CH398885A - Method of preparing an antibiotic - Google Patents

Method of preparing an antibiotic

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CH398885A
CH398885A CH1262663A CH1262663A CH398885A CH 398885 A CH398885 A CH 398885A CH 1262663 A CH1262663 A CH 1262663A CH 1262663 A CH1262663 A CH 1262663A CH 398885 A CH398885 A CH 398885A
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CH
Switzerland
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sep
antibiotic
medium
strain
demethyltetracycline
Prior art date
Application number
CH1262663A
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French (fr)
Inventor
Daniel Mccormick Jerry Robert
Hirsch Ursula
Raymond Jensen Elmer
Oscar Sjolander Newell
Original Assignee
American Cyanamid Co
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P29/00—Preparation of compounds containing a naphthacene ring system, e.g. tetracycline
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
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    • C12R2001/485—Streptomyces aureofaciens

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Description

  

  Procédé de     préparation    d'un     antibiotique       La présente     invention        n    pour objet un     procédé     pour la préparation de la     déméthyltétracycline    et ses       épinières.     



  Le nouvel antibiotique en question se forme dans  un processus de     fermentation    .dans     lequel    on     utilise     des souches mutantes :de Streptomyces     aureofaciens.     Le     nouvel        antibiotique        semble    étroitement apparenté  aux     membres    de la     famille    tétracycline décrite anté  rieurement, mais il en est     nettement        différent.    Il est  caractérisé par une stabilité marquée aussi bien en  milieu     alcalin    qu'en milieu .acide,

   et est     supérieur    aux  tétracyclines à cet égard. Il a     une    activité     antibiotique     similaire et peut servir aux mêmes usages, et de la  même façon générale, que les     tétracyclines    actuelle  ment connues.  



  Suivant     l'invention,    on fournit un     procédé    pour  la préparation de l'antibiotique     déméthyltétracycAine     et ses     épinières,    ce procédé étant caractérisé     par    le  fait qu'on fait     fermenter,    dans des conditions     a6ro-          bies,    un milieu nutritif aqueux renfermant une source       assimilable    de carbone, d'azote et de     substances    mi  nérales avec une souche :de<I>S.</I>     aureofaciens    produc  trice de     déméthyltétracycline.     



  En effet, on a constaté qu'en     utilisant    certaines  souches mutantes de<I>S.</I>     aureofaciens    qui seront plus  particulièrement décrites ci-après, on obtient une  substance     antibiotique    similaire ,à la tétracycline. Le  nouvel antibiotique particulier qui se forme à     ;la    suite  du processus de     fermentation    dépend de la nature du  milieu nutritif .et des autres conditions du processus.  Dans un milieu exempt de     chlorures,    l'antibiotique  qui .prédomine est l'analogue non     chloruré    de la té  tracycline.

   Dans un milieu riche en brome, il se     forme     l'antibiotique bromé ; et dans un milieu riche en  chlore, l'antibiotique     prédominant    sera un antibioti  que chloré analogue à la     chlorotétracycline.    Ordinai-         rement,    il se forme aussi de la tétracycline, de la       chlomotétracycline    et/ou de la     bromotétracycline    pen  dant le     @processus    de     fermentation,    et leurs propor  tions relatives     dépendent    -de la teneur du milieu en  ions chlorure et/ou bromure, et de la     souche    d     e    micro  organisme utilisée.

   En     sélectionnant        soigneusement     la souche de<I>S.</I>     aureofaciens,        il    est possible     d'éliminer     presque     complètement    la     formation    de ces antibioti  ques connus du groupe     tétracycline.     



  Le nouvel antibiotique peut être converti en     épi-          mères    comme     décrit    ci-après, de façon     similaire    à la  conversion de la     tétracycline    en     quatrimycines.     



  Des     @analyses    chimiques, et l'examen des proprié  tés     chimiques    et     physiques    du nouveau composé indi  quent qu'il     diffère    essentiellement des     tétracyclines     par le fait qu'ils contiennent un groupe     -méthyle    en  moins.

   Le groupe méthyle en question est très vrai  semblablement celui qui     occupe    la position 6 sur le  noyau     naphtacène    des     tétracyclines.    En conséquence,  l'analogue de la tétracycline     s'appellera    4-diméthyl       amino-1,4,4a,5,5a,6,11,12a-octahydro-3,6,10,12,12a-          pentahydroxy    -1,11     -dioxo-2-naphtacène-carboxamid@e.     Le nom courant approprié     d    e ce nouvel antibiotique  serait     déméthyltétracycline,    et on     utilisera    ici cette  nomenclature.

   Mais     il    est     entendu    que la structure       postulée    n'a pas été prouvée     par    une synthèse non       équivoque,    et     pourrait    être trouvée erronée par la  suite. La présente invention concerne un     procédé     déterminé pour la préparation de     composés    qui pos  sèdent des propriétés déterminées, et     dent    pas     limitée     par un système     partiewlier    -de nomenclature ni par  une s     tructure    probable.  



  Le nouvel antibiotique est produit par     certaines     souches mutantes de<I>S.</I>     aureofaciens.    Ces souches       sont        sans    aucun     doute   <I>de</I> l'espèce<I>Streptomyces</I>     au-          reofaciens,        puisqu'elles    dérivent     de    la souche priani-           tive    A-377 isolée par le     D.r        B.M.        Duggar,

      et déposée  aux     Northern        Regional        Research        Laboratories    à       Peoria    (Illinois, Etats-Unis), .et indexées en ce Labo  ratoire sous le N      NRRL    2.209.

   Les mutations     com-          portant    un     traitement    de la souche A-377 par des  agents mutagènes, comprenant     successivement    l'irra  diation     ultraviolette,    la nicotine et le     chlorhyd    :

  rate de       2,2=dichloro-N-méthyldiéthylarnine,    ont été     utilisées     pour créer l'une des souches.     Diverses        autres.    souches  ont été obtenues par mutation spontanée .et     par        trai-          tement    à l'aide d'agents     mutagènes.    Ces diverses sou  ches qui produisent les nouveaux     antibiotiques    en dif  férentes proportions et avec des     .rendements    divers,

    présentent les caractéristiques générales de l'espèce  <I>S.</I>     aureofaciens.    Elles différent un peu entre     elles    et  aussi des :souches de S.     aureofaciens        antérieurement     décrites, principalement par leur ,pigmentation et leur  propriété de produire les nouveaux     antibiotiques.          Dans    la plupart des cas, on note un     ;pigment    brun  rougeâtre lorsque les micro-organismes sont culti  vés     sur    des milieux de culture ordinaires.

   Les nuan  ces du     pigment    varient de la nuance pêche ou du  brun cuivré jusqu'à un acajou foncé,     suivant    la sou  che     particulière    et le milieu     nutritif    utilisé. Bien que  la propriété de produire le nouvel antibiotique de la  présente invention soit     généralement    associée à des  souches qui     présentent    ce type de :pigmentation, cette  formation de pigmente la production des nouveaux       antibiotiques    ne sont pas     nécessairement    des proprié  tés :solidaires.

   Toutes les souches étudiées produisent  de la     chloro@tétracycline,    et généralement de la tétra  cycline, bien que les proportions relatives de ces anti  biotiques varient considérablement suivant la nature  du milieu de     fermentation,    les conditions de fermen  tation et la souche     particulière    choisie.

   Dans     certains     cas, la     production    de     chlorotétracycline    et de     tétra-          cyeline    est très faible, de l'ordre de     quelques        pour-          cent    sur le ,total de l'antibiotique produit     par    la fer  mentation.  



  Les :souches mutantes qui produisent le     nouvel     antibiotique de la     :présente    invention possèdent les  mêmes caractéristiques générales que les souches qui  produisent la     tétracycline,    et -elles diffèrent entre elles  de la même façon générale que -les souches productri  ces de tétracycline diffèrent l'une de l'autre,     :ainsi     qu'on l'a expliqué :dans .plusieurs     articles        scientifiques     qui ont été :publiés.

   Bien que :de nombreuses souches  de S.     aureofaciens    soient à la disposition du     publie     dans les collections ide cultures et aient été décrites  dans des brevets     et,dans    la littérature     scientifique,    les  données suivantes serviront à illustrer le type de va  riation des     nouvelles    souches, par rapport à la .souche       primitive    A-377 qui     :se    trouve :sous la     désignation          NRRL    2.209.  



  <I>Comparaison des souches de S.</I>     au.reofaciens     <I>S-604 et A-377 sur divers milieux</I>  Le<I>Streptomyces</I>     aureofaciens        souche    S-604, qui  produit la     chlorodéméthyltétracycline    et la     déméthyl-          tétracyclin:e    a été comparé au<I>Streptomyces aureofa-</I>         ciens    souche A-377     (NRRL    2.209) par observation  des caractéristiques de croissance sur divers milieux  incubés à 26-27  C.  



  Les observations faites sont les suivantes  
EMI0002.0078     
  
    <I>1. <SEP> Glycérol, <SEP> asparagine, <SEP> extrait <SEP> de <SEP> bceuf,</I>
<tb>  <I>agar-agar</I>
<tb>  Glycérol <SEP> 1,0 <SEP> %
<tb>  Asparagine-L <SEP> 0,05%
<tb>  Extrait <SEP> de <SEP> boeuf <SEP> .. <SEP> . <SEP> 0,02%
<tb>  KH2P04 <SEP> . <SEP> .... <SEP> 0,05 <SEP>  /o
<tb>  Agar,agar <SEP> Bacto <SEP> 1,5 <SEP> 0/0
<tb>  Eau <SEP> distillée, <SEP> q.s. <SEP> pour <SEP> ... <SEP> .. <SEP> . <SEP> 100 <SEP> %
<tb>  Ajustement <SEP> du <SEP> pH <SEP> par <SEP> KOH
<tb>  à <SEP> 50 <SEP> % <SEP> . <SEP> .. <SEP> .. <SEP> . <SEP> 7,0 <SEP> 0/0
<tb>  pH <SEP> après <SEP> stérilisation <SEP> 7,1 <SEP> 0/0
<tb>  <I>Streptomyces <SEP> aureofaciens</I>
<tb>  <I>Souche <SEP> S-604 <SEP> Souche <SEP> A-377</I>
<tb>  Croissance <SEP> .

   <SEP> Abondante, <SEP> cou- <SEP> Assez <SEP> abondante
<tb>  leur <SEP>   <SEP> Venetian
<tb>  red <SEP>   <SEP> ( )
<tb>  Hyphes <SEP> aériens <SEP> Abondants, <SEP> Blancs, <SEP> unifor  blanc <SEP> à <SEP>   <SEP> Rose <SEP> mes
<tb>  grey <SEP>   <SEP> ( )
<tb>  Sporulation <SEP> Légère, <SEP> deve- <SEP> Aucune
<tb>  nant <SEP> abondante
<tb>  Pigment <SEP> diffusible <SEP> Brun <SEP> rougeâtre <SEP> Jaune
<tb>  Envers <SEP>   <SEP> Bmown <SEP> Maho- <SEP> Jaune <SEP> à <SEP> jaune
<tb>  gany <SEP>   <SEP> ( ) <SEP> orange <SEP> clair
<tb>  ( ) <SEP> Désignation <SEP> des <SEP> nuances <SEP> d'après <SEP> le <SEP>   <SEP> Color <SEP> H@ar  mony <SEP> Manual <SEP>   <SEP> 3e <SEP> édition, <SEP> édité <SEP> par <SEP> Container
<tb>  Corporation <SEP> of <SEP> America.

       
EMI0002.0079     
  
    <I>2. <SEP> Dextrine, <SEP> Czapek-Dox, <SEP> agar-agar</I>
<tb>  Dextrine <SEP> 1,0 <SEP> 0/0
<tb>  NaN03 <SEP> ....... <SEP> 0,2 <SEP> 0/0
<tb>  K.HP04 <SEP> 0,1 <SEP> %
<tb>  MgSO,. <SEP> 7H.0 <SEP> 0,05 <SEP>  lo
<tb>  KCl <SEP> ... <SEP> 0,05 <SEP> %
<tb>  FeSO4. <SEP> 7H.0 <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> <B>0,001%</B>
<tb>  Agar-agar <SEP> Bacto <SEP> .. <SEP> 1,5 <SEP> %
<tb>  Eau <SEP> distillée, <SEP> q:s. <SEP> ,pour <SEP> . <SEP> 100,0 <SEP> %
<tb>  pH <SEP> après <SEP> .stérilisation <SEP> 7;

  0 <SEP> 0/0
<tb>  <I>Streptomyces <SEP> aureofaciens</I>
<tb>  <I>Souche <SEP> S-604 <SEP> Souche <SEP> A-377</I>
<tb>  Croissance <SEP> Rare,hyagine <SEP> Profuse
<tb>  Hyphes <SEP> .aériens <SEP> Absents <SEP> Abondants,
<tb>    <SEP> lead <SEP> grey <SEP>   <SEP> ( )
<tb>  Globules <SEP> su  perficiels <SEP> inco  lores
<tb>  Sporulation <SEP> Aucune <SEP> Abondante
<tb>  Pigment <SEP> diffusible <SEP> Aucun <SEP> Léger, <SEP> jaune
<tb>  pâle
<tb>  Envers <SEP> _.--.-<B>------- <SEP> ----</B> <SEP> Non <SEP> pigmenté <SEP> Non <SEP> pigmenté
<tb>  ( ) <SEP> voir <SEP> note <SEP> précédente       
EMI0003.0001     
  
    <I>3. <SEP> Liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> maïs, <SEP> agar-agar</I>
<tb>  Liqueur <SEP> ide <SEP> macération <SEP> de <SEP> maïs <SEP> 0,4 <SEP> %
<tb>  Sucrose <SEP> ---- <SEP> --..

