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PERFECTIONNEMENTS APPORTES AUX PROCEDES DE PREPARATION DES COMPOSES
STEROIDES.
L'invention est relative à un procédé pour l'oxygénation de certains composés stéroides à l'aide de cultures choisies de micro-organismes ; et elle concerne, plus particulièrement, l'introduction d'un groupement hydroxyle à la position 11 du noyau stéroïde dans la configuration ss. Une réaction particulièrement utile, qui peut être effectuée par ce procédé, est la conversion du composé S (substance S de Reichtein ou 17-hydroxy- 11-desoxycorticostérone ) en composé F (composé F de Kendall ou 17-hydro- xycorticostérone).
La préparation de composés stéroïdes biologiquement actifs, tels que la ou le cortisone et le compose F, se fait avec de nombreuses difficultés sérieuses. Un des problèmes les plus difficile est l'introduction d'atomes d'oxygène à des positions essentielles du noyau stéroïde, surtout à la position 11 de ce noyau. Le composé S peut être obtenu par des voies synthétiques connues, à partir de diverses matières stéroïdes initiales, d'origine naturelle et relativement économiques, telles que des matières stéroïdes du type végétal. Par contre, le composé F est beaucoup plus difficile à obtenir et est un composé de grande valeur, qui est particulièrement utile pour le traitement de l'arthritisme rhumatismal et de certains états du corps humain.
Tout procédé par lequel le composé S peut etre converti en composé F avec un bon rendement et sans dépenses excessives a une valeur importante pour l'industrie pharmaceutique et pour le public en général.
Des méthodes ont déjà été proposées pour convertir le composé S en composé F par des organismes tout différents de ceux décrits ci-dessous pour la mise en oeuvre du procédé faisant l'objet de l'invention. Dans le brevet E.U.A. n 2.602.769 on a décrit l'usage de Cunninghamella blakesleena
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(de l'ordre des Mucorales) et dans un article paru dans le Journal of the .
American Chemistry Society (Vol. 77,-p. 2381, 1952) on décrit un procédé pour lequel on utilise le Streptomyces fradiae. Un grand nombre de microorganismes ont été essayés en ce qui concerne leur efficacité pour convertir le composé S en composé F. La plupart des ces micro-organismes ne donnent aucune indication relative à la 11-ss-hydroxylation. Un nombre considérable de cultures d'organismes, de l'ordre des Mucorales, ont été essayées pour la même réaction mais quelques unes seulement de celles-ci permettaient d'obtenir un degré réduit de conversion.
Contrairement aux méthodes publiées par les inventeurs du procédé faisant l'objet de l'invention et aux pauvres résultats obtenus avec une variété d'organismes étudiés par ces inventeurs, les micro-organismes-du genre Curvularia ont donné des résultats très favorables en ce qu'ils permettent de préparer des produits, tels que le composé F, avec des rendements atteignant 40 % ou davantage. Par ailleurs, on peut effectuer les réactions dans des conditions telles que les produits puissent être isolés assez aisément avec un degré de pureté élevé. Ceci permet, pour la première fois, la préparation pratique sur une grande échelle et par des méthodes biochimiques, de substances telles que le composé F.
On a découvert qu'en mettant en contact un composé- stéroïde, en particulier ceux qui comportent un groupement méthylène à la position 11, avec l'activité oxygénante de certains micro-organismes choisis, c'est-àdire avec les organismes eux-mêmes ou avec des systèmes?enzymes de ces organismes, on peut obtenir la 11- ss -hydroxylation sélective de ces composés stéroïdes. Parmi d'autres réactions, qui peuvent être effectuées, on peut citer la conversion du composé S en composé F. Les organismes en question sont des souches oxygénantes de champignons du genre Curvularia, ce genre appartenant à l'ordre des Moniliales de la classe des Fungi imperfecti.Ces idicatios sont basées sur la classification de Saccardo, P.A. Sylloge Fungorum Vol. 8.
Une valeur particulière ont les souches des espèces Curvularia Falcata, C. brachyspora, C. lunate , C. pallescens et d'autres espèces de ce genre. D'autres microorganismes du genre Curvularia peuvent être choisis pour effectuer le procédé, faisant l'objet de l'invention, en faisant des essais simples qui sont décrits avec plus de détails plus loin.
On peut se procurer plusieurs de ces organismes dans les collections de culture publiques et d'autres peuvent être isolés à partir de matières naturelles, telles que du terreau, par des méthodes normalisées bien connues par les mycologistes.
Comme décrit plus haut, on peut se servir du procédé faisant l' objet de l'invention pour convertir le composé S en composé F. Toutefois, le procédé peut également être utilisé par la 11-ss -oxygénation d'une variété d'autres composés stéroïdes qui sont non substitués à la position 11 du noyau. Diverses chaînes latérales peuvent être présentées à la position 17 du noyau et des groupements céto ou hydroxyle peuvent se trouver à la position 3 du noyau. Les composés stéroïdes, utilisés comme supports pour la réaction, peuvent également comporter des liaisons doubles carbone-carbone en divers points du noyau, par exemple aux positions 3,4 ou 5,6.
Il est à noter que le rendement en produit oxygéné varie, jusqu'à un certain degré, avec la nature du composé stéroïde utilisé comme matière initiale ; avec la souche particulière de Curvularia utilisée et avec les conditions adoptées pour la réaction, c'est-à-dire la température, la durée , le pH, le milieu nutritif, le moment auquel le composé est ajouté au micro-organisme, etc.
Par ailleurs, un micro-organisme oxygénant donné, appartenant à l'espèce préférée, peut avoir des effets très variables sur des composés stéroïdes différents, c'est-à-dire qu'n bon rendement en dérive 11- ss -oxygéné correspondant peut être obtenu quand on se sert d'une souche oxygénànte donnée et d'un composé stéroïde déterminé alors qu'un autre composé stéroïde, utilisé dans des conditions qui, à part cela, sont absolument identiques, forment le composé désiré avec un rendement qui est seulement modéré ou faible.
