représente un groupe arylcarbonylal-
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Les groupes phénacyle substitués comportent de préférence un ou plusieurs substituants choisis parmi les groupes alkyle, les groupes alcoxy et les atomes d'halogène.
Comme exemples de tels groupes phénacyle, on peut citer les groupes phénacyle, 2-méthylphénacyle, 3-méthylphénacyle,
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4-chlorophênacyle, 2-bromophénacyle, 3-bromophénacyle ou 4-bromophën.acyle.
Parmi les esters, les esters de méthyle, éthyle, butyle et benzyle sont particulièrement préférés.
Les sels et.les esters de la Monacoline K selon la présente invention peuvent être facilement préparés
par salification ou estérification de la Monacoline K ellemême ou d'un dérivé réactif de la Monacoline K. Des exemples de dérivés réactifs convenables comprennent l'acide correspondant à la Monacoline K et, dans le cas de la préparation des esters, les sels de Monacoline K (par exemple les classes de sels décrites plus haut, en particulier le sel de sodium, de potassium, de calcium, de magnésium, d'aluminium, de fer, de zinc, de cuivre, de nickel ou de cobalt).
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par simple réaction de la Monacoline K ou de l'acide correspondant avec un oxyde, hydroxyde, carbonate ou bicarbonate, de préférence un hydroxyde ou carbonate du métal choisi. On doit prendre les mesures nécessaires pour que la réaction soit effectuée à.une valeur de pH supérieure à 5,0 et de préférence à 7,0 pour assurer une conversion complète de la Monacoline K ou de l'acide correspondant en le sel désiré. La Monacoline K utilisée dans cette réaction est de préférence préparée comme décrit dans les demandes de brevet précitées, par culture d'un champignon du genre Monascus et isolement de la Monacoline K à partir du milieu de culture.
La Monacoline K peut être isolée du milieu de culture et purifiée avant salification ou, plus avantageusement, la réaction de salification est effectuée au cours de l'isolement et la purification de la Monacoline K à partir du milieu de culture, de sorte que la Monacoline K est isolée sous la forme de son sel de métal désiré. Quelque soit la méthode adoptée, le sel métallique peut être isolé du milieu de réaction ou
du milieu de culture par des méthodes bien connues dans la technique y compris celles décrites ci-après en relation avec l'isolement des sels métalliques de la Monacoline K
à partir de cultures de champignons producteurs de sels de Monacoline K.
Les esters de la Monacoline K peuvent être préparés par simple estérification de la Monacoline K ou d'un dérivé réactif de celle-ci.La réaction peut être effectuée en faisant réagir un alcool de formule ROH (ou un dérivé
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ou l'acide correspondant, de préférence en présence d'un agent de déshydratation, par exemple un halogénure d'acide, comme le chlorure d'acétyle. Selon un autre mode de réalisation, les esters de la Monacoline K peuvent être préparés en faisant réagir un sel de la Monacoline K avec un halogénure de formule RX (dans laquelle R représenta un groupe alkyle substitué ou non substitué et X représente un atome d'halogène, de préférence un atome d'iode).
il est aussi possible de préparer directement les sels de la Monacoline K par culture d'un microorganisme producteur de sel de Monacoline K, du genre Monascus. Des microorganismes convenables qui peuvent être utilisés
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(IFO 8201) ; Monascus ruber SANK 11272 (.IFO 9203) ; Monascus ruber SANK 13778 (Ferm 4959) ; Monascus ruber SANK 15177 <EMI ID=21.1>
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(Ferm 4957). Tous ces microorganismes sont disponibles ,dans des collections reconnues de cultures, telles que désignées par les abréviations suivantes :
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Les souches préférées du genre Menasses qui peuvent être utilisées dans le procédé de l'invention, pour produire les sels de la Monacoline K, sont Monascus 'tuber SANK 10671,
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Monascus ruber SANK 15177 et Monascus ruber SANK 18174 sont tous des champignons récemment isolés du sol par la présente demanderesse, leurs propriétés microbiologiques
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Monascus ruber SANK 15177 (FERM 4956)
Cette souche a été isolée du sol à Tukimino, Yamato-city, préfecture de Kanagawa, Japon, et a été déposée le 27 avril 1979, sous le n[deg.] 4956,auprès du Fermentation Research Institute.
Cette souche croît bien sur un milieu pomme de terre-
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colorante soluble ayant une coloration brun-jaunâtre à brun-rougeâtre. Il se forme beaucoup de cléistothécies sur la couche basale des hyphes.
Sur un milieu farine d'avoine-agar, cette souche produit une substance colorante brun pâle et elle croît bien. La formation des cléistothécies est bonne : cellesci sont sphériques, d'un diamètre de 30 à 60 micromètres, et se forment sur de courts pédoncules. Ces pédoncules sont presque incolores et ramifiés, leurs dimensions étant de 25-60 x 3,5 � 5,0 micromètres. Les asques sont évanescents et par conséquent difficiles à observer. Les ascospores sont incolores et ellipsoïdales et leurs dimensions sont de 4,5-6,5 x 4,0 - 5,0 micromètres ; leurs surfaces sont lisses. Les conidies sont liées depuis leur sommet
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Leurs tissus sont rompus.
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meilleure croissance est observée entre 23 et 30[deg.]C.
Monascus ruber SANK 10671 (FERM 4958)
Cette souche a été isolée du sol à Shinagawa-ku, Tokyo, Japon, et a été déposée le 27 avril 1979 sous le n[deg.] 4958 auprès du Fermentation Research Institute.
La croissance sur les milieux pomme de terre-glucoseagar et farine d'avoine-agar est similaire à celle de la souche SANK 15177, sauf que la substance colorante soluble produite est rouge sombre.' Le diamètre des cléistothécies est de 30-80 micromètres et les dimensions des pédoncules sont de 30-70 x 3,0 - 5,0 micromètres. On n'observe pas d'asques. Les ascospores sont incolores et ellipsoïdales et leurs dimensions sont de 4,5-6,5 x 4,0 - 5,0 micromètres. Les conidies sont incolores et piriformes ou ovoïdes et leurs dimensions sont de 6,0 - 10,0 x 6,0 - 8,5 micromètres.
Monascus ruber SANK 13778- (FERM 4959) Cette souche a été isolée du sol à Inawashirocho Nagata, Yama-gun, Préfecture de Fukushima, Japon, et a été
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Fermentation Research Institute.
La croissance sur les milieux pomme de terre-
<EMI ID=30.1>
de la souche SANK 15177, sauf que la substance colorante soluble produite est de couleur brun-rougeâtre pâle à brun-rougeâtre. Les cléistothécies ont un diamètre de
35-75 micromètres et les pédoncules sont de 30-70 x 3,5-5,0 micromètres. On n'observe pas d'asques. Les ascospores sont incolores et ellipsoïdales et.leurs dimensions sont de 4,5-6,0 x 4,0-5,0 micromètres. Leurs surfaces
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x 6,0-10,0 micromètres.
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Cette souche a été isolée du sol à Shakotancho, Shakotan-gun, Shiribeshi'Shicho, Préfecture de Hokkaido, Japon, et a été déposée le 27 avril 1979, sous le n[deg.]4957, auprès du Fermentation Research Institute.
La croissance sur les milieux pomme de terreglucose - agar et farine d'avoine-agar est similaire à celle de la souche SANK 15177, sauf que la substance colorante produite est rose pâle. Les cléistothécies ont un diamètre de 20-70 micromètres et les dimensions des pédoncules sont de 20-60 x 3,0-5,0 micromètres. On n'observe pas d'asques. Les ascospores sont incolores et ellipsoïdales et leurs dimensions sont de 5,0-7,0 x 4,0-5,5 micromètres ; leurs surfaces sont lisses. Les conidies sont reliées entre elles depuis leur sommet et sont incolores ; la plupart d'entre elles sont piriformes et ont des dimensions de 6,0-9,5 x 6,0-10,0 microns.
Sur la base de l'observation des caractéristiques mentionnées plus haut,. ces microorganismes ont tous été identifiés comme étant des souches de Monascus ruber
van Tieghem.
<EMI ID=33.1>
et van Tieghem, Bull. Soc. Botan. France, 31, 227 (1884).
La production d'ascospores par la souche a été mentionnée par Cole et al dans le Canadian Journal of Botany, 46,
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arthrospores".