   <SEP> -- <SEP> - <SEP> 1,0 <SEP> % <SEP> Sporulation <SEP> Très <SEP> abondante, <SEP> Très <SEP> abondante,
<tb>  MgS04. <SEP> 7H0 <SEP> 0,025% <SEP> uniforme <SEP> uniforme
<tb>  KH204 <SEP> ...-. <SEP> <B>-------</B> <SEP> -.. <SEP> -..-.-..- <SEP> . <SEP> -..- <SEP> ..-- <SEP> 0,2 <SEP> %
<tb>  (NlÎ4)2HP04 <SEP> --..----.--........0,2 <SEP> % <SEP> Pigment <SEP> diffusible <SEP> Très <SEP> concentré, <SEP> jaune <SEP> verdâtre
<tb>  A.gar-agar <SEP> Bacto <SEP> .-. <SEP> . <SEP> . <SEP> ... <SEP> 2,0 <SEP> % <SEP>  deep <SEP> brown  <SEP> clair
<tb>  Eau <SEP> du <SEP> robinet, <SEP> q.s.

   <SEP> .pour <SEP> __ <SEP> 100,0 <SEP> % <SEP> à <SEP>  deep <SEP> brown
<tb>  pH <SEP> après <SEP> stérilisation <SEP> -- <SEP> - <SEP> 6,3 <SEP>  /o <SEP> Mahogany 
<tb>  <I>Streptomyces <SEP> aureofaciens</I> <SEP> Envers <SEP> <B>-------</B> <SEP>  Brown <SEP>  Covert <SEP> Brown 
<tb>  <I>Souche <SEP> S-604 <SEP> Souche <SEP> A-377</I>
<tb>  Mahogany  <SEP> (C )
<tb>  Croissance <SEP> <B>---------</B> <SEP> . <SEP> Profuse <SEP> Profuse <SEP> foncé <SEP> ( )
<tb>  Hyphes, <SEP> aériens. <SEP> - <SEP> Abondants <SEP> Abondants,
<tb>   rose,taupe  <SEP> ( ) <SEP>  Beaver 
<tb>  foncé <SEP> ( ) <SEP> voir <SEP> notes <SEP> précédentes
<tb>  <I>4.

   <SEP> Autres <SEP> milieux</I>
<tb>  <I>Streptomyces <SEP> aureofaciens</I>
<tb>  <I>Souche <SEP> S-604 <SEP> Souche <SEP> A-377</I>
<tb>  Agar@agar <SEP> nutritif <SEP> Croissance <SEP> médiocre, <SEP>   <SEP> Taupe <SEP> brown <SEP>   <SEP> à <SEP> Croissance <SEP> assez <SEP> abondante. <SEP> Pas <SEP> d'hyphes
<tb>    <SEP> dark <SEP> brown <SEP>   <SEP> ( ). <SEP> Pas. <SEP> d'hyphes <SEP> aé- <SEP> aériens. <SEP> Envers <SEP> :

   <SEP> jaune <SEP> pâle. <SEP> Pigment <SEP> so  riens. <SEP> Envers <SEP>   <SEP> Taupe <SEP> brown <SEP>   <SEP> ( ). <SEP> Pig- <SEP> luble <SEP> jaune <SEP> à <SEP> jaune <SEP> brunâtre <SEP> clair
<tb>  ment <SEP> soluble <SEP> brun <SEP> rougeâtre
<tb>  Glucose, <SEP> asparagine, <SEP> Croissance <SEP> abondante. <SEP> Gros <SEP> hyphes <SEP> aé- <SEP> Croissance <SEP> assez <SEP> abondante. <SEP> Hyphes <SEP> aé  extrait <SEP> de <SEP> viande, <SEP> riens <SEP> bigarrés: <SEP>   <SEP> rose <SEP> taupe <SEP>   <SEP> à <SEP>   <SEP> Fawn <SEP>   <SEP> riens <SEP> blancs <SEP> devenant <SEP> de <SEP> plus <SEP> :en <SEP> plus
<tb>  agar-agar <SEP> ou <SEP>   <SEP> carcel <SEP>   <SEP> ( ). <SEP> Sporulation: <SEP> abon- <SEP> gris <SEP> quand <SEP> la <SEP> formation <SEP> de <SEP> isporcs <SEP> aug  dante. <SEP> Envers:

   <SEP>   <SEP> Taupe <SEP> brown <SEP>   <SEP> ( ). <SEP> Pig- <SEP> mente. <SEP> Envers: <SEP> Jaune <SEP> clair. <SEP> Pigment <SEP> so  m,ent <SEP> soluble <SEP> brun <SEP> rougeâte <SEP> luble <SEP> jaune <SEP> clair
<tb>  Pomme <SEP> de <SEP> .terre <SEP> Croissance <SEP> profuse <SEP> humide, <SEP> lisse, <SEP> modulée <SEP> : <SEP> Croissance <SEP> profuse <SEP> lisse, <SEP> humide, <SEP> nodu   <   <SEP> Dark <SEP> brown <SEP> Mahogany <SEP>   <SEP> ( ) <SEP> avec <SEP> trace <SEP> iée <SEP> : <SEP>   <SEP> Light <SEP> Mellon <SEP> Yellow <SEP>   <SEP> ( ) <SEP> à <SEP>   <SEP> An  de <SEP>   <SEP> peach <SEP> tan <SEP>   <SEP> ( ). <SEP> Hyphes <SEP> aériens <SEP> : <SEP> tique <SEP> . <SEP> rose <SEP>   <SEP> ( ). <SEP> Hyphes <SEP> aériens <SEP> :

   <SEP> trace.
<tb>  absents <SEP> à <SEP> abondants, <SEP> devenant <SEP> blancs <SEP> à <SEP> Pas <SEP> de <SEP> pigment <SEP> soluble
<tb>    <SEP> carcel <SEP>   <SEP> .( ). <SEP> Sporulation <SEP> abondante
<tb>  dans <SEP> les <SEP> zones <SEP> de <SEP> fonte <SEP> formation <SEP> d'hy  phes <SEP> aériens. <SEP> Pigment <SEP> soluble <SEP>   <SEP> choco  late <SEP>   <SEP> ( ) <SEP> à <SEP>   <SEP> chocodate <SEP> brown <SEP>   <SEP> ( )
<tb>  Lait <SEP> pourpre <SEP> Léger <SEP> collier <SEP> de <SEP> croissance <SEP>   <SEP> Deep <SEP> red <SEP> Léger <SEP> collier <SEP> de <SEP> croissance <SEP> blanc <SEP> à <SEP> jaune
<tb>  Mahogany <SEP>   <SEP> ( ). <SEP> Peu <SEP> de <SEP> variation <SEP> nota- <SEP> pâle.

   <SEP> Peu <SEP> de <SEP> variation <SEP> notable <SEP> du <SEP> pH,
<tb>  ble <SEP> du <SEP> pH, <SEP> peu <SEP> de <SEP> peptonisation <SEP> appa- <SEP> peu <SEP> de <SEP> peptonisation <SEP> apparente <SEP> en <SEP> 15
<tb>  rente. <SEP> Légère <SEP> réaction <SEP> colorée <SEP> faussement <SEP> jours
<tb>  alcaline <SEP> due <SEP> à <SEP> la <SEP> diffusion <SEP> du <SEP> pigment
<tb>  soluble
<tb>  ( ) <SEP> voir <SEP> -notes <SEP> précédentes         Sur tous les     agar-agars,excepté        dextrine        Czapek-          Dox,    mais y compris la culture     inclinée    sur pomme  de terre, le S.

       aureofaciens    souche S-604 produit une    pigmentation foncée caractéristique,     apparaissant    gé  néralement avec la     croissance.    De même, il :est facile  d'observer le pigment     caractéristique    soluble brun  rougeâtre.

    
EMI0004.0010     
  
    <I>5. <SEP> Observations <SEP> microscopiques</I>
<tb>  <I>Streptomyces <SEP> aureofaciens</I>
<tb>  <I>Milieu <SEP> Souche <SEP> S-604 <SEP> Souche <SEP> A-377</I>
<tb>  <I>Mycélium <SEP> Spores <SEP> Mycélium <SEP> Spores</I>
<tb>  Glycérol, <SEP> asparagine, <SEP> Sinueux, <SEP> continu, <SEP> Sphéroïdaux <SEP> à <SEP> ovoï- <SEP> Sinueux, <SEP> continu, <SEP> Sphér6ïdaux <SEP> à <SEP> ovoï  extrait <SEP> de <SEP> b#uf, <SEP> ramifié. <SEP> Diamètre <SEP> Baux. <SEP> Diamètre <SEP> ramifié. <SEP> Diamètre <SEP> daux. <SEP> Diamètre
<tb>  agar-agar <SEP> 0,8 <SEP> à <SEP> > <SEP> 1,0 <SEP> mi- <SEP> 1,5 <SEP> - <SEP> 2,0 <SEP> microns <SEP> 0,7à <SEP> > <SEP> 1,0 <SEP> micron <SEP> 1,5 <SEP> - <SEP> 2,0 <SEP> microns
<tb>  :cron
<tb>  Liqueur <SEP> de <SEP> macéra- <SEP> Sinueux, <SEP> :

  continu, <SEP> Sphéroïdaux <SEP> -à <SEP> ovoï- <SEP> Sinueux, <SEP> continu, <SEP> Sphéroïdaux <SEP> à <SEP> 0voï  tion <SEP> de <SEP> maïs, <SEP> agar- <SEP> ramifié. <SEP> Diamètre <SEP> daux. <SEP> Diamètre <SEP> ramifié. <SEP> Diamètre <SEP> daux. <SEP> Diamètre
<tb>  agar <SEP> 0,8 <SEP> à <SEP> > <SEP> 1,0 <SEP> mi- <SEP> 1,5 <SEP> à <SEP> 2,0 <SEP> microns <SEP> 0,8à <SEP> > <SEP> 1,0 <SEP> micron <SEP> 1,5 <SEP> - <SEP> 2,0 <SEP> microns
<tb>  cron       La morphologie du     mycélium    et des spores pour  la souche S-604 est     apparemment        :similaire    à celle  observée pour la souche A-377.

   Les deux souches  montrent un     mycélium    continu, sinueux,     ramifié,    avec  tendance     occasionnelle    des hyphes     aériens    à la     spira-          lisation.    Les spores caractéristiques sont     ovoïdaux    à       sphérdïda:ux.     



  Pour illustrer les variations de couleur parmi les  différentes souches de S.     aureofaciens    qui produisent  les     déméthyltétracyclines,    on :a cultivé quatre souches       sélectionnées    sur de     l'agar-agar        avecliqueur    de macé  ration de maïs, et on a fait les observations sui  vantes  
EMI0004.0027     
  
    <I>Observations <SEP> de <SEP> couleur <SEP> (0)</I>
<tb>  <I>Streptomyces <SEP> aureofaciens</I>
<tb>  <I>Agar-agar <SEP> avec <SEP> liqueur <SEP> de <SEP> macération</I>
<tb>  <I>de <SEP> mais <SEP> (AP4)

  </I>
<tb>  <I>Incubation <SEP> 4 <SEP> jours <SEP> à <SEP> <B>270C</B></I>
<tb>  <I>Souche <SEP> Colonies <SEP> isolées <SEP> Croissance</I>
<tb>  <I>en <SEP> masse</I>
<tb>  S-604M1 <SEP>   <SEP> Deep <SEP> red <SEP> Maho- <SEP>   <SEP> Deep <SEP> .red <SEP> Maho  gany <SEP>   <SEP> gany <SEP>  
<tb>  S-1071 <SEP>   <SEP> Cepper <SEP> brown <SEP>   <SEP>   <SEP> Deep <SEP> brown
<tb>  Mahogany <SEP>   <SEP> à
<tb>    <SEP> Red <SEP> Mahogany <SEP>  
<tb>  V-62 <SEP> Large <SEP> zone <SEP> margi- <SEP>   <SEP> Light <SEP> copper
<tb>  hale <SEP>   <SEP> peach <SEP> tan<B> </B> <SEP> brown <SEP>  
<tb>  devenant <SEP>   <SEP> light
<tb>  copper <SEP> brown <SEP>  
<tb>  au <SEP> centre <SEP> de <SEP> la
<tb>  colonie
<tb>  B-740 <SEP>   <SEP> Dark <SEP> Wine <SEP>   <SEP>  <   <SEP> Burgundy <SEP>  
<tb>  (o) <SEP> couleurs <SEP> suivant <SEP> l'ouvrage <SEP> déjà <SEP> cité.

         Une     méthode    relativement simple pour sélec  tionner une souche de<I>S.</I>     aureofaciens    capable de       produire    les nouveaux .antibiotiques consiste à choi  sir une :souche de<I>S.</I>     aureofaciens        qui    présente des ;  colonies marron     foncé    quand on la cultive sur un  milieu     d'agar-agar    et de liqueur de macération de  maïs. On prépare des inocula avec ces colonies et on  conduit une fermentation comme     expliqué        dans    les  exemples 1 .et 2 ci-après.

