CH380879A - Antibiotic preparation process - Google Patents

Antibiotic preparation process

Info

Publication number
CH380879A
CH380879A CH4642757A CH4642757A CH380879A CH 380879 A CH380879 A CH 380879A CH 4642757 A CH4642757 A CH 4642757A CH 4642757 A CH4642757 A CH 4642757A CH 380879 A CH380879 A CH 380879A
Authority
CH
Switzerland
Prior art keywords
sep
medium
chlorodemethyltetracycline
demethyltetracycline
fermentation
Prior art date
Application number
CH4642757A
Other languages
French (fr)
Inventor
Daniel Mccormick Jerry Robert
Hirsch Ursula
Raymond Jensen Elmer
Oscar Sjolander Newell
Original Assignee
American Cyanamid Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to NL99951D priority Critical patent/NL99951C/xx
Priority claimed from US587518A external-priority patent/US2878289A/en
Priority to FR739115A priority patent/FR1235916A/en
Application filed by American Cyanamid Co filed Critical American Cyanamid Co
Priority to CH1262663A priority patent/CH398885A/en
Publication of CH380879A publication Critical patent/CH380879A/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P29/00—Preparation of compounds containing a naphthacene ring system, e.g. tetracycline
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides

Landscapes

  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

  

  Procédé de     préparation        d'antibiotiques       La présente invention a pour objet un procédé       pour    la préparation de substances thérapeutiques  nouvelles que l'on a identifiées comme étant des  antibiotiques du groupe de la     chlordéméthyltétracy-          cline    et de la     bromdéméthyltétracycline    et leurs     épi-          mères.     



  Ce procédé est caractérisé par le fait qu'on fait       fermenter,    dans des conditions d'aérobiose, un     milieu     nutritif aqueux contenant une source de carbone assi  milable, de l'azote et des substances minérales, com  prenant des ions chlorure et/ou bromure au moyen  d'une souche de<I>Streptomyces</I>     auréofaciens    produc  trice de     déméthyltétracycline.     



  On peut également     obtenir    les     épimères    de la       déméthyltétracycline,    de la     chlordéméthyltétracycline     ou de la     bromdéméthyltétracycline    en ajoutant le pH  d'une solution concentrée de la     déméthyltétracycline     correspondante à une valeur comprise entre 3,0 et  5,0 et en laissant reposer la solution jusqu'à ce que  l'isomérisation ait     atteint    un équilibre.  



  Chacun des antibiotiques tétracycline antérieure  ment connus qui sont produits par fermentation avec  le S.     auréofaciens    dans des conditions particulières,  à savoir la     chlortétracycline    et la     bromtétracycline     possède sa contrepartie dans la nouvelle série     d7anti-          biotiques.     



  Dans un milieu exempt de chlorures, l'antibiotique  qui prédomine est l'analogue non chloruré de la tétra  cycline. Dans un milieu riche en brome, il se forme  l'antibiotique bromé ; et dans un milieu riche en  chlore, l'antibiotique prédominant sera un antibiotique  chloré analogue à la     chlorotétracycline.     



  Les nouveaux antibiotiques peuvent être convertis  en     épimères    comme décrit ci-après, de façon similaire  à la conversion des tétracyclines en     quatrimycines.       Des     analyses    chimiques, et l'examen des proprié  tés chimiques et physiques des nouveaux composés,  indiquent qu'ils     diffèrent    essentiellement des tétracy  clines correspondantes par le fait qu'ils contiennent  un groupe méthyle en moins. Le groupe méthyle en  question est très vraisemblablement celui qui occupe  la position 6 sur le noyau     naphtacène    des tétracycli  nes.

   En conséquence, l'analogue de la     chlortétracy-          cline    s'appellera     7-chlor-4-diméthylamino-1,4,4a,5,          5a,6,11,12a-octahydro-3,6,10,12,12a-pentahydroxy-1,          11-dioxo-2-naphtacène-carboxamide.     



  Les nouveaux antibiotiques sont produits par cer  taines souches mutantes de S.     auréo        f        aciens.    Ces  souches sont sans aucun doute de l'espèce<I>Streptomy-</I>  <I>ces</I>     auréofaciens,        puisqu'elles    dérivent de la souche       primitive    A-377 isolée par le Dr B.

   M.     Duggar,    et  déposée aux     Northem    Régional Research     Laborato-          ries    à     Peoria        (Illinois,    Etats-Unis), et     indexées    en ce  Laboratoire sous le     NI,        NRRL    2209.

   Les mutations       comportant    un traitement de la souche A-377 par des  agents mutagènes, comprenant successivement l'irra  diation     ultraviolette,    la nicotine et le     chlorhydrate    de       2,2-dichloro-N-méthyldiéthylamine,    ont été     utilisées     pour créer l'une     des    souches. Diverses autres souches  ont été obtenues par mutation spontanée et par trai  tement à l'aide d'agents mutagènes.

   Ces diverses  souches qui produisent les nouveaux     antibiotiques    en       différentes        proportions    et avec des rendements divers,  présentent les caractéristiques     générales    de l'espèce  <I>S.</I>     auréofaciens.    Elles     diffèrent    un peu entre elles et  aussi des souches de S.     auréofaciens    antérieurement  décrites, principalement par leur pigmentation et leur  propriété de produire les nouveaux antibiotiques.

    Dans la     plupart    des cas, on note un pigment     brun         rougeâtre lorsque les micro-organismes sont cultivés  sur des     milieux    de culture     ordinaires.    Les nuances  du pigment varient de la nuance pêche ou du brun  cuivré jusqu'à un acajou foncé, suivant la souche  particulière et le     milieu    nutritif utilisé. Bien que la  propriété de produire les nouveaux antibiotiques soit  généralement associée à des souches qui présentent  ce type de pigmentation, cette formation de pigment  et la production des nouveaux antibiotiques ne sont  pas nécessairement des propriétés solidaires.

   Toutes  les souches étudiées produisent de la     chlorotétra-          cycline,    et généralement de la tétracycline, bien  que les proportions relatives de ces antibiotiques  varient     considérablement    suivant la nature du milieu  de fermentation, les conditions de fermentation et la  souche     particulière    choisie. Dans certains cas, la pro  duction de     chlorotétracycline    et de tétracycline est    très faible, de l'ordre de quelques % sur le total de  l'antibiotique produit par la     fermentation.     



  Les souches mutantes qui produisent les nou  veaux antibiotiques possèdent les mêmes caractéristi  ques générales que les souches qui produisent les       tétracyclines,    et elles diffèrent entre elles de la même  façon générale que les souches productrices de tétra  cycline diffèrent l'une de l'autre, ainsi qu'on l'a expli  qué dans plusieurs articles scientifiques qui ont été       publiés.    Bien que de nombreuses souches de S.

       auréo-          faciens    soient à la disposition du public     dans    les col  lections de cultures et aient été décrites dans la litté  rature scientifique, les données     suivantes    serviront à  illustrer le type de variation des nouvelles souches,  par rapport à la souche     primitive    A-377 qui se trouve  sous la désignation     NRRL    2209.

      <I>Comparaison des souches de S.</I>     auréofaciens   <I>S-604 et A-377 sur divers milieux</I>  Le<I>Streptomyces</I>     auréofaciens    souche S-604 qui produit la     chlorodéméthyltétracycline    et la     déméthyltétra-          cycline    a été comparé au<I>Streptomyces</I>     auréofaciens    souche A-377     (NRRL    2209) par observation des carac  téristiques de croissance sur divers     milieux        incubé    à     26-27o    C.  



  Les observations faites sont les suivantes  
EMI0002.0028     
  
    <I>1. <SEP> Glycérol, <SEP> asparagine, <SEP> extrait <SEP> de <SEP> bceuf, <SEP> agar-agar</I>
<tb>  Glycérol <SEP> ..........................................._............._....... <SEP> 1,0 <SEP> %
<tb>  Asparagine-L <SEP> <B>.............</B> <SEP> .<B>...........</B> <SEP> .<B>............................</B> <SEP> 0,05%
<tb>  Extrait <SEP> de <SEP> boeuf <SEP> <B>.....</B> <SEP> _<B>....</B> <SEP> __<B>..........</B> <SEP> .<B>...................</B> <SEP> ...._ <SEP> 0,2 <SEP> %
<tb>  #2P04 <SEP> ............................................................_..... <SEP> 0,05%
<tb>  Agar-agar <SEP> Bacto <SEP> <B>.........</B> <SEP> .<B>................</B> <SEP> __<B>.........</B> <SEP> .<B>........</B> <SEP> 1,5 <SEP> %
<tb>  Eau <SEP> distillée, <SEP> q.s. <SEP> pour <SEP> ..........' <SEP> . <SEP> _..

   <SEP> <B>__ <SEP> ........</B> <SEP> 100 <SEP> %
<tb>  Ajustement <SEP> du <SEP> pH <SEP> par <SEP> KOH <SEP> à <SEP> 50% <SEP> : <SEP> <B>......</B> <SEP> 7,0
<tb>  pH <SEP> après <SEP> stérilisation <SEP> <B>.....................................</B> <SEP> 7,1
<tb>  <I>Streptomyces <SEP> auréofaciens</I>
<tb>  Souche <SEP> S-604 <SEP> Souche <SEP> A-377
<tb>  Croissance <SEP> Abondante, <SEP> couleur <SEP>   <SEP> Venetian <SEP> red <SEP>   <SEP> ( <SEP> ) <SEP> Assez <SEP> abondante
<tb>  Hyphes <SEP> aériens <SEP> Abondants, <SEP> blanc <SEP> à <SEP>   <SEP> Rose <SEP> grey <SEP>   <SEP> (*) <SEP> Blancs, <SEP> uniformes
<tb>  Sporulation <SEP> Légère, <SEP> devenant <SEP> abondante <SEP> Aucune
<tb>  Pigment <SEP> diffusible <SEP> Brun <SEP> rougeâtre <SEP> Jaune
<tb>  Envers <SEP>   <SEP> Brown <SEP> Mahogany <SEP>   <SEP> (*) <SEP> Jaune <SEP> à <SEP> jaune,

   <SEP> orange <SEP> clair
<tb>  (*) <SEP> Désignation <SEP> des <SEP> nuances <SEP> d'après <SEP> le <SEP>   <SEP> Color <SEP> Harmony <SEP> Manual <SEP>   <SEP> 3e <SEP> édition, <SEP> édité <SEP> par <SEP> Container <SEP> Corporation
<tb>  of <SEP> America.
<tb>  <I>2. <SEP> Dextrine, <SEP> Czapek-Dox, <SEP> agar-agar</I>
<tb>  Dextrine <SEP> .<B>.......</B> <SEP> __<B>..............</B> <SEP> .<B>.........</B> <SEP> .<B>.................</B> <SEP> .<B>.........</B> <SEP> 1,0 <SEP> ô
<tb>  NaN03 <SEP> ...._......._..._......................................__......... <SEP> 0,2 <SEP> <B>%</B>
<tb>  K2HP04._........___..._...._..............._........................

   <SEP> 0,1 <SEP> %
<tb>  MgS04 <SEP> - <SEP> 7H20 <SEP> <B>...........</B> <SEP> .<B>...........</B> <SEP> .<B>...........................</B> <SEP> <I>0,05 <SEP> %</I>
<tb>  KCl <SEP> ......_...__....................................._................... <SEP> 0,05
<tb>  FeS04 <SEP> # <SEP> 7H20 <SEP> <B>..........</B> <SEP> .<B>..............................</B> <SEP> .<B>............ <SEP> 0,001%</B>
<tb>  Agar-agar <SEP> Bacto <SEP> <B>........</B> <SEP> _<B>...............</B> <SEP> .<B>.......</B> <SEP> .<B>..............</B> <SEP> 1,5 <SEP> %
<tb>  Eau <SEP> distillée, <SEP> q.s.

   <SEP> pour <SEP> .<B>..................</B> <SEP> -<B>.........</B> <SEP> -<B>....</B> <SEP> 100,0 <SEP> %
<tb>  pH <SEP> après <SEP> stérilisation <SEP> <B>-----</B> <SEP> .<B>--------------</B> <SEP> _<B>.........</B> <SEP> .<B>....</B> <SEP> 7,0
<tb>  <I>Streptomyces <SEP> auréofaciens</I>
<tb>  Souche <SEP> S-604 <SEP> Souche <SEP> A-377
<tb>  Croissance <SEP> Rare, <SEP> hyaline <SEP> Profuse
<tb>  Hyphes <SEP> aériens <SEP> Absents <SEP> Abondants, <SEP>   <SEP> lead <SEP> grey <SEP>   <SEP> (*)
<tb>  Globules <SEP> superficiels <SEP> incolores
<tb>  Sporulation <SEP> Aucune <SEP> Abondante
<tb>  Pigment <SEP> diffusible <SEP> Aucun <SEP> Léger: <SEP> jaune <SEP> pâle
<tb>  Envers <SEP> Non <SEP> pigmenté <SEP> Non <SEP> pigmenté
<tb>  (*) <SEP> Voir <SEP> note <SEP> précédente.