En plus des souches de champignons mentionnées plus haut, tous champignons du genre Monascus, y compri3 leurs variétés et les- souches obtenues par mutation, qui sont capables de produire des sels de Monacoline K, peuvent être utilisés dans le procédé de la présente invention.
Les sels de la Monacoline K peuvent être produits en cultivant le microorganisme choisi dans un milieu de culture, dans des conditions aérobies,en utilisant les techniques bien connues de culture de champignons et autres
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Monascus peut être tout d'abord cultivée sur un milieu convenable et les microorganismes produits peuvent être ensuite recueillis et inoculés dans un autre milieu de culture où ils sont cultivés pour produire le sel de Monacoline K désiré; le milieu de culture utilisé pour la multiplication du microorganisme et le milieu de culture utilisé pour la production du sel de Monacoline K peuvent être identiques
ou différents. Tout milieu de culture bien connu dans la technique pour la culture des champignons peut être utilisé, pourvu qu'il contienne, de manière en soi bien connue, les substances nutritives nécessaires, en particulier une
source de carbone assimilable et une source d'azote assimilable. Des exemples de sources convenables de carbone assimilable sont le glucose, le maltose, la dextrine, l'amidon, le lactose, le saccharose et la glycérine. Parmi ces sources, le glucose et la glycérine sont particulièrement appréciés pour la production des sels de la Monacoline K. Comme exemples de sources convenables
d'azote assimilable, on peut citer les peptones, l'extrait de viande, la levure, l'extrait de levure, la farine de soja, la farine de pois, la liqueur de mais macéré, le son de riz et les sources d'azote minéral. Parmi ces sources d'azote, les peptones sont tout particulièrement préférées. Lors de la production du sel de Monacoline K, on peut ajouter au milieu de culture, si nécessaire, un sel
minéral et/ou un sel métallique. De plus, si nécessaire -
une faible quantité d'un métal lourd peut aussi être ajoutée.
Pour la production des sels de la Monacoline K par fermentation avec un champignon du genre Monascus, il est important que soient présents, dans le milieu de culture ou dons
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du sel que l'on désire produire.
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cultute du microorganisme sur ur milieu pomme de terredextrose-agar (par exemple disponible auprès de Difco Company) et l'inoculer ensuite dans un autre milieu de culture où on le cultive pour produire le sel de Monacoline K désiré. Le microorganisme est de préférence cultivé dans des conditions aérobies, en utilisant des méthodes de culture Bien connues dans la technique, par exemple la culture sur solide, la culture sous agitation ou la culture sous aération et agitation. Le microorganisme croît sur un intervalle étendu de températures, par exemple de 7 à 35[deg.]C,
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de produire de la Monacoline K ou l'un de ses sels, la
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Pendant la culture du microorganisme, la production du sel de Monacoline K peut être régulée par prélèvement d'échantillons du milieu de culture et mesure de l'activité physiologique du sel de Monacoline K dans le milieu de culture selon les essais décrits plus loin. La culture peut être poursuivie jusqu'à obtention d'une accumulation importante du sel de Monacoline K dans le milieu de culture et ce sel peut être isolé à ce moment et extrait du milieu de culture et des tissus du microorganisme par toute combinaison convenable de techniques d'isolement choisie eu égard à ses propriétés physiques et chimiques.
Par exemple, on peut utiliser tout ou partie des techniques d'isolement suivantes : extraction de la liqueur à partir du milieu de culture au moyen d'un solvant hydrophile
(comme l'éther diéthylique, l'acétate d'éthyle ou le chloroforme) extraction du microorganisme avec un solvant hydrophile (,comme l'acétone ou un alcool) ; concentration, par exemple par évaporation de tout ou partie du solvant sous pression réduite ; dissolution dans un solvant davantage polaire (comme l'acétone ou un alcool);enlèvement des impuretés avec un solvant moins polaire (comme l'éther de pétrole ou l'hexane) ,; filtration sur gel à travers une colonne garnie d'une substance comme le Sephadex (dénomination commerciale d'une substance disponible auprès de la Pharmacea Co.
Limited, Etats-Unis d'Amérique) ; chromatographie d'absorption avec du charbon actif ou un gel de silice ; chromatographie liquide rapide ; conversion en la Monacoline K elle-même ou en l'acide correspondant ; purification directe sous la forme du sel métallique ; et autres méthodes similaires. En utilisant une combinaison conve,nable de ces techniques, le sel de Monacoline K désiré
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substance pure.
Comme décrit dans la demande de brevet précitée , la Monacoline K elle-même peut être aussi produite en utilisant les microorganismes et les techniques décrits ci-dessus.
L'activité physiologique des sels et des esters
de la Monacoline K peut être évaluée et déterminée quantitativement par les essais suivants qui peuvent être aussi utilisés sous forme modifiée .pour réguler ou diriger la production des sels
de Monacoline K au cours du procédé de fermentation selon la présente invention.
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Tout comme la Monacoline K elle-même, les sels et esters de la Monacoline K inhibent spéciquement l'activité de la 3-hydroxy-3-méthylglutaryl-CoA réductase, qui est l'enzyme de détermination de la vitesse dans la biosynthèse
J
du cholestérol. Le tableau I ci-après donne les concentrations (en ng/ml) des composés de l'invention qui inhibent
<EMI ID=42.1>
CoA réductase ^mesurée par la méthode décrite dans Analytical Biochemestry, 31, 383 (19692.7 et les concentra-
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de 50 % la biosynthèse du cholestérol �mesure effectuée selon la méthode du Journal of Biological Chemistry, 247,
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correspondants pour le composé connu ML-236B (qui est un composé connu comme ayant un type similaire d'activité et qui est obtenu en cultivant des microorganismes du genre Pénicillium, comme décrit dans le brevet britannique n[deg.]
1 453 425, au nom de la présente demanderesse). On donne aussi la concentration de Monacoline K qui inhibe de 50 % la biosynthèse du cholestérol. On peut constater que, tandis que la concentration de ML-236B requise pour inhiber
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centration correspondante pour les esters de la Monacoline K est de l'ordre de 1 ng/ml (c'est-à-dire que le pouvoir d'inhibition est d'environ 10 fois plus élevé) et la concentration correspondante pour le sel de sodium de la Monacoline K est d'environ 0,14 ng/ml (pouvoir d'inhibition environ 70 fois plus élevé). Les activités des sels et des esters de la Monacoline K sont comparables à ou plus élevées que celles de la Monacoline K elle-même.
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2. Réduction des taux de cholestérol sanguin
Les animaux utilisés dans cet essai sont du* rais de la souche Wistar Imamichi, pesant chacun environ 300 g. Les essais sont effectués sur plusieurs groupes de rats comportar.t chacun 5 animaux. Chaque animal reçoit une in-
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(dénomination commerciale d'une substance connue pour accroître le taux du cholestérol sanguin) tandis qu'on lui administre simultanément, par voie orale, l'un des composés mentionnés sur le tableau II suivant, en la quantité indiquée sur ce tableau. 20 heures après l'administration orale les rats sont sacrifiés- en les saignant ; on recueille le sang et le foie et on détermine, par des moyens usuels,
les taux de cholestérol. Les résultats sont rapportés dans
le tableau II qui donne la réduction des taux de cholestérol dans ;le. sang et le foie .par. comparaison avec un groupe témoin de ra auxquels on a seulement administré du Triton WR-1339.
Dans un but de comparaison, on donne les résultats correspondants pour la Monacoline K elle-même et pour le composé ML-236B,,. mais ces composés ont été administrés en des doses nettement supérieures à celles utilisées pour
les composés de l'invention afin d'obtenir une réduction comparable des taux de cholestérol.
TABLEAU II
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La réduction du taux de cholestérol du sang ou du foie est donnée par la formule :
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où : A est le taux dans le groupe traité seulement par le
Triton WR-1339
B est le taux dans le groupe témoin non traité
C est le taux dans le groupe soumis à l'essai.
3. Toxicité aiguë
Les composés soumis aux essais sont les esters de méthyle, d'éthyle, de butyle, et de benzyle et les sels de sodium et de calcium de la Monacoline K. On a trouvé que
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de ces composés ,est d'au moins 2000 mg/kg par administration
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péritonéale. Ainsi, ces composés présentent une très faible toxicité.
Ces résultats démontrent que les composes de l'invention inhibent la biosynthèse du cholestérol et, par conséquent, diminuent le taux de cholestérol dans le sang. Ils constituent par conséquent des médicaments précieux pour le traitement de l'hyperlipémie et de l'artériosclérose.