   A la fin de la période de  fermentation, on acidifie une :certaine quantité de la  liqueur de fermentation à un pH voisin de 1,5     pour     solubiliser l'antibiotique .et on filtre pour obtenir une  solution aqueuse limpide. On place une ou deux gout  tes du filtrat sur une bande de     papier    et on les     chro-          matographie    par les méthodes     ordinaires    de     dévelop-          pement        chromatographique.    On utilise comme solvant  du     butanol    équilibré avec -un tampon phosphate  aqueux     0,3M,au    pH 3.

   On développe les bandes de  papier par chromatographie     descendante    avec la  phase solvant du mélange équilibré. L'emplacement  des taches correspondant à     l'antibiotique    est facile à  déterminer     par        inspection    aux rayons     ultraviolets.     Une autre méthode plus sensible, consiste à placer la  bande sur un plateau     d'agar-agar    ensemencé avec des  micro-organismes sensibles aux antibiotiques tels que  le     Bacillus        cereus    ou le<I>Bacilles</I>     subtilis,    et à faire  incuber les plateaux.

   Des zones     .d'inhibition    apparais  sent dans les régions     correspondant    aux taches d'anti  biotiques. La comparaison des taches<I>avec</I> des échan  tillons témoins d'antibiotique pur et les     indices         Rf      donnés ci-après, fournissent     une    base pour détecter  la     -présence    du nouvel antibiotique dans la liqueur       fermentée,    et une base     semi-quantitative    pour déter  miner la quantité     présente.     



  On peut :donner     une        illustration    de cette technique  à l'aide de la     fig.    1 du dessin qui montre     comment     la     chromatographie    sur bande de papier peut séparer      et détecter les diverses tétracyclines et les     ,produits     de la présente     invention.    Le dessin représente une  bande de papier 1, sur     laquelle    on a placé, au point  2, une     petite    quantité d'une solution     d'antibiotique     contenant de la tétracycline,

       @de    la     chlorodéméthyl-          tétracycline,    de la     déméthyltétracycdine    et de la       cholrodéméthyltétracycline.        L'activité    antibiotique to  tale de la solution placée au point 2 est de 30     micro-          grammes,    exprimée en     ;tétracycline.    On développe  alors les bandes de papier comme décrit plus haut.  Au bout     d'un    certain temps, on examine les bandes  aux rayons ultraviolets, avec les     résultats        indiqués    sur  le dessin.

   Le front du solvant s'est     avancé    jusqu'au  point indiqué par le trait plein, 3. Le constituant  tétracycline de la     .solution    mixte d'antibiotiques s'est  avancé jusqu'au point 5 .et la     chlorotétracycline    s'est         avancée    jusqu'au .point 7. Le nouvel     antibiotique,        dé-          méthyltétracyclin:e,        s'@est    avancé     jusqu'au    point 4, et  l'antibiotique     chlorodéméthyltétracycline    se trouve  au point 6.

   Les indices     Rf    de ces antibiotiques sont  aussi     indiqués    sur le     .dessin.        L'indice        Rf        ,est    par défi  nition la distance entre la tache et le     point        d'origine    2,  divisée par la distance     entre    le front de solvant 3 et  l'origine 2, et bien     entendu        il    est toujours     inférieur    à  1.

   On peut utiliser divers systèmes solvants pour ob  tenir une série     d'indices        Rf    pour tel ou tel antibioti  que     particulier,    et ces indices sont considérés     comme     très précieux pour     identifier    les antibiotiques et les       distinguer        :d'autres.     



  Les indices     Rf    de     quelques    tétracyclines,     quatri-          mycines    et     déméthyltétracyclines    dans deux     systèmes     solvants précis sont indiqués dans le .tableau suivant  
EMI0005.0053     
  
    Acétate <SEP> d'éthyle <SEP> <B>pH <SEP> 4,7,</B> <SEP> 90/10
<tb>  tampon <SEP> chloroforme%butanol,
<tb>  Antibiotique <SEP> citratep#ho@sphate <SEP> H3P04 <SEP> aqueux
<tb>  (Mac <SEP> Elvain) <SEP> 0,3M <SEP> -I- <SEP> 0,1 <SEP> %
<tb>  acide <SEP> trichlozacétique,
<tb>  pH <SEP> 1,9
<tb>  Chlorotétracycline <SEP> .. <SEP> ... <SEP> . <SEP> <B>0,76-0,80</B> <SEP> 0,61
<tb>  Bromotétracycaine <SEP> <B>.... <SEP> 0,76-0,80 <SEP> 0,61</B>
<tb>  Tétracycline <SEP> . <SEP> ..

   <SEP> ... <SEP> ... <SEP> .. <SEP> . <SEP> <B>......... <SEP> ...</B> <SEP> 0,46-0,47 <SEP> 0,20
<tb>  Quatrimycine <SEP> ........ <SEP> . <SEP> .. <SEP> .. <SEP> ... <SEP> ..... <SEP> 0,14-0,16 <SEP> 0,12
<tb>  Chloroqnatrimycine <SEP> . <SEP> .... <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> <B>0,27-0,28</B> <SEP> 0,33
<tb>  B.romoquatrimycine <SEP> <B>0,27-0,28</B> <SEP> 0,33
<tb>  Oxyquatrimycine <SEP> .. <SEP> . <SEP> . <SEP> <B>0,00-0,06</B> <SEP> 0,11
<tb>  Chlorodéméthyltétracycline <SEP> . <SEP> .. <SEP> <B>0,68-0,72</B> <SEP> 0,39
<tb>  Déméthyltétracycline <SEP> 0,27 <SEP> 0,22
<tb>  Epichlo#rodéméthydtétracycline <SEP> <B>0,25-0,27</B> <SEP> 0,20
<tb>  Epidéméthyltétracycline <SEP> 0,09 <SEP> 0,10       Plusieurs souches de S.

       aureofaciens    qui produi  sent le nouvel     antibiotique    ont été déposées à     d'ARne-          rican    Type Culture Collection, à     Washington.        Elles     sont cataloguées sous les     Nos        ATCC    12 551, 12 552,  12 553 et 12 554.

   Il est entendu que des mutantes,  produisant aussi les     nouveaux.antibiatiques        peuvent     être tirées de ces souches par des méthodes couran  tes, et en fait il faut s'attendre à ce que     certaines.     d'entre elles possèdent la     propriété    de     produire    des  rendements plus élevés d'un ou plusieurs des nou  veaux antibiotiques, dans des conditions     favorables.     Ces     mutants    peuvent varier quelque peu     quant    à  leurs caractéristiques     morphologiques    générales,

   de  même que les diverses souches de l'espèce<I>S.</I>     aureo-          faciens.    On s'attend aussi à ce que d'autres souches  de<I>S.</I>     aureofaciens    productrices de     déméthyhétracy-          cline    puissent être trouvées     @dans    la nature et puis  sent     "être    créées à partir des .souches actuellement iso  lées de<I>S.</I>     aureofaciens    qui ne produisent pas. ce non  vol antibiotique.

      L'un des avantages les plus importants de la dé  méthykétracycline sur les tétracyclines décrites anté  rieurement est sa stabilité     accrue    en     milieu    acide et  alcalin.     L'insta#bilté    de la tétracycline en     milieu    acide  et     l'instabilité        d        @e    la     chlorotétracycline    en milieu     alca-          Un    sont bien,     connues.    La     déméthyltébracyclinie    ne  perd     qu',

  environ    33 0/0 de son activité dans     l'acide     chlorhydrique II à     100o    C en 6     mn.        Dans    la     soude     0,1N ,à 500 C, la     déméthyltétracycli.ne    a une     demi-vie          d@environ    20 heures, contre 3,3     heures    pour la tétra  cycline.

   Ces propriétés inattendues sont très précieu  ses, étant donné que l'instabilité de la     tétracycline    en       milieu    acide et     l'instabilité    de la     chlorotétracycline    en  milieu .alcalin limitent ou empêchent     complètement          l'emploi    de ces substances précieuses dans de nom  breuses applications.

   Grâce -à la stabilité bien     meil-          Jeure    des nouveaux     antibiotiques,        il        est    possible de  préparer de nombreux produits pharmaceutiques qui  ne pouvaient pas être préparés de façon     satisfaisante     avec .les tétracyclines.

   La stabilité     accrue    permet      aussi     d'améliorer    les procédés de     récupération    et de       raffinage,    car on peut avoir recours à des conditions  plus     rigoureuses    de pH et de     température,    .et on peut  donc améliorer l'efficacité -de .diverses étapes du pro  cédé.  



  On a comparé la     déméthyltétracycline    avec les  tétracyclines     dans    des tests<I>in vivo,</I> et on a trouvé  qu'il n'y a pas de     différence        appréciable        ,dans    l'acti  vité antibactérienne des     déméthyltétracyclines    en  comparaison de leurs analogues tétracycline. On en       conclut    donc que     1e    nouvel antibiotique peut servir  au traitement des     mânes    maladies, de la même façon  générale que les     tétracyclines        actuellement        :employées.     



  Les spectres     d'absorptions        d'ultraviolet    des     tétra-          cyclines    et la     déméthyltétracycline    sont très simi  laires.  



  On voit une comparaison des spectres     d'absorp-          don    d'ultraviolet des     tétracyclines        :dans   <B>la</B> tableau<B>1,</B>  qui indique les     coefficients        d'extinction        Ei @m        (absorp-          tion        spectrophotométrique    d'une solution à 1 % me  surée dans une     cellule    de 1     cm)

      mesurés au     maxima     et aux     minima    des     minima    des     différents    antibioti  ques. On a calculé les valeurs d'après les courbes  d'absorption     d'ultraviolet,    en corrigeant à 1<B>()/0</B> les  concentrations auxquelles on a fait les essais. Tous  les     échantillons    ont     été    mesurés dans.     une    solution de       H2SO4        O,1N.     



  Les spectres d'absorptions     d'infrarouge    .de quel  ques produits nouveaux :sont     représentés    sur les .au  tres figures du dessin. La     fig.        2représente    la compa  raison des spectres     d'absorption,        d'infrarouge    de la       tétracycline    base libre et ide ,la     d:

  éméthyltétracycline     base libre.     Comme    on ale voit, il y a plusieurs     diffé-          rences    nettes,     et    aussi des     similitudes.    La     fig.    3  montre le     spectre    d'absorption     d'infrarouge    du     chlor-          hydrate        d'épichlorodéméthyltétracycline.    Ces courbes  ont été obtenues sur un     spectrophotomètre        @automati-          que    enregistreur à     infrarouge     <RTI  

   ID="0006.0068">   Perkin-Elmer    modèle  21, avec les ,antibiotiques en phase solide, comprimés  en un disque avec     KBr.    Voici     d'autres        données     prisme -     NaCI    ; résolution - 2 ; réponse - 1 - 1 ; gain   5 ;     vitesse        1/2     ; suppression - 2 ; et  échelle:<B>50,8</B>     mm    pour un     micron.     



       Diverses    méthodes ont été mises au point pour  titrer les     tétracyclines,    et certaines d'entre     elles    peu  vent servir à titrer les     ,déméthyltétracyclines,    avec bien  entendu des modifications.  



       L'épidé#méthyltétracyrlinc    de la présente inven  tion est considérée comme     un    isomère de la     dém6thyl-          tétracycline.    La     différence    structurale semble être  basée sur un     réarrangement    du groupe     diméthyl-          amine    sur     l'atome   <B>d</B>e carbone en position 4.

   Appa  remment, .dans certaines     conditions    qui :seront     décrites     plus en détail ci-après, l'inversion se produit     st    on  obtient un :mélange à l'équilibre de     démébhylt6tra-          cycline    et -de son     épinière.    On peut     séparer    les deux  pour     obtenir    des produits pratiquement     purs.     



  On peut convertir la     déméthyltétracycline    en sa  forme isomère en ajustant     simplement    le pH d'une  
EMI0006.0101     
      solution     concentrée    de     l'antibiotique    entre 3,0 et 5,0  et     en,    laissant reposer la     solution    jusqu'à ce que l'iso  mérisation soit parvenue à     un    équilibre.

   Les     condi-          tions    les plus     importantes    qu'il est nécessaire de régler  pour convertir da     -déméthyltétracycline        @en    ses iso  mères sont la     concentration,    le     pH,    le temps et la       température.     



  Le     plus    commode est -de réaliser     l'isomérisation    à  la température ambiante,     ruais    à des températures  plus élevées, on obtient un taux de conversion plus  <I>élevé. Le pH</I> doit être compris     -entre    3,0 et 5,0 envi  ron, de     préférence        entre    3,5     @et    4,5. Il se produit une  certaine     é:pimérisation    à .des pH sortant de cet     inter-          valle,    et     même    dans l'eau distillée<B>;</B> mais la vitesse est  très faible.

   La concentration de l'antibiotique dans la       solution    -aqueuse doit être aussi élevée que possible  si l'on vent obtenir des vitesses     d'épimérisiation        plus     grandes.     rL'équilibrage    complet peut     nécessiter    une  durée d'environ 24 heures à<B>250</B> C, mais on peut  obtenir un équilibrage     satisfaisant    en un temps     beau-          coupplus    court dans des     conditions    déterminées. Or  dinairement toutefois, on obtient les meilleurs résul  tats en laissant reposer la solution pendant des durées  d'une semaine ou davantage.

   Il     semble    que l'équilibre  soit atteint, dans la plupart des cas, à 50     0/0environ    ;  autrement dit, à     l'équilibre    la moitié environ de la       déméthyltétracycline    est convertie .en     épimère.     