         
EMI0003.0001     
  
    <I>3. <SEP> Liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> mais, <SEP> agar-agar</I>
<tb>  Liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> maïs <SEP> .................. <SEP> 0,4 <SEP> %
<tb>  Sucrose <SEP> ....._............................................................ <SEP> 1,0 <SEP> %
<tb>  MgS04 <SEP> - <SEP> 7H20 <SEP> <B>....................</B> <SEP> --<B>.........</B> <SEP> .<B>.........</B> <SEP> .<B>......</B> <SEP> 0,025%
<tb>  KH2P04....................................-........................... <SEP> 0,2 <SEP> %
<tb>  (NH4)2HP04......................................................... <SEP> 0,2 <SEP> %
<tb>  Agar-agar <SEP> Bacto <SEP> <B>............. <SEP> ..................................</B> <SEP> 2,0 <SEP> %
<tb>  Eau <SEP> du <SEP> robinet, <SEP> q.s. <SEP> pour <SEP> <B>.....................

   <SEP> ........</B> <SEP> 100,0
<tb>  pH <SEP> après <SEP> stérilisation <SEP> .................................... <SEP> 6,3 <SEP> %
<tb>  <I>Streptomyces <SEP> auréofaciens</I>
<tb>  Souche <SEP> S-604 <SEP> Souche <SEP> A-377
<tb>  Croissance <SEP> Profuse <SEP> Profuse
<tb>  Hyphes <SEP> aériens <SEP> Abondants <SEP>   <SEP> rose <SEP> taupe <SEP>   <SEP> (*) <SEP> foncé <SEP> Abondants, <SEP>   <SEP> Beaver <SEP>  
<tb>  Sporulation <SEP> Très <SEP> abondante, <SEP> uniforme <SEP> Très <SEP> abondante, <SEP> uniforme
<tb>  Pigment <SEP> diffusible <SEP> Très <SEP> concentré, <SEP>   <SEP> deep <SEP> brown <SEP>   <SEP> à <SEP> jaune <SEP> verdâtre <SEP> clair
<tb>    <SEP> deep <SEP> brown <SEP> Mahogany <SEP>  
<tb>  Envers <SEP>   <SEP> Brown <SEP> Mahogany <SEP>   <SEP> foncé <SEP> (*) <SEP>   <SEP> Covert <SEP> Brown <SEP>   <SEP> (C*)
<tb>  (*)

   <SEP> Voir <SEP> notes <SEP> précédentes.
<tb>  <I>4. <SEP> Autres <SEP> milieux</I>
<tb>  <I>Streptomyces <SEP> auréofaciens</I>
<tb>  Souche <SEP> S-604 <SEP> Souche <SEP> A-377
<tb>  Agar-agar <SEP> nutritif <SEP> Croissance <SEP> médiocre, <SEP>   <SEP> Taupe <SEP> Croissance <SEP> assez <SEP> abondante. <SEP> Pas
<tb>  brown <SEP>   <SEP> à <SEP>   <SEP> dark <SEP> brown <SEP>   <SEP> (*). <SEP> d'hyphes <SEP> aériens. <SEP> Envers <SEP> :

   <SEP> jaune
<tb>  Pas <SEP> d'hyphes <SEP> aériens. <SEP> Envers <SEP> pâle. <SEP> Pigment <SEP> soluble <SEP> jaune <SEP> à
<tb>    <SEP> Taupe <SEP> brown <SEP>   <SEP> (*). <SEP> Pigment <SEP> jaune <SEP> brunâtre <SEP> clair
<tb>  soluble <SEP> brun <SEP> rougeâtre
<tb>  Glucose, <SEP> asparagine, <SEP> extrait <SEP> de <SEP> Croissance <SEP> abondante. <SEP> Gros <SEP> hy- <SEP> Croissance <SEP> assez <SEP> abondante. <SEP> Hy  viande, <SEP> agar-agar <SEP> phes <SEP> aériens <SEP> bigarrés <SEP> :

   <SEP>   <SEP> rose <SEP> phes <SEP> aériens <SEP> blancs <SEP> devenant <SEP> de
<tb>  taupe <SEP>   <SEP> à <SEP>   <SEP> fawn <SEP>   <SEP> ou <SEP>   <SEP> carcel <SEP>   <SEP> plus <SEP> en <SEP> plus <SEP> gris <SEP> quand <SEP> la <SEP> for  (*). <SEP> Sporulation <SEP> abondante. <SEP> En- <SEP> mation <SEP> de <SEP> spores <SEP> augmente. <SEP> En  vers<B>:</B> <SEP>   <SEP> Taupe <SEP> brown <SEP>   <SEP> (*). <SEP> Pig- <SEP> vers <SEP> : <SEP> jaune <SEP> clair. <SEP> Pigment <SEP> solu  ment <SEP> soluble <SEP> brun <SEP> rougeâtre <SEP> ble <SEP> jaune <SEP> clair
<tb>  Pomme <SEP> de <SEP> terre <SEP> Croissance <SEP> profuse <SEP> humide, <SEP> lisse, <SEP> Croissance <SEP> profuse <SEP> lisse, <SEP> humide,
<tb>  nodulée <SEP> : <SEP>   <SEP> Dark <SEP> brown <SEP> Maho- <SEP> nodulée <SEP> :

   <SEP>   <SEP> Light <SEP> Mellon <SEP> yel  gany <SEP>   <SEP> (*) <SEP> avec <SEP> trace <SEP> de <SEP>   <SEP> peach <SEP> low <SEP>   <SEP> <B>(</B>*) <SEP> à <SEP>   <SEP> Antique <SEP> rose <SEP>   <SEP> (*).
<tb>  tan <SEP>   <SEP> (*). <SEP> Hyphes <SEP> aériens <SEP> : <SEP> ab- <SEP> Hyphes <SEP> aériens <SEP> :

   <SEP> trace. <SEP> -Pas <SEP> de
<tb>  sents <SEP> à <SEP> abondants, <SEP> devenant <SEP> pigment <SEP> soluble
<tb>  blancs <SEP> à <SEP>   <SEP> carcel <SEP>   <SEP> (*). <SEP> Sporula  tion <SEP> abondante <SEP> dans <SEP> les <SEP> zones
<tb>  de <SEP> forte <SEP> formation <SEP> d'hyphes <SEP> aé  riens. <SEP> Pigment <SEP> soluble <SEP>   <SEP> choco  late <SEP>   <SEP> (*) <SEP> à <SEP>   <SEP> chocolate <SEP> brown <SEP>  
<tb>  Lait <SEP> pourpre <SEP> Léger <SEP> collier <SEP> de <SEP> croissance <SEP> Léger <SEP> collier <SEP> de <SEP> croissance <SEP> blanc
<tb>    <SEP> Deep <SEP> red <SEP> Mahogany <SEP>   <SEP> (*). <SEP> Peu <SEP> à <SEP> jaune <SEP> pâle.

   <SEP> Peu <SEP> de <SEP> variation
<tb>  de <SEP> variation <SEP> notable <SEP> du <SEP> pH, <SEP> peu <SEP> notable <SEP> du <SEP> pH, <SEP> peu <SEP> de <SEP> peptoni  de <SEP> peptonisation <SEP> apparente. <SEP> Lé- <SEP> sation <SEP> apparente <SEP> en <SEP> 15 <SEP> jours
<tb>  gère <SEP> réaction <SEP> colorée <SEP> faussement
<tb>  alcaline <SEP> due <SEP> à <SEP> la <SEP> diffusion <SEP> du
<tb>  pigment <SEP> soluble
<tb>  (*) <SEP> Voir <SEP> notes <SEP> précédentes.

         Sur tous les     agar-agars,    excepté     destrine        Czapek-Dox,    mais y compris la culture inclinée sur pomme de  terre, le S.     auréofaciens    souche S-604 produit une pigmentation foncée caractéristique, apparaissant généra  lement avec la     croissance.    De même, il est facile d'observer le pigment caractéristique soluble brun rougeâtre.

      
EMI0004.0001     
  
    <I>5. <SEP> Observations <SEP> microscopiques</I>
<tb>  <I>Streptomyces <SEP> auréofaciens</I>
<tb>  Souche <SEP> S-604 <SEP> Souche <SEP> A-377
<tb>  Milieu <SEP> Mycélium <SEP> Spores <SEP> Mycélium <SEP> Spores
<tb>  Glycérol, <SEP> aspa.ca- <SEP> Sinueux, <SEP> continu, <SEP> Sphéroïdaux <SEP> Sinueux, <SEP> continu, <SEP> Sphéroïdaux
<tb>  gine, <SEP> extrait <SEP> de <SEP> ramifié. <SEP> Diamètre <SEP> à <SEP> ovoïdaux. <SEP> Dia- <SEP> ramifié. <SEP> Diamètre <SEP> à <SEP> ovoïdaux.

   <SEP> Dia  boeuf, <SEP> agar-agar <SEP> 0,8à <SEP> > <SEP> 1,0 <SEP> mi- <SEP> mètre <SEP> 1,5 <SEP> - <SEP> 2,0 <SEP> 0,7à <SEP> > <SEP> 1,0 <SEP> mi- <SEP> mètre <SEP> 1,5 <SEP> - <SEP> 2,0
<tb>  cron <SEP> microns <SEP> cron <SEP> microns
<tb>  Liqueur <SEP> de <SEP> macé- <SEP> Sinueux, <SEP> continu, <SEP> Sphéroïdaux <SEP> Sinueux, <SEP> continu, <SEP> Sphéroïdaux
<tb>  ration <SEP> de <SEP> maïs, <SEP> ramifié. <SEP> Diamètre <SEP> à <SEP> ovoïdaux. <SEP> Dia- <SEP> ramifié. <SEP> Diamètre <SEP> à <SEP> ovoïdaux.

   <SEP> Dia  agar-agar <SEP> 0,8à <SEP> > <SEP> 1,0 <SEP> mi- <SEP> mètre <SEP> 1,5 <SEP> - <SEP> 2,0 <SEP> 0,8à <SEP> > <SEP> 1,0 <SEP> mi- <SEP> mètre <SEP> 1,5 <SEP> - <SEP> 2,0
<tb>  cron <SEP> microns <SEP> cron <SEP> microns       La morphologie du mycélium et des spores pour la souche S-604 est apparemment similaire à celle obser  vée pour la souche A-377. Les deux souches montrent un mycélium continu, sinueux, ramifié, avec tendance  occasionnelle des hyphes     aériens    à la     spiralisation.    Les spores caractéristiques sont ovoïdaux à sphéroïdaux.  



  Pour illustrer les variations de     couleur    parmi les différentes souches<I>de S.</I>     auréofaciens    qui produisent les       déméthyltétracyclines,    on a cultivé quatre souches sélectionnées sur de l'agar-agar avec liqueur de macération  de maïs, et on a fait les observations suivantes  
EMI0004.0007     
  
    <I>Observations <SEP> de <SEP> couleur <SEP> (*) <SEP> ;

   <SEP> Streptomyces <SEP> auréofaciens</I>
<tb>  Agar-agar <SEP> avec <SEP> liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> maïs <SEP> (AP4)
<tb>  Incubation <SEP> 4 <SEP> jours <SEP> à <SEP> 27  <SEP> C
<tb>  Souche <SEP> Colonies <SEP> isolées <SEP> Croissance <SEP> en <SEP> masse
<tb>  S-604M1 <SEP>   <SEP> Deep <SEP> red <SEP> mahogany <SEP>   <SEP>   <SEP> Deep <SEP> red <SEP> mahogany <SEP>  
<tb>  S1071 <SEP>   <SEP> Copper <SEP> brown <SEP>   <SEP>   <SEP> Deep <SEP> brown <SEP> mahogany <SEP>   <SEP> à <SEP>   <SEP> Red
<tb>  mahogany <SEP>  
<tb>  V-62 <SEP> Large <SEP> zone <SEP> marginale <SEP>   <SEP> peach <SEP> tan<B>,

  ></B>
<tb>  devenant <SEP>   <SEP> light <SEP> copper <SEP> brown <SEP>   <SEP> au <SEP>   <SEP> Light <SEP> copper <SEP> brown <SEP>  
<tb>  centre <SEP> de <SEP> la <SEP> colonie
<tb>  B-740 <SEP>   <SEP> Dark <SEP> Wine <SEP>   <SEP>   <SEP> Burgundy <SEP>  
<tb>  (*) <SEP> Couleurs <SEP> suivant <SEP> l'ouvrage <SEP> déjà <SEP> cité.       Une méthode relativement simple pour sélection  ner une souche de<I>S.</I>     auréofaciens    capable de pro  duire les nouveaux antibiotiques, consiste à choisir  une souche de S.     auréofaciens    qui présente des colo  nies marron foncé quand on la cultive sur un     milieu     d'agar-agar et de liqueur de macération de maïs.