Les composés de l'invention peuvent être administrés oralement ou parentéralement sous la forme
de capsules, de comprimés, de préparations injectables ou .de toute autre formulation connue, quoique leur administration orale soit normalement préférée.La dose varie en fonction de l'âge et du poids du corps du patient, ainsi que de la, gravité de l'état, mais, en, général, la dose journalière pour un adulte est de préférence de 0,1
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<EMI ID=54.1>
encore de 0,5 à 10 mg dans le cas des esters de la Monocoline K.
La préparation des composés de l'invention est
<EMI ID=55.1> titre non limitatif.
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Sel de sodium de la Monacoline K
300 litres d'un milieu de culture présentant un pH de 5,5 avant stérilisation et contenant 5 % en poids/ volume de glucose, 0,5 % en poids/volume de liqueur de
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tion commerciale Kyokuto, disponible auprès de Kyokuto Seiyaku KK, Japon) et 0,5 % en poids/volume de chlorure d'ammonium sont introduits dans un fermenteur de 600 litres,
<EMI ID=58.1>
18174 (Ferm. 4957) dans ce milieu. La culture du micro-
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un débit d'aération de 300 litres par minute et une agitation à raison de 190 tours par minute. Au bout de cette durée, on règle le pH du milieu de culture contenant le microorganisme à une valeur de 3,4 par addition d'acide chlorhydrique 6N, puis on le soumet à une extraction avec
800 litres de méthanol.
On ajoute 6 kg d'Hyflo Super Cel et on filtre ensuite l'extrait, en utilisant un filtre-presse, pour obtenir 1100 litres d'extrait méthanolique. Cet extrait est lavé avec 200 litres d'une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium et ensuite avec 180 litres d'ëthylcyclohexane. La solution résultante est soumise à une extraction avec 600 litres de dichlorure d'éthylène. On <EMI ID=60.1> le dichlorure d'éthylène et on laisse réagir à 80[deg.] C .pendant
30 minutes. On lave ensuite, successivement le mélange réactionnel avec 200 litres d'une solution aqueuse à 2 %
en poids/volume de bicarbonate de sodium et avec 200
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de chlorure de sodium. Le mélange est ensuite concentré par évaporation sous pression réduite, ce qui donne 135 g d'une substance huileuse.
Cette substance huileuse est dissoute dans
400 ml de méthanol. 20 ml de la solution méthanolique résultante (contenant 6,8, g de l'huile) sont ensuite soumis à une chromatographie liquide rapide de préparation en utilisant l'appareillage dénommé "System 500" de Waters Co. Limited, équipé d'une colonne de Prepac C18
(colonne en phase inversée). On utilise un mélange
85:15 en volume de méthanol et d'eau, en tant qu'agent de développement. Le développement est effectué à un débit
<EMI ID=62.1>
minutes) ; on observe les indications d'un réfractomètre différentiel relié à la masse et. on sépare la fraction donnant le pic principal sur le réfractomètre différentiel. On répète cette opération, on recueille les fractions résultantes correspondant au pic principal et on les concentre pour obtenir 10,2 g d'une substance huileuse. Cette substance huileuse est dissoute dans 30 ml de méthanol et on soumet à nouveau 6 ml de la solution méthanolique (contenant environ 2 g de l'huile) à la même chromatographie liquide rapide de préparation ; on
<EMI ID=63.1>
et d'eau, à un débit de 200 ml/minute. On sépare la fraction présentant le pic principal. On répète cette opéra-
<EMI ID=64.1>
pondants au pic principal. Le résidu est traité par du méthanol aqueux pour donner 1170 mg de cristaux bruts, lesquels sont recristallisés plusieurs fois dans l'éthanol, ce qui donne 864 mg de cristaux.
<EMI ID=65.1>
dant 3 heures. On sépare les insolubles par filtration et on lyophilise le filtrat pour obtenir 900 mg du sel de sodium de la Monacoline K, qui présente les propriétés suivantes :
2. Analyse élémentaire
<EMI ID=66.1>
3. Poids moléculaire ;
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5. Spectre d'absorption ultraviolette :
Comme le montre la figure 1 des dessins ci-joints,
<EMI ID=68.1>
<EMI ID=69.1>
6. Spectre d'absorption infrarouge (comprimé de KBr) :
Comme le montre la figure 2 des dessins ci.joints.
7. Spectre de résonance magnétique nucléaire (D20) .
Comme le montre la figure 3 des dessins ci-joints.
8. Chromatographie rapide en phase liquide :
Durée de séjour : 8,5 minutes ;
Garnissage de la colonne : Microbondapac C18 ; Méthanol aqueux à 60 % en volume/volume + 0,1 %
de PIC-A (produit de Waters Co. Limited) ;
Débit : 1,5 ml/minute.
Comme le montre la figure 4 des dessins ci-joints.
9. Solubilité :
Soluble dans l'eau ; insoluble dans les solvants organiques.
10. Pouvoir rotatoire spécifique :
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EXEMPLE 2
Sel de sodium de la Monacoline K
300 litres d'un milieu de culture présentant un pH de 7,4 avant stérilisation et contenant 1,5 % en poids/ volume d'amidon soluble, 1,5 % en poids/volume de glycérine, 2,0 % en poids/volume de farine de poisson et 0,2 % en poids/volume de carbonate de calcium sont introduits dans un ferménteur de 600 litres ; le microorganisme
<EMI ID=71.1>
ce milieu. La culture du microorganisme est effectuée pendant 120 heures à 26[deg.]C, avec un débit d'aération de
300 litres par minute, sous agitation à raison de 190 tours par minute. Le -milieu de culture est ensuite filtré en utilisant -un filtre-presse, pour donner 35 kg
(poids humide) de microorganisme.
On y ajoute 100 litres d'eau et on règle la valeur du pH du mélange à 12 par addition d'hydroxyde de sodium, sous agitation. Le mélange est ensuite laissé à la température ambiante pendant une heure, après quoi on y ajoute
<EMI ID=72.1>
un filtre-presse. Le pH du filtrat est réglé à la valeur de 10 par addition d'acide chlorhydrique et le mélange résultant est-.ensuite adsorbé sur une colonne contenant
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d'eau puis avec 15 litres d'une solution aqueuse à 10 en volume/volume de méthanol. La colonne est ensuite éluée avec du méthanol aqueux à 90 % en volume/volume. L'éluat est concentré jusqu'à un volume d'environ 10 litres et son pH est ensuite réglé à la valeur 2 par addition d'acide chlorhydrique; le mélange est alors soumis à une extraction par l'acétate d'éthyle. L'extrait est lavé avec une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium, séché
sur du sulfate de sodium anhydre et ensuite concentré
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substance huileuse contenant l'acide de la Monacoline K. On ajoute du méthanol à cette substance huileuse, en quantité suffisante pour obtenir un volume total de 100 ml. On soumet 20 ml de la solution résultante à une chromatographie liquide rapide de préparation en utilisant une colonne à. phase inversée (comme décrit dans l'exemple 1); on élue avec une solution aqueuse à 20 % en volume/volume de méthanol (contenant 2 % d'acide acétique),à. un débit .de 200 ml/minute. La fraction présentant le pic principa..
<EMI ID=75.1>
tes). Les 80 ml restants de la solution méthanolique sont ensuite traites par le même processus. Les fractions résultantes correspondant au pic principal sont recueillies, concentrées et extraites par l'acétate d'éthyle.
L'extrait est concentré jusqu'à, siccité, après addition d'heptane- pour donner 1,2 � d'une substance huileuse.
Cette substance huileuse est dissoute dans 20 ml de méthanol et est ensuite soumise à une chromatographie liquide rapide, comme décrit ci-dessus, pour donner 150 mg d'acide de la Monacoline K. On yajoute 2 ml de méthanol et
100 ml d'eau et on règle le pH de la solution résultante
<EMI ID=76.1>
qui donne une solution aqueuse claire. On fait passer cette solution à travers une colonne contenant 10 ml de résine
<EMI ID=77.1>
avec du méthanol aqueux à 80 % en volume/volume. L'éluat est lyophilisé pour donnet 130 mg du sel de sodium de la
<EMI ID=78.1>
priétés du produit sont identiques à celles données pour le produit de l'exemple 1.