       Etant    donné que la concentration est un facteur  important pour obtenir des rendements     élevés    en de  courts laps de temps, il faut choisir un système sol  vant qui donne la plus forte     concentration    de     dé-          mé        thyltétracycline.    Il faut     tamponner    ces systèmes  solvants pour obtenir un pH compris dans l'inter  valle préférentiel.

   Les divers solvants     comprennent    le  méthanol, l'éthanol, le     butanol,        l'facétone,    le     2-éthoxy-          éthanol,    le     2-méthoxypropanol,    le     tétrahydrofurrane,     la     diméthylformamide    et les mélanges de ces     solvants.     On peut utiliser d'autres solvants encore.

   Un -tampon  préférentiel est le phosphate     monoso@dique,    mais. on  peut utiliser d'autres     tampons    et     couples    de     tampons     qui maintiennent le pH dans     l'intervalle    désiré.  



  On peut récupérer     ll'épimère    de la     présente    inven  tion à partir d'une ,solution aqueuse,     rde    la même  façon générale que l'on récupère .les     .tétracyclines.     Bien qu'il ait une activité     antibactérienne,   <I>in vitro</I> et  <I>in vivo,</I> légèrement     inférieure    à celle de la     déméthyl-          tétracycline,        l'épimère    est encore :

  très utile -dans le       traitement    des maladies causées par les     bactéries,     grâce à son activité antibactérienne     appréciable.     



  Comme on     pourrait    .s'y attendre, le     déméthyl-          tét:racycline    forme des     sels        et    des complexes du même  type, et de la même façon générale, que -les tétra  cyclines. Le     traitement    par les acides à un pH infé  rieur à 4 environ aboutit à la formation de sels d'aci  des.

   On peut     obtenir    la base libre à un pH de 4 à 6  environ; et aux pH     supérieurs    à 6, on obtient     !des     sels avec des bases, par exemple le sel de     ,calcium.    De       même,    on forme des sels des     épimères.     



  Comme on l'a indiqué     @précédemment,    le procédé  de la présente     invention    pour da préparation de la         déméthyltétracycline    se     distingue        notamment    du Pro  cédé de     préparation    ;

  de la     chlorotétracycline,    de la       tétracycline    et de la     bromotétracycline,    par le fait que  l'on choisit une souche     mutante    de<I>S.</I>     aureofaciens     qui produit la     déméthyltétracycline    au     lieu    de l'une  des     tétracyclines.    La composition du milieu de     fer-          mentation,    la durée d'aération, la température, le  réglage des ions d'hydrogènes, la méthode d'inocula  tion, etc., utilisés lors :

  de la production de     chlor-          tétracycline,    -de     bromtétracycline    et de     tétracycline     se     prêtent    également pour la production :de da nou  velle     déméthyltétracycline.     



  Afin que     lie        processus    de     fermentation    suivant       l'invention    puisse être plus     complètement    compris, on  le     ,décrira    maintenant en se référant     aux        exemples     .précis qui     suivent     <I>Exemple 1</I>  On peut préparer un milieu .approprié     pour    la       préparation    d'inocula     destinés    à ces     fermentations,     avec les substances suivantes       sucrose    30 g/1       (NH4)

  2S04        ..        ...        ..        ..........    2     g/1     CaC03     ....   <B>------ .............</B> .....     ..............    7     g/1     ;liqueur de macération de mais     .-.---    16,5     cm3/1     Le pH du     milieu    ainsi obtenu ,est d'environ 6,8.

    On mesure une portion de 8     cana    que l'on     introduit     dans un tube     B.rewer    de 20     cm,    et on stérilisé à 1200 C       pendant    20     minutes.    On inocule     alors    le     milieu    stéri  lisé avec 0,5     cms    d'une suspension aqueuse de     spores     d'une souche de<I>S.</I>     aureofaciens    capable de produire  de la     chlorodéméthyitétracycline,    par     .exemple    la sou  che S-604,

   la     suspension    contenant environ 40 - 60  millions de spores par     cm3.    On fait incuber le milieu  inoculé     pendant    24 heures à<B>280</B> C, sur une     ;secoueuse     alternative     fonctionnant    à 110     cycles    par minute.  



  Un milieu de     fermentation    ,approprié contient de  l'eau et un     milieu    typique qui convient pour     produire     de la     chloro:déméthyltétracycline    est de suivant  
EMI0007.0155     
  
    amidon <SEP> de <SEP> maïs <SEP> 55 <SEP> g/1
<tb>  CaC03 <SEP> ._<B>-</B> <SEP> ....... <SEP> ...... <SEP> ... <SEP> 57 <SEP> g/1
<tb>  (NH4)2S04 <SEP> .... <SEP> . <SEP> .. <SEP> ... <SEP> <B>---- <SEP> -------</B> <SEP> 5 <SEP> g/1
<tb>  FeS04. <SEP> 7H20 <SEP> .. <SEP> ....... <SEP> ...... <SEP> . <SEP> 40 <SEP> mg/1
<tb>  MnS04. <SEP> 4H20 <SEP> ....... <SEP> . <SEP> . <SEP> _ <SEP> <B>....... <SEP> <I>50</I></B> <SEP> mg/1
<tb>  ZnS04. <SEP> 7<B>1-1</B>20 <SEP> .100 <SEP> mg/1
<tb>  CoC12. <SEP> 6H20 <SEP> ..... <SEP> ...........

   <SEP> 5 <SEP> mg/1
<tb>  liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> maïs <SEP> _ <SEP> 30 <SEP> g/1
<tb>  farine <SEP> de <SEP> graine <SEP> de <SEP> coton <SEP> .... <SEP> .... <SEP> . <SEP> .... <SEP> 2 <SEP> g/1
<tb>  huile <SEP> de <SEP> saindoux <SEP> .. <SEP> . <SEP> .... <SEP> . <SEP> . <SEP> .. <SEP> 2,0%
<tb>  en <SEP> volume       Quand on restreint la teneur de ce     milieu    en ions  chlorure, cela tend à augmenter la quantité ide     dé-          m6thyltétracycline    aux dépens de la     production    de       chlorordéméthyltébracychne.     



  <I>Exemple 2</I>  On     prépare    un milieu     d'inoculation    comme décrit  à     l'exemple    1 et on     l'inocule    avec des .spores d'une  race de<I>Streptomyces</I>     aureofaciens        productrice    de dé-           méthyltétracycline.    On laisse incuber cet     inoculat     pendant 24 heures à     28     C dans un agitateur de  culture à mouvement alternatif.

   On prépare un milieu  de fermentation contenant  farine de maïs .     ..        ...    . .. . 14,5 g/1       amidon    de maïs<B>-------</B>     ..        ....   <B>----</B>     ...........    47,5 g/1  liqueur de macération du maïs  à 50 % de matières     solides-----    . 22,5     g/1     9,0 g/1       (NH4)2S04    .....<B>--------------------------</B> .<B>------</B> .5,85 g/1       NH4Cl   <B>---------------</B> ..<B>-----</B>     ..   <B>--------------</B>     .......    . .

   1,66     g/1-          MnS04    (70 %)<B>------------------------------ -</B>     ..    56     mg/1          COCI2    - 5H20     _.---------        ...    .<B>-------</B>     ..        ._..    5     mg/1     huile de lard<B>----------------</B>     ....------        _    . 25     mil/1     Ce milieu est réparti à raison -de 30     ml        chacun     dans -des     flacons        d'Erlenmeyer    de 250 ml.

   On bouche  les     flacons    avec des tampons d'ouate et les     stérilise     pendant 20 minutes à     121c)    C. Après refroidissement,  les flacons stérilisés sont inoculés avec 1     m1    de     l'ino-          culat,    incubé pendant 24 heures, de la race     décrite     ci-dessus. Les flacons de fermentation inoculés sont       soumis    à une incubation dans un agitateur de culture  à mouvement     .rotatif,    à une     température    ne dépassant  pas 280 C. On laisse la fermentation -se     poursuivre     pendant 140 heures.

   Un échantillon de ce bouillon  fermenté est alors analysé quant â sa teneur en     Chloro-          tétracycline,    en :se servant de la méthode, décrite dans       cette        !demande,    consistant à mesurer le     changement     d'absorption     dans    l'ultraviolet avant et après dégrada  tion alcaline. La .teneur     calculée    .en     chlorotétracycline     est inférieure à     40,y/ml,        dest,à-,dire    à la     sensibilité     garantie de cette méthode d'analyse.

   Par chromato  graphie sur papier du bouillon     fermenté,    on ne trouve  que des     .traces    de     chlorotétracycline.    Par la     ânéthodc     d'analyse     spectrophotométrique        @décrite    dans     cette     demande,

   on trouve une teneur en     déméthylchloro-          tétracycline    et     déméthyltétracycline        correspondant    à  2090     y/ml.    La     chromatographie    sur papier montre  que ces deux     déméthyltétracyclines    se trouvent en  proportions à peu près     égales.     



  <I>Exemple 2a</I>  On prépare un     milieu    d'inoculation     comme    dans  l'exemple 1 :et on l'inocule ,avec des     spores    d'une race       différente    de<I>S.</I>     aureofaciens    productrice de     déméthyl-          tétracycline.    Cet     inoculat    est incubé     comme    décrit à       l'exemple    1.

   On prépare un milieu de fermentation  contenant:  farine de mais ..<B>------------------ .....</B> . . 67,0     g/1     liqueur de macération du maïs  à 50 % de matières     solides.    25,0 g/1       CaCO3    pulvérisé     ....        ...        ..        ........   <B>-----</B> 9,0     g/1          (NH4)2S04        .........        .......        ..        .....   <B>---- 6,75</B>     g/1     4 2,

  0 g/1       MnS04        (70        %)        ._..-    .     ..        .....        ...        ._        100        mg/1          CoC12.    6H20     .........    ...     ...    5     mg/1     huile de lard .<B>--------</B> ... .     ...        .......    30     m1/1     Cc milieu     -est    traité, inoculé et     incubé    comme  dans l'exemple 2.

   Le     bouillon    récolté est analysé    aussi bien par spectrophotométrie que par chromato  graphie     sur    papier. La chromatographie sur papier ne       permet    pas ide ,déceler la présence de     chlorotétracy-          cline.    L'analyse     spectrophotométrique    donne une te  neur totale en     déméthyltétracycline    de 1430     yAnl,     dont 300     y/ml    de     déméthylchlorotétracycline.    Par  chromatographie sur papier, on s'assure que le reste  de la totalité des substances antibiotiques est formé  de     déméthyltétracycline,

      dont la teneur calculée par       différence    est de 1130     y/ml.     



  <I>Exemple 2b</I>  On     effectue    une     fermentation    dans les conditions  décrites à     l'exemipel    2, sauf que l'on utilise une race  différente     ide    S.     aureofaciens        productrice    de     déméthyl-          tétracycline        comme    agent de fermentation et que le       milieu    de     fermentation    contient  farine de maïs . .. .. 16,9     g/1     amidon<B>de</B> maïs .

   66,42     g/1     liqueur de     macération        idumaïs,     à 50 % de matières     sodi@des    . 27,5     g/1          CaCO3        pulvérisé    11,43     g/1          (NH4)2S04    9,0 g/1       NH4Cl        .....        .......    ....... 2,0     g/1          MnS04    (70%) .. . .. 160     mg/1          CoCl2.6H20    5     mg/1     huile de lard ... ... ..

   33,3     m1/1     On laisse la     fermentation    se poursuivre pendant  140 heures. Comme l'indique la chromatographie sur  papier, le bouillon de fermentation ne     contient    que  de la     déméthyltétracycline.    Un essai     biologique    du  bouillon     révèle    une teneur en     déméthyltétracycline     correspondant à 810     ;,/ml,    vis-à-vis du     staphylo-          coccus        aureus.     



  <I>Exemple 3</I>       Fermentation   <I>eh cuve</I>  On conduit une     fermentation    de 40     litres    dans  une cuve pilote, essentiellement     suivant    la méthode  décrite à l'exemple 2. Après avoir préparé     'le    milieu,  on le stérilise pendant 25 minutes à 125c C et on  l'inocule avec un     inoculum    de souche S-604 préparé  comme indiqué par     Duggar,    brevet des Etats-Unis  d'Amérique No 2482055. On conduit la fermenta  tion avec agitation continue à une température de  280 C pendant les 24     premières    heures, et     25(,    C jus  qu'à achèvement, .en 135 heures.

   On introduit de  l'air stérile à raison     ide    0,3     1/1/mn    pendant les seize  premières heures, puis .à raison de     0,51/1/mn    jusqu'à  la récolte.  



  Les exemples suivants illustrent la     récupération,     le     raffinage    et la séparation des antibiotiques.  <I>Exemple A</I>  <I>Raffinage de la</I>     chlorodéméthyltétracycline     <I>et de la</I>     défnétlayltétracycline     On prépare     25,81itres    de     liqueur    comme dans       l'exemple    3, on les traite par 200     cm2    d'acide chlor  hydrique     concentré    pour ajuster le pH à 1,5. On filtre      la liqueur traitée, après l'avoir mélangée à 2,8 kg  d'un adjuvant de filtration, pour     obtenir   <B>16,3</B> litres  de filtrat.

   On reprend de .tourteau de filtration par  25 litres d'eau à une     température    d'environ 500 C et  on ajuste au pH 1,5.     Après    avoir agité pendant 30  minutes, on     filtre    le .tourteau     @délayé    et on     réunit    le  filtrat au filtrat     précédent,    pour former une masse  de 42,3 litres. On traite le     filtrat    réuni avec 6,76 kg  de     chlorure    de sodium et on extrait à quatre reprises  par le     butanol    à raison de 15 0/0 :du volume du fil  trat.