   On  prépare des inocula avec ces colonies et on conduit  une     fermentation    comme expliqué dans les exemples  1 et 2 ci-après.  



  Les indices     Rf    de quelques tétracyclines,     quatri-          mycines    et     déméthyltétracyclines    dans deux systèmes  solvants précis indiqués dans le tableau suivant.

    
EMI0004.0016     
  
    90/10
<tb>  chloroforme/
<tb>  Acétate <SEP> d'éthyle/ <SEP> butanol,
<tb>  Antibiotique <SEP> pH <SEP> 4,7, <SEP> tampon <SEP> HsPO4 <SEP> aqueux
<tb>  citrate-phosphate <SEP> 0,3M+0,1o/o
<tb>  (Mac <SEP> Elvain) <SEP> acide <SEP> trichlor  acétique,
<tb>  pH <SEP> 1,9
<tb>  Chlorotétracycline <SEP> 0,76-0,80 <SEP> 0,61
<tb>  Bromotétracycline <SEP> 0,76-0,80 <SEP> 0,61
<tb>  Tétracycline <SEP> 0,46-0,47 <SEP> 0,20
<tb>  Quatrimycine <SEP> 0,14-0,16 <SEP> 0,12
<tb>  Chloroquatrimycine <SEP> 0;

  27-0,28 <SEP> 0,33
<tb>  Bromoquatrimycine <SEP> 0,27-0,28 <SEP> 0,33
<tb>  Oxyquatrimycine <SEP> 0,00-0,06 <SEP> 0,11
<tb>  Chlorodéméthyltétracy  cline <SEP> 0,68-0,72 <SEP> 0,39
<tb>  Déméthyltétracycline <SEP> 0,27 <SEP> 0,22
<tb>  Epichlorodéméthyltétra  cycline <SEP> 0,25-0,27 <SEP> 0,20
<tb>  Epidéméthyltétracycline <SEP> 0,09 <SEP> 0,10       Plusieurs souches de<I>S.</I>     auréofaciens    qui produi  sent les nouveaux antibiotiques ont été déposées à       l'American    Type Culture Collection, à Washington,  et sont cataloguées sous les     Nos        ATCC    12551,  12552, 12553 et 12554.

   Il est entendu que des mu  tantes produisant aussi les nouveaux antibiotiques  peuvent être tirées de ces souches par     des    méthodes  courantes, et en fait, il faut s'attendre à ce que cer  taines d'entre elles possèdent la propriété de produire  des rendements plus élevés d'un ou plusieurs des  nouveaux antibiotiques, dans des conditions favora  bles.

   Ces mutantes     peuvent    varier quelque peu quant  à leurs caractéristiques morphologiques générales, de  même que les diverses souches de l'espèce S.     auréo-          faciens.    On s'attend aussi à ce que d'autres souches  de S.     auréofaciens    productrices de     déméthyltétra-          cycline    puissent être trouvées dans la nature et puis  sent être créées à partir des souches actuellement iso  lées de<I>S.</I>     auréofaciens    qui ne produisent pas ces  nouveaux antibiotiques.  



  Les analyses chimiques d'échantillons très purifiés  de     chlorodéméthyltétracycline    concordent avec la for  mule empirique calculée     C.,1H#,tCl0g,    l'erreur se si  tuant dans la marge expérimentale.  



  Le point de fusion de la     chlorodéméthyltétracy-          cline    sous forme de base libre, mesuré sur une     plate-          forme    chaude, est de 170-1750 C avec décomposition.  Le point de     fusion    de la     chlorotétracycline    est de  168-169 C.

        Voici d'autres     comparaisons    entre la     chlorotétra-          cycline    et la     chlorodéméthyltétracycline.    La     chloro-          déméthyltétracycline    présente un indice<B>pH,,</B> de 4,45  dans un mélange de     diméthylformamide    et d'eau à  50/50. La rotation optique de la     chlorodéméthylté-          tracycline    dans l'acide chlorhydrique 0,03 N à une  concentration de 0,5 % est     [ ]D    =<B>2610</B> ; pour la       chlorotétracycline,    on trouve - 2430.

   Les     déméthyl-          tétracyclines    semblent être plus solubles dans l'eau  que les     tétracyclines    correspondantes. Par exemple,  le chlorhydrate de     chlorodéméthyltétracycline    est so  luble dans l'eau à raison d'environ 45     mg/cm3,    contre  environ 14     mg/cm3    pour la     chlorotétracycline.       L'activité antibactérienne des tétracyclines et des       déméthyltétracyclines    est généralement similaire, mais  avec des     différences    nettes comme on le verra par  le tableau suivant.  



  Ce tableau compare les concentrations de     chloro-          tétracycline    et de     chlorodéméthyltétracycline    qui sont       nécessaires    pour réaliser une inhibition     demi-maxi-          mum    de la croissance,     exprimées    en     microgrammes          d'antibiotique    par     cm3    de solution, en des laps de  temps     variant    de 4 à 48 heures avec divers micro  organismes. Les     chiffres    faibles indiquent une inhibi  tion plus     efficace    de la croissance.

    
EMI0005.0034     
  
    Tableau <SEP> I
<tb>  <I>Antibiotique</I>
<tb>  Micro-organisme <SEP> Chlorotétracycline <SEP> Chlorodéméthyltétracycline
<tb>  Temps <SEP> en <SEP> heures <SEP> Temps <SEP> en <SEP> heures
<tb>  4 <SEP> 8 <SEP> 24 <SEP> 48 <SEP> 4 <SEP> 8 <SEP> 24 <SEP> 48
<tb>  Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> ATCC
<tb>  6538 <SEP> P <SEP> ... <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> ..................... <SEP> 0,041 <SEP> 0,072 <SEP> 0,57 <SEP> 4,1 <SEP> 0,065 <SEP> 0,094 <SEP> 0,41 <SEP> 0,68
<tb>  Staphylococcus <SEP> albus <SEP> ........................ <SEP> 7,5 <SEP> 20,5 <SEP> >50,0 <SEP> >50,0 <SEP> 16,5 <SEP> 50,0 <SEP> >50,0 <SEP> >50,0
<tb>  Escherichia <SEP> coli <SEP> .............................. <SEP> 0,12 <SEP> 0,27 <SEP> 1,5 <SEP> 10,2 <SEP> 0,16 <SEP> 0,3 <SEP> 0,66 <SEP>  < l,56
<tb>  >0,8
<tb>  Salmonella <SEP> gallinarum <SEP> ..

   <SEP> 0,4 <SEP> 0,74 <SEP> 4,65 <SEP> 37,0 <SEP> 0,4 <SEP> 0,56 <SEP> 1,06 <SEP> 1,1
<tb>  Bacillus <SEP> cereus <SEP> <B>....................</B> <SEP> _<B>.............</B> <SEP>  < 0,025 <SEP> 0,035 <SEP> 0,15 <SEP> 1,1 <SEP>  < 0,015 <SEP> 0,039 <SEP> 0,077 <SEP> 0,19
<tb>  Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> ...... <SEP> 0,31 <SEP> 0,56 <SEP> 6,3 <SEP> 35,0 <SEP> 0,94 <SEP> 1,3 <SEP> 4,3 <SEP> 6,7
<tb>  Streptococcus <SEP> pyrogenes <SEP> bêta <SEP> hé- <SEP> -  molytique <SEP> <B>... <SEP> ................................</B> <SEP> 11,5 <SEP> 43,0 <SEP> >50,0 <SEP> >50,0 <SEP> 14,4 <SEP> 41,0 <SEP> >50,0 <SEP> >50;

  0
<tb>  Proteus <SEP> vulgaris <SEP> <B>............. <SEP> .....</B>........... <SEP> 0,28 <SEP> 0,56 <SEP> 9,2 <SEP> 50,0 <SEP> 0,62 <SEP> 1,12 <SEP> 1,38 <SEP> 4,4
<tb>  Escherichia <SEP> coli <SEP> ATCC <SEP> 9637 <SEP> ...... <SEP> 0,54 <SEP> 1,18 <SEP> 6,6 <SEP> 34,0 <SEP> 0,43 <SEP> 0,67 <SEP> 0,97 <SEP> 1,

  8       On observe des résultats     similaires    quand on com  pare la     bromotétracycline    à la     bromodéméthyltétra-          cycline.    On a trouvé aussi que les     déméthyltétracy-          cline    sont considérablement supérieures à     l'oxytétra-          cycline        dans    le même type de test.  



  On a aussi comparé les     déméthyltétracyclines    avec  les     tétracyclines    dans des tests<I>in vivo,</I> et on a trouvé  qu'il n'y a pas de     différence    appréciable dans l'activité  antibactérienne des     déméthyltétracyclines    en compa  raison de leurs analogues     tétracycline.     



  Les spectres d'absorption d'ultraviolet     des    tétra  cyclines et des     déméthyltétracyclines    sont très similai  res. La     fig.    2 des dessins montre la comparaison entre  le spectre d'absorption d'ultraviolet de la     chlorotétra-          cycline    et de la     chlorodéméthyltétracycline    à la même    concentration. Comme on le notera, la     forme    des  courbes est essentiellement la même, mais il y a tou  tefois un léger frottement du spectre d'absorption de  la     chlorodéméthyltétracycline    au voisinage de 260 mil  limicrons.  



  On voit une autre     comparaison    des spectres d'ab  sorption d'ultraviolet des tétracyclines dans le tableau  II, qui indique les coefficients d'extinction<B>El,",.</B> (ab  sorption     spectrophotométrique    d'une solution à 1 %  mesurée dans une cellule de 1 cm) mesurés au     maxima     et aux     minima    des     minima    des     différents    antibiotiques.  On a     calculé    les valeurs d'après les courbes d'absorp  tion d'ultraviolet, en corrigeant à 1 % les concentra  tions auxquelles on a     fait    les essais.

   Tous les     échan-          tillons    ont été mesurés     dans    une solution de     H2SO4     0,1 N.  
EMI0005.0069     
  
    Tableau <SEP> II
<tb>  Max. <SEP> Min. <SEP> Max. <SEP> Min. <SEP> Max.
<tb>  <I>Antibiotique</I> <SEP> É <SEP> ci  <SEP> milli- <SEP> É <SEP> 11i0 <SEP> milli- <SEP> É <SEP> roi  <SEP> milli- <SEP> É <SEP> 0/  <SEP> milli- <SEP> É <SEP> c<B>/</B>  <SEP> milli  i <SEP> cm <SEP> micron <SEP> i <SEP> cm <SEP> micron <SEP> i <SEP> cm <SEP> micron <SEP> i <SEP> cm <SEP> micron <SEP> i <SEP> cm <SEP> micron
<tb>  Chlorhydrate <SEP> de <SEP> chlorotétra  cyline <SEP> ........ <SEP> . <SEP> _ <SEP> .......... <SEP> ........ <SEP> .

   <SEP> 209 <SEP> 368 <SEP> <B>135</B> <SEP> 302 <SEP> 356 <SEP> 265 <SEP> 288 <SEP> 242 <SEP> 343 <SEP> 228
<tb>  Epichlorotétracycline <SEP> -NH4 <SEP> 170 <SEP> 368 <SEP> 100 <SEP> 302 <SEP> 332 <SEP> 254 <SEP> 290 <SEP> 242 <SEP> 342 <SEP> 228
<tb>  Chlorhydrate <SEP> de <SEP> chlorodémé  thyltétracycline <SEP> <B>.......... <SEP> - <SEP> ..</B>.. <SEP> 249 <SEP> 368 <SEP> 160 <SEP> 299 <SEP> 362 <SEP> 268 <SEP> 270 <SEP> 238 <SEP> 357 <SEP> 227
<tb>  Chlorhydrate <SEP> d'épichlorodé  méthyltétracycline <SEP> <B>............</B> <SEP> 242 <SEP> 368 <SEP> 130 <SEP> 300 <SEP> 348 <SEP> 254 <SEP> 289 <SEP> 238 <SEP> 346 <SEP> 227         Les spectres d'absorption d'infrarouge de plu  sieurs des produits nouveaux sont représentés sur les  autres     figures    du dessin.