EXEMPLE 3
<EMI ID=79.1>
On répète la culture, l'extraction, la concentration, le chromatographie liquide rapide de préparation,
et la recristallisation dans l'éthanol, comme décrit dans l'exemple 1. 500 mg des cristaux résultants sont ensuite dissous dans 50 ml de chlorure de méthylène et la solution résultante est filtrée à. travers un filtre à pores très fins. 20 ml d'une solution aqueuse saturée d'hydroxyde de calcium sont ajoutés au filtrat et le mélange est ensuite énergiquement agité à. la température ambiante. Toutes les fois que le pH de la solution décroît pour venir en dessous de 8, on ajoute 'une nouvelle portion de 10 ml d'une solu-tion aqueuse saturée d'hydroxyde de sodium et on poursuit l'agitation. Lorsque le pH ne diminue plus (après addition d'une quantité totale de 50 ml de la solution aqueuse d'hydroxyde de calcium), on ajoute de l'eau distillée et on place la totalité de la solution dans un entonnoir à décantation.
On recueille la phase organique et on sépare le solvant par distillation. Le résidu est traité par l'héptane et une poudre est ensuite obtenue en soumettant le mélange à des -ultrasons. La poudre est filtrée et
échée pour donner 450 mg du sel de calcium de la Monacoline K, sous la forme d'une poudre blanche,
Ce sel de calcium présente les propriétés suivantes:
1. Poids moléculaire :
882 (par spectrométrie de masse)
2. Formule brute :
<EMI ID=80.1>
3. Point de fusion :
<EMI ID=81.1>
4. Pouvoir- rotatoire spécifique
<EMI ID=82.1>
- -
5. Spectre d'absorption infrarouge (KBr) :
Comme le montre la figure 5 des dessins ci-joints.
<EMI ID=83.1>
Comme le montre la figure 6 des dessins ci-joints.
EXEMPLE 4
Ester méthylique de la Monacoline K
On répète les processus de culture, extraction, concentration, chromatographie liquide rapide de préparation et recristallisation dans l'éthanol, comme décrit dans l'exemple 1, pour obtenir 864 mg de Monacoline K. On dissout
200 mg de cette Monacoline K dans 20 ml de méthanol (qui a été préalablement déshydraté avec le tamis moléculaire 3A). Après addition de quelques gouttes de chlorure d'acétyle, la solution est agitée à la température ambiante pendant
3 heures. Le solvant est séparé par distillation et le résidu est soumis à une extraction avec 50 ml d'acétate
<EMI ID=84.1>
"'" tion aqueuse à 2 % en poids/volume de bicarbonate de sodium et une solution aqueuse saturée de chlorure de sddium, puis il est séché sur du sulfate de sodium anhydre, après quoi le solvant est séparé par distilla-" tion. Le résidu est adsorbé sur une colonne contenant
<EMI ID=85.1>
ment traité par du benzène. Les fractions éluées avec un mélange 6 : 94 en volume d'acétate d'éthyle et de benzène sont recueillies et le solvant est séparé par distillation, ce qui donne 65 mg de l'ester méthylique de la Monacoline K, sous la forme d'une huile incolore.
, Ce produit présente les propriétés suivantes :
1. Poids moléculaire :
436,6 (par spectrométrie de masse)
2. Formule brute ;
<EMI ID=86.1>
<EMI ID=87.1>
4. Spectre d'absorption infrarouge
Comme le montre la figure 7 des dessins ci-joints.
5. Spectre de résonance magnétique nucléaire :
Comme le montre la figure 8 des dessins ci-joints,.
EXEMPLE 5
Ester méthylique de la Monacoline K
On prépare le sel de sodium de la Monacoline K en procédant comme décrit dans l'exemple 2. On dissout ensuite 100 mg de ce sel de sodium dans 2 ml de.sulfoxyde
<EMI ID=88.1>
de méthyle à la solution. La solution est ensuite soumise
<EMI ID=89.1>
dans un récipient de réaction équipé d'un condenseur à reflux. Le mélange réactionnel est ensuite dilué avec
5 ml d'eau et soumis à une extraction avec 10 ml de chlorure de méthylène. Le solvant est chassé de l'extrait par distillation et: le résidu est adsorbé sur une colonne conte-nant 10 g de gel de silice (Wakogel C-100) qui a été préalablement traité par du benzène. Les fractions éluées avec un mélange 4:96 en volume d'acétate d'éthyle et de benzène sont recueillies et le solvant est chasse par distillation, ce qui donne 35 mg de l'ester méthylique de la Monacoline K, sous la forme d'une Huile.
-EXEMPLE 6
<EMI ID=90.1>
préalablement déshydraté à l'aide du tamis moléculaire 3A et on ajoute quelques gouttes de chlorure d'acétyle à la solution. Le mélange est ensuite agité à la température ambiante pendant 3 heures, puis le solvant est chassé par distillation et le résidu est soumis à une extraction
avec 50 ml d'acétate d'éthyle. L'extrait est lavé successivement avec une solution aqueuse à 2 % en poids/volume de bicarbonate de sodium et avec une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium, puis il est séché sur du sulfate de sodium anhydre. Après séparation du solvant par distillation, le résidu est adsorbé sur une colonne
<EMI ID=91.1>
préalablement traité par du benzène. Les fractions éluées avec un mélange 6:94 en volume d'acétate d'éthyle et de benzène sont recueillies et le solvant est chassé par distillation, ce qui donne 30 mg de l'ester éthylique de la Monacoline K, sous la forme d'une huile incolore.
Les propriétés de ce composé sont les suivantes :
1. poids moléculaire:
450,6 (par spectrométrie de masse)
2. Formule brute :
<EMI ID=92.1>
Comme le montre la figure 9 des dessins ci-joints.
4. Spectre de résonance magnétique nucléaire :
Comme le contre la figure 10 des dessins ci-joints.
EXEMPLE 7
Ester butylique de la Monacoline K
On dissout 200 mg de Monacoline K (préparée comme décrit dans l'exemple 1).dans 20 ml de méthanol qui a été préalablement déshydraté avec le tamis moléculaire 3A.
Après addition de quelques gouttes de chlorure d'acétyle à la solution, le mélange résultant est agité à la tempéra-
<EMI ID=93.1>
chassé par distillation et le résidu est soumis à une extraction avec 50 ml d'acétate d'éthyle. L'extrait est lavé successivement avec une solution aqueuse à 2 % en poids/volume de bicarbonate de sodium et une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium. La solution est ensuite séchée sur du sulfate de sodium anhydre et le solvant est chassé par distillation. Le résidu est adsorbé sur une
<EMI ID=94.1>
a été préalablement traité par du benzène. Les fractions éluées avec un mélange 4 ; 96 en volume d'acétate d'éthyle et de benzène sont recueillies et le solvant est chassé par distillation, ce qui donne 80 mg de l'ester butylique de la Monacoline K, sous la forme d'une huile incolore.
Ce composé présente les propriétés suivantes :
1. Poids moléculaire :
478,7 (par spectrométrie de masse).
2. Formule brute :
<EMI ID=95.1>
Comme le montre la figure 11 des dessins ci-joints.
<EMI ID=96.1>
Comme le montre la figure 12 des dessins ci-joints.
EXEMPLE 8
Ester benzylique de la Monacoline K
On dissout 200 mg de Monacoline K (préparée comme décrit dans l'exemple 1) dans 20 ml d'alcool benzylique qui a été préalablement déshydraté au moyen du tamis moléculaire 3A. Après addition de quelques gouttes de chlorure d'acétyle à. la solution, le mélange résultant est agité à la température ambiante pendant 3 heures. Le solvant est ensuite chassé par distillation et le résidu
<EMI ID=97.1>
L'extrait est lavé successivement avec une solution aqueuse à 2 % en poids/volume de bicarbonate de sodium
et avec une- solution aqueuse saturée de chlorure de sodium. La solution est ensuite sêchée sur du sulfate de sodium anhydre et le solvant est chassé par distillation. Le résidu est adsorbé sur une colonne contenant 10 g de gel de silice (Wakogel C-100) qui a été préalablement traité par du benzène. lies fractions éluées avec un mélange 4 :96 en volume d'acétate d'éthyle et de benzène sont recueillies et le solvant est chassé par distillation, ce qui donne
70 mg de l'ester benzylique de la Monacoline K, sous la forme d'une huile incolore.