La présence d'un groupement hydroxyle à la position 21 de la structure sté- roïde du type prégnène peut être partiulièrement utile pour fournir un bon
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rendement en compose 11 ss -hydroxy.Comme les composés stéroides du type cortical possèdent un tel groupement hydroxyle , le procédé est particu- librement utile pour préparer les composés 11- -hydroxylés de cette sé- rie. Parmi les produits qui peuvent être convertis en produits 11- ss -hy- droxylés correspondants on peut citer les composés S ou le desoxycorticos- térone. Diverses méthodes peuvent être utilisées pour évaluer les produits obtenus par c@s procèdes.
Par exemple, si l'on se sert d'un compo$4 stérpi- de avec une chaîne latérale appropriée, la proportion du produit obtenu peut être évaluée en détermi@ant l'effet sur des souris traitées par l'adré- nalectome ou en se basant sur le nombre d'ésinophiles qui se trouvent dans le sang des animaux ayant servi aux essais. Par ailleurs, les produits purs, obtenus par la réaction d'hydroxylation, peuvent être isolés comme décrit ci-dessous.
L'efficacité d'un micro-organisme choisi pour le procédé faisant l'objet de l'invention, peut être déterminée en cultivant l'organisme dans un milieu nutritif approprié contenant des hydrates de carbone, des sels, des sources d'azote organique, etc. Le composé stéroïde, à l'état solide ou en solution dans un solvant approprié tel que l'acétone ou l'éthanol,est ajouté, dans des conditions stériles, au micro-organisme cultivé et le mé- lange est agité et aéré pour provoquer la croissance du micro-organisme et l'oxygénation du support stéroide. Le stérol:de peut être ajouté quand le milieu est ensemencé, dans des conditoons stériles , avec une culture du micro-organisme ou aprs que la croissance de l'organisme à commen é.
Dans certains cas il peut être bon d'ajouter le composé stéroïde après que la croissance du micro-organisme a commencé dans le milieu nutritif et dans des conditions aérobiques. Ceci convient tout particulièrement'quand, pendant les phases initiales de la croissance du micro-organisme,, il existe une tendance à la formation de sous-produits non voulus à partir du support stéroide. L'acétate +.. un autre ester du stéroïde peut être utilisé à la place de l'alcool lui-même bien que ceci puisse parfois être la cause d'une diminution appréciable du rendement en produit hydroxylé.
Suivant une variante, on peut utiliser des préparations enzymes obtenues à partir de la culture d'un organisme oxygéné approprié du genre Curvularia pour la mise en oeuvre du procédé. Une autre méthode, tràs efficace, consiste à cultiver le micro-organisme sur un milieu nutritif approprié dans des conditions aérobiques et en l'absence du stéroïde. La culture mycellienne peut ensuite être séparée par filtration du bouillon et peut, si on le désire, être lavée à l'eau distillée. Le mycelium est alors mis en suspension dans l'eau distillée soutenant le support stéroïde. L'agitation et l'aération du mélange sont continuées pendant une période comprise entre environ 12 à 48 heures après quoi on récupère les produits résultant de la réaction.
Ce procédé présente l'avantage que le composé stéroïde peut être aisément récupéré car les diverses matières nutritives, utilisées à l'origine, pour obtenir la croissance du micro organisme sont alors absentes ainsi que les diverses matières excrétées par les organismes, au cours de leur croissance, pendant la période initiale. Avec certaines sou hes du genre Curvularia on obtient, par cette méthode, des rendements totaux, encore meilleurs en produits oxygénés que dans le cas cù le stéroïde est ajouté, au début ou à une période intermédiaire déterminée, à l'ensémble du bouillon de fermentation. D'autres méthodes, bien connues des chimistes qui s'occupent des enzymes, peuvent être utilisées pour la mise en oeuvre du procédé d'oxygénation en question.
La proportion des produits et la vitesse d'oxy- génation ainsi que la nature que l'on se sert de l'ensemble du bouilloh de fermentation ou du mycelium lavé et isolé.
En général, une concentration qui ne dépasse pas 1 à 2% en poids total du support, par exemple de la matière du genre composé S, est adoptée pour la mise en oeuvre du procédé, mais parfois on peut juger qu'il est plus favorable d'utiliser d'autres concentrations. Comme la solubilité de la ma- tière initiale dans l'eau est très limitée, un excs de la matière peut être lentement converti en produit oxygéné. Toutefois, le degré de substitution
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du stéroïde, quand il est ajouté au système à oxygéner, cest-à-dire au mocro-organisme en cours de croissance ou du système enzyme, ne paraît pas affecter fortement le rendement et la nature des produits dans des conditions qui, à part cela, restent identiques.
Si l'on ajoute une solution du composé stéroïde dans un solvant miscible à l'eau au système de fermentation aqueux, le stéroïde est généralement précipité à l'état finement divisé en présence d'un grand excès d'eau. Ceci ne paraît pas améliorer d'une manière appréciable la vitesse de la réaction comparativement à celle obtenue par l'addition de cristaux secs et relativement grands du stéroïde.
Quand le traitement d'oxygénation est terminé, le produit peut être récupéré hors du mélange par extraction à l'aide d'un solvant approprié et non miscible à l'eau. Des hydrocarbures inférieurs chlorés, des cétones et des alcools peuvent être utilisés à cet effet.Ceux-ci comprennent le chloroforme, le chlorure de méthylène, le trichlorocéthane, le dichlorure d'éthylàne, etc. L'usage du dichlorure d'éthylène chaud, c'est-à-dire à une témpérature comprise entre environ 40 et environ 80 , convient tout particulièrement à l'extraction des produits stéroïdes. L'extrait du produit et les matières initiales n'ayant pas réagi peuvent être concentrés jusqu'à avoir un faible volume ou jusqu'à siccité pour obtenir un produit solide. La purification du produit peut se faire de différentes manières.