   La     fig.    3 est une représenta  tion du spectre d'absorption     d'infrarouge    du     chlorhy-          drate    de     chlorodéméthyltétracycline.     



  Ces courbes ont été obtenues sur un     spectrophoto-          mètre.    automatique enregistreur à     infrarouge        Perkin-          Ehner    modèle 21, avec les     antibiotiques    en phase       solide,        comprimés    en un disque avec     KBr.    Voici d'au  tres données :     prisme    -     NaCl    ; résolution - 2 ; ré  ponse - 1 - 1 ; gain - 5 ; vitesse     1/2        mn/micron    ;  suppression - 2 ; et échelle: 50,8 mm pour un micron.  



  Comme on     l'indique    plus haut, on peut obtenir  la     bromodéméthyltétracycline        comme    antibiotique       principal    de la fermentation, en réglant la teneur en       halogène    du     milieu    de fermentation. Généralement, le       milieu    nutritif aqueux doit contenir au moins 50 par  ties par     million    d'ions bromure et la teneur en ions  chlorure doit être maintenue aussi basse que possible,       moins    de 50     parties    par     million    environ d'ions chlo  rure.

   L'ion bromure peut être fourni par     n'importe     quel bromure soluble dans l'eau, par exemple le bro  mure de potassium, qui libère des ions bromure pour  servir à la     synthèse    biologique de l'antibiotique.  



  A     part    le réglage de la teneur en     ions        halogènes     de la fermentation, le procédé de préparation de la       bromodéméthyltétracycline    est     similaire    à celui de  préparation de la     chlorodéméthyltétraeycline,    décrit  plus haut. Les souches<I>de S.</I>     auréofaciens    qui pro  duisent la     déméthyltétracycline    peuvent aussi servir  à     produire        l'analogue    bromé.  



  La     bromodéméthyltétracycline    a à peu près la  même activité antibactérienne que la     chlorodéméthyl-          tétracycline,    et elle peut     servir    aux mêmes usages et  de la même façon.  



  II n'est pas nécessaire de séparer la     bromodémé-          thyltétracycline    des autres antibiotiques qui peuvent  se former     concurremment    durant la fermentation, car  un mélange des diverses     déméthyltétracyclines    est  utile à de nombreux usages ; par exemple, on peut  concentrer le     milieu        nutritif    fermenté et l'utiliser di  rectement pour sa teneur en antibiotiques.

   Une autre  façon de     l'utiliser    est     d'acidifier    la liqueur fermentée,  de     filtrer    pour     éliminer    le mycélium et les matières  insolubles ; de neutraliser et de concentrer pour obte  nir une poudre sèche que l'on peut mélanger à des       aliments    pour animaux. Les antibiotiques     mélangés     sont     utiles    pour stimuler la croissance de     nombreux     animaux.  



  Une forme brute de     bromodéméthyltétracycline,     et des mélanges de celle-ci avec d'autres antibiotiques,  peuvent servir à préserver les     viandes,        volailles    et  poissons de la même façon que l'on emploie actuelle  ment les     tétracyclines.    Dans ces compositions, il n'est  guère nécessaire de faire attention aux     proportions     des diverses tétracyclines qu'elles peuvent contenir.  



  Au cas où l'on désire séparer la     bromodéméthyl-          tétracycline    des autres antibiotiques contenus dans la       liqueur        fermentée,    on peut le faire     par    plusieurs  moyens qui apparaîtront à l'homme de     l'art.    Par    exemple, le traitement par un acide détruit la tétra  cycline, et le traitement par un alcali détruit la     chloro-          tétracycline        dans    la     liqueur    fermentée.

   On peut récu  pérer la     bromodéméthyltétracycline    à partir des solu  tions résultantes, grâce à une chromatographie frac  tionnée en     utilisant    de la terre     d'infusoires    dans la  colonne. Un mélange de chloroforme et de     butanol     au pH 2,0 environ élue les antibiotiques de la terre  d'infusoires.

   La     bromodéméthyltétracycline        sort    de la       colonne    en avant de la     déméthyltétracycline    et on  peut la récupérer à partir de     l'éluant.    On peut aussi  séparer la     bromodéméthyltétracycline    pour     obtenir     un seul constituant antibiotique, grâce à la     technique     de distribution à contre-courant de     Craig.     



  Les     épinières    des     déméthyltétracyclines    obtenues  par le procédé selon la présente invention sont des  isomères des     déméthyltétracyclines.    La différence  structurale semble être basée sur un réarrangement  du groupe     diméthylamine    sur l'atome de carbone en  position 4. Apparemment, dans     certaines    conditions       qui    seront décrites plus en détail ci-après, l'inversion  se produit et on obtient un mélange à l'équilibre de       déméthyltétracycline    et de son     épinière.    On peut sé  parer les deux pour obtenir des produits pratique  ment purs.

   Pour chacun des corps,     chlorodéméthyl-          tétracycline    et     bromodéméthyltétracycline,    il existe  un isomère correspondant     que:    l'on appellera     épichlo-          rodéméthyltétracycline    et     épibromodéméthyltétracy-          cline     On peut     convertir    les     déméthyltétracyclines    en  leurs formes isomères en ajustant simplement le pH  d'une solution concentrée de l'antibiotique entre 3,0  et 5,

  0 et en laissant reposer la solution jusqu'à ce  que l'isomérisation soit parvenue à un     équilibre.    Les       conditions    les plus     importantes    qu'il est nécessaire  de régler pour     convertir    les     déméthyltétracyclines    en  leurs isomères sont la concentration, le pH, le temps  et la température.  



  Le plus commode est de réaliser l'isomérisation à  la température ambiante,     mais    à des températures  plus élevées, on obtient un taux de conversion plus  élevé. Le pH doit être compris entre 3,0 et 5,0 envi  ron, de préférence entre 3,5 et 4,5. Il se produit une       certaine        épimérisation    à des pH     sortant    de cet inter  valle, et même dans l'eau distillée ; mais la vitesse  est très faible.

   La concentration de l'antibiotique dans  la solution aqueuse doit être aussi élevée que possible  si l'on veut obtenir des vitesses     d'épimérisation    plus  grandes.     L'équilibrage    complet peut nécessiter     une     durée d'environ 24 heures à 250 C, mais on peut  obtenir un     équilibrage    satisfaisant en un temps beau  coup plus     court    dans des conditions déterminées. Or  dinairement toutefois, on obtient les meilleurs résul  tats en laissant     reposer    la solution pendant des durées  d'une semaine ou davantage.

   Il semble que     l'équilibre     soit     atteint,    dans la     plupart    des cas, à 50 % environ ;  autrement     dit,    à l'équilibre la moitié environ de la       déméthyltétracycline    est     convertie    en     épinière.     



       Etant    donné que la concentration est un facteur       important    pour obtenir des rendements élevés en de      courts laps de temps, il faut choisir un système sol  vant qui donne la plus forte concentration de     démé-          thyltétracycline.    Il faut tamponner ces systèmes sol  vants pour obtenir un pH     compris    dans     l'intervalle     préférentiel.

   Les divers solvants comprennent le mé  thanol,     l'éthanol,    le     butanol,    l'acétone, le     2-éthoxy-          éthanol,    le     2-méthoxypropanol,    le     tétrahydrofurane,     la     diméthylformamide    et les mélanges de ces solvants.  On peut utiliser d'autres solvants encore. Un tampon  préférentiel est le phosphate     monosodique,    mais on  peut     utiliser    d'autres tampons et couples de tampons  qui maintiennent le pH dans l'intervalle désiré.  



  On peut récupérer les     épimères    des     déméthyltétra-          cyclines    à partir des solutions aqueuses, de la même  façon générale que l'on récupère les tétracyclines.  Bien qu'ils aient une activité antibactérienne, in vitro  et in vivo, légèrement inférieure à celle des     déméthyl-          tétracyclines,    ils sont     encore    très utiles dans le trai  tement des maladies causées par les bactéries, grâce  à leur activité antibactérienne appréciable.  



  Comme on pourrait s'y     attendre,    les     déméthylté-          tracyclines        forment    des sels et des complexes du  même type, et de la même façon générale, que les       tétracyclines.    Le traitement par les acides à un pH  inférieur à 4 environ aboutit à la formation de sels  d'acides. On peut     obtenir    la base libre à un pH de  4 à 6 environ; et aux pH supérieurs à 6, on obtient  des sels avec des bases, par exemple le sel de calcium.  De même, on forme des sels des     épimères.     



  Comme on l'a indiqué précédemment, le procédé  de la présente invention pour la préparation des       déméthyltétracyclines,    se distingue notamment du  procédé de préparation de la     chlorotétracycline,    de  la tétracycline et de la     bromotétracycline,    par le fait  que l'on choisit une souche mutante de<I>S.</I>     auréofa-          cierrs    qui produit la     déméthyltétracycline    désirée au  lieu de l'une des tétracyclines.  



  Afin que le processus de fermentation suivant  l'invention puisse être plus complètement compris,  on le décrira maintenant en se référant aux exemples  précis qui suivent    Exemple 1  On peut préparer un     milieu    approprié pour la  préparation     d'inocula    destinés à ces fermentations,  avec les substances suivantes  
EMI0007.0035     
  
    30 <SEP> g/1
<tb>  (NH4)2S04 <SEP> <B>-----</B> <SEP> .<B>--------------------------</B> <SEP> .<B>---------------</B> <SEP> .<B>-----</B> <SEP> 2 <SEP> g/1
<tb>  CaCO3 <SEP> <B>......................</B> <SEP> .<B>------------------- <SEP> ----------- <SEP> -----</B> <SEP> 7 <SEP> g/1
<tb>  Liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> maïs <SEP> <B>............</B> <SEP> 16,

  5 <SEP> c13/1       Le pH du     milieu    ainsi obtenu est d'environ 6,8.  On mesure une portion de 8     crn9    que l'on introduit  dans un tube     Brewer    de 20 cm, et on     stérilise    à  1200 C pendant 20     minutes.    On inocule alors le  milieu stérilisé avec 0,5     cm3    d'une suspension aqueuse  de spores d'une souche de S.

       auréofaciens    capable de  produire de la     chlorodéméthyltétracycline,    par exem  ple la souche S-604, la suspension contenant environ    40-60 millions de spores par     cm3.    On fait incuber  le milieu inoculé pendant 24 heures à 280 C, sur une       secoueuse        alternative    fonctionnant à 110 cycles par  minute.  



  Un     milieu    de fermentation approprié contient de  l'eau et un     milieu    typique qui convient pour pro  duire de la     chlorodéméthyltétracycline    est le suivant  
EMI0007.0050     
  
    Amidon <SEP> de <SEP> maïs <SEP> <B>....</B> <SEP> _<B>.....</B> <SEP> __<B>.............</B> <SEP> __<B>.........</B> <SEP> 55 <SEP> g/1
<tb>  CaC03...........................-..................................... <SEP> 57 <SEP> g/1
<tb>  (NH4)sSd4 <SEP> <B>............... <SEP> ............... <SEP> ...................... <SEP> 5 <SEP> g/i</B>
<tb>  FeS04. <SEP> 7H20 <SEP> <B>....... <SEP> ........................................</B> <SEP> 40 <SEP> mg/1
<tb>  MnS04.

   <SEP> 4H20 <SEP> <B>......</B> <SEP> .....<B>..........</B> <SEP> .<B>.....................</B> <SEP> .<B>....</B> <SEP> 50 <SEP> mg/1
<tb>  ZnS04 <SEP> 7H20 <SEP> <B>............... <SEP> .............. <SEP> .................</B> <SEP> 100 <SEP> mg/1
<tb>  CoC12 <SEP> 6H20 <SEP> <B>............... <SEP> ................ <SEP>   <SEP> ....... <SEP> .....</B> <SEP> 5 <SEP> mg/1
<tb>  Liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> maïs <SEP> ............... <SEP> 30 <SEP> g/1
<tb>  Farine <SEP> de <SEP> graine <SEP> de <SEP> coton <SEP> ........................ <SEP> 2 <SEP> g/1
<tb>  Huile <SEP> de <SEP> saindoux <SEP> ._<B>.....................................</B> <SEP> ..