Les propriétés de ce composé sont les suivantes :
1. Poids moléculaire :
<EMI ID=98.1>
2. Formule brute :
C31H44C6.
3. Spectre d'absorption infrarouge (CHC1-) :
<EMI ID=99.1>
joints.
<EMI ID=100.1>
<EMI ID=101.1>
joints.
REVENDICATIONS
1. Composés utiles comme agents anti-hypercholes�
<EMI ID=102.1>
par des dérivés de la Monacoline K répondant à la formule :
<EMI ID=103.1>
dans laquelle :
R représente un atome métallique ou un groupe alkyle substitué ou non substitué ; et
- n est l'inverse de la valence de l'atome ou du groupe représenté par R.
<EMI ID = 1.1>
and their application in therapy.
The present invention relates to salts and esters of the free acid corresponding to the lactone called Monacoline K, the processes for their preparation and their
<EMI ID = 2.1>
British patent application No. [deg.] 8,005,748, in the name of the present Applicant, describes Monacoline K and its preparation using microorganisms of the genus Monascus, in particular the strain 1005 (FERM 4822) of Monascus ruber. This British request discloses the valuable and unexpected activity of the Monacoline K as
<EMI ID = 3.1>
subsequent British n [deg.] 8 007 240 describes the preparation of Monacoline K by culture of various other microorganisms of the genus Monascus. It has now been found that the salts and esters of the free acid, of which Monacoline K is the lactone, exhibit anti-hyperchole activity.
<EMI ID = 4.1>
comparable or better. For convenience, these compounds are referred to herein as "Monacoline K salts or esters". It is understood that this expression refers to the salts and esters of the acid of which Monacoline K is the lactone.
The salts and esters of Monacoline K which are the subject of the present invention correspond to the formula:
<EMI ID = 5.1>
in which :
- R represents a substituted or unsubstituted alkyl group or a metal atom; and - n is the inverse of the valence of the group or atom represented by R.
The invention also relates to a process for preparing the salts and esters of Monacoline K. by salification or esterification of Monacoline A or of a reactive derivative thereof.
<EMI ID = 6.1>
<EMI ID = 7.1>
Monacoline K, and separation of said Monacoline A salt from the culture medium.
The salts of Monacoline K to which the present invention applies are the metal salts and, preferably, the alkali metal salts, such as the sodium or potassium salts, the alkaline earth metal salts such as the calcium or magnesium salts, the salts of the metals of Group Lira of the Periodic Table of the Elements, such as the aluminum salt, and the salts of transition metals of Groups Ib, IIb and VIII of the Periodic Table of the Elements, such as the salts of iron and nickel , cobalt, copper and zinc. Among these metal salts, the alkali metal salts, the alkaline earth metal salts and the aluminum salt are those which are preferred, the sodium, calcium and aluminum salts being very particularly preferred.
Monacoline K salts can be easily converted to Monacoline K itself, or to the acid
<EMI ID = 8.1>
Monacoline K: resulting or the corresponding acid can be transformed again into a salt in the presence of an alkaline substance, for example an alkali metal hydroxide or carbonate. These transformations can be carried out quantitatively, repeatedly. It has been found that the transformation of Monacoline K, or of the corresponding acid, into a metal salt or vice versa, is
<EMI ID = 9.1> substances. The determining pH value is around 5.0.
As long as metal ions are available, the Monacoline
<EMI ID = 10.1>
<EMI ID = 11.1>
less than 5.0, Monacoline K itself, the acid corresponding to Monacoline K or a mixture of these two
<EMI ID = 12.1>
The Monacoline K esters according to the present invention are those of the compounds of the above formula for which R represents a substituted or unsubstituted alkyl group. When R represents an unsubstituted alkyl group, this can be a chain group
straight or branched chain, preferably up to
8 carbon atoms. As examples of such alkyl groups represented by R, mention may be made of methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl and hexyl groups.
When R represents a substituted alkyl group, the substituent can be chosen, as is well known in this technique, from a wide range of groups and atoms, including in particular aryl groups, acyl groups (in particular arylcarbonyl groups), alkoxy groups, halogen atoms and hydroxy groups. Particularly preferred substituents are aryl groups and arylcarbonyl groups, i.e. those where R represents an aralkyl group or an arylcarbonylalkyl group.
When R represents an aralkyl group, this is preferably a substituted or unsubstituted benzyl group. The substituted benzyl groups preferably comprise one or more substituents chosen from alkyl groups, alkoxy groups and halogen atoms. As examples of such benzyl groups, one can
<EMI ID = 13.1>
benzyl, 2-bromobenzyl, 3-bromobenzyl or 4-bromobenzyl.
When R represents an arylcarbonylal- group
<EMI ID = 14.1>
The substituted phenacyl groups preferably comprise one or more substituents chosen from alkyl groups, alkoxy groups and halogen atoms.
As examples of such phenacyl groups, mention may be made of phenacyl, 2-methylphenacyl, 3-methylphenacyl,
<EMI ID = 15.1>
4-chlorophenacyl, 2-bromophenacyl, 3-bromophenacyl or 4-bromophen.acyle.
Among the esters, methyl, ethyl, butyl and benzyl esters are particularly preferred.
The salts and esters of Monacoline K according to the present invention can be easily prepared
by salification or esterification of Monacoline K itself or of a reactive derivative of Monacoline K. Examples of suitable reactive derivatives include the acid corresponding to Monacoline K and, in the case of the preparation of esters, the salts of Monacoline K (for example the classes of salts described above, in particular the sodium, potassium, calcium, magnesium, aluminum, iron, zinc, copper, nickel or cobalt salt).
<EMI ID = 16.1>
by simple reaction of Monacoline K or the corresponding acid with an oxide, hydroxide, carbonate or bicarbonate, preferably a hydroxide or carbonate of the chosen metal. Steps must be taken to have the reaction carried out at a pH value greater than 5.0 and preferably 7.0 to assure complete conversion of the Monacoline K or the corresponding acid to the desired salt. The Monacoline K used in this reaction is preferably prepared as described in the abovementioned patent applications, by culture of a fungus of the genus Monascus and isolation of Monacoline K from the culture medium.
Monacoline K can be isolated from the culture medium and purified before salification or, more advantageously, the salification reaction is carried out during the isolation and purification of Monacoline K from the culture medium, so that Monacoline K is isolated in the form of its desired metal salt. Whichever method is adopted, the metal salt can be isolated from the reaction medium or
of the culture medium by methods well known in the art including those described below in connection with the isolation of the metal salts of Monacoline K
from cultures of mushrooms producing Monacoline K salts.
Monacoline K esters can be prepared by simple esterification of Monacoline K or a reactive derivative thereof. The reaction can be carried out by reacting an alcohol of formula ROH (or a derivative
<EMI ID = 17.1>
or the corresponding acid, preferably in the presence of a dehydrating agent, for example an acid halide, such as acetyl chloride. According to another embodiment, the esters of Monacoline K can be prepared by reacting a salt of Monacoline K with a halide of formula RX (in which R represents a substituted or unsubstituted alkyl group and X represents an atom of halogen, preferably an iodine atom).
it is also possible to directly prepare the salts of Monacoline K by culture of a salt-producing microorganism of Monacoline K, of the genus Monascus. Suitable microorganisms that can be used
<EMI ID = 18.1>
<EMI ID = 19.1>
<EMI ID = 20.1>
(IFO 8201); Monascus ruber SANK 11272 (.IFO 9203); Monascus ruber SANK 13778 (Ferm 4959); Monascus ruber SANK 15177 <EMI ID = 21.1>
<EMI ID = 22.1>
(Ferm 4957). All these microorganisms are available, in recognized collections of cultures, as designated by the following abbreviations:
<EMI ID = 23.1>
The preferred strains of the genus Menasses which can be used in the process of the invention, to produce the salts of Monacoline K, are Monascus' tuber SANK 10671,
<EMI ID = 24.1>
Monascus ruber SANK 15177 and Monascus ruber SANK 18174 are all fungi recently isolated from the ground by the present applicant, their microbiological properties
<EMI ID = 25.1>
Monascus ruber SANK 15177 (FERM 4956)
This strain was isolated from the soil in Tukimino, Yamato-city, Kanagawa prefecture, Japan, and was deposited on April 27, 1979, under the number [deg.] 4956, with the Fermentation Research Institute.