La plus efficace-est la séparation, par chromatographie, du produit d'avec les matières initiales et d'avec d'autres produits, tels que des substances plus fortement oxygénées, qui peuvent être formés au cours de la réaction. Des adsôrbants, tels que du gel de silice ou d'autres matières adsorbantes appropriées, sont particulièrement utiles à cet effet. On a découvert qu'une colonne, préparée avec un mélange de gel de silice et d'un alcool inférieur, plus spécialement l'éthanol, est particulièrement utile pour la séparation des matières stéroides initiales.
Les mélanges stérol:des peuvent agir sur des colonnes d'adsorbants tels qu'un gel de silice, en solution concentrée dans du chloroforme ou du chlorure de méthylène. La colonne peu.ensuite être lavée avec des quantités additionnelles du solvant pour enlever certaines impuretés telles que des graisses et des pigments . Le mélange adsorbé est ensuite séparé par l'addition graduelle d'un mélange du solvant et d'un faible pourcentage, par exemple de 1 à 5 %, d'un alcool inférieur (méthanol, éthanol, etc. ) Les matières peuvent être séparées et les composés séparés peuvent être récupérés graduellement hors de la colonne en utilisant des mélanges de sol.. vants qui ont une polarité graduellement croissante.
Par exemple, un mélange de chlorure de méthylène et une quantité réduite mais graduellement croissante et très utile.
Des fractions de la matière récupérée hors des colonnes chromatographiques peuvent être vérifiées, en ce qui concerne la nature du produit, en soumettant des petites portions des solutions à des analyses au papier chromatographique. Des méthodes qui sont particulièrement utiles pour effectuer ce genre de séparation et d'analyse sont décrites en détail dans le brevet E.U.A. n 2.602.769 et dans un article de Shull et autres publié dans les Archives of Biochemistry, Vol. 37, p. 186 (1952). Ces méthodes sont également très utiles pour évaluer des nouvelles souches de micro-organismes en vue de déterminer leur efficacité pour le procédé faisant l'objet de l' invention.
La fermentation peut se faite sur une petite échelle, avec le stéroïde, le composé S ou un dérivé approprié du composé S comme support et l'extrait total du mélange de fermentation peut être concentré et soumis à l'essai au papier chromatographique. En'utilisant des échantillons connus du composé S, du composé F ou d'autres produits apparentés, à titre de comparaison, il est possible de déterminer si le micro-organisme choisi convient au procédé en question.
Des chromatogrammes décroissants sur papier, obtenus à l'aide de papier traité avec une solution à 35 % de glycol propylénique et développé
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avec un mélange de 78 volumes de toluène et 22 vplumes de dioxane, peuvent être utilisés pour l'évaluation rapide de diverses souches des micro-organis- mes préférés. Une telle séparation peut être terminée en une période aussi courte nue trois heures et le chromatogramme sur papier, après avoir été séché, peut être examiné avec de la lumière ultra-violette pour déterminer la position des diverses matières, telles que les composés S et F, par leur fluorescence. Les zones, dans lesquelles les diverses substances se présen- tent, peuvent être marquées et découpées dans la feuille ou bande de papier.
La matière peut ensuite être récupérée à l'aide d'un solvant, tel que l' éthanol, et obtenue sous la forme d'une matière solide et pratiquement pure par évaporation, Une analyse quantitative d'un mélange de ce genre peut être faite de cette manière. La quantité des produits peut être déterminée, par exemple, en mesurant le spectre d'absorption par l'ultra-violet de solutions de ces matiàres. Particulièrement utiles sont les caractéristiques d' absorption de ces composés quand ils sont dissous dans l'acide sulfurique concentré.
Aprss séparation des produits de réaction par chromatographie à l'aide d'une colonne, les fractions désirées peùvent être mélangées et concentrées jusqu'à avoir un petit volume. Le produit peut ensuite être cristallisé hors d'un solvant approprié, tel que l'acétate d'éthyle. Un produit, préparé par l'application du procédé en question, peut être comparé à des échantillons d'un composé F authentique et on a constaté qu'ils sont identiques à tous les points de vue. Le corticostérone, préparé par le procédé selon l'invention, a également été comparé à un échantillon normalisé et on a constaté qu'il est identique à celui-ci.
Les exemples ci-dessous sont donnés à titre illustratif et n'ont aucun caractère limitatif ni restrictif. En effet, des modes de réalisation de l'invention, apparemment très différents entre eux, peuvent être' envisa- gés sans sortir des limites de protection de l'invention.
EXEMPLE I.-
Une culture d'un organisme, provenant de la collection de culture du Quatermaster Corps à Philadelphie et désignée par eux comme étant le Curvularia falcata QM120h, a été propagé sur un milieu de culture à l' agar. La société demanderesse a établi que cet organisme appartient à l'espèce C. lunata plutôt qu'à l'espèce C. falcata et pour cette raison elle le désignera ci-après par Curvularia lunata (QM120h), Une culture vivante de cet organisme a été déposée à 'la Fermentation Division of the Northern Régional esearch Laboratory à Peoria (Illinois) et a été ajoutée à sa col- lection permanente de micro-organismes sous la désignation NRRL 2380.
L'organisme est séparé, par rinçage, de la souche d'agar dans des conditions stériles et dans un milieu stérile ayant la composition suivante
EMI5.1
<tb>
<tb> extrait <SEP> de <SEP> malt <SEP> 5 <SEP>
<tb> sucrose <SEP> 1 <SEP> %
<tb> nitrate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 0,2 <SEP> % <SEP>
<tb> chlorure <SEP> de <SEP> potassium <SEP> 0,05 <SEP> %
<tb> sulfate <SEP> de <SEP> magnésium <SEP> heptahydraté <SEP> 0,05 <SEP> %
<tb> sulfate <SEP> ferreux <SEP> heptahydraté <SEP> 0,05 <SEP> % <SEP>
<tb> biphosphate <SEP> acide <SEP> de <SEP> potassium <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> % <SEP>
<tb> Eau <SEP> distillée <SEP> réglée <SEP> pour <SEP> un <SEP> pH=
<tb> 7. <SEP> 0 <SEP> avec <SEP> de <SEP> la <SEP> potasse <SEP> caustique
<tb> restant.