   <SEP> 2,0%
<tb>  en <SEP> volume       Quand on restreint la teneur de ce milieu en ions  chlorure cela tend à augmenter la quantité de     démé-          thyltétracycline    aux dépens de la production de     chlo-          rodéméthyltétracycline.       Exemple 2    On conduit une fermentation en flacons de     se-          coueuse    qui aboutit à former une     certaine    quantité  de     déméthyltétracycline    et de     chlorodéméthyltétracy-          cline,

      avec un     milieu    préparé comme suit  
EMI0007.0062     
  
    Liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> mais <SEP> ............... <SEP> 30 <SEP> g/1
<tb>  Huile <SEP> de <SEP> saindoux <SEP> .......................................... <SEP> 2 <SEP> %
<tb>  en <SEP> volume
<tb>  Amidon <SEP> de <SEP> maïs <SEP> .......................................... <SEP> 55 <SEP> g/1
<tb>  Farine <SEP> de <SEP> graine <SEP> de <SEP> coton <SEP> ........................ <SEP> 2 <SEP> g/1
<tb>  CaC03.................................................................. <SEP> 7 <SEP> g/1
<tb>  (ffl4)aS04 <SEP> <B>................................... <SEP> ........... <SEP> ......</B> <SEP> 5 <SEP> g/1
<tb>  NH4Cl <SEP> ......................:

  ........................................... <SEP> 1,5g/1
<tb>  FeS04.7H20 <SEP> ................................................ <SEP> 40 <SEP> mg/1
<tb>  ZnS04. <SEP> 7H20 <SEP> <B>.... <SEP> ................... <SEP> ........................</B> <SEP> 100 <SEP> mg/1
<tb>  MnS04 <SEP> ' <SEP> 4H20 <SEP> <B>........... <SEP> ................. <SEP> - <SEP> ..... <SEP> ........</B> <SEP> 50 <SEP> mg/1
<tb>  CoC12 <SEP> - <SEP> 6H20 <SEP> ................................................

   <SEP> 5 <SEP> mg/1       On mesure une portion de 25     cm3    que l'on intro  duit dans un     flacon        Erlenmeyer    de 250     cm3,    on stéri  lise pendant 20     minutes    à     120o    C et on inocule avec  1     cm3    de culture     mycélienne    préparée comme dans  l'exemple 1.

   Après     incubation    de 120 heures à     26o    C  sur une     secoueuse    rotative à 186     t/mn,    on titre la  liqueur et on trouve qu'elle ne contient pas plus de  70     microgrammes    environ de     chlorotétracycline    par       cm3,        environ    450     microgrammes    de     déméthyltétracy-          cline    par     cm3,

      et     environ    900     microgrammes    de     chlo-          rodéméthyltétracycline    par     em3.       Exemple 3  On prépare un     milieu        d'inoculation    comme décrit  à l'exemple 1 et on l'inocule avec des spores d'une  race de<I>Streptomyces</I>     auréofaciens    productrice de     dé-          méthyltétracycline.    On laisse     incuber    cet     inoculai    pen-           dant    24 heures à 280 C dans un agitateur de culture  à mouvement alternatif.

   On prépare un milieu de  fermentation contenant  
EMI0008.0002     
  
    Farine <SEP> de <SEP> maïs <SEP> <B>...........</B> <SEP> .<B>.................</B> <SEP> -<B>...........</B> <SEP> 14,5 <SEP> g/1
<tb>  Amidon <SEP> de <SEP> maïs <SEP> <B>.....</B> <SEP> .<B>.............</B> <SEP> .._..<B>..................</B> <SEP> 47,5 <SEP> g/1
<tb>  Liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> du <SEP> maïs, <SEP> à
<tb>  50 <SEP> % <SEP> de <SEP> matières <SEP> solides <SEP> <B>........</B> <SEP> 22,5 <SEP> g/1
<tb>  CaCO3 <SEP> 9,0 <SEP> g/1
<tb>  (NH4)2SO4 <SEP> <B>...........</B> <SEP> .<B>-----</B> <SEP> -<B>....</B> <SEP> .....<B>----</B> <SEP> .<B>---------------------</B> <SEP> 5,85 <SEP> g/1
<tb>  4 <SEP> 1,66 <SEP> g/1
<tb>  MnS04 <SEP> (70 <SEP> %) <SEP> -...-<B>.........</B> <SEP> .<B>........</B> <SEP> .._.__.<B>----------</B> <SEP> ...

   <SEP> 56 <SEP> mg/1
<tb>  COCl2 <SEP> - <SEP> 5H20 <SEP> _.<B>............</B> <SEP> .<B>.........</B> <SEP> __....<B>-------</B> <SEP> ._... <SEP> 5 <SEP> mg/1
<tb>  Huile <SEP> de <SEP> lard <SEP> <B>......</B> <SEP> -.<B>.......................................</B> <SEP> 25 <SEP> m1/1       Ce milieu est réparti à raison de 30 ml chacun  dans des     flacons        d'Erlenmeyer    de 250 ml. On bouche  les     flacons    stérilisés sont     inoculés    avec 1 ml de     l'ino-          pendant    20 minutes à 1210 C.

   Après refroidissement,  les flacons     stérilisés    sont inoculés avec 1 ml de     l'ino-          culat,        incubé    pendant 24 heures, de la race décrite  ci-dessus. Les     flacons    de fermentation inoculés sont  soumis à une incubation dans un agitateur de culture  à mouvement rotatif, à une température ne dépassant  pas 280 C. On laisse la fermentation se poursuivre  pendant 140 heures.

   Un échantillon de ce bouillon  fermenté est alors analysé     quant    à sa teneur en     chlo-          rotétracycline,    en se servant de la méthode, décrite       dans        cette    demande, consistant à mesurer le change  ment d'absorption dans     l'ultraviolet        avant    et après  dégradation     alcaline.    La teneur calculée en     chloroté-          tracycline    est     inférieure    à 50     ,1/m1,

      c'est-à-dire à la       sensibilité        garantie    de cette méthode d'analyse. Par  chromatographie sur papier du bouillon fermenté, on  ne trouve que des traces de     chlorotétracycline.    Par la  méthode d'analyse     spectrophotométrique    décrite dans  cette demande, on trouve une teneur en     déméthyl-          chlorotétracycline    et     déméthyltétracycline    correspon  dant à 2090     ,1/m1.    La chromatographie sur papier  montre que ces deux     déméthyltétracyclines    se trou  vent en proportions à peu près égales.

      Exemple 4    On prépare un     milieu    d'inoculation comme     dans     l'exemple 1, et on l'inocule avec des spores d'une  race de S.     auréofaciens    productrice de     déméthyltétra-          cycline.    Cet inoculai est incubé comme décrit à  l'exemple 1.

   On prépare un     milieu    de fermentation  contenant  
EMI0008.0041     
  
    Farine <SEP> de <SEP> maïs <SEP> <B>--------------------------------</B> <SEP> 67,0 <SEP> g/1
<tb>  Liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> du <SEP> maïs, <SEP> à
<tb>  <B>50%</B> <SEP> de <SEP> matières <SEP> solides <SEP> <B>..............

   <SEP> _.</B> <SEP> 25,0 <SEP> g/1
<tb>  CaC03 <SEP> pulvérisé <SEP> .<B>..................</B> <SEP> .<B>---------------</B> <SEP> .<B>......</B> <SEP> 9,0 <SEP> g/1
<tb>  4)2S04 <SEP> <B>....</B> <SEP> __<B>.............</B> <SEP> .<B>....</B> <SEP> -<B>.............</B> <SEP> ....-<B>.......</B> <SEP> 6,75 <SEP> g/1
<tb>  4 <SEP> 2,0 <SEP> g/1
<tb>  MnS04 <SEP> (70 <SEP> %) <SEP> <B>.................</B> <SEP> .._.....<B>------</B> <SEP> .<B>......</B> <SEP> _<B>.....</B> <SEP> 100 <SEP> mg/1
<tb>  CoC12 <SEP> - <SEP> 6H20 <SEP> ....<B>....</B> <SEP> _...-<B>....</B> <SEP> ___<B>............

   <SEP> .......</B> <SEP> 5 <SEP> mg/1
<tb>  Huile <SEP> de <SEP> lard <SEP> <B>....</B> <SEP> .<B>........</B> <SEP> _.....<B>................</B> <SEP> __<B>-----</B> <SEP> 30 <SEP> ml/1       Ce     milieu    est traité, inoculé et incubé comme     dans     l'exemple (3). Le bouillon récolté est analysé aussi    bien par spectrophotométrie que par chromatographie  sur papier.

   On ne décèle pas de     chlorotétracycline.    La  plus grande partie du produit est de la     déméthylchlo-          rotétracycline.    On trouve une teneur totale corres  pondant à 2540     y/ml    de     déméthyltétracyclines,    dont  2200     y/ml    sont formés de     déméthylchlorotétracycline.     La chromatographie sur papier confirme que seule  une petite quantité de     déméthyltétracycline    s'est for  mée.

      Exemple 5    On effectue une fermentation comme dans l'exem  ple (4), sauf que l'on     utilise    une race     différente    de  <I>S.</I>     auréofaciens    productrice de     déméthyltétracycline     en tant qu'agent de fermentation. Le bouillon fer  menté est analysé comme dans l'exemple (4).

   La  chromatographie sur papier ne     permet    pas de déceler  la présence de     chlorotétracycline.    L'analyse     spectro-          photométrique    donne une teneur totale en     déméthyl-          tétracyclines    de 1430     y/ml,    dont 300     y/ml    de     démé-          thylchlorotétracycline.    Par chromatographie sur pa  pier, on s'assure que le reste de la     totalité    des substan  ces antibiotiques est formé de     déméthyltétracycline,     dont la teneur, calculée par différence,

   est de  1130     y/ml.       Exemple 6    On effectue une     fermentation    dans les conditions  décrites à l'exemple (3), sauf que l'on utilise une race  différente de<I>S.</I>     auréofaciens    productrice de     déméthyl-          tétracycline    comme agent de fermentation et que le  milieu de fermentation contient  
EMI0008.0073     
  
    Farine <SEP> de <SEP> maïs <SEP> <B>-------</B> <SEP> -<B>----</B> <SEP> ...<B>---------------------</B> <SEP> 16,9 <SEP> g/1
<tb>  Amidon <SEP> de <SEP> maïs <SEP> <B>----- <SEP> --------------------------- <SEP> --------</B> <SEP> 66,42 <SEP> g/1
<tb>  Liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> du <SEP> maïs,

   <SEP> à
<tb>  50 <SEP> % <SEP> de <SEP> matières <SEP> solides <SEP> <B>------------------</B> <SEP> 27,5 <SEP> g/1
<tb>  CaCOs <SEP> pulvérisé <SEP> <B>---------------------------- <SEP> ....</B> <SEP> . <SEP> ..... <SEP> 11,43 <SEP> g/1
<tb>  (NH4)2S04 <SEP> <B>--------------------</B> <SEP> .<B>-----</B> <SEP> .-..-.<B>------</B> <SEP> ...<B>--------</B> <SEP> 9,0 <SEP> g/1
<tb>  NH4Cl <SEP> <B>-----</B> <SEP> .<B>---------------------------------</B> <SEP> -...-<B>----------</B> <SEP> 2,0 <SEP> g/1
<tb>  MnS04 <SEP> (70 <SEP> %) <SEP> <B>----</B> <SEP> .-<B>-------------------------- <SEP> ------- <SEP> 160</B> <SEP> mg/1
<tb>  CoCl2 <SEP> - <SEP> 6H20 <SEP> <B>---------------------------- <SEP> ----------------- <SEP> -</B> <SEP> 5 <SEP> mg/1
<tb>  Huile <SEP> de <SEP> lard <SEP> <B>-------------------------------</B> <SEP> -....<B>-----</B> <SEP> 33,

  3 <SEP> m1/1       On laisse la fermentation se poursuivre pendant  140 heures. Comme l'indique la chromatographie sur  papier, le bouillon de fermentation ne contient que  de la     déméthyltétracycline.    Un essai biologique du  bouillon révèle une teneur en     déméthyltétracycline     correspondant à 810     y/ml,    vis-à-vis du     staphylococcus          aureus.     



  Exemple 7  On procède de façon analogue à celle de l'exem  ple (3). On prépare un     milieu    d'inoculation conte  nant:  
EMI0008.0080     
  
    Liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> du <SEP> maïs, <SEP> à <SEP> 50 <SEP> % <SEP> de
<tb>  matières <SEP> solides <SEP> <B>--------------- <SEP> -----------------</B> <SEP> -<B>-----------</B> <SEP> 20 <SEP> g/1
<tb>  Dextrose <SEP> .. <SEP> . <SEP> .. <SEP> .... <SEP> ...... <SEP> .......... <SEP> .30 <SEP> g/1
<tb>  (NH4)2S04 <SEP> <B>------------------------- <SEP> ----- <SEP> ---------- <SEP> - <SEP> ----------------</B> <SEP> 2 <SEP> g/1
<tb>  CaCO3 <SEP> ....___..._._...........__...._...._................................ <SEP> 7 <SEP> g/1         On     stérilise    ce     milieu    et on l'inocule avec des  spores d'une race de S.

       auréofaciens    productrice de       déméthyltétracycline.    On le soumet à     l'incubation,     comme dans l'exemple (3). Après une période de  croissance de 24     heures,    cet inocula est     utilisé    pour  ensemencer un     milieu    de fermentation contenant    Les exemples     suivants    illustrent la récupération,  le     raffinage    et la séparation des antibiotiques.  