This strain grows well on a potato medium-
<EMI ID = 26.1>
soluble dye with a yellowish brown to reddish brown coloring. Many cleistothecia are formed on the basal layer of the hyphae.
On an oatmeal-agar medium, this strain produces a pale brown coloring substance and it grows well. The formation of cleistothecia is good: these are spherical, with a diameter of 30 to 60 micrometers, and are formed on short peduncles. These peduncles are almost colorless and branched, their dimensions being 25-60 x 3.5 # 5.0 micrometers. The asci are evanescent and therefore difficult to observe. The ascospores are colorless and ellipsoidal and their dimensions are 4.5-6.5 x 4.0 - 5.0 microns; their surfaces are smooth. Conidia are linked from their top
<EMI ID = 27.1>
Their tissues are broken.
<EMI ID = 28.1>
best growth is observed between 23 and 30 [deg.] C.
Monascus ruber SANK 10671 (FERM 4958)
This strain was isolated from the soil at Shinagawa-ku, Tokyo, Japan, and was deposited on April 27, 1979 under number [deg.] 4958 with the Fermentation Research Institute.
The growth on the potato-glucoseagar and oatmeal-agar medium is similar to that of the SANK 15177 strain, except that the soluble coloring substance produced is dark red. ' The diameter of the cleistothecia is 30-80 micrometers and the dimensions of the peduncles are 30-70 x 3.0 - 5.0 micrometers. We do not observe asci. The ascospores are colorless and ellipsoidal and their dimensions are 4.5-6.5 x 4.0 - 5.0 micrometers. The conidia are colorless and piriform or ovoid and their dimensions are 6.0 - 10.0 x 6.0 - 8.5 micrometers.
Monascus ruber SANK 13778- (FERM 4959) This strain was isolated from the ground at Inawashirocho Nagata, Yama-gun, Fukushima Prefecture, Japan, and was
<EMI ID = 29.1>
Fermentation Research Institute.
Growth in potato circles-
<EMI ID = 30.1>
SANK 15177, except that the soluble coloring substance produced is pale reddish brown to reddish brown in color. Cleistothecia have a diameter of
35-75 micrometers and the peduncles are 30-70 x 3.5-5.0 micrometers. We do not observe asci. The ascospores are colorless and ellipsoidal and their dimensions are 4.5-6.0 x 4.0-5.0 microns. Their surfaces
<EMI ID = 31.1>
x 6.0-10.0 micrometers.
<EMI ID = 32.1>
This strain was isolated from the soil at Shakotancho, Shakotan-gun, Shiribeshi'Shicho, Hokkaido Prefecture, Japan, and was deposited on April 27, 1979, under number [deg.] 4957, with the Fermentation Research Institute.
Growth on potato glucose - agar and oatmeal-agar media is similar to that of strain SANK 15177, except that the coloring substance produced is pale pink. Cleistothecia have a diameter of 20-70 micrometers and the dimensions of the peduncles are 20-60 x 3.0-5.0 micrometers. We do not observe asci. The ascospores are colorless and ellipsoidal and their dimensions are 5.0-7.0 x 4.0-5.5 micrometers; their surfaces are smooth. Conidia are interconnected from the top and are colorless; most of them are piriform and have dimensions of 6.0-9.5 x 6.0-10.0 microns.
Based on the observation of the characteristics mentioned above ,. these microorganisms have all been identified as strains of Monascus ruber
van Tieghem.
<EMI ID = 33.1>
and van Tieghem, Bull. Soc. Botan. France, 31, 227 (1884).
The production of ascospores by the strain was mentioned by Cole et al in the Canadian Journal of Botany, 46,
<EMI ID = 34.1>
arthrospores ".
In addition to the strains of fungi mentioned above, all fungi of the genus Monascus, including their varieties and the strains obtained by mutation, which are capable of producing salts of Monacoline K, can be used in the process of the present invention.
The salts of Monacoline K can be produced by cultivating the microorganism chosen in a culture medium, under aerobic conditions, using well-known techniques for cultivating mushrooms and the like.
<EMI ID = 35.1>
Monascus can first be cultivated on a suitable medium and the microorganisms produced can then be collected and inoculated in another culture medium where they are cultivated to produce the desired Monacoline K salt; the culture medium used for the multiplication of the microorganism and the culture medium used for the production of the salt of Monacoline K may be identical
or different. Any culture medium well known in the art for cultivating mushrooms can be used, provided that it contains, in a manner which is well known per se, the necessary nutrients, in particular a
source of assimilable carbon and source of assimilable nitrogen. Examples of suitable sources of assimilable carbon are glucose, maltose, dextrin, starch, lactose, sucrose and glycerin. Among these sources, glucose and glycerin are particularly appreciated for the production of Monacoline K salts. As examples of suitable sources
assimilable nitrogen, there may be mentioned peptones, meat extract, yeast, yeast extract, soy flour, pea flour, macerated corn liquor, rice bran and sources of 'mineral nitrogen. Among these sources of nitrogen, peptones are very particularly preferred. During the production of Monacoline K salt, a salt can be added to the culture medium, if necessary.
mineral and / or a metal salt. In addition, if necessary -
a small amount of a heavy metal can also be added.
For the production of Monacoline K salts by fermentation with a fungus of the genus Monascus, it is important that they are present in the culture medium or donations
<EMI ID = 36.1>
salt you want to produce.
<EMI ID = 37.1>
cultivates microorganism on a medium of terredextrose-agar apple (for example available from Difco Company) and then inoculate it in another culture medium where it is cultivated to produce the desired Monacoline K salt. The microorganism is preferably cultivated under aerobic conditions, using culture methods well known in the art, for example culture on solid, culture with stirring or culture with aeration and stirring. The microorganism grows over a wide range of temperatures, for example from 7 to 35 [deg.] C,
<EMI ID = 38.1>
to produce Monacoline K or one of its salts, the
<EMI ID = 39.1>
During the culture of the microorganism, the production of the Monacoline K salt can be regulated by taking samples of the culture medium and measuring the physiological activity of the Monacoline K salt in the culture medium according to the tests described below. The culture can be continued until a significant accumulation of the Monacoline K salt is obtained in the culture medium and this salt can be isolated at this time and extracted from the culture medium and from the tissues of the microorganism by any suitable combination of techniques. of isolation chosen having regard to its physical and chemical properties.
For example, all or part of the following isolation techniques can be used: extraction of the liquor from the culture medium using a hydrophilic solvent
(such as diethyl ether, ethyl acetate or chloroform) extraction of the microorganism with a hydrophilic solvent (such as acetone or an alcohol); concentration, for example by evaporation of all or part of the solvent under reduced pressure; dissolution in a more polar solvent (such as acetone or an alcohol); removal of impurities with a less polar solvent (such as petroleum ether or hexane); gel filtration through a column packed with a substance such as Sephadex (trade name of a substance available from the Pharmacea Co.
Limited, United States of America); absorption chromatography with activated carbon or silica gel; rapid liquid chromatography; conversion into Monacoline K itself or the corresponding acid; direct purification in the form of the metal salt; and other similar methods. Using a suitable combination of these techniques, the desired Monacoline K salt
<EMI ID = 40.1>
pure substance.
As described in the aforementioned patent application, Monacoline K itself can also be produced using the microorganisms and techniques described above.
The physiological activity of salts and esters
of Monacoline K can be evaluated and quantitatively determined by the following tests which can also be used in modified form. to regulate or direct the production of salts
of Monacoline K during the fermentation process according to the present invention.
<EMI ID = 41.1>
Like Monacoline K itself, the salts and esters of Monacoline K specifically inhibit the activity of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase, which is the speed-determining enzyme in biosynthesis
J
cholesterol. Table I below gives the concentrations (in ng / ml) of the compounds of the invention which inhibit
<EMI ID = 42.1>
CoA reductase ^ measured by the method described in Analytical Biochemestry, 31, 383 (19692.7 and the concentra-
<EMI ID = 43.1>
by 50% the biosynthesis of cholesterol mesure measurement made according to the method of the Journal of Biological Chemistry, 247,
<EMI ID = 44.1>
corresponding to the known compound ML-236B (which is a compound known to have a similar type of activity and which is obtained by cultivating microorganisms of the genus Penicillium, as described in British patent n [deg.]