<tb>
Cent millilitres de ce milieu sont versés dans chacun de plusieurs flacons de trois cents millilitres. A chaque flacon on ajoute 50 mg
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de composé S dissous dans un petit volume d'acétone. Pendant ces opérations, le mélange de fermentation est maintenu à des conditions stériles. Le mélange est ensuite agité pendant une période de sept jours à une température d'en vioron 28 . Les contenus de flacons sont mélangés et le mélange est extrait avec plusieurs portions de bichlorure d'éthylène en se servant chaque fois d'un cinquième du volume de la phase aqueuse. Le mélange des extraits au bichlorure d'éthylène est séché sur du sulfate de sodium anhydre et, après que le produit dessicateur a été enlevé, on sépare la solvant sous vide.
La solution est concentrée jusqu'à avoir un volume de 1 à 2 ml et un échantillon de cette solution est soumis à la chromatographie au papier en se servant d'un premier système de solvants contenant 50% en volume d'éther et 50% en volume d'hexane et d'un second système de solvants formé par un mélange eau-benzène. On a constaté que le produit contient le composé F en comparant des chromatogrammes sur papier avec un échantillon d'un composé F authentique, utilisé com'ne repàre.
On a également obtenu des indications au sujet de la présence de produits plus fortement oxygénés.
Le concentrat au dichlorure d'éthylène est placé sur une colonne chromatographique constituée par du gel de silice mélangé avec un petit volume d'éthanol (un ml de solvant par g de gel de silice). La colonne est amplifiée à l'aide d'un mélange de 97 volumes de chlorure de méthylène et 3 volumes d'éthanol à 95 %. Le produit. fourni par la colonne, est recueilli sous la forme de petites fractions, ayant un même volume, qui sont examinées périodiquement à l'aide de papier chromatographique afin de séparer les fractions contenant le produit désiré. Toutes ces fractions sont combinées et concentrées sous vide jusqu'à siccité pour obtenir le produit solide.
On a constaté que ce produit est le composé F eh le comparant à un échantil- lon connu dé la même matière.
EXEMPLE II.-
Une culture de Curvularia lunata (QM 120h) est cultivée dans des flacons contenant le même milieu que celui décrit dans l'exemple I. Cent ml de cet inoculum sont ajoutés à deux litres du milieu suivant :
EMI6.1
<tb>
<tb> Sucrose <SEP> 1%
<tb> Tryptone <SEP> Difco <SEP> 1%
<tb> Nitrate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 0,2%
<tb> Biphosphate <SEP> de <SEP> potassium <SEP> hydrogéné <SEP> 0,1%
<tb> Sulfate <SEP> de <SEP> magnésium <SEP> heptahydraté <SEP> 0,05 <SEP> %
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> potassium <SEP> 0,05 <SEP> %
<tb> Sulfate <SEP> ferreux <SEP> heptahydraté <SEP> 0,001%
<tb>
Le pH de ce mélange est rendu égal à 7 avec de l'acide sulfurique et 0,25 % de carbonate de calcium sont ajoutés avant que le mélange soit stérilisé.
Le milieu inoculé est aéré avec un débit d'environ 0,5 à 1 volume d'air par volume de solution et par minute à 27 -28 pendant 24 heures. Pendant cette période, le mélange est agité à une vitesse d'environ 1700 t/m. Un demi-gramme du composé S, à l'état d'alcool, est dissous dans 20 ml d'éthanol à 95%. La solution est ajoutée au mélange de fermentation dans des conditions stériles. La réaction est ensuite poursuivie pendant encore 24 heures exactement dans les mêmes conditions que celles décrites plus haut.
La totalité du mélange de fermentation est sortie de la cuve de fermentation. Le mélange est extrait deux fois avec un volume égal de bichlorure d'éthylène à 70 . Les extraits sont mélangés et évaporés jusqu'à siccité. Les matières solides sèches sont dissoutes dans un petit volume de chlorure de méthylène et la solution est ajoutée à une colonne de gel de
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silice.. Cette colonne a été préparée préalablement en traitant chaque gramme de gel de sil@@ avec 1 ml d'éthanol à 95%. Ce mélange est mis en suspension dans du chlorure de méthylène et est versé dans une colonne chromatographi- que. Après que le mélange stéroïde a été introduit dans la colonne, il est lavé avec plusieurs portions de chlorure de méthylène, pour enlever les graisses et les pigments.
La colonne est ensuite amplifiée en y ajoutant un mélange de 97 volumes de chlorure de méthylène et 3 volumes d'éthanol. Le produit récupéré est subdivisé en une série de petites fractions. Des portions de cellesci sont analysées par chromatographie au papier et les fractions, contenant le même composée sont combinées. On a constaté que la matière, qui sort en premier lieu de la colonne, est le composé S récupéré. Cette matière peut être isolée et récupérée à nouveau. La matière, qui quitte la colonne en deu- xième lieu, est un stéroide non identifié.
La matière, quittant la colonne en troisième lieu, .peut être récupérée et on constate qu'il s'agit du composé F. En séparant le solvant des fractions mélangées contenant le composé F, on obtient un rendement dépassant 35 % d'un produit sec qui peut être facilement purifié davantage.
EXEMPLE III.-
Une culture de Curvularia lunata (QM 120h), comme celle utilisée pour l'exemple I, est cultivée sur le même milieu que celui décrit dans l' exemple I dans des conditions aérobiques. Le mycelium, fourni par deux litres de ce mélange et obtenu après une croissance de 22 heures, est filtré, il est lavé avec un petit volume d'eau distillée et est ensuite mis en suspension dans deux litres d'eau distillée.
On ajoute un demi-gramme de composé S à ce mélange. Cette préparation est agitée et aérée avec un débit d'un demi-volume d'air par volume du mélange et par minute pendant 16 heures. Le mélange est ensuite extrait trois fois avec un demi-volume de chloroforme. Le mélange des extraits au chloroforme est concentré jusqu'à avoir un petit volume et le mélange des stéroïdes est purifié par chromatographie sur une colonne de gel de silice.