  Exemple A       Raffinage   <I>de la</I>     chlorodéméthyltétracycline     <I>et de la</I>     déméthyltétracycline     
EMI0009.0014     
  
    CaCO3 <SEP> <B>.......</B> <SEP> .<B>......</B> <SEP> .<B>......................... <SEP> ...... <SEP> ..........</B> <SEP> - <SEP> 10,0 <SEP> g/1
<tb>  (NH3)2S04 <SEP> ....<B>............................</B> <SEP> .<B>..................</B> <SEP> 9,84 <SEP> g/1
<tb>  FeSO., <SEP> - <SEP> 7H20 <SEP> <B>......</B> <SEP> .<B>..............................</B> <SEP> .<B>..........</B> <SEP> 60,0 <SEP> mg/1
<tb>  ZnSO4 <SEP> - <SEP> 7H20 <SEP> <B>------------------</B> <SEP> -<B>..........</B> <SEP> .<B>---- <SEP> ------------</B> <SEP> 100,0 <SEP> mg/1
<tb>  MnSO4 <SEP> ' <SEP> HZO <SEP> <B>-------</B> <SEP> ....._....._..<B>-------------</B> <SEP> ..

   <SEP> ........... <SEP> 50,0 <SEP> mg/1
<tb>  CoN03 <SEP> - <SEP> 6H20 <SEP> <B>..................................... <SEP> ...........</B> <SEP> 5,0 <SEP> mg/1
<tb>  MgSO4. <SEP> 7H20 <SEP> ....<B>......................................</B> <SEP> .<B>.....</B> <SEP> 2,0 <SEP> g/1
<tb>  1,48 <SEP> g/1
<tb>  H2P0.j <SEP> (85 <SEP> %) <SEP> <B>................................... <SEP> ------------</B> <SEP> 400,0 <SEP> mg/1
<tb>  Amidon <SEP> _<B>...........</B> <SEP> __<B>..........................................</B> <SEP> 55,0 <SEP> g/1
<tb>  l-méthionine <SEP> <B>-----</B> <SEP> .<B>..............</B> <SEP> -<B>................... <SEP> ........</B> <SEP> . <SEP> 600,0 <SEP> mg/1
<tb>  l-histidine <SEP> <B>....................</B> <SEP> .<B>....</B> <SEP> .<B>........</B> <SEP> .<B>.....

   <SEP> ........</B> <SEP> .<B>.....</B> <SEP> 800,0 <SEP> mg/1
<tb>  Huile <SEP> de <SEP> lard <SEP> <B>.....................................</B> <SEP> .<B>-------</B> <SEP> _ <SEP> 20 <SEP> m1/1       Ce     milieu    est réparti dans des flacons et     stérilisé     à     1201,    C pendant 15 minutes. Après inoculation, les  flacons sont soumis à une incubation dans un agita  teur de culture à mouvement rotatif, à une tempéra  ture ne dépassant pas     28o    C. Après une durée de  fermentation de 51 heures, on ajoute du     KBr82    radio  actif (environ 800     millicuries    par gramme) en quan  tité suffisante pour obtenir une concentration de 2 mi  crocuries par ml du milieu.

   Après une nouvelle pé  riode de     fermentation        de    15 heures, on sépare un  filtrat du bouillon     acidifié,    en ajustant le pH du bouil  lon à 1,3 au moyen d'acide oxalique puis en     filtrant.     Ce filtrat acide est alors analysé par     chromatographie     sur papier, en se servant d'un système de     n-butanol     de pH 3,0.

   Dans ce système, une     halogénodéméthyl-          tétracycline    se déplace vers l'avant, par rapport à la       déméthyltétracycline.        L'examen    de radioactivité du     fil-          trat    de fermentation montre deux pointes de radio  activité, l'une au point de départ, correspondant au  brome     résiduaire,    non employé dans le     métabolisme,     l'autre immédiatement en avant de la     déméthyltétra-          cycline,    ce.

   qui démontre que du     brome82    a été incor  poré par le microorganisme,     donnant    lieu à la for  mation de     déméthylbromotétracycline.       Exemple 8    <I>Fermentation en cuve</I>    On conduit une fermentation de 40 litres dans une  cuve pilote, essentiellement suivant la méthode décrite  à l'exemple 2. Après avoir préparé le milieu, on le  stérilise pendant 25 minutes à     125,1    C et on l'inocule  avec un     inoculum    de souche S-604 préparé comme  indiqué par     Duggar,    brevet des     Etats-Unis    d'Améri  que No 2482055.

   On conduit la fermentation avec  agitation continue à une température de 280 C pen  dant les 24 premières heures, et 250 C jusqu'à achè  vement, en 135 heures. On introduit de     l'air    stérile à  raison de 0,3     1/1/mn    pendant les     seize    premières  heures, puis à raison de 0,5     1/1/mn    jusqu'à la     récolte.       On prépare 25,8 litres de liqueur comme dans  l'exemple 3, on les traite par 200     cm3    d'acide chlor  hydrique concentré pour ajuster le pH à 1,5.

   On  filtre la liqueur traitée, après l'avoir mélangée à 2,8 kg  d'un adjuvant de     filtration,    pour     obtenir    16,3     litres     de filtrat. On reprend le tourteau de     filtration    par  25 litres d'eau à une température     d'environ    500 C et  on ajuste au pH 1,5. Après avoir     agité    pendant  30 minutes, on     filtre    le     tourteau    délayé et on réunit  le filtrat au filtrat précédent, pour former une masse  de 42,3 litres. On traite le filtrat réuni avec 6,76 kg  de chlorure de sodium et on extrait à quatre reprises  par le     butanol    à raison de 15% du volume du filtrat.

    On réunit les extraits, on les clarifie par filtration et on  les concentre sous vide à 25-300 C jusqu'à un volume  final de 6     litres.       Exemple B  <I>Séparation</I>     chromatographique     <I>de la</I>     chlorodéméthyltétracycline     <I>et de la</I>     déméthyltétracycline       On divise le concentré au     butanol    de l'exemple A  en deux portions égales, on concentre l'une à 900     cm3     et on concentre     l'autre    à 610     cm3    sous vide. On filtre  les concentrés et on les ajuste au pH 2 avec de la  soude à 50 %.

      Pour préparer le système solvant     utilisé    pour la  séparation     chromatographique,    on     équilibre    un mé  lange à 80 % de     butanol    et 20 % de chloroforme  avec de l'eau ajustée au pH 2 au moyen d'acide       chlorhydrique.    Les colonnes sont des colonnes de  verre de 15 cm de     diamètre        garnies    de 2,8 kg     die     terre d'infusoires lavée à l'acide. On     équilibre    les       colonnes    avec la phase aqueuse du système solvant  avant l'usage.  



  On traite les deux concentrés au     butanol,    sur des  colonnes séparées. On verse doucement les concentrés  dans le haut des     colonnes.    Puis on élue les colonnes  avec la phase     solvante    que l'on fait passer au travers  à raison d'environ 10     litres    par heure. Dans chaque  cas, on prend 40 tranches de 500     cm3,    et on déter  mine la teneur en antibiotique de chacune par chro  matographie sur bande de papier.

   Dans la portion de  900     cm3,    les tranches 6 à 17 contiennent la     chloro-          déméthyltétracycline    et la     chlorotétracycline,    et les  tranches 24 à 40     contiennent    la     déméthyltétracycline     et la     tétracycline.    Dans la portion de 610     cm3,        les     tranches 7 à 18     contiennent    la     chlorodéméthyltétra-          cycline    et la     chlôrotétracycline,

      et les tranches 19 à  31 contiennent la     déméthyltétracycline    et la tétracy  cline.      Exemple C  <I>Récupération de la</I>     chlorodéméthyltétracycline     <I>à partir de fractions de colonne</I>  On réunit les fractions     contenant    de la     chlorodé-          méthyltétracycline    et provenant de l'exemple B, pour  obtenir un volume d'environ 12 litres. On ajoute une  égale quantité d'eau, et on concentre le mélange sous  vide jusqu'à 1810     cm3    de solution aqueuse.

   On ajuste  le pH du concentré à 2,3-1,9 par addition d'acide       chlorhydrique.    On lave à     deux    reprises le concentré  acidifié avec 180     cmu    de chloroforme, on filtre et  on concentre, sous vide jusqu'à un volume de 360     cm3.     On ajuste le pH du     concentré    entre 1,2 et 2,8 avec  de la soude à 50 %. On sèche la solution par con  gélation pour donner 18,56 g de chlorhydrate de       chlorodéméthyltétracycline    amorphe, titrant 550 mi  crogrammes par mg.

      Exemple D  <I>Cristallisation</I>  <I>du chlorhydrate de</I>     chlorodéméthyltétracycline     <I>par le mélange acétone-éther</I>  On prend 18,56g de     chlorodéméthyltétracycline     séchée par congélation comme dans l'exemple C, on  agite     dans    un mélange de 55     em3    d'acétone, 7,4     cm3     d'eau et 3,7     cm3    d'acide chlorhydrique concentré. On       filtre    la solution et on rince les solides à deux repri  ses avec un total de 55     cm3    d'acétone contenant  1,85     em3    d'eau.

   On réunit les filtrats, le pH étant de  0,8, et on traite par 55     cm8    d'éther. On ensemence  le mélange, on laisse     vieillir    18 heures à la tempéra  ture ambiante avec agitation     constante,    et on enlève  par filtration les cristaux qui se forment. On lave le  produit avec un mélange d'acétone, d'eau et d'éther,  puis avec de l'acétone et finalement avec de l'éther,  et on sèche sous vide à 400 C. On obtient un rende  ment de 4,74 g de chlorhydrate de     chlorodéméthyl-          tétracycline        cristallin    titrant 1090     microgrammes    par  mg, ce qui représente un rendement d'opération de  50,6 %.

   Le produit contient 11 % de     chlorotétracy-          cline.       Exemple E  <I>Cristallisation</I>  <I>du chlorhydrate de</I>     chlorodéméthyltétracycline     <I>à partir d'un mélange</I>     butanol-cellosolve       On prend une portion de 50,4 g de     chlorodémé-          thyltétracycline    séchée par congélation, préparée  comme     dans    l'exemple C, et titrant 700     microgram-          mes    par mg, on la délaie     dans    22,5     cm3    de     cellosolve,

       et à la solution     résultante    on ajoute, au total, 205     cm3     de     butanol.    On ajuste le pH à 0,8 par addition de  11     cm3    d'acide chlorhydrique     concentré    et on laisse       vieillir    le mélange 51 heures avec agitation. On en  lève les     cristaux    obtenus par filtration, on lave avec  un mélange à 90/10 de     butanol    et de     cellosolve,    puis  avec du chloroforme et on sèche sous vide.

   On ob  tient un rendement de 30,6 g de chlorhydrate de       chlorodéméthyltétracycline,    titrant 1053     microgram-          mes    par mg, soit un rendement de 84 %.    Exemple F  <I>Recristallisation de la</I>     chlorodéméthyltétracycline     <I>de manière à détruire la</I>     chlorotétracycline     On prend 1 g de la     chlorodéméthyltétracycline     préparée dans l'exemple D, on la délaie dans 3     cm3     de mélange à 90 % de     butanol    et 10 % de     cellosolve,

       et on y ajoute 3     cm3    de     triéthylamine    pour ajuster le  pH à 10,4. On laisse reposer la solution incomplète  à la température     ambiante        pendant    24 heures pour  détruire la     chlorotétracycline    qui peut être présente,  et au bout de ce temps on ajoute de l'acide chlorhy  drique concentré pour abaisser le pH à 0,8, et on  laisse vieillir le mélange pendant 24 heures avec agi  tation.

   On filtre le produit cristallin, on le lave avec  un     mélange;    à 90 % de     butanol    et 10 % de     cello-          solve,    puis au chloroforme et on sèche sous vide à       40     C. On obtient un rendement de 0,36 g de     chlor-          hydrate    de     chlorodéméthyltétracycline,    titrant 1228       microgrammes    par mg et contenant environ 2,5 %  de     chlorotétracycline,    ce qui représente un rende  ment de 40 %.  