1,453,425, on behalf of the present plaintiff). The concentration of Monacoline K is also given, which inhibits cholesterol biosynthesis by 50%. It can be seen that while the concentration of ML-236B required to inhibit
<EMI ID = 45.1>
the corresponding concentration for the Monacoline K esters is of the order of 1 ng / ml (that is to say that the inhibition power is approximately 10 times higher) and the corresponding concentration for the salt of Monacoline K sodium is approximately 0.14 ng / ml (inhibition power approximately 70 times higher). The activities of the salts and esters of Monacoline K are comparable to or higher than those of Monacoline K itself.
<EMI ID = 46.1>
<EMI ID = 47.1>
2. Reduction in blood cholesterol levels
The animals used in this test are * rais of the Wistar Imamichi strain, each weighing approximately 300 g. The tests are carried out on several groups of rats comprising 5 animals each. Each animal receives an in-
<EMI ID = 48.1>
(trade name of a substance known to increase blood cholesterol levels) while one of the compounds mentioned in table II below is administered to it orally, in the amount indicated in this table. 20 hours after oral administration the rats are sacrificed - bleeding them; we collect the blood and the liver and we determine, by usual means,
cholesterol levels. The results are reported in
Table II which gives the reduction in cholesterol levels in; blood and liver .par. comparison with a control group of ra to which only Triton WR-1339 was administered.
For comparison, the corresponding results are given for Monacoline K itself and for the compound ML-236B ,,. but these compounds were administered in doses significantly higher than those used for
the compounds of the invention in order to obtain a comparable reduction in cholesterol levels.
TABLE II
<EMI ID = 49.1>
The reduction in blood or liver cholesterol levels is given by the formula:
<EMI ID = 50.1>
where: A is the rate in the group treated only by the
Triton WR-1339
B is the rate in the untreated control group
C is the rate in the group tested.
3. Acute toxicity
The compounds tested are the methyl, ethyl, butyl, and benzyl esters and the sodium and calcium salts of Monacoline K. It has been found that
<EMI ID = 51.1>
of these compounds, is at least 2000 mg / kg per administration
<EMI ID = 52.1>
peritoneal. Thus, these compounds have very low toxicity.
These results demonstrate that the compounds of the invention inhibit the biosynthesis of cholesterol and, consequently, lower the cholesterol level in the blood. They are therefore valuable medicines for the treatment of hyperlipemia and arteriosclerosis.
The compounds of the invention can be administered orally or parenterally in the form
capsules, tablets, injections or any other known formulation, although their oral administration is normally preferred.The dose varies depending on the age and body weight of the patient, as well as the severity of , but, in general, the daily dose for an adult is preferably 0.1
<EMI ID = 53.1>
<EMI ID = 54.1>
still 0.5 to 10 mg in the case of Monocoline K esters.
The preparation of the compounds of the invention is
<EMI ID = 55.1> non-limiting title.
<EMI ID = 56.1>
Monacoline K sodium salt
300 liters of a culture medium having a pH of 5.5 before sterilization and containing 5% by weight / volume of glucose, 0.5% by weight / volume of liquor
<EMI ID = 57.1>
Kyokuto commercial tion, available from Kyokuto Seiyaku KK, Japan) and 0.5% w / v of ammonium chloride are introduced into a 600 liter fermenter,
<EMI ID = 58.1>
18174 (Ferm. 4957) in this environment. The culture of micro-
<EMI ID = 59.1>
a ventilation rate of 300 liters per minute and agitation at the rate of 190 revolutions per minute. At the end of this period, the pH of the culture medium containing the microorganism is adjusted to 3.4 by addition of 6N hydrochloric acid, then it is subjected to extraction with
800 liters of methanol.
6 kg of Hyflo Super Cel are added and the extract is then filtered, using a filter press, to obtain 1100 liters of methanolic extract. This extract is washed with 200 liters of a saturated aqueous solution of sodium chloride and then with 180 liters of ethylcyclohexane. The resulting solution is extracted with 600 liters of ethylene dichloride. We <EMI ID = 60.1> ethylene dichloride and allowed to react at 80 [deg.] C. During
30 minutes. The reaction mixture is then washed successively with 200 liters of a 2% aqueous solution
by weight / volume of sodium bicarbonate and with 200
<EMI ID = 61.1>
sodium chloride. The mixture is then concentrated by evaporation under reduced pressure, which gives 135 g of an oily substance.
This oily substance is dissolved in
400 ml of methanol. 20 ml of the resulting methanolic solution (containing 6.8 g of the oil) are then subjected to rapid liquid chromatography for preparation using the apparatus called "System 500" from Waters Co. Limited, equipped with a column of Prepac C18
(column in reverse phase). We use a mixture
85:15 by volume of methanol and water, as a development agent. Development is done at a speed
<EMI ID = 62.1>
minutes) ; we observe the indications of a differential refractometer connected to ground and. the fraction giving the main peak is separated on the differential refractometer. This operation is repeated, the resulting fractions corresponding to the main peak are collected and concentrated to obtain 10.2 g of an oily substance. This oily substance is dissolved in 30 ml of methanol and 6 ml of the methanolic solution (containing approximately 2 g of the oil) are again subjected to the same rapid liquid chromatography for preparation; we
<EMI ID = 63.1>
and water, at a flow rate of 200 ml / minute. The fraction showing the main peak is separated. We repeat this operation-
<EMI ID = 64.1>
laying at the main peak. The residue is treated with aqueous methanol to give 1170 mg of crude crystals, which are recrystallized several times from ethanol, which gives 864 mg of crystals.
<EMI ID = 65.1>
for 3 hours. The insolubles are separated by filtration and the filtrate is lyophilized to obtain 900 mg of the sodium salt of Monacoline K, which has the following properties:
2. Elementary analysis
<EMI ID = 66.1>
3. Molecular weight;
<EMI ID = 67.1>
5. Ultraviolet absorption spectrum:
As shown in Figure 1 of the attached drawings,
<EMI ID = 68.1>
<EMI ID = 69.1>
6. Infrared absorption spectrum (KBr tablet):
As shown in Figure 2 of the accompanying drawings.
7. Nuclear magnetic resonance spectrum (D20).
As shown in Figure 3 of the accompanying drawings.
8. Rapid liquid chromatography:
Duration of stay: 8.5 minutes;
Column packing: Microbondapac C18; 60% v / v aqueous methanol + 0.1%
PIC-A (product of Waters Co. Limited);
Flow rate: 1.5 ml / minute.
As shown in Figure 4 of the accompanying drawings.
9. Solubility:
Soluble in water; insoluble in organic solvents.
10. Specific rotary power:
<EMI ID = 70.1>
EXAMPLE 2
Monacoline K sodium salt
300 liters of culture medium having a pH of 7.4 before sterilization and containing 1.5% by weight / volume of soluble starch, 1.5% by weight / volume of glycerin, 2.0% by weight / volume of fish meal and 0.2% by weight / volume of calcium carbonate are introduced into a 600 liter container; the microorganism
<EMI ID = 71.1>
this medium. The culture of the microorganism is carried out for 120 hours at 26 [deg.] C, with an aeration rate of
300 liters per minute, with stirring at the rate of 190 revolutions per minute. The culture medium is then filtered using a filter press, to give 35 kg
(wet weight) of microorganism.
100 liters of water are added thereto and the pH value of the mixture is adjusted to 12 by addition of sodium hydroxide, with stirring. The mixture is then left at room temperature for one hour, after which it is added
<EMI ID = 72.1>
a filter press. The pH of the filtrate is adjusted to the value of 10 by addition of hydrochloric acid and the resulting mixture is then adsorbed on a column containing
<EMI ID = 73.1>
of water then with 15 liters of an aqueous solution at 10 in volume / volume of methanol. The column is then eluted with 90% v / v aqueous methanol. The eluate is concentrated to a volume of approximately 10 liters and its pH is then adjusted to value 2 by addition of hydrochloric acid; the mixture is then subjected to extraction with ethyl acetate. The extract is washed with a saturated aqueous solution of sodium chloride, dried
over anhydrous sodium sulfate and then concentrated
<EMI ID = 74.1>
oily substance containing the acid of Monacoline K. Methanol is added to this oily substance, in sufficient quantity to obtain a total volume of 100 ml. 20 ml of the resulting solution is subjected to rapid liquid chromatography of preparation using a column. reverse phase (as described in Example 1); eluted with an aqueous solution at 20% by volume / volume of methanol (containing 2% of acetic acid), at. a flow rate of 200 ml / minute. The fraction showing the main peak ..