On obtient un rendement d'environ 35 % en composé F. pur. En outre, environ 10% du composé S, utilisé comme matière initiale, sont récupérés à l'état pur.
EXEMPLE IV.-
Une culture, fournie par les Philadelphia Laboratories du Quartermaster Corps sous la désignation Curvularia sp. QM 371d, est cultivée dans des flacons dans des conditions aérobiques sur le milieu décrit dans l'exemple I. Cet organisme a maintenant été définitivement déterminé comme appartenant à l'espèce C. pallescens et sera donc désigné spécifiquement ci-après comme étant'la Curvularia pallescens (QM 371d). Une culture vivante de cet organisme a été déposée à la Fermentation Division of the Northern Régional Research Laboratory à Peoria (Illinois) et a été ajoutée à sa collection permanente de micro-organismes sous le n NRRL-2381. Après une croissance pendant 24 heures, on utilise 100 ml de ce mélange pour ensemencer deux litres du milieu décrit dans 1''exemple II.
Après que le mélange de deux litres a continué à croître dans des conditoons aérobiques et pendant 24 heures, on ajoute un demi-gramme du composé S en mélange de fermentation dans des conditions stériles. Le mélange est agité à 28 pendant encore 20 heures en étant aéré et dans toute sa masse. Le mélange est sorti du récipient dans lequel la fermentation a eu lieu et est extrait trois fois, avec un demi-volume de chloroforme ,chaque fois. Les extraits sont mélangés et concen- tres jusqu'à avoir un petit volume. Le mélange est alors plané sur une co- lonne de gel de silice qui a été préparée de la manière indiquée plus haut.
La colonne de gel de silice est lavée avec du chlorure de méthylène et est ensuite amplifiée avec une solution d'éthanol dans du chlorure de méthylène.
A partir de la colonne, on récupère un peu de la matière initiale formée par le composé S ainsi que le produit 11- ss-oxygéné constituant le composé F. Le produit isolé est purifié et son point de fusion, ainsi que ses autres
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propriétés physiques, sont comparés à ceux d'un échantillon synthétique pur.
On constate que ces matières sont identiques. Par ailleurs, le composé F, préparé de cette manière, est essayé en ce qui concerne son activité pour la teneur en glycogène de l'organisme de souris adrénalectomisées. On a cônsta- té qu'il est très efficace, ce qui est une -autre preuve de la nature du produit.
EXEMPLE V.-
Une culture de Curvularia lunata (QM 120h) est cultivée comme décrit dans l'exemple I excepté que l'on utilise du desoxycorticostérone à la place du composé S. Quand la fermentation est terminée, le produit brut est extrait à l'aide de méthyl isobutyl cétone et le solvant est ensuite enlevé sous vide. Le produit résiduel est essayé en ce qui concerne son activité pour la teneur en glycogène du foie de souris adrénalectomisées et le résultat positif montre l'introduction d'un 11- ss -hydroxyle dans le stéroïde. La purification par chromatmgraphie sur colonne, comme décrite plus haut, donne un rendement approximatif de '28 % en un composé cristallisé et on constate qu'il s'agit du corticostérone par ses constantes physiques.
REVENDICATIONS .-
1.- Procédé pour la 11- -hydroxylation d'un composé stéroïde, dans lequel on met le composé stéroïde en contact avec la partie active oxygénante d'un organisme choisi parmi ceux faisant partie du genre Curvularia.
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IMPROVEMENTS TO THE PROCESSES FOR THE PREPARATION OF COMPOUNDS
STEROIDS.
The invention relates to a process for the oxygenation of certain steroid compounds using selected cultures of microorganisms; and it relates more particularly to the introduction of a hydroxyl group at position 11 of the steroid nucleus in the ss configuration. A particularly useful reaction, which can be carried out by this method, is the conversion of compound S (substance S from Reichtein or 17-hydroxy-11-deoxycorticosterone) to compound F (compound F from Kendall or 17-hydro-xycorticosterone).
The preparation of biologically active steroid compounds, such as or cortisone and compound F, takes place with many serious difficulties. One of the most difficult problems is the introduction of oxygen atoms at essential positions of the steroid nucleus, especially at position 11 of this nucleus. Compound S can be obtained by known synthetic routes, from various starting steroid materials, of natural origin and relatively inexpensive, such as steroid materials of the plant type. On the other hand, compound F is much more difficult to obtain and is a very valuable compound which is particularly useful for the treatment of rheumatic arthritis and certain conditions of the human body.
Any process by which compound S can be converted to compound F with good yield and without excessive expense has great value for the pharmaceutical industry and for the public in general.
Methods have already been proposed for converting compound S into compound F by organisms quite different from those described below for the implementation of the process forming the subject of the invention. In the E.U.A. n 2.602.769 the use of Cunninghamella blakesleena has been described
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(of the order of Mucorales) and in an article published in the Journal of the.
American Chemistry Society (Vol. 77, -p. 2381, 1952) discloses a method for which Streptomyces fradiae is used. A large number of microorganisms have been tested for their effectiveness in converting compound S to compound F. Most of these microorganisms give no indication of 11-ss-hydroxylation. A considerable number of cultures of organisms, of the order Mucorales, have been tested for the same reaction, but only a few of these yielded a reduced degree of conversion.
Contrary to the methods published by the inventors of the process forming the subject of the invention and to the poor results obtained with a variety of organisms studied by these inventors, the microorganisms of the genus Curvularia have given very favorable results in that 'they allow products, such as compound F, to be prepared with yields of up to 40% or more. On the other hand, the reactions can be carried out under conditions such that the products can be isolated quite easily with a high degree of purity. This allows, for the first time, the practical preparation on a large scale and by biochemical methods, of substances such as compound F.