  Les exemples suivants illustrent la conversion des  antibiotiques en diverses formes    Exemple G       Bromhydrate   <I>de</I>     chlorodéméthyltétracycline       On dissout 1,0g de     chlorodéméthyltétracycline-          ammonium    dans 20     cm3    d'eau et on traite la solution  par 0,6     cm2    d'acide bromhydrique à 48 % pour ajus  ter le pH à 1,6.

   On     laisse        vieillir    le mélange pendant  18 heures en agitant, à la température     ambiante,    et  au bout de ce temps on trouve des cristaux en aiguil  les     allongées    de     bromhydrate    de     chlorodéméthyltétra-          cycline.    On filtre le produit, on le lave avec 6     cm3     d'eau ajustée au pH 2,2 avec de l'acide bromhydri  que, et on sèche sous vide pendant 5 heures à     44,1    C.  On obtient un rendement de 750 mg de     bromhydrate     de     chlorodéméthyltétracycline.     



  Analyse calculée pour     C21H22N@ClBr08       C : 46,2; H : 4,1 ; N : 5,1 ;<B>CI:</B> 6,5 ;     Br    : 14,6 ;  O : 23,4.  



  Analyse effective  C : 45,94; H: 4,44 ;<B>N:</B> 4,71 ;<B>CI:</B> 6,78 ; 6,47 ;       Br    : 13,74 ; O     (différence)    : 24,39 ; 24,70.         Exemple    H  <I>Préparation du sel d'ammonium</I>  <I>de</I>     chlorodéméthyltétracycline       On prend une     portion    de 100 mg de la     chlorodé-          méthyltétracycline    préparée;

   dans l'exemple D, on la  dissout dans 0,5     cm3    de mélange à 90 % de     butanol     et<B>10%</B> de     cellosolve,    et on fait barboter du gaz       ammoniac    dans la solution jusqu'à ce qu'il     apparaisse     un solide     épais.    On dilue la bouillie avec une petite  quantité     d'ammoniaque    aqueuse concentrée, on laisse  reposer à la température ambiante pendant 5 heures  et on filtre. On lave: le produit avec un     mélange    à  90 % de     butanol    et 10 % de     cellosolve,    puis à l'acé  tone, et on sèche sous vide.

   On obtient un rendement      de 41,4 mg de sel d'ammonium de     chlorodéméthyl-          tétracycline,    titrant 1148     microgrammes    par mg en  chlorhydrate de     chlorotétracycline    (rendement 44 % ).  Exemple I  <I>Préparation de la</I>     chlorodéméthyltétracycline   <I>neutre</I>  On prend une portion de 50 mg de la     chlorodé-          méthyltétracycline    obtenue dans l'exemple D; titrant  1090     microgrammes    par mg, on la dissout dans  1,3     cm3    d'eau et on traite la solution par le carbonate  de sodium à sec jusqu'à un pH de 7-8.

   On     élimine     par centrifugation le précipité amorphe obtenu, et on  ajuste au pH 5,4 le liquide limpide de décantation,  et on le laisse vieillir 16 heures à la température am  biante. On filtre le produit, on le lave à l'eau et on  le sèche sous vide à     35o    C, pour obtenir 21,9 mg  de     chlorodéméthyltétracycline    neutre cristalline ti  trant 1250 grammes par mg (rendement<B>50%).</B>



  Process for the preparation of antibiotics The present invention relates to a process for the preparation of new therapeutic substances which have been identified as antibiotics from the group of chlordemethyltetracycline and bromdemethyltetracycline and their epimers.



  This process is characterized by the fact that an aqueous nutrient medium is fermented, under aerobic conditions, containing an assimilable carbon source, nitrogen and mineral substances, comprising chloride and / or bromide ions. by means of a strain of <I> Streptomyces </I> aureofaciens producing demethyltetracycline.



  The epimers of demethyltetracycline, chlordemethyltetracycline or bromdemethyltetracycline can also be obtained by adding the pH of a concentrated solution of the corresponding demethyltetracycline to a value between 3.0 and 5.0 and allowing the solution to stand until until the isomerization has reached equilibrium.



  Each of the previously known tetracycline antibiotics which are produced by fermentation with S. aureofaciens under specific conditions, namely chlortetracycline and bromtetracycline has its counterpart in the new series of antibiotics.



  In a chloride-free medium, the predominant antibiotic is the unchlorinated analogue of tetra cyclin. In a medium rich in bromine, the brominated antibiotic is formed; and in a medium rich in chlorine, the predominant antibiotic will be a chlorinated antibiotic similar to chlorotetracycline.



  New antibiotics can be converted to epimers as described below, similar to the conversion of tetracyclines to quatrimycins. Chemical analyzes, and examination of the chemical and physical properties of the new compounds, indicate that they differ essentially from the corresponding tetracyclines in that they contain one less methyl group. The methyl group in question is most likely that which occupies position 6 on the naphtacene ring of tetracyclines.

   Accordingly, the analogue of chlortetracycline will be called 7-chlor-4-dimethylamino-1,4,4a, 5, 5a, 6,11,12a-octahydro-3,6,10,12,12a- pentahydroxy-1, 11-dioxo-2-naphtacene-carboxamide.



  The new antibiotics are produced by certain mutant strains of S. aureofaciens. These strains are undoubtedly of the species <I> Streptomy- </I> <I> ces </I> aureofaciens, since they are derived from the primitive strain A-377 isolated by Dr B.

   M. Duggar, and deposited at the Northem Regional Research Laboratories in Peoria (Illinois, USA), and indexed in this Laboratory under the NI, NRRL 2209.

   Mutations involving treatment of strain A-377 with mutagens, successively comprising ultraviolet irradiation, nicotine and 2,2-dichloro-N-methyldiethylamine hydrochloride, were used to create one of the strains . Various other strains have been obtained by spontaneous mutation and by treatment with mutagens.

   These various strains, which produce the new antibiotics in different proportions and with varying yields, present the general characteristics of the species <I> S. </I> aureofaciens. They differ a little from each other and also from the strains of S. auréofaciens previously described, mainly by their pigmentation and their property of producing new antibiotics.

    In most cases, a reddish-brown pigment is noted when microorganisms are grown on ordinary culture media. The undertones of the pigment vary from a peach or coppery brown shade to a dark mahogany, depending on the particular strain and the nutrient medium used. Although the property of producing the new antibiotics is generally associated with strains which exhibit this type of pigmentation, this pigment formation and the production of the new antibiotics are not necessarily interdependent properties.

   All the strains studied produce chlorotetracycline, and generally tetracycline, although the relative proportions of these antibiotics vary considerably depending on the nature of the fermentation medium, the fermentation conditions and the particular strain chosen. In some cases the production of chlorotetracycline and tetracycline is very low, on the order of a few% of the total antibiotic produced by fermentation.



  The mutant strains which produce the new antibiotics have the same general characteristics as the strains which produce the tetracyclines, and they differ from each other in the same general way as the strains producing tetra cyclin differ from each other, as well. that has been explained in several scientific articles that have been published. Although many strains of S.

       aureo-facials are available to the public in culture collections and have been described in the scientific literature, the following data will be used to illustrate the type of variation of the new strains, compared to the primitive strain A-377 which occurs. found under the designation NRRL 2209.

      <I> Comparison of the strains of S. </I> aureofaciens <I> S-604 and A-377 on various media </I> The <I> Streptomyces </I> aureofaciens strain S-604 which produces chlorodemethyltetracycline and Demethyltetracyclin was compared to <I> Streptomyces </I> aureofaciens strain A-377 (NRRL 2209) by observing the growth characteristics on various media incubated at 26-27o C.



  The observations made are as follows
EMI0002.0028
  
    <I> 1. <SEP> Glycerol, <SEP> asparagine, <SEP> extract <SEP> from <SEP> beef, <SEP> agar-agar </I>
<tb> Glycerol <SEP> ........................................... _............._....... <SEP> 1.0 <SEP>%
<tb> Asparagine-L <SEP> <B> ............. </B> <SEP>. <B> ........... </ B > <SEP>. <B> ............................ </B> <SEP> 0.05%
<tb> Extract <SEP> from <SEP> beef <SEP> <B> ..... </B> <SEP> _ <B> .... </B> <SEP> __ <B>. ......... </B> <SEP>. <B> ................... </B> <SEP> .... _ <SEP> 0.2 <SEP>%
<tb> # 2P04 <SEP> .......................................... .................._..... <SEP> 0.05%
<tb> Agar-agar <SEP> Bacto <SEP> <B> ......... </B> <SEP>. <B> .............. .. </B> <SEP> __ <B> ......... </B> <SEP>. <B> ........ </B> <SEP> 1, 5 <SEP>%
<tb> Distilled <SEP> water, <SEP> q.s. <SEP> for <SEP> .......... '<SEP>. <SEP> _ ..

   <SEP> <B> __ <SEP> ........ </B> <SEP> 100 <SEP>%
<tb> <SEP> adjustment of <SEP> pH <SEP> by <SEP> KOH <SEP> to <SEP> 50% <SEP>: <SEP> <B> ...... </B> < MS> 7.0
<tb> pH <SEP> after <SEP> sterilization <SEP> <B> ................................ ..... </B> <SEP> 7.1
<tb> <I> Streptomyces <SEP> aureofaciens </I>
<tb> Strain <SEP> S-604 <SEP> Strain <SEP> A-377
<tb> Growth <SEP> Abundant, <SEP> color <SEP> <SEP> Venetian <SEP> red <SEP> <SEP> (<SEP>) <SEP> Fairly <SEP> abundant
<tb> Hyphae <SEP> aerial <SEP> Abundant, <SEP> white <SEP> to <SEP> <SEP> Pink <SEP> gray <SEP> <SEP> (*) <SEP> White, <SEP> uniform
<tb> Sporulation <SEP> Slight, <SEP> becoming <SEP> abundant <SEP> None
<tb> Pigment <SEP> diffusible <SEP> Brown <SEP> reddish <SEP> Yellow
<tb> Reverse <SEP> <SEP> Brown <SEP> Mahogany <SEP> <SEP> (*) <SEP> Yellow <SEP> to <SEP> yellow,

   <SEP> orange <SEP> light
<tb> (*) <SEP> Designation <SEP> of the <SEP> shades <SEP> according to <SEP> the <SEP> <SEP> Color <SEP> Harmony <SEP> Manual <SEP> <SEP> 3rd <SEP> edition, <SEP> edited <SEP> by <SEP> Container <SEP> Corporation
<tb> of <SEP> America.
<tb> <I> 2. <SEP> Dextrin, <SEP> Czapek-Dox, <SEP> agar-agar </I>
<tb> Dextrin <SEP>. <B> ....... </B> <SEP> __ <B> .............. </B> <SEP> . <B> ......... </B> <SEP>. <B> ................. </B> <SEP>. < B> ......... </B> <SEP> 1,0 <SEP> ô
<tb> NaN03 <SEP> ...._......._..._.......................... ............__......... <SEP> 0.2 <SEP> <B>% </B>
<tb> K2HP04 ._........___..._...._..............._.......... ..............

   <SEP> 0.1 <SEP>%
<tb> MgS04 <SEP> - <SEP> 7H20 <SEP> <B> ........... </B> <SEP>. <B> .......... . </B> <SEP>. <B> ........................... </B> <SEP> <I> 0 , 05 <SEP>% </I>
<tb> KCl <SEP> ......_...__................................ ....._................... <SEP> 0.05
<tb> FeS04 <SEP> # <SEP> 7H20 <SEP> <B> .......... </B> <SEP>. <B> ........... ................... </B> <SEP>. <B> ............ <SEP> 0.001% </ B >
<tb> Agar-agar <SEP> Bacto <SEP> <B> ........ </B> <SEP> _ <B> ............... </B> <SEP>. <B> ....... </B> <SEP>. <B> .............. </B> <SEP> 1.5 <SEP>%
<tb> Distilled <SEP> water, <SEP> q.s.

   <SEP> for <SEP>. <B> .................. </B> <SEP> - <B> ......... < / B> <SEP> - <B> .... </B> <SEP> 100.0 <SEP>%
<tb> pH <SEP> after <SEP> sterilization <SEP> <B> ----- </B> <SEP>. <B> -------------- </ B> <SEP> _ <B> ......... </B> <SEP>. <B> .... </B> <SEP> 7.0
<tb> <I> Streptomyces <SEP> aureofaciens </I>
<tb> Strain <SEP> S-604 <SEP> Strain <SEP> A-377
<tb> Growth <SEP> Rare, <SEP> hyaline <SEP> Profuse
<tb> Hyphae <SEP> aerial <SEP> Absent <SEP> Abundant, <SEP> <SEP> lead <SEP> gray <SEP> <SEP> (*)
<tb> Superficial <SEP> colorless <SEP> blood cells
<tb> Sporulation <SEP> None <SEP> Abundant
<tb> Pigment <SEP> diffusible <SEP> None <SEP> Light: <SEP> yellow <SEP> pale
<tb> Reverse <SEP> No <SEP> pigmented <SEP> No <SEP> pigmented
<tb> (*) <SEP> See <SEP> previous <SEP> note.