   On réunit les extraits, on les     clarifie        par    filtra  tion et on des     concentre    sous vide à 25 - 300 C jus  qu'à un volume final de 6 litres.  



  <I>Exemple B</I>  <I>Séparation</I>     chromatographique     <I>de la</I>     chlorodéméthyltétracycline     <I>et de la</I>     déméthyltétracycline     On divise le     concentré    au     butanol    de     l'exemple    A  en deux     portions        égales,    on concentre :l'une à  900     cm3    et on concentre l'autre à 610     cm3    sous vide.

    On filtre les     concentrés    et on les ajuste au pH 2       avec        de        la        soude        .à        50        %.     



       Pour    préparer le système solvant utilisé pour la  séparation     chromatographique,    on équilibre un     mé-          lange    à     80        %        ide        butanol        et        20        %        de        chloroforme     avec ide l'eau ajustée -au     .pH    2 au moyen     d'acide     chlorhydrique.

   Les     colonnes    sont :des colonnes de  verre de 15 cm de diamètre garnies ;de 2,8 kg de  terre     d'infusoires    lavée à l'acide. On     équilibre    les       colonnes    avec la phase ,aqueuse du     système    solvant  avant l'usage.  



  On traite les deux concentrés .au     buroanol,    :sur des  colonnes séparées. On verse doucement les concen  trés dans le haut des colonnes. Puis on     élue        les.    co  lonnes avec la phase     solvante    que l'on fait passer au  travers à raison d'environ 10 litres par heure.     Dans     chaque cas, on prend 40     tranches    de 500     cm3,        et    on       détermine    la teneur en antibiotique de chacune     par     chromatographie sur bande de papier.

   Dans la por  tion de 900     cm3,    les     tranches    6 à 17     contiennent    la       chlorodéméthyltétracycline    et la     chlorotétracycline,    et  les     tranches    24 à 40     contiennent    la     déméthyltétra-          cycline    et la     :

  tétracycline.        Dans    la portion de     610        cm3,     les tranches 7 à 18     contiennent    la     chlorodéméthyl-          tétracycline        et    la     chloroitétracycline,    et les tranches  19 à 31     contiennent    la     déméthyltétracycline    et la       tétracycline.     



  <I>Exemple C</I>  <I>Récupération de la</I>     déméthyltétracycline     <I>à partir de fractions de colonne</I>  On réunit les tranches de     l'exemple    B qui con  tiennent la     déméthyltétracycline    pour     obtenir    un vo  lume de 14 litres. On -ajoute un égal volume d'eau  et on concentre le     mélangesous    vide :à     241,    C jusqu'à    un volume de 565     cm3    de     :solution    aqueuse.

   On ajuste  le pH :du     concentré    à 1,65 en     ajoutant    de l'acide       chlorhydrique    concentré, et. on lave la solution à  deux reprises avec 55     cm3    de     :

  chloroforme.    On     filtre     la solution .lavée     @et    on l'ajuste au     pH    5,8     avec    ide       la        soude    à     50        %.        A.près        vieillissement        de    3     heures    à  la     température    ambiante, .et 15 heures à     4()    C, on  filtre la     bouillie        cristalline    obtenue et on lave le pro  duit à l'eau et on .sèche sous vide à     401)

      C. On     obtient     un rendement de 4,7 g de     ,dêmé@thyltétracycline    neu  tre     brute        titrant        880.microgrammes        par    mg     exprimés     en chlorhydrate de     tétracycline,    ce qui représente un       rendement        d'ensemble        de        73        %    à     partir        du        concen-          tré    aqueux.  



  Les sels de     déméthyltétracycline    peuvent se for  mer par un     :traitement    avec des acides et des bases.  L'acide     chlorhydrique    est :un     acide        préférentiel        parce     que les sels de cet     acide    et des     déméthyltétracyclines     sont des produits très     utiles.    On peut     communiquer     des propriétés     spéciales        enutilisant        d'autres        ,acides;

       tels que l'acide     sulfurique,        l'acide        phosphorique,     l'acide acétique, l'acide borique et les :autres     acides     organiques et inorganiques. On peut     préparer    des       sels    avec des bases, en utilisant les     hydroxydes        alca-          lins    tels que la soude et ales hydroxydes.     alcalino-          terreux,    comme indiqué     plus    haut.

   Le sel de calcium       est        particulièrement    utile, et on peut le     préparer    en       ajustant        simplement    au ,pH 6 - 10 une solution  :aqueuse de     déméthyltétracycline,    avec au     moins    un  équivalent     molaire    de calcium dans la solution.

   On  peut préparer les sels de baryum, de .magnésium, de  strontium,     :etc.,    de façon     similaire.   <B>Il</B> sue     forme    aussi  des complexes de     déméthyltétracychne    .avec le     bore,     le     zirconium    et     d'autres    ions     métalliques    polyvalents,       comme    dans le cas des     tétracyclines.     



       Evidemment    si le     milieu    de     fermentation    ne con  tient pas de chlore ni de     brome,    on ne     peut    pas     for-          mer    .de     chlorodéméthyltétracycline    ni de     bromodémé-          thyltétracycline.    En     pareil    cas,     d'antibiotique        princi-          pal    sera la     déméthyltéroracycline.    Quand on élève la       teneur    en ions     chlorure,

          particulièrement        au-dessus     de 50 .parties par     million,        il    se     forme    des     .quantités     notables de     chlorodéméthyltétracycline,    car une par  tie d'ions chlorure peut amener la formation d'envi  ron 14 parties :de     chlorodéméthyltétracycline.     



  Une petite     concentration    d'ions bromure dans le       milieu    de fermentation, d'environ 10     parties    par mil  lion ê     plusieurs    pour-cent, tend -à diminuer la forma  tion .de     chlorodéméthyltébracycline,    et la formation  de     déméiacycline    est     généralement        accrue.  



  Process for the preparation of an antibiotic The present invention relates to a process for the preparation of demethyltetracycline and its spines.



  The new antibiotic in question is formed in a fermentation process in which mutant strains of Streptomyces aureofaciens are used. The new antibiotic appears to be closely related to members of the tetracycline family previously described, but is markedly different. It is characterized by a marked stability both in alkaline environment and in acidic environment,

   and is superior to tetracyclines in this regard. It has similar antibiotic activity and can be used for the same uses, and in the same general way, as the currently known tetracyclines.



  According to the invention, there is provided a process for the preparation of the antibiotic demethyltetracycAine and its spines, this process being characterized by the fact that an aqueous nutrient medium is fermented under aerobic conditions containing an assimilable source of carbon, nitrogen and mineral substances with a strain: of <I> S. </I> aureofaciens producing demethyltetracycline.



  In fact, it has been observed that by using certain mutant strains of <I> S. </I> aureofaciens which will be more particularly described below, an antibiotic substance similar to tetracycline is obtained. The particular new antibiotic which is formed as a result of the fermentation process depends on the nature of the nutrient medium and other conditions of the process. In a chloride-free medium, the predominating antibiotic is the unchlorinated analogue of te tracycline.

   In a medium rich in bromine, the brominated antibiotic is formed; and in a medium rich in chlorine, the predominant antibiotic will be a chlorinated antibiotic similar to chlorotetracycline. Usually, tetracycline, chlomotetracycline and / or bromotetracycline are also formed during the fermentation process, and their relative proportions depend on the chloride and / or bromide ion content of the medium, and of the strain of microorganism used.

   By carefully selecting the strain of <I> S. </I> aureofaciens, it is possible to almost completely eliminate the formation of these known antibiotics of the tetracycline group.



  The new antibiotic can be converted to epimers as described below, similar to the conversion of tetracycline to quatrimycins.



  Chemical analyzes, and examination of the chemical and physical properties of the new compound indicate that it differs essentially from the tetracyclines in that they contain one less methyl group.

   The methyl group in question is very similar to that which occupies the 6 position on the naphtacene ring of tetracyclines. Accordingly, the tetracycline analog will be called 4-dimethyl amino-1,4,4a, 5,5a, 6,11,12a-octahydro-3,6,10,12,12a-pentahydroxy -1,11 -dioxo-2-naphtacene-carboxamid @ e. The appropriate common name for this new antibiotic would be demethyltetracycline, and this nomenclature will be used herein.

   But it is understood that the postulated structure has not been proved by an unequivocal synthesis, and could be found to be erroneous thereafter. The present invention relates to a determined process for the preparation of compounds which possess specific properties, and which are not limited by a partial system of nomenclature nor by a probable structure.



  The new antibiotic is produced by certain mutant strains of <I> S. </I> aureofaciens. These strains are undoubtedly <I> of </I> the species <I> Streptomyces </I> au- reofaciens, since they derive from the prianitive strain A-377 isolated by D.r B.M. Duggar,

      and deposited at the Northern Regional Research Laboratories in Peoria (Illinois, United States),. and indexed in this Laboratory under the N NRRL 2.209.

   Mutations involving treatment of strain A-377 with mutagens, successively comprising ultraviolet irradiation, nicotine and hydrochloride:

  2,2 = dichloro-N-methyldiethylamine spleen, were used to create one of the strains. Various others. strains were obtained by spontaneous mutation and by treatment with mutagens. These various strains which produce the new antibiotics in dif ferent proportions and with varying yields,

    show the general characteristics of the species <I> S. </I> aureofaciens. They differ a little from each other and also from the strains of S. aureofaciens previously described, mainly by their pigmentation and their property of producing new antibiotics. In most cases, a reddish brown pigment is noted when the microorganisms are grown on ordinary culture media.

   The shades of the pigment vary from a peach or coppery brown shade to a dark mahogany, depending on the particular strain and the nutrient medium used. Although the property of producing the new antibiotic of the present invention is generally associated with strains which exhibit this type of pigmentation, this pigment formation in the production of the new antibiotics are not necessarily interdependent properties.

   All the strains studied produce chlorotetracycline, and generally tetra cyclin, although the relative proportions of these antibiotics vary considerably depending on the nature of the fermentation medium, the fermentation conditions and the particular strain chosen.

   In some cases the production of chlorotetracycline and tetracycline is very low, on the order of a few percent of the total antibiotic produced by fermentation.



  The mutant strains which produce the novel antibiotic of the present invention have the same general characteristics as the strains which produce tetracycline, and they differ from each other in the same general way as the strains producing tetracycline differ from one another. on the other, as has been explained: in several scientific articles which have been: published.

   Although: many strains of S. aureofaciens are available to the public in culture collections and have been described in patents, and in the scientific literature the following data will serve to illustrate the type of variation of the new strains, compared to the primitive strain A-377 which: is found: under the designation NRRL 2.209.



  <I> Comparison of S. </I> au.reofaciens <I> S-604 and A-377 strains on various media </I> The <I> Streptomyces </I> aureofaciens strain S-604, which produces Chlorodemethyltetracycline and Demethyltetracyclin: e was compared to <I> Streptomyces aureofa- </I> ciens strain A-377 (NRRL 2.209) by observing growth characteristics on various media incubated at 26-27 C.



  The observations made are as follows
EMI0002.0078
  
    <I> 1. <SEP> Glycerol, <SEP> asparagine, <SEP> extract <SEP> from <SEP> beef, </I>
<tb> <I> agar-agar </I>
<tb> Glycerol <SEP> 1.0 <SEP>%
<tb> Asparagine-L <SEP> 0.05%
<tb> Extract <SEP> from <SEP> beef <SEP> .. <SEP>. <SEP> 0.02%
<tb> KH2P04 <SEP>. <SEP> .... <SEP> 0.05 <SEP> / o
<tb> Agar, agar <SEP> Bacto <SEP> 1.5 <SEP> 0/0
<tb> Distilled <SEP> water, <SEP> q.s. <SEP> for <SEP> ... <SEP> .. <SEP>. <SEP> 100 <SEP>%
<tb> <SEP> adjustment of <SEP> pH <SEP> by <SEP> KOH
<tb> to <SEP> 50 <SEP>% <SEP>. <SEP> .. <SEP> .. <SEP>. <SEP> 7.0 <SEP> 0/0
<tb> pH <SEP> after <SEP> sterilization <SEP> 7.1 <SEP> 0/0
<tb> <I> Streptomyces <SEP> aureofaciens </I>
<tb> <I> Strain <SEP> S-604 <SEP> Strain <SEP> A-377 </I>
<tb> Growth <SEP>.

   <SEP> Abundant, <SEP> neck- <SEP> Fairly <SEP> abundant
<tb> their <SEP> <SEP> Venetian
<tb> red <SEP> <SEP> ()
<tb> Hyphae <SEP> aerial <SEP> Abundant, <SEP> White, <SEP> unifor white <SEP> to <SEP> <SEP> Pink <SEP> mes
<tb> gray <SEP> <SEP> ()
<tb> Sporulation <SEP> Slight, <SEP> deve- <SEP> None
<tb> nant <SEP> abundant
<tb> Pigment <SEP> diffusible <SEP> Brown <SEP> reddish <SEP> Yellow
<tb> Reverse <SEP> <SEP> Bmown <SEP> Maho- <SEP> Yellow <SEP> to <SEP> yellow
<tb> gany <SEP> <SEP> () <SEP> orange <SEP> light
<tb> () <SEP> Designation <SEP> of the <SEP> shades <SEP> according to <SEP> the <SEP> <SEP> Color <SEP> H @ ar mony <SEP> Manual <SEP> <SEP > 3rd <SEP> edition, <SEP> edited <SEP> by <SEP> Container
<tb> Corporation <SEP> of <SEP> America.