It has been discovered that by contacting a steroid compound, in particular those which have a methylene group in the 11 position, with the oxygenating activity of certain selected microorganisms, i.e. with the organisms themselves or with enzyme systems of these organisms, the selective 11-ss -hydroxylation of these steroid compounds can be achieved. Among other reactions which can be carried out, mention may be made of the conversion of compound S into compound F. The organisms in question are oxygenating strains of fungi of the genus Curvularia, this genus belonging to the order of Moniliales of the class of Fungi imperfecti These idicatios are based on the classification of Saccardo, PA Sylloge Fungorum Vol. 8.
Of particular value are the strains of the species Curvularia Falcata, C. brachyspora, C. lunate, C. pallescens and other species of this genus. Other microorganisms of the genus Curvularia can be chosen to carry out the method, which is the subject of the invention, by carrying out simple tests which are described in more detail below.
Many of these organisms can be obtained from public culture collections and others can be isolated from natural materials, such as potting soil, by standard methods well known to mycologists.
As described above, the process forming the object of the invention can be used to convert compound S to compound F. However, the process can also be used by the 11-ss -oxygenation of a variety of others. steroid compounds which are unsubstituted at the 11 position of the ring. Various side chains can be presented at position 17 of the ring and keto or hydroxyl groups can be found at position 3 of the ring. The steroid compounds, used as supports for the reaction, can also have carbon-carbon double bonds at various points of the ring, for example at positions 3,4 or 5,6.
It should be noted that the yield of oxygenated product varies, to a certain extent, with the nature of the steroid compound used as starting material; with the particular strain of Curvularia used and with the conditions adopted for the reaction, i.e. temperature, time, pH, nutrient medium, time at which the compound is added to the microorganism, etc.
On the other hand, a given oxygenating microorganism, belonging to the preferred species, can have very variable effects on different steroid compounds, i.e. a good yield of the corresponding 11- ss -oxygenated derivative can be obtained when one uses a given oxygenating strain and a given steroid compound while another steroid compound, used under conditions which other than that are absolutely identical, form the desired compound in a yield which is only moderate or weak.
The presence of a hydroxyl group at the 21-position of the pregnene-type steroid structure can be particularly useful in providing good
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yield of compound 11 ss -hydroxy. Since steroid compounds of the cortical type have such a hydroxyl group, the process is particularly useful in preparing the 11--hydroxy compounds of this series. Among the products which can be converted into the corresponding 11-ss -hydroxylated products, mention may be made of the compounds S or deoxycorticosterone. Various methods can be used to evaluate the products obtained by these processes.
For example, if a steroid compound with an appropriate side chain is used, the proportion of the product obtained can be evaluated by determining the effect on mice treated with adrenalectoma or by based on the number of esinophils in the blood of test animals. Furthermore, the pure products obtained by the hydroxylation reaction can be isolated as described below.
The efficiency of a microorganism chosen for the process forming the subject of the invention can be determined by culturing the organism in a suitable nutrient medium containing carbohydrates, salts, sources of organic nitrogen. , etc. The steroid compound, in the solid state or in solution in a suitable solvent such as acetone or ethanol, is added, under sterile conditions, to the cultured microorganism and the mixture is stirred and aerated to cause growth of the microorganism and oxygenation of the steroid carrier. The sterol: of can be added when the medium is inoculated, in sterile conditoons, with a culture of the microorganism or after the growth of the organism has started.
In some cases it may be beneficial to add the steroid compound after the growth of the microorganism has started in the nutrient medium and under aerobic conditions. This is particularly suitable when, during the initial phases of the growth of the microorganism, there is a tendency for the formation of unwanted by-products from the steroid carrier. Acetate + ... another ester of the steroid can be used in place of the alcohol itself although this can sometimes cause an appreciable decrease in the yield of hydroxy product.
According to a variant, it is possible to use enzyme preparations obtained from the culture of an appropriate oxygenated organism of the genus Curvularia for carrying out the process. Another very efficient method is to cultivate the microorganism on a suitable nutrient medium under aerobic conditions and in the absence of the steroid. The mycellium culture can then be separated by filtration from the broth and can, if desired, be washed with distilled water. The mycelium is then suspended in distilled water supporting the steroid carrier. Stirring and aeration of the mixture is continued for a period of between about 12 to 48 hours after which the products resulting from the reaction are recovered.
This process has the advantage that the steroid compound can be easily recovered because the various nutritive materials, originally used, to obtain the growth of the microorganism are then absent as well as the various materials excreted by the organisms, during their growth, during the initial period. With certain strains of the genus Curvularia one obtains, by this method, total yields, even better in oxygenated products than in the case where the steroid is added, at the beginning or at a determined intermediate period, to the whole of the fermentation broth. . Other methods, well known to chemists dealing with enzymes, can be used for carrying out the oxygenation process in question.
The proportion of products and the rate of oxygenation as well as the nature that one uses of the whole of the fermentation broth or of the washed and isolated mycelium.
In general, a concentration which does not exceed 1 to 2% by total weight of the support, for example of the material of the type S compound, is adopted for carrying out the process, but sometimes it may be judged to be more favorable. to use other concentrations. Since the solubility of the starting material in water is very limited, an excess of the material can be slowly converted to oxygenate. However, the degree of substitution
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of the steroid, when added to the system to be oxygenated, i.e. to the growing mocro-organism or the enzyme system, does not appear to strongly affect the yield and the nature of the products under conditions which, apart from this , remain the same.
If a solution of the steroid compound in a water-miscible solvent is added to the aqueous fermentation system, the steroid is generally precipitated in a finely divided state in the presence of a large excess of water. This does not appear to appreciably improve the rate of the reaction as compared to that obtained by the addition of dry and relatively large crystals of the steroid.
When the oxygenation treatment is complete, the product can be recovered from the mixture by extraction with a suitable solvent immiscible with water. Chlorinated lower hydrocarbons, ketones and alcohols can be used for this purpose, these include chloroform, methylene chloride, trichlorokethane, ethylene dichloride, etc. The use of hot ethylene dichloride, that is to say at a temperature between about 40 and about 80, is particularly suitable for the extraction of steroid products. The product extract and unreacted starting materials can be concentrated to low volume or to dryness to obtain a solid product. The purification of the product can be done in different ways.
The most efficient is the separation, by chromatography, of the product from the starting materials and from other products, such as more strongly oxygenated substances, which may be formed during the reaction. Adsorbents, such as silica gel or other suitable adsorbent materials, are particularly useful for this purpose. It has been found that a column, prepared with a mixture of silica gel and a lower alcohol, more especially ethanol, is particularly useful for the separation of the initial steroid materials.
The sterol mixtures: can act on adsorbent columns such as silica gel, in concentrated solution in chloroform or methylene chloride. The column can then be washed with additional amounts of the solvent to remove certain impurities such as fats and pigments. The adsorbed mixture is then separated by the gradual addition of a mixture of the solvent and a small percentage, for example 1 to 5%, of a lower alcohol (methanol, ethanol, etc.). The materials can be separated. and the separated compounds can be gradually recovered from the column using soil mixtures which have gradually increasing polarity.
For example, a mixture of methylene chloride and a small but gradually increasing amount and very useful.
Fractions of the material recovered from the chromatographic columns can be checked for the nature of the product by subjecting small portions of the solutions to chromatographic paper analyzes. Methods which are particularly useful for carrying out this kind of separation and analysis are described in detail in U.S. Patent No. No. 2,602,769 and in an article by Shull et al published in Archives of Biochemistry, Vol. 37, p. 186 (1952). These methods are also very useful for evaluating new strains of microorganisms with a view to determining their effectiveness for the method which is the object of the invention.
The fermentation can be done on a small scale, with the steroid, the S compound or an appropriate derivative of the S compound as a carrier and the total extract of the fermentation mixture can be concentrated and tested on the chromatographic paper. Using known samples of compound S, compound F, or other related products, for comparison, it is possible to determine whether the selected microorganism is suitable for the process in question.
Decreasing chromatograms on paper, obtained using paper treated with a 35% solution of propylene glycol and developed
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with a mixture of 78 volumes of toluene and 22 plumes of dioxane, can be used for the rapid evaluation of various strains of the preferred microorganisms. Such a separation can be completed in as short a period of three hours and the paper chromatogram, after being dried, can be examined with ultra-violet light to determine the position of various materials, such as compounds S and F. , by their fluorescence. The areas in which the various substances are present can be marked and cut from the sheet or strip of paper.
The material can then be recovered with the aid of a solvent, such as ethanol, and obtained as a solid and substantially pure material by evaporation. A quantitative analysis of such a mixture can be made. in this way. The amount of the products can be determined, for example, by measuring the ultraviolet absorption spectrum of solutions of these materials. Particularly useful are the absorption characteristics of these compounds when dissolved in concentrated sulfuric acid.
After separation of the reaction products by chromatography using a column, the desired fractions can be mixed and concentrated to a small volume. The product can then be crystallized out of a suitable solvent, such as ethyl acetate. A product, prepared by the application of the method in question, can be compared to samples of an authentic compound F and have been found to be identical in all respects. The corticosterone, prepared by the process according to the invention, was also compared with a standardized sample and it was found that it is identical to this sample.
The examples below are given by way of illustration and are in no way limiting or restrictive. Indeed, embodiments of the invention, apparently very different from one another, can be envisaged without departing from the protective limits of the invention.
EXAMPLE I.-
A culture of an organism, from the Quatermaster Corps culture collection in Philadelphia and designated by them as Curvularia falcata QM120h, was propagated on agar culture medium. The applicant company has established that this organism belongs to the species C. lunata rather than to the species C. falcata and for this reason it will hereinafter refer to it as Curvularia lunata (QM120h), A living culture of this organism has has been deposited with the Fermentation Division of the Northern Regional Research Laboratory in Peoria, Illinois, and has been added to its permanent collection of microorganisms as NRRL 2380.
The organism is separated, by rinsing, from the agar strain under sterile conditions and in a sterile medium having the following composition
EMI5.1
<tb>
<tb> extract <SEP> from <SEP> malt <SEP> 5 <SEP>
<tb> sucrose <SEP> 1 <SEP>%
<tb> <SEP> sodium <SEP> nitrate <SEP> 0.2 <SEP>% <SEP>
<tb> <SEP> potassium <SEP> <SEP> 0.05 <SEP>% chloride
<tb> <SEP> magnesium <SEP> sulfate <SEP> heptahydrate <SEP> 0.05 <SEP>%
<tb> sulfate <SEP> ferrous <SEP> heptahydrate <SEP> 0.05 <SEP>% <SEP>
<tb> biphosphate <SEP> <SEP> potassium <SEP> <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP>% <SEP>
<tb> Distilled <SEP> water <SEP> set <SEP> for <SEP> a <SEP> pH =
<tb> 7. <SEP> 0 <SEP> with <SEP> of <SEP> the <SEP> potash <SEP> caustic
<tb> remaining.
<tb>
One hundred milliliters of this medium are poured into each of several three hundred milliliter bottles. 50 mg are added to each vial
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of compound S dissolved in a small volume of acetone. During these operations, the fermentation mixture is maintained under sterile conditions. The mixture is then stirred for a period of seven days at a temperature of en vioron 28. The contents of the vials are mixed and the mixture is extracted with several portions of ethylene dichloride, each time using one fifth of the volume of the aqueous phase. The mixture of ethylene dichloride extracts is dried over anhydrous sodium sulfate and, after the desiccant has been removed, the solvent is removed in vacuo.
The solution is concentrated to a volume of 1 to 2 ml and a sample of this solution is subjected to paper chromatography using a first solvent system containing 50% by volume ether and 50% by volume. volume of hexane and a second solvent system formed by a water-benzene mixture. The product was found to contain compound F by comparing chromatograms on paper with a sample of an authentic compound F, used as a benchmark.
Indications have also been obtained regarding the presence of more strongly oxygenated products.