         
EMI0003.0001
  
    <I> 3. <SEP> Liqueur <SEP> of <SEP> maceration <SEP> of <SEP> corn, <SEP> agar-agar </I>
<tb> Liqueur <SEP> of <SEP> maceration <SEP> of <SEP> corn <SEP> .................. <SEP> 0.4 <SEP> %
<tb> Sucrose <SEP> ....._..................................... ....................... <SEP> 1.0 <SEP>%
<tb> MgS04 <SEP> - <SEP> 7H20 <SEP> <B> .................... </B> <SEP> - <B> ......... </B> <SEP>. <B> ......... </B> <SEP>. <B> ...... </B> <SEP> 0.025%
<tb> KH2P04 ....................................-......... .................. <SEP> 0.2 <SEP>%
<tb> (NH4) 2HP04 ........................................... .............. <SEP> 0.2 <SEP>%
<tb> Agar-agar <SEP> Bacto <SEP> <B> ............. <SEP> .................. ................ </B> <SEP> 2.0 <SEP>%
<tb> <SEP> water from <SEP> tap, <SEP> q.s. <SEP> for <SEP> <B> .....................

   <SEP> ........ </B> <SEP> 100.0
<tb> pH <SEP> after <SEP> sterilization <SEP> ................................... . <SEP> 6.3 <SEP>%
<tb> <I> Streptomyces <SEP> aureofaciens </I>
<tb> Strain <SEP> S-604 <SEP> Strain <SEP> A-377
<tb> Growth <SEP> Profuse <SEP> Profuse
<tb> Hyphae <SEP> aerial <SEP> Abundant <SEP> <SEP> pink <SEP> taupe <SEP> <SEP> (*) <SEP> dark <SEP> Abundant, <SEP> <SEP> Beaver <SEP >
<tb> Sporulation <SEP> Very <SEP> abundant, <SEP> uniform <SEP> Very <SEP> abundant, <SEP> uniform
<tb> Pigment <SEP> diffusible <SEP> Very <SEP> concentrated, <SEP> <SEP> deep <SEP> brown <SEP> <SEP> to <SEP> yellow <SEP> greenish <SEP> clear
<tb> <SEP> deep <SEP> brown <SEP> Mahogany <SEP>
<tb> Reverse <SEP> <SEP> Brown <SEP> Mahogany <SEP> <SEP> dark <SEP> (*) <SEP> <SEP> Covert <SEP> Brown <SEP> <SEP> (C *)
<tb> (*)

   <SEP> See <SEP> previous <SEP> notes.
<tb> <I> 4. <SEP> Other <SEP> backgrounds </I>
<tb> <I> Streptomyces <SEP> aureofaciens </I>
<tb> Strain <SEP> S-604 <SEP> Strain <SEP> A-377
<tb> Agar-agar <SEP> nutritious <SEP> Poor growth <SEP>, <SEP> <SEP> Mole <SEP> Growth <SEP> fairly <SEP> abundant. <SEP> Not
<tb> brown <SEP> <SEP> to <SEP> <SEP> dark <SEP> brown <SEP> <SEP> (*). <SEP> of aerial <SEP> hyphae. <SEP> To <SEP>:

   <SEP> yellow
<tb> No aerial <SEP> hyphae <SEP>. <SEP> Pale <SEP> reverse. <SEP> Pigment <SEP> soluble <SEP> yellow <SEP> to
<tb> <SEP> Taupe <SEP> brown <SEP> <SEP> (*). <SEP> Pigment <SEP> yellow <SEP> brownish <SEP> light
<tb> soluble <SEP> brown <SEP> reddish
<tb> Glucose, <SEP> asparagine, <SEP> extract <SEP> from <SEP> Abundant growth <SEP>. <SEP> Big <SEP> hy- <SEP> Fairly abundant <SEP> growth. <SEP> Hy meat, <SEP> agar-agar <SEP> aerial <SEP> phes <SEP> variegated <SEP>:

   <SEP> <SEP> pink <SEP> aerial <SEP> phes <SEP> white <SEP> becoming <SEP> of
<tb> taupe <SEP> <SEP> to <SEP> <SEP> fawn <SEP> <SEP> or <SEP> <SEP> carcel <SEP> <SEP> plus <SEP> in <SEP> plus <SEP> gray <SEP> when <SEP> the <SEP> for (*). <SEP> Abundant <SEP> sporulation. <SEP> En- <SEP> <SEP> mation of <SEP> spores <SEP> increases. <SEP> En vers <B>: </B> <SEP> <SEP> Taupe <SEP> brown <SEP> <SEP> (*). <SEP> Pig- <SEP> to <SEP>: <SEP> yellow <SEP> light. <SEP> Pigment <SEP> solu ment <SEP> soluble <SEP> brown <SEP> reddish <SEP> blue <SEP> yellow <SEP> light
<tb> Apple <SEP> of <SEP> earth <SEP> Growth <SEP> profuse <SEP> moist, <SEP> smooth, <SEP> Growth <SEP> profuse <SEP> smooth, <SEP> moist,
<tb> nodulated <SEP>: <SEP> <SEP> Dark <SEP> brown <SEP> Maho- <SEP> nodulated <SEP>:

   <SEP> <SEP> Light <SEP> Mellon <SEP> yel gany <SEP> <SEP> (*) <SEP> with <SEP> trace <SEP> of <SEP> <SEP> peach <SEP> low <SEP > <SEP> <B> (</B> *) <SEP> to <SEP> <SEP> Antique <SEP> pink <SEP> <SEP> (*).
<tb> tan <SEP> <SEP> (*). <SEP> Aerial <SEP> hyphae <SEP>: <SEP> ab- <SEP> Aerial <SEP> hyphae <SEP>:

   <SEP> trace. <SEP> -Not <SEP> from
<tb> smells <SEP> to <SEP> abundant, <SEP> becoming <SEP> pigment <SEP> soluble
<tb> blanks <SEP> to <SEP> <SEP> carcel <SEP> <SEP> (*). <SEP> Abundant <SEP> sporula tion <SEP> in <SEP> the <SEP> zones
<tb> of <SEP> strong <SEP> formation <SEP> of aerial <SEP> hyphae. <SEP> Pigment <SEP> soluble <SEP> <SEP> choco late <SEP> <SEP> (*) <SEP> to <SEP> <SEP> chocolate <SEP> brown <SEP>
<tb> Milk <SEP> purple <SEP> Light <SEP> collar <SEP> of <SEP> growth <SEP> Light <SEP> collar <SEP> of <SEP> growth <SEP> white
<tb> <SEP> Deep <SEP> red <SEP> Mahogany <SEP> <SEP> (*). <SEP> Little <SEP> to <SEP> pale yellow <SEP>.

   <SEP> Little <SEP> of <SEP> variation
<tb> of <SEP> noticeable <SEP> variation <SEP> of <SEP> pH, <SEP> little <SEP> noticeable <SEP> of <SEP> pH, <SEP> little <SEP> of <SEP> peptoni of <SEP> apparent peptonization <SEP>. <SEP> The <SEP> sation <SEP> apparent <SEP> in <SEP> 15 <SEP> days
<tb> manages <SEP> reaction <SEP> colored <SEP> falsely
<tb> alkaline <SEP> due <SEP> to <SEP> the <SEP> diffusion <SEP> of the
<tb> soluble <SEP> pigment
<tb> (*) <SEP> See <SEP> previous <SEP> notes.

         On all agar-agars except Czapek-Dox, but including the potato slant, S. aureofaciens strain S-604 produced a characteristic dark pigmentation, usually appearing with growth. Likewise, it is easy to observe the characteristic reddish brown soluble pigment.

      
EMI0004.0001
  
    <I> 5. <SEP> Microscopic <SEP> observations </I>
<tb> <I> Streptomyces <SEP> aureofaciens </I>
<tb> Strain <SEP> S-604 <SEP> Strain <SEP> A-377
<tb> Medium <SEP> Mycelium <SEP> Spores <SEP> Mycelium <SEP> Spores
<tb> Glycerol, <SEP> aspa.ca- <SEP> Sinuous, <SEP> continuous, <SEP> Spheroidal <SEP> Sinuous, <SEP> continuous, <SEP> Spheroidal
<tb> gine, <SEP> extract <SEP> from branched <SEP>. <SEP> Diameter <SEP> to <SEP> ovoid. Branched <SEP> Dia- <SEP>. <SEP> Diameter <SEP> to <SEP> ovoid.

   <SEP> Dia ox, <SEP> agar-agar <SEP> 0.8 to <SEP>> <SEP> 1.0 <SEP> mid <SEP> meter <SEP> 1.5 <SEP> - <SEP> 2.0 <SEP> 0.7 to <SEP>> <SEP> 1.0 <SEP> mid <SEP> meter <SEP> 1.5 <SEP> - <SEP> 2.0
<tb> cron <SEP> microns <SEP> cron <SEP> microns
<tb> Liquor <SEP> of <SEP> Mac- <SEP> Sinuous, <SEP> continuous, <SEP> Spheroidal <SEP> Sinuous, <SEP> continuous, <SEP> Spheroidal
<tb> <SEP> ration of <SEP> corn, <SEP> branched. <SEP> Diameter <SEP> to <SEP> ovoid. Branched <SEP> Dia- <SEP>. <SEP> Diameter <SEP> to <SEP> ovoid.

   <SEP> Dia agar-agar <SEP> 0.8 to <SEP>> <SEP> 1.0 <SEP> mid <SEP> meter <SEP> 1.5 <SEP> - <SEP> 2.0 <SEP > 0.8 to <SEP>> <SEP> 1.0 <SEP> mid <SEP> meter <SEP> 1.5 <SEP> - <SEP> 2.0
<tb> cron <SEP> microns <SEP> cron <SEP> microns The morphology of mycelium and spores for strain S-604 is apparently similar to that observed for strain A-377. Both strains show a continuous, sinuous, branched mycelium with occasional tendency of the aerial hyphae to spiral. The characteristic spores are ovoid to spheroidal.



  To illustrate the color variations among the different strains <I> of S. </I> aureofaciens which produce the demethyltetracyclines, four selected strains were grown on agar-agar with maize maceration liquor, and we made the following observations
EMI0004.0007
  
    <I> Observations <SEP> of <SEP> color <SEP> (*) <SEP>;

   <SEP> Streptomyces <SEP> aureofaciens </I>
<tb> Agar-agar <SEP> with <SEP> liquor <SEP> of <SEP> maceration <SEP> of <SEP> corn <SEP> (AP4)
<tb> Incubation <SEP> 4 <SEP> days <SEP> to <SEP> 27 <SEP> C
<tb> Strain <SEP> Isolated <SEP> colonies <SEP> Growth <SEP> in <SEP> mass
<tb> S-604M1 <SEP> <SEP> Deep <SEP> red <SEP> mahogany <SEP> <SEP> <SEP> Deep <SEP> red <SEP> mahogany <SEP>
<tb> S1071 <SEP> <SEP> Copper <SEP> brown <SEP> <SEP> <SEP> Deep <SEP> brown <SEP> mahogany <SEP> <SEP> to <SEP> <SEP> Red
<tb> mahogany <SEP>
<tb> V-62 <SEP> Large <SEP> zone <SEP> marginal <SEP> <SEP> peach <SEP> tan <B>,

  > </B>
<tb> becoming <SEP> <SEP> light <SEP> copper <SEP> brown <SEP> <SEP> to <SEP> <SEP> Light <SEP> copper <SEP> brown <SEP>
<tb> center <SEP> of <SEP> the <SEP> colony
<tb> B-740 <SEP> <SEP> Dark <SEP> Wine <SEP> <SEP> <SEP> Burgundy <SEP>
<tb> (*) <SEP> Colors <SEP> following <SEP> the work <SEP> already <SEP> cited. A relatively simple method of selecting a strain of <I> S. </I> aureofaciens capable of producing the new antibiotics is to choose a strain of S. aureofaciens which shows dark brown colonies when grown on a soil. medium of agar-agar and corn maceration liquor.

   Inocula are prepared with these colonies and fermentation is carried out as explained in Examples 1 and 2 below.



  The Rf numbers of some tetracyclines, fourth-mycines and demethyltetracyclines in two precise solvent systems indicated in the following table.

    
EMI0004.0016
  
    90/10
<tb> chloroform /