<EMI ID = 75.1>
your). The remaining 80 ml of the methanolic solution are then treated by the same process. The resulting fractions corresponding to the main peak are collected, concentrated and extracted with ethyl acetate.
The extract is concentrated to dryness, after addition of heptane- to give 1.2 # of an oily substance.
This oily substance is dissolved in 20 ml of methanol and is then subjected to rapid liquid chromatography, as described above, to give 150 mg of Monacoline K acid. 2 ml of methanol are added thereto and
100 ml of water and the pH of the resulting solution is adjusted
<EMI ID = 76.1>
which gives a clear aqueous solution. This solution is passed through a column containing 10 ml of resin
<EMI ID = 77.1>
with 80% v / v aqueous methanol. The eluate is lyophilized to give 130 mg of the sodium salt of the
<EMI ID = 78.1>
properties of the product are identical to those given for the product of Example 1.
EXAMPLE 3
<EMI ID = 79.1>
The culture, the extraction, the concentration, the rapid liquid chromatography for preparation are repeated,
and recrystallization from ethanol, as described in Example 1. 500 mg of the resulting crystals are then dissolved in 50 ml of methylene chloride and the resulting solution is filtered through. through a very fine pore filter. 20 ml of a saturated aqueous solution of calcium hydroxide are added to the filtrate and the mixture is then vigorously stirred. Room temperature. Whenever the pH of the solution drops to below 8, a new 10 ml portion of a saturated aqueous solution of sodium hydroxide is added and stirring is continued. When the pH no longer decreases (after adding a total amount of 50 ml of the aqueous calcium hydroxide solution), distilled water is added and the whole solution is placed in a separatory funnel.
The organic phase is collected and the solvent is distilled off. The residue is treated with heptane and a powder is then obtained by subjecting the mixture to ultrasound. The powder is filtered and
to give 450 mg of the calcium salt of Monacoline K, in the form of a white powder,
This calcium salt has the following properties:
1. Molecular weight:
882 (by mass spectrometry)
2. Gross formula:
<EMI ID = 80.1>
3. Melting point:
<EMI ID = 81.1>
4. Specific rotational power
<EMI ID = 82.1>
- -
5. Infrared absorption spectrum (KBr):
As shown in Figure 5 of the accompanying drawings.
<EMI ID = 83.1>
As shown in Figure 6 of the accompanying drawings.
EXAMPLE 4
Monacoline K methyl ester
The culture, extraction, concentration, rapid liquid chromatography preparation and recrystallization procedures in ethanol are repeated, as described in Example 1, to obtain 864 mg of Monacoline K. It is dissolved
200 mg of this Monacoline K in 20 ml of methanol (which has been previously dehydrated with the molecular sieve 3A). After adding a few drops of acetyl chloride, the solution is stirred at room temperature for
3 hours. The solvent is distilled off and the residue is extracted with 50 ml of acetate
<EMI ID = 84.1>
"'" tion 2% w / v aqueous sodium bicarbonate and a saturated aqueous solution of sddium chloride, then it is dried over anhydrous sodium sulfate, after which the solvent is distilled off. residue is adsorbed on a column containing
<EMI ID = 85.1>
benzene treated. The fractions eluted with a 6: 94 by volume mixture of ethyl acetate and benzene are collected and the solvent is separated by distillation, which gives 65 mg of the methyl ester of Monacoline K, in the form of a colorless oil.
, This product has the following properties:
1. Molecular weight:
436.6 (by mass spectrometry)
2. Gross formula;
<EMI ID = 86.1>
<EMI ID = 87.1>
4. Infrared absorption spectrum
As shown in Figure 7 of the accompanying drawings.
5. Nuclear magnetic resonance spectrum:
As shown in Figure 8 of the accompanying drawings.
EXAMPLE 5
Monacoline K methyl ester
The sodium salt of Monacoline K is prepared by proceeding as described in Example 2. Then 100 mg of this sodium salt is dissolved in 2 ml of sulphoxide.
<EMI ID = 88.1>
of methyl to the solution. The solution is then submitted
<EMI ID = 89.1>
in a reaction vessel equipped with a reflux condenser. The reaction mixture is then diluted with
5 ml of water and extracted with 10 ml of methylene chloride. The solvent is removed from the extract by distillation and: the residue is adsorbed on a column containing 10 g of silica gel (Wakogel C-100) which has been previously treated with benzene. The fractions eluted with a 4:96 by volume mixture of ethyl acetate and benzene are collected and the solvent is distilled off, which gives 35 mg of the methyl ester of Monacoline K, in the form of an Oil.
- EXAMPLE 6
<EMI ID = 90.1>
previously dehydrated using the 3A molecular sieve and a few drops of acetyl chloride are added to the solution. The mixture is then stirred at room temperature for 3 hours, then the solvent is distilled off and the residue is subjected to extraction.
with 50 ml of ethyl acetate. The extract is washed successively with a 2% w / v aqueous solution of sodium bicarbonate and with a saturated aqueous solution of sodium chloride, then it is dried over anhydrous sodium sulfate. After separation of the solvent by distillation, the residue is adsorbed on a column
<EMI ID = 91.1>
previously treated with benzene. The fractions eluted with a 6:94 by volume mixture of ethyl acetate and benzene are collected and the solvent is distilled off, which gives 30 mg of the ethyl ester of Monacoline K, in the form of a colorless oil.
The properties of this compound are as follows:
1. molecular weight:
450.6 (by mass spectrometry)
2. Gross formula:
<EMI ID = 92.1>
As shown in Figure 9 of the accompanying drawings.
4. Nuclear magnetic resonance spectrum:
As against Figure 10 of the accompanying drawings.
EXAMPLE 7
Monacoline K butyl ester
200 mg of Monacoline K (prepared as described in Example 1) are dissolved in 20 ml of methanol which has been previously dehydrated with the molecular sieve 3A.
After adding a few drops of acetyl chloride to the solution, the resulting mixture is stirred at room temperature.
<EMI ID = 93.1>
distilled off and the residue is extracted with 50 ml of ethyl acetate. The extract is washed successively with a 2% w / v aqueous solution of sodium bicarbonate and a saturated aqueous solution of sodium chloride. The solution is then dried over anhydrous sodium sulfate and the solvent is distilled off. The residue is adsorbed on a
<EMI ID = 94.1>
was previously treated with benzene. The fractions eluted with a mixture 4; 96 by volume of ethyl acetate and benzene are collected and the solvent is distilled off, which gives 80 mg of the butyl ester of Monacoline K, in the form of a colorless oil.
This compound has the following properties:
1. Molecular weight:
478.7 (by mass spectrometry).
2. Gross formula:
<EMI ID = 95.1>
As shown in Figure 11 of the accompanying drawings.
<EMI ID = 96.1>
As shown in Figure 12 of the accompanying drawings.
EXAMPLE 8
Monacoline K benzyl ester
200 mg of Monacoline K (prepared as described in Example 1) are dissolved in 20 ml of benzyl alcohol which has been previously dehydrated using the molecular sieve 3A. After adding a few drops of acetyl chloride to. the solution, the resulting mixture is stirred at room temperature for 3 hours. The solvent is then distilled off and the residue
<EMI ID = 97.1>
The extract is washed successively with a 2% w / v aqueous solution of sodium bicarbonate
and with a saturated aqueous solution of sodium chloride. The solution is then dried over anhydrous sodium sulfate and the solvent is distilled off. The residue is adsorbed on a column containing 10 g of silica gel (Wakogel C-100) which has been previously treated with benzene. lees fractions eluted with a 4: 96 by volume mixture of ethyl acetate and benzene are collected and the solvent is distilled off, which gives
70 mg of the benzyl ester of Monacoline K, in the form of a colorless oil.
The properties of this compound are as follows:
1. Molecular weight:
<EMI ID = 98.1>
2. Gross formula:
C31H44C6.
3. Infrared absorption spectrum (CHC1-):
<EMI ID = 99.1>
joints.
<EMI ID = 100.1>
<EMI ID = 101.1>
joints.
CLAIMS
1. Compounds useful as anti-hyperchole agents #
<EMI ID = 102.1>
by derivatives of Monacoline K corresponding to the formula:
<EMI ID = 103.1>
in which :
R represents a metal atom or a substituted or unsubstituted alkyl group; and
- n is the inverse of the valence of the atom or of the group represented by R.