The ethylene dichloride concentrate is placed on a chromatographic column consisting of silica gel mixed with a small volume of ethanol (one ml of solvent per g of silica gel). The column is amplified using a mixture of 97 volumes of methylene chloride and 3 volumes of 95% ethanol. The product. supplied by the column, is collected in the form of small fractions, having the same volume, which are examined periodically using chromatographic paper in order to separate the fractions containing the desired product. All of these fractions are combined and concentrated in vacuo to dryness to obtain the solid product.
This product has been found to be compound F eh comparing it to a known sample of the same material.
EXAMPLE II.-
A culture of Curvularia lunata (QM 120h) is cultivated in flasks containing the same medium as that described in Example I. One hundred ml of this inoculum are added to two liters of the following medium:
EMI6.1
<tb>
<tb> Sucrose <SEP> 1%
<tb> Tryptone <SEP> Difco <SEP> 1%
<tb> Nitrate <SEP> of <SEP> sodium <SEP> 0.2%
<tb> Biphosphate <SEP> of <SEP> potassium <SEP> hydrogenated <SEP> 0.1%
<tb> Sulfate <SEP> of <SEP> magnesium <SEP> heptahydrate <SEP> 0.05 <SEP>%
<tb> <SEP> potassium chloride <SEP> 0.05 <SEP>%
<tb> Sulfate <SEP> ferrous <SEP> heptahydrate <SEP> 0.001%
<tb>
The pH of this mixture is made equal to 7 with sulfuric acid and 0.25% calcium carbonate is added before the mixture is sterilized.
The inoculated medium is aerated with a flow rate of about 0.5 to 1 volume of air per volume of solution per minute at 27-28 for 24 hours. During this period, the mixture is stirred at a speed of about 1700 rpm. Half a gram of compound S, in the form of alcohol, is dissolved in 20 ml of 95% ethanol. The solution is added to the fermentation mixture under sterile conditions. The reaction is then continued for a further 24 hours under exactly the same conditions as those described above.
All of the fermentation mixture has left the fermentation tank. The mixture is extracted twice with an equal volume of 70% ethylene dichloride. The extracts are mixed and evaporated to dryness. The dry solids are dissolved in a small volume of methylene chloride and the solution is added to a gel column of
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silica. This column was pre-prepared by treating each gram of silica gel with 1 ml of 95% ethanol. This mixture is suspended in methylene chloride and is poured into a chromatographic column. After the steroid mixture has been introduced into the column, it is washed with several portions of methylene chloride, to remove fats and pigments.
The column is then amplified by adding thereto a mixture of 97 volumes of methylene chloride and 3 volumes of ethanol. The recovered product is subdivided into a series of small fractions. Portions of these are analyzed by paper chromatography and the fractions, containing the same compound, are combined. It has been found that the material which first comes out of the column is the recovered compound S. This material can be isolated and recovered again. The material, which leaves the column second, is an unidentified steroid.
The material leaving the column third, can be recovered and found to be compound F. By separating the solvent from the mixed fractions containing compound F, a yield exceeding 35% of a product is obtained. dry which can be easily further purified.
EXAMPLE III.-
A culture of Curvularia lunata (QM 120h), like that used for example I, is cultivated on the same medium as that described in example I under aerobic conditions. The mycelium, supplied by two liters of this mixture and obtained after a growth of 22 hours, is filtered, it is washed with a small volume of distilled water and is then suspended in two liters of distilled water.
Half a gram of compound S is added to this mixture. This preparation is stirred and aerated with a flow rate of half a volume of air per volume of the mixture and per minute for 16 hours. The mixture is then extracted three times with half a volume of chloroform. The mixture of the chloroform extracts is concentrated to a small volume and the mixture of steroids is purified by chromatography on a column of silica gel.
A yield of about 35% of pure compound F. is obtained. In addition, about 10% of the compound S, used as starting material, is recovered in the pure state.
EXAMPLE IV.-
A culture, supplied by the Philadelphia Laboratories of the Quartermaster Corps under the designation Curvularia sp. QM 371d, is cultured in flasks under aerobic conditions on the medium described in Example I. This organism has now been definitively determined as belonging to the species C. pallescens and will therefore be specifically referred to hereinafter as being 'the Curvularia pallescens (QM 371d). A live culture of this organism has been deposited with the Fermentation Division of the Northern Regional Research Laboratory in Peoria, Illinois and has been added to its permanent collection of microorganisms under number NRRL-2381. After growth for 24 hours, 100 ml of this mixture is used to inoculate two liters of the medium described in Example II.
After the two liter mixture has continued to grow under aerobic conditions and for 24 hours, half a gram of compound S is added as a fermentation mixture under sterile conditions. The mixture is stirred at 28 for a further 20 hours while being aerated and throughout its mass. The mixture is taken out of the vessel in which the fermentation took place and is extracted three times, with half a volume of chloroform, each time. The extracts are mixed and concentrated until they have a small volume. The mixture is then hovered on a column of silica gel which has been prepared as indicated above.
The silica gel column is washed with methylene chloride and is then amplified with a solution of ethanol in methylene chloride.
From the column, some of the initial material formed by the compound S is recovered as well as the 11-ss-oxygenated product constituting the compound F. The isolated product is purified and its melting point, as well as its other
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physical properties, are compared to those of a pure synthetic sample.
It can be seen that these materials are identical. On the other hand, compound F, prepared in this way, is tested for its activity for the glycogen content of the organism of adrenalectomized mice. It has been found to be very effective, which is further proof of the nature of the product.
EXAMPLE V.-
A culture of Curvularia lunata (QM 120h) is grown as described in Example I except that deoxycorticosterone is used instead of compound S. When the fermentation is complete, the crude product is extracted with methyl isobutyl ketone and the solvent is then removed in vacuo. The residual product is tested for its activity for the glycogen content of the liver of adrenalectomized mice and the positive result shows the introduction of an 11-ss -hydroxyl into the steroid. Purification by column chromatography, as described above, gives an approximate yield of 28% of a crystalline compound and it is observed that it is corticosterone by its physical constants.
CLAIMS .-
1. A process for the 11-hydroxylation of a steroid compound, in which the steroid compound is brought into contact with the oxygenating active part of an organism selected from those belonging to the genus Curvularia.