       
EMI0002.0079
  
    <I> 2. <SEP> Dextrin, <SEP> Czapek-Dox, <SEP> agar-agar </I>
<tb> Dextrin <SEP> 1.0 <SEP> 0/0
<tb> NaN03 <SEP> ....... <SEP> 0.2 <SEP> 0/0
<tb> K.HP04 <SEP> 0.1 <SEP>%
<tb> MgSO ,. <SEP> 7H.0 <SEP> 0.05 <SEP> lo
<tb> KCl <SEP> ... <SEP> 0.05 <SEP>%
<tb> FeSO4. <SEP> 7H.0 <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> <B> 0.001% </B>
<tb> Agar-agar <SEP> Bacto <SEP> .. <SEP> 1.5 <SEP>%
<tb> Distilled <SEP> water, <SEP> q: s. <SEP>, for <SEP>. <SEP> 100.0 <SEP>%
<tb> pH <SEP> after <SEP>. sterilization <SEP> 7;

  0 <SEP> 0/0
<tb> <I> Streptomyces <SEP> aureofaciens </I>
<tb> <I> Strain <SEP> S-604 <SEP> Strain <SEP> A-377 </I>
<tb> Growth <SEP> Rare, hyagine <SEP> Profuse
<tb> Hyphae <SEP> .aerial <SEP> Absent <SEP> Abundant,
<tb> <SEP> lead <SEP> gray <SEP> <SEP> ()
<tb> Globules <SEP> su perfware <SEP> inco lores
<tb> Sporulation <SEP> None <SEP> Abundant
<tb> Pigment <SEP> diffusible <SEP> None <SEP> Light, <SEP> yellow
<tb> pale
<tb> Reverse <SEP> _. - .- <B> ------- <SEP> ---- </B> <SEP> No <SEP> pigmented <SEP> No <SEP> pigmented
<tb> () <SEP> see <SEP> previous <SEP> note
EMI0003.0001
  
    <I> 3. <SEP> Liqueur <SEP> of <SEP> maceration <SEP> of <SEP> corn, <SEP> agar-agar </I>
<tb> Liqueur <SEP> ide <SEP> maceration <SEP> of <SEP> maize <SEP> 0.4 <SEP>%
<tb> Sucrose <SEP> ---- <SEP> - ..

   <SEP> - <SEP> - <SEP> 1.0 <SEP>% <SEP> Sporulation <SEP> Very <SEP> abundant, <SEP> Very <SEP> abundant,
<tb> MgS04. <SEP> 7H0 <SEP> 0.025% <SEP> uniform <SEP> uniform
<tb> KH204 <SEP> ...-. <SEP> <B> ------- </B> <SEP> - .. <SEP> -..-.-..- <SEP>. <SEP> -..- <SEP> ..-- <SEP> 0.2 <SEP>%
<tb> (NlÎ4) 2HP04 <SEP> --.. ----. - ........ 0.2 <SEP>% <SEP> Pigment <SEP> diffusible <SEP> Very <SEP > concentrated, <SEP> yellow <SEP> greenish
<tb> A.gar-agar <SEP> Bacto <SEP> .-. <SEP>. <SEP>. <SEP> ... <SEP> 2,0 <SEP>% <SEP> deep <SEP> brown <SEP> clear
<tb> <SEP> water from <SEP> tap, <SEP> q.s.

   <SEP> .for <SEP> __ <SEP> 100.0 <SEP>% <SEP> to <SEP> deep <SEP> brown
<tb> pH <SEP> after <SEP> sterilization <SEP> - <SEP> - <SEP> 6.3 <SEP> / o <SEP> Mahogany
<tb> <I> Streptomyces <SEP> aureofaciens </I> <SEP> Reverse <SEP> <B> ------- </B> <SEP> Brown <SEP> Covert <SEP> Brown
<tb> <I> Strain <SEP> S-604 <SEP> Strain <SEP> A-377 </I>
<tb> Mahogany <SEP> (C)
<tb> Growth <SEP> <B> --------- </B> <SEP>. <SEP> Profuse <SEP> Profuse <SEP> dark <SEP> ()
<tb> Hyphae, aerial <SEP>. <SEP> - <SEP> Abundant <SEP> Abundant,
<tb> pink, taupe <SEP> () <SEP> Beaver
<tb> dark <SEP> () <SEP> see <SEP> previous <SEP> notes
<tb> <I> 4.

   <SEP> Other <SEP> backgrounds </I>
<tb> <I> Streptomyces <SEP> aureofaciens </I>
<tb> <I> Strain <SEP> S-604 <SEP> Strain <SEP> A-377 </I>
<tb> Agar @ agar <SEP> nutritious <SEP> Growth <SEP> poor, <SEP> <SEP> Taupe <SEP> brown <SEP> <SEP> to <SEP> Growth <SEP> fairly <SEP> abundant. <SEP> No <SEP> of hyphae
<tb> <SEP> dark <SEP> brown <SEP> <SEP> (). <SEP> Not. <SEP> of aerial <SEP> a- <SEP> hyphae. <SEP> To <SEP>:

   <SEP> pale yellow <SEP>. <SEP> Pigment <SEP> are nothing. <SEP> Reverse <SEP> <SEP> Taupe <SEP> brown <SEP> <SEP> (). <SEP> Pig- <SEP> luble <SEP> yellow <SEP> to <SEP> yellow <SEP> brownish <SEP> light
<tb> ment <SEP> soluble <SEP> brown <SEP> reddish
<tb> Glucose, <SEP> asparagine, <SEP> Abundant <SEP> growth. <SEP> Large <SEP> hyphae <SEP> a- <SEP> Growth <SEP> fairly <SEP> abundant. <SEP> Hyphae <SEP> ate extract <SEP> from <SEP> meat, <SEP> nothings <SEP> variegated: <SEP> <SEP> pink <SEP> taupe <SEP> <SEP> to <SEP> <SEP > Fawn <SEP> <SEP> nothing white <SEP> <SEP> becoming <SEP> of <SEP> plus <SEP>: in <SEP> more
<tb> agar-agar <SEP> or <SEP> <SEP> carcel <SEP> <SEP> (). <SEP> Sporulation: <SEP> abon- <SEP> gray <SEP> when <SEP> the <SEP> formation <SEP> of <SEP> isporcs <SEP> aug dante. <SEP> Reverse:

   <SEP> <SEP> Taupe <SEP> brown <SEP> <SEP> (). <SEP> Pig- <SEP> lie. <SEP> Reverse: <SEP> Light yellow <SEP>. <SEP> Pigment <SEP> n / a, ent <SEP> soluble <SEP> brown <SEP> reddish <SEP> luble <SEP> yellow <SEP> light
<tb> Apple <SEP> of <SEP>. earth <SEP> Growth <SEP> profuse <SEP> moist, <SEP> smooth, <SEP> modulated <SEP>: <SEP> Growth <SEP> profuse <SEP> smooth, <SEP> wet, <SEP> nodu <<SEP> Dark <SEP> brown <SEP> Mahogany <SEP> <SEP> () <SEP> with <SEP> trace <SEP> iée <SEP>: <SEP > <SEP> Light <SEP> Mellon <SEP> Yellow <SEP> <SEP> () <SEP> to <SEP> <SEP> An de <SEP> <SEP> peach <SEP> tan <SEP> <SEP> (). <SEP> Aerial <SEP> hyphae <SEP>: <SEP> tick <SEP>. <SEP> pink <SEP> <SEP> (). <SEP> Aerial <SEP> hyphae <SEP>:

   <SEP> trace.
<tb> absent <SEP> to <SEP> abundant, <SEP> becoming white <SEP> <SEP> to <SEP> No <SEP> of soluble <SEP> pigment <SEP>
<tb> <SEP> carcel <SEP> <SEP>. (). <SEP> Abundant <SEP> sporulation
<tb> in <SEP> the <SEP> zones <SEP> of <SEP> cast <SEP> formation <SEP> of aerial <SEP> hypes. <SEP> Pigment <SEP> soluble <SEP> <SEP> choco late <SEP> <SEP> () <SEP> to <SEP> <SEP> chocodate <SEP> brown <SEP> <SEP> ()
<tb> Milk <SEP> purple <SEP> Light <SEP> collar <SEP> of <SEP> growth <SEP> <SEP> Deep <SEP> red <SEP> Light <SEP> collar <SEP> of <SEP> growth <SEP> white <SEP> to <SEP> yellow
<tb> Mahogany <SEP> <SEP> (). <SEP> Little <SEP> of <SEP> variation <SEP> nota- <SEP> pale.

   <SEP> Little <SEP> of <SEP> noticeable <SEP> variation <SEP> of <SEP> pH,
<tb> ble <SEP> of <SEP> pH, <SEP> little <SEP> of <SEP> peptonization <SEP> appa- <SEP> little <SEP> of <SEP> peptonization <SEP> apparent <SEP> in <SEP> 15
<tb> annuity. <SEP> Slight <SEP> reaction <SEP> colored <SEP> falsely <SEP> days
<tb> alkaline <SEP> due <SEP> to <SEP> the <SEP> diffusion <SEP> of the <SEP> pigment
<tb> soluble
<tb> () <SEP> see <SEP> -previous <SEP>notes On all agar-agars, except Czapek-Dox dextrin, but including the slant culture on potato, S.

       aureofaciens strain S-604 produces a characteristic dark pigmentation, usually appearing with growth. Likewise, the characteristic reddish-brown soluble pigment is easy to observe.

    
EMI0004.0010
  
    <I> 5. <SEP> Microscopic <SEP> observations </I>
<tb> <I> Streptomyces <SEP> aureofaciens </I>
<tb> <I> Medium <SEP> Strain <SEP> S-604 <SEP> Strain <SEP> A-377 </I>
<tb> <I> Mycelium <SEP> Spores <SEP> Mycelium <SEP> Spores </I>
<tb> Glycerol, <SEP> asparagine, <SEP> Sinuous, <SEP> continuous, <SEP> Spheroidal <SEP> to <SEP> ovoid- <SEP> Sinuous, <SEP> continuous, <SEP> Spher6id <SEP> to <SEP> ovoï extracted <SEP> from <SEP> b # uf, <SEP> branched. <SEP> Diameter <SEP> Leases. <SEP> Branched <SEP> diameter. <SEP> Diameter <SEP> daux. <SEP> Diameter
<tb> agar-agar <SEP> 0.8 <SEP> to <SEP>> <SEP> 1.0 <SEP> mid <SEP> 1.5 <SEP> - <SEP> 2.0 <SEP> microns <SEP> 0.7 to <SEP>> <SEP> 1.0 <SEP> micron <SEP> 1.5 <SEP> - <SEP> 2.0 <SEP> microns
<tb>: cron
<tb> Liqueur <SEP> of <SEP> macerated- <SEP> Sinuous, <SEP>:

  continuous, <SEP> Spheroidal <SEP> -to <SEP> ovoid- <SEP> Sinuous, <SEP> continuous, <SEP> Spheroidal <SEP> to <SEP> 0voï tion <SEP> of <SEP> maize, <SEP > agar- <SEP> branched. <SEP> Diameter <SEP> daux. <SEP> Branched <SEP> diameter. <SEP> Diameter <SEP> daux. <SEP> Diameter
<tb> agar <SEP> 0.8 <SEP> to <SEP>> <SEP> 1.0 <SEP> mid <SEP> 1.5 <SEP> to <SEP> 2.0 <SEP> microns < SEP> 0.8 to <SEP>> <SEP> 1.0 <SEP> micron <SEP> 1.5 <SEP> - <SEP> 2.0 <SEP> microns
<tb> cron The morphology of mycelium and spores for strain S-604 is apparently: similar to that observed for strain A-377.

   Both strains show a continuous, sinuous, branched mycelium with occasional tendency of the aerial hyphae to spiral. The characteristic spores are ovoid to spherdida: ux.



  To illustrate the color variations among the different strains of S. aureofaciens which produce demethyltetracyclines, we: cultured four selected strains on agar with a maize maceration liquor, and the following observations were made
EMI0004.0027
  
    <I> Observations <SEP> of <SEP> color <SEP> (0) </I>
<tb> <I> Streptomyces <SEP> aureofaciens </I>
<tb> <I> Agar-agar <SEP> with <SEP> liqueur <SEP> of <SEP> maceration </I>
<tb> <I> of <SEP> but <SEP> (AP4)

  </I>
<tb> <I> Incubation <SEP> 4 <SEP> days <SEP> to <SEP> <B>270C</B> </I>
<tb> <I> Strain <SEP> Isolated <SEP> colonies <SEP> Growth </I>
<tb> <I> in <SEP> mass </I>
<tb> S-604M1 <SEP> <SEP> Deep <SEP> red <SEP> Maho- <SEP> <SEP> Deep <SEP> .red <SEP> Maho gany <SEP> <SEP> gany <SEP>
<tb> S-1071 <SEP> <SEP> Cepper <SEP> brown <SEP> <SEP> <SEP> Deep <SEP> brown
<tb> Mahogany <SEP> <SEP> to
<tb> <SEP> Red <SEP> Mahogany <SEP>
<tb> V-62 <SEP> Large <SEP> zone <SEP> margi- <SEP> <SEP> Light <SEP> copper
<tb> hale <SEP> <SEP> peach <SEP> tan <B> </B> <SEP> brown <SEP>
<tb> becoming <SEP> <SEP> light
<tb> copper <SEP> brown <SEP>
<tb> at the <SEP> center <SEP> of <SEP> the
<tb> colony
<tb> B-740 <SEP> <SEP> Dark <SEP> Wine <SEP> <SEP> <<SEP> Burgundy <SEP>
<tb> (o) <SEP> colors <SEP> following <SEP> the work <SEP> already <SEP> cited.

         A relatively simple method of selecting a strain of <I> S. </I> aureofaciens capable of producing the new antibiotics is to choose a: strain of <I> S. </I> aureofaciens which exhibits; dark brown colonies when grown on a medium of agar-agar and corn steep liquor. Inocula are prepared with these colonies and fermentation is carried out as explained in Examples 1 and 2 below.

   At the end of the fermentation period, a certain quantity of the fermentation liquor is acidified to a pH in the region of 1.5 to dissolve the antibiotic. And filtered to obtain a clear aqueous solution. One or two drops of the filtrate are placed on a strip of paper and chromatographed by ordinary methods of chromatographic development. As solvent, butanol equilibrated with a 0.3M aqueous phosphate buffer, at pH 3, is used.

   The paper bands are developed by descending chromatography with the solvent phase of the equilibrated mixture. The location of the spots corresponding to the antibiotic can easily be determined by UV inspection. Another more sensitive method consists of placing the strip on an agar-agar tray inoculated with microorganisms sensitive to antibiotics such as Bacillus cereus or <I> Bacilli </I> subtilis, and incubating the trays.

   Zones of inhibition appear in the regions corresponding to the antibiotic spots. Comparison of the stains with <I> with </I> control samples of pure antibiotic and the Rf indices given below provide a basis for detecting the presence of the new antibiotic in the fermented liquor, and a semi-basic basis. quantitative to determine the amount present.



  We can: give an illustration of this technique with the aid of fig. 1 of the drawing which shows how paper strip chromatography can separate and detect the various tetracyclines and products of the present invention. The drawing shows a strip of paper 1, on which has been placed, in point 2, a small amount of an antibiotic solution containing tetracycline,

       @chlorodemethyltetracycline, demethyltetracycdine and cholrodemethyltetracycline. The total antibiotic activity of the solution placed at point 2 is 30 micrograms, expressed as tetracycline. The strips of paper are then developed as described above. After some time, the strips were examined with ultraviolet rays, with the results shown in the drawing.

   The solvent front has advanced to the point indicated by the solid line, 3. The tetracycline component of the mixed antibiotic solution has advanced to point 5 and the chlorotetracycline has advanced to at point 7. The new antibiotic, demethyltetracyclin: e, has advanced to point 4, and the antibiotic chlorodemethyltetracycline is in point 6.

   The Rf indices of these antibiotics are also indicated in the drawing. The Rf index is by definition the distance between the spot and the point of origin 2, divided by the distance between the solvent front 3 and the origin 2, and of course it is always less than 1.

   A variety of solvent systems can be used to obtain a series of Rf indices for a particular antibiotic, and these indices are considered to be very valuable in identifying and distinguishing antibiotics from others.



  The Rf numbers of some tetracyclines, fourth-mycines and demethyltetracyclines in two specific solvent systems are shown in the following table.
EMI0005.0053
  
    Ethyl <SEP> <SEP> <B> pH <SEP> 4.7, </B> <SEP> 90/10
<tb> <SEP> chloroform% butanol buffer,
<tb> Antibiotic <SEP> citratep # ho @ sphate <SEP> H3P04 <SEP> aqueous
<tb> (Mac <SEP> Elvain) <SEP> 0.3M <SEP> -I- <SEP> 0.1 <SEP>%
<tb> <SEP> trichlozacetic acid,
<tb> pH <SEP> 1.9
<tb> Chlorotetracycline <SEP> .. <SEP> ... <SEP>. <SEP> <B> 0.76-0.80 </B> <SEP> 0.61
<tb> Bromotetracycaine <SEP> <B> .... <SEP> 0.76-0.80 <SEP> 0.61 </B>
<tb> Tetracycline <SEP>. <SEP> ..

   <SEP> ... <SEP> ... <SEP> .. <SEP>. <SEP> <B> ......... <SEP> ... </B> <SEP> 0.46-0.47 <SEP> 0.20
<tb> Quatrimycin <SEP> ........ <SEP>. <SEP> .. <SEP> .. <SEP> ... <SEP> ..... <SEP> 0.14-0.16 <SEP> 0.12
<tb> Chloroqnatrimycin <SEP>. <SEP> .... <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> <B> 0.27-0.28 </B> <SEP> 0.33
<tb> B.romoquatrimycin <SEP> <B> 0.27-0.28 </B> <SEP> 0.33
<tb> Oxyquatrimycin <SEP> .. <SEP>. <SEP>. <SEP> <B> 0.00-0.06 </B> <SEP> 0.11
<tb> Chlorodemethyltetracycline <SEP>. <SEP> .. <SEP> <B> 0.68-0.72 </B> <SEP> 0.39
<tb> Demethyltetracycline <SEP> 0.27 <SEP> 0.22
<tb> Epichlo # rodemethydtetracycline <SEP> <B> 0.25-0.27 </B> <SEP> 0.20
<tb> Epidemethyltetracycline <SEP> 0.09 <SEP> 0.10 Several strains of S.

       aureofaciens which produces the new antibiotic have been deposited with the ARnerican Type Culture Collection in Washington. They are cataloged under Nos ATCC 12 551, 12 552, 12 553 and 12 554.

   It is understood that mutants, also producing the new antibiotics, can be derived from these strains by current methods, and indeed some should be expected. of them have the property of producing higher yields of one or more of the new antibiotics, under favorable conditions. These mutants may vary somewhat in their general morphological characteristics,

   as well as the various strains of the species <I> S. </I> aureofaciens. It is also expected that other strains of <I> S. </I> aureofaciens producing demethyhetracycline could be found in nature and then be created from the currently isolated strains of. <I> S. </I> aureofaciens which do not produce this antibiotic non-flight.

      One of the most important advantages of methyketracycline over the tetracyclines described previously is its increased stability in acidic and alkaline medium. The instability of tetracycline in an acidic medium and the instability of chlorotetracycline in an alkaline medium are well known. The demethyltebracyclinie loses only,

  approximately 33% of its activity in hydrochloric acid II at 100 ° C. in 6 min. In 0.1N sodium hydroxide at 500 ° C., demethyltetracycline has a half-life of about 20 hours, against 3.3 hours for tetra cyclin.

   These unexpected properties are very valuable since the instability of tetracycline in an acidic medium and the instability of chlorotetracycline in an alkaline medium limit or completely prevent the use of these valuable substances in many applications.

   Thanks to the much better stability of the new antibiotics, it is possible to prepare many pharmaceuticals which could not be satisfactorily prepared with tetracyclines.

   The increased stability also improves the recovery and refining processes, since more stringent pH and temperature conditions can be used, and thus the efficiency of various process steps can be improved.



  Demethyltetracycline was compared with tetracyclines in <I> in vivo tests, </I> and found that there was no appreciable difference in the antibacterial activity of the demethyltetracyclines compared to their analogues. tetracycline. It is therefore concluded that the new antibiotic can be used for the treatment of male diseases, in the same general way as the tetracyclines currently used.



  The ultraviolet absorption spectra of tetracyclines and demethyltetracycline are very similar.



  We see a comparison of the ultraviolet absorption spectra of tetracyclines: in <B> the </B> table <B> 1, </B> which indicates the extinction coefficients Ei @m (absorption spectrophotometric of a 1% safe solution in a 1 cm cell)

      measured at the maxima and minima of the minima of the various antibiotics. Values were calculated from ultraviolet absorption curves, correcting the concentrations at which tested to 1 <B> () / 0 </B>. All samples were measured in. a solution of H2SO4 O, 1N.



  The infrared absorption spectra of some new products are shown in the other figures of the drawing. Fig. 2 represents the comparison of the absorption, infrared spectra of free base tetracycline and ide, the d:

  emethyltetracycline free base. As we can see, there are several clear differences, and also similarities. Fig. 3 shows the infrared absorption spectrum of epichlorodemethyltetracycline hydrochloride. These curves were obtained on an automatic infrared recording spectrophotometer @ RTI

   ID = "0006.0068"> Perkin-Elmer Model 21, with the solid phase antibiotics compressed into a disc with KBr. Here are other prism data - NaCI; resolution - 2; answer - 1 - 1; gain 5; speed 1/2; deletion - 2; and scale: <B> 50.8 </B> mm for one micron.



       Various methods have been developed for titrating tetracyclines, and some of them can be used to titrate, demethyltetracyclines, of course with modifications.



       The epide # methyltetracyrlinc of the present invention is considered to be an isomer of dem6ethyltetracycline. The structural difference appears to be based on a rearrangement of the dimethylamine group on the <B> d </B> carbon atom in position 4.

   Apparently, under certain conditions which will be described in more detail hereinafter, the inversion occurs to obtain an equilibrium mixture of demébhylt6tra-cyclin and its spinal cord. The two can be separated to obtain practically pure products.



  Demethyltetracycline can be converted to its isomeric form by simply adjusting the pH of a
EMI0006.0101
      concentrated antibiotic solution between 3.0 and 5.0 and allowing the solution to stand until the isomerization has reached equilibrium.

   The most important conditions which must be set in order to convert from -demethyltetracycline to its isomers are concentration, pH, time and temperature.



  The most convenient is to carry out the isomerization at room temperature, but at higher temperatures a higher conversion rate is obtained. The pH </I> should be between approximately 3.0 and 5.0, preferably between 3.5 and 4.5. Some epimerization occurs at pHs outside this range, and even in distilled water <B>; </B> but the rate is very low.

   The concentration of the antibiotic in the aqueous solution should be as high as possible if faster epimerization rates are to be obtained. rComplete equilibration may require about 24 hours at <B> 250 </B> C, but satisfactory equilibration can be achieved in a much shorter time under specified conditions. Usually, however, the best results are obtained by allowing the solution to stand for periods of a week or more.

   It seems that equilibrium is reached, in most cases, at about 50 0/0; that is, at equilibrium about half of the demethyltetracycline is converted to an epimer.



       Since concentration is an important factor in obtaining high yields in short periods of time, a solvent system should be chosen which gives the highest concentration of methyltetracycline. These solvent systems must be buffered to obtain a pH within the preferential range.

   The various solvents include methanol, ethanol, butanol, acetone, 2-ethoxyethanol, 2-methoxypropanol, tetrahydrofurran, dimethylformamide and mixtures of these solvents. Still other solvents can be used.

   A preferential buffer is monosodium phosphate, maize. other buffers and pairs of buffers can be used which maintain the pH in the desired range.



  The epimer of the present invention can be recovered from an aqueous solution, in the same general manner as the tetracyclines are recovered. Although it has antibacterial activity, <I> in vitro </I> and <I> in vivo, </I> slightly less than that of demethyltetracycline, the epimer is still:

  very useful -in the treatment of diseases caused by bacteria, thanks to its appreciable antibacterial activity.



  As might be expected, demethyltet: racycline forms salts and complexes of the same type, and generally the same, as the tetra cyclines. Treatment with acids at a pH below about 4 results in the formation of acid salts.

   The free base can be obtained at a pH of about 4 to 6; and at pH greater than 6, salts with bases, for example the calcium salt, are obtained. Likewise, salts of the epimers are formed.



  As indicated above, the process of the present invention for the preparation of demethyltetracycline differs in particular from the process for preparation;

  chlorotetracycline, tetracycline and bromotetracycline, by choosing a mutant strain of <I> S. </I> aureofaciens which produces demethyltetracycline instead of one of the tetracyclines. The composition of the fermentation medium, the duration of aeration, the temperature, the setting of the hydrogen ions, the method of inoculation, etc., used in:

  of the production of chlor-tetracycline, -bromtetracycline and tetracycline are also suitable for the production of: new demethyltetracycline.



  In order that the fermentation process according to the invention may be more fully understood, it will now be described with reference to the specific examples which follow <I> Example 1 </I> A suitable medium can be prepared for the preparation of. 'inocula intended for these fermentations, with the following substances sucrose 30 g / 1 (NH4)

  2S04 .. ... .. .......... 2 g / 1 CaC03 .... <B> ------ ............. < / B> ..... .............. 7 g / 1; corn maceration liquor.-.--- 16.5 cm3 / 1 The pH of the medium thus obtained , is approximately 6.8.

    We measure a portion of 8 cana which is introduced into a B.rewer tube of 20 cm, and sterilized at 1200 C for 20 minutes. The sterilized medium is then inoculated with 0.5 cms of an aqueous suspension of spores of a strain of <I> S. </I> aureofaciens capable of producing chlorodemethyitetracycline, for example the strain S-604 ,

   the suspension containing about 40 - 60 million spores per cm3. The inoculated medium is incubated for 24 hours at <B> 280 </B> C, on a reciprocating shaker operating at 110 cycles per minute.



  A suitable fermentation medium contains water and a typical medium suitable for producing chloro: demethyltetracycline is as follows
EMI0007.0155
  
    <SEP> corn <SEP> starch <SEP> 55 <SEP> g / 1
<tb> CaC03 <SEP> ._ <B> - </B> <SEP> ....... <SEP> ...... <SEP> ... <SEP> 57 <SEP> g / 1
<tb> (NH4) 2S04 <SEP> .... <SEP>. <SEP> .. <SEP> ... <SEP> <B> ---- <SEP> ------- </B> <SEP> 5 <SEP> g / 1
<tb> FeS04. <SEP> 7H20 <SEP> .. <SEP> ....... <SEP> ...... <SEP>. <SEP> 40 <SEP> mg / 1
<tb> MnS04. <SEP> 4H20 <SEP> ....... <SEP>. <SEP>. <SEP> _ <SEP> <B> ....... <SEP> <I>50</I> </B> <SEP> mg / 1
<tb> ZnS04. <SEP> 7 <B> 1-1 </B> 20 <SEP> .100 <SEP> mg / 1
<tb> CoC12. <SEP> 6H20 <SEP> ..... <SEP> ...........

   <SEP> 5 <SEP> mg / 1
<tb> liqueur <SEP> of <SEP> maceration <SEP> of <SEP> corn <SEP> _ <SEP> 30 <SEP> g / 1
<tb> flour <SEP> of <SEP> seed <SEP> of <SEP> cotton <SEP> .... <SEP> .... <SEP>. <SEP> .... <SEP> 2 <SEP> g / 1
<tb> <SEP> lard <SEP> oil <SEP> .. <SEP>. <SEP> .... <SEP>. <SEP>. <SEP> .. <SEP> 2.0%
<tb> in <SEP> volume When the chloride ion content of this medium is restricted, it tends to increase the amount of methyltetracycline at the expense of the production of chlorordemethyltbracychne.



  <I> Example 2 </I> An inoculation medium is prepared as described in Example 1 and inoculated with .spores of a race of <I> Streptomyces </I> aureofaciens producing de- methyltetracycline. This inoculate is incubated for 24 hours at 28 ° C. in a reciprocating culture shaker.

   A fermentation medium containing corn flour is prepared. .. .... ... 14.5 g / 1 corn starch <B> ------- </B> .. .... <B> ---- </B> .......... 47.5 g / 1 50% solids corn maceration liquor -----. 22.5 g / 1 9.0 g / 1 (NH4) 2S04 ..... <B> -------------------------- </B>. <B> ------ </B>. 5.85 g / 1 NH4Cl <B> --------------- </B> .. <B> ----- </B> .. <B> -------------- </B> ........ .

   1.66 g / 1- MnS04 (70%) <B> ------------------------------ - </B> .. 56 mg / 1 COCI2 - 5H20 _.--------- .... <B> ------- </B> .. ._ .. 5 mg / 1 oil of bacon <B> ---------------- </B> ....------ _. 25 mil / 1 This medium is distributed at the rate of -30 ml each in-250 ml Erlenmeyer flasks.

   The vials are capped with cotton balls and sterilized for 20 minutes at 121c) C. After cooling, the sterilized vials are inoculated with 1 ml of the inoculate, incubated for 24 hours, of the breed described above. above. The inoculated fermentation flasks are incubated in a rotating culture shaker at a temperature not exceeding 280 ° C. The fermentation is allowed to continue for 140 hours.

   A sample of this fermented broth is then analyzed for its Chlorotetracycline content, using the method, described in this application, of measuring the change in absorption in the ultraviolet before and after alkaline degradation . The calculated content of chlorotetracycline is less than 40, y / ml, ie the guaranteed sensitivity of this analytical method.

   By chromatography on fermented broth paper, only traces of chlorotetracycline were found. By the spectrophotometric analysis method @ described in this application,

   there is a content of demethylchlorotetracycline and demethyltetracycline corresponding to 2090 y / ml. Chromatography on paper shows that these two demethyltetracyclines are found in approximately equal proportions.



  <I> Example 2a </I> An inoculation medium is prepared as in Example 1: and inoculated with spores of a different race from <I> S. </I> aureofaciens producing demethyltetracycline. This inoculate is incubated as described in Example 1.

   A fermentation medium is prepared containing: corn flour .. <B> ------------------ ..... </B>. . 67.0 g / 1 corn maceration liquor at 50% solids. 25.0 g / 1 CaCO3 pulverized .... ... .. ........ <B> ----- </B> 9.0 g / 1 (NH4) 2S04 ... ...... ....... .. ..... <B> ---- 6.75 </B> g / 1 4 2,

  0 g / 1 MnS04 (70%) ._..-. .. ..... ... ._ 100 mg / 1 CoC12. 6H20 ......... ... ... 5 mg / 1 bacon oil. <B> -------- </B> .... ... ....... 30 m1 / 1 Cc medium -is treated, inoculated and incubated as in Example 2.

   The broth collected is analyzed both by spectrophotometry and by chromatography on paper. Chromatography on paper does not allow the presence of chlorotetracycline to be detected. Spectrophotometric analysis gives a total demethyltetracycline content of 1430 yAnl, including 300 y / ml of demethylchlorotetracycline. By chromatography on paper, it is ensured that the rest of all the antibiotic substances are formed from demethyltetracycline,

      whose content calculated by difference is 1130 y / ml.



  <I> Example 2b </I> Fermentation is carried out under the conditions described in example 2, except that a different race ide S. aureofaciens producing demethyl-tetracycline is used as the fermentation agent and that the medium of fermentation contains corn flour. .. .. 16.9 g / 1 <B> corn </B> starch.

   66.42 g / 1 idumaïs maceration liquor, 50% sodium content. 27.5 g / 1 CaCO3 pulverized 11.43 g / 1 (NH4) 2S04 9.0 g / 1 NH4Cl ..... ....... ....... 2.0 g / 1 MnS04 (70%) ... .. 160 mg / 1 CoCl2.6H20 5 mg / 1 bacon oil ... ... ..

   33.3 m1 / 1 Fermentation is allowed to continue for 140 hours. As the paper chromatography indicates, the fermentation broth contains only demethyltetracycline. A biological test of the broth revealed a content of demethyltetracycline corresponding to 810% / ml, against staphylococcus aureus.



  <I> Example 3 </I> Fermentation <I> eh vat </I> A fermentation of 40 liters is carried out in a pilot vat, essentially according to the method described in Example 2. After having prepared the medium, it is carried out Sterilize it for 25 minutes at 125 ° C. and inoculate with an inoculum of strain S-604 prepared as indicated by Duggar, United States Patent No. 2482055. The fermentation is carried out with continuous stirring at a temperature of 280 C for the first 24 hours, and 25 (, C until completion,. In 135 hours.

   Sterile air is introduced at a rate of 0.3 1/1 / min during the first sixteen hours, then at a rate of 0.51 / 1 / min until harvest.



  The following examples illustrate the recovery, refining and separation of antibiotics. <I> Example A </I> <I> Refining of </I> chlorodemethyltetracycline <I> and </I> defnetlayltetracycline 25.81itres of liquor are prepared as in Example 3, they are treated with 200 cm2 of concentrated hydrochloric acid to adjust the pH to 1.5. The treated liquor is filtered, after mixing it with 2.8 kg of a filter aid, to obtain <B> 16.3 </B> liters of filtrate.

   Filtration water is taken up in 25 liters of water at a temperature of about 500 ° C. and the pH is adjusted to 1.5. After stirring for 30 minutes, the diluted .tourteau® is filtered and the filtrate is combined with the previous filtrate, to form a mass of 42.3 liters. The combined filtrate is treated with 6.76 kg of sodium chloride and extracted four times with butanol in an amount of 15% of the volume of the treated wire.

   The extracts are combined, clarified by filtration and concentrated in vacuo at 25-300 ° C. to a final volume of 6 liters.



  <I> Example B </I> <I> Chromatographic </I> separation </I> of </I> chlorodemethyltetracycline <I> and </I> demethyltetracycline The butanol concentrate of example A is divided in two equal portions, one concentrates: one to 900 cm3 and one concentrates the other to 610 cm3 under vacuum.

    The concentrates are filtered and adjusted to pH 2 with 50% sodium hydroxide.



       To prepare the solvent system used for the chromatographic separation, a mixture of 80% butanol and 20% chloroform is equilibrated with water adjusted to .pH 2 by means of hydrochloric acid.

   The columns are: glass columns 15 cm in diameter packed with 2.8 kg of acid washed diatomaceous earth. The columns are equilibrated with the aqueous phase of the solvent system before use.



  The two concentrates are treated with buroanol: on separate columns. Gently pour the concentrates at the top of the columns. Then we elect them. columns with the solvent phase which is passed through at a rate of about 10 liters per hour. In each case, 40 slices of 500 cm3 are taken, and the antibiotic content of each is determined by chromatography on a paper strip.

   In the 900 cc portion, slices 6 to 17 contain chlorodemethyltetracycline and chlorotetracycline, and slices 24 to 40 contain demethyltetracycline and:

  tetracycline. In the 610 cc portion, slices 7 through 18 contain chlorodemethyltetracycline and chloroitetracycline, and slices 19 through 31 contain demethyltetracycline and tetracycline.



  <I> Example C </I> <I> Recovery of </I> demethyltetracycline <I> from column fractions </I> The slices of example B which contain demethyltetracycline are combined to obtain a volume of 14 liters. An equal volume of water is added and the mixture is concentrated in vacuo: at 241 ° C. to a volume of 565 cm3 of: aqueous solution.

   The pH is adjusted: of the concentrate to 1.65 by adding concentrated hydrochloric acid, and. the solution is washed twice with 55 cm3 of:

  chloroform. The washed solution is filtered and adjusted to pH 5.8 with 50% sodium hydroxide solution. After aging for 3 hours at room temperature, and 15 hours at 4 () C, the crystalline slurry obtained is filtered and the product is washed with water and dried under vacuum at 401)

      C. A yield of 4.7 g of crude neutral demethyltetracycline assayed 880 micrograms per mg expressed as tetracycline hydrochloride is obtained, which represents an overall yield of 73% from the aqueous concentrate.



  Demethyltetracycline salts can be formed by treatment with acids and bases. Hydrochloric acid is: a preferred acid because the salts of this acid and of the demethyltetracyclines are very useful products. Special properties can be imparted by using other, acids;

       such as sulfuric acid, phosphoric acid, acetic acid, boric acid and the: other organic and inorganic acids. Salts can be prepared with bases, using alkaline hydroxides such as sodium hydroxide and hydroxides. alkaline earth, as indicated above.

   The calcium salt is particularly useful, and can be prepared by simply adjusting to pH 6-10 an aqueous solution of demethyltetracycline, with at least one molar equivalent of calcium in the solution.

   The barium, magnesium, strontium, etc, salts can be prepared in a similar fashion. <B> It </B> also forms complexes of demethyltetracychne with boron, zirconium and other polyvalent metal ions, as in the case of tetracyclines.



       Obviously, if the fermentation medium does not contain chlorine and bromine, neither chlorodemethyltetracycline nor bromodemetethyltetracycline can be formed. In such a case, the main antibiotic will be demethylteroracycline. When increasing the chloride ion content,

          particularly above 50 parts per million, substantial amounts of chlorodemethyltetracycline are formed, as one part of chloride ions can lead to the formation of about 14 parts of chlorodemethyltetracycline.



  A small concentration of bromide ions in the fermentation medium, from about 10 parts per thousand to several percent, tends to decrease the formation of chlorodemethyltbracycline, and the formation of demelyacycline is generally increased.

Claims (1)

REVENDICATION Procédé de préparation de la déméthylt6tracy- cline, caractérisé en ce qu'on :fait fermenter, dans des conditions aérobies, un milieu nutritif .aqueux ren fermant une source assimilable de carbone, d'azote et de substances minérales avec une souche de<I>S.</I> aureo- faciens productrice deRTI ID="0009.0218"WI="32" HE="4" LX="1438" LY="2659"> déméthyltétracycline. SOUS-REVENDICATIONS 1. CLAIM Process for the preparation of demethylt6tracycline, characterized in that: fermenting, under aerobic conditions, an aqueous nutrient medium containing an assimilable source of carbon, nitrogen and mineral substances with a strain of < I> S. </I> aureofaciens producer of RTI ID = "0009.0218" WI = "32" HE = "4" LX = "1438" LY = "2659"> demethyltetracycline. SUB-CLAIMS 1. Procédé suivant la revendication, caractérisé en ce que le milieu contient des ions de métaux @alca- lino-terreux, et après fermentation, on ajuste le pH du milieu entre 6 et 10, de manière à précipiter les sels alcalino-terreux <B>de</B> l'antibiotique. 2. Procédé suivant la revendication, caractérisé en ce qu'on récupère l'antibiotique à partir du milieu de fermentation. 3. Process according to claim, characterized in that the medium contains ions of alkaline earth metals @, and after fermentation, the pH of the medium is adjusted between 6 and 10, so as to precipitate the alkaline earth salts <B> of </B> the antibiotic. 2. Method according to claim, characterized in that the antibiotic is recovered from the fermentation medium. 3. Procédé suivant la revendication pour l'obten tion d'un épinière de déanéthyltétracycline, caracté risé en ce qu'on ajuste le pH d'une solution concen trée :de déméthyltétracycline à une valeur comprise entre 3,0 et 5,0, et on laisse reposer la solution j@us- qu'à,ce que l'isomérisation aitutteint un stade d'équi libre. Process according to claim for the production of a deanethyltetracycline spinal cord, characterized in that the pH of a concentrated solution of deethyltetracycline is adjusted to a value between 3.0 and 5.0, and allow the solution to stand until the isomerization has reached an equilibrium stage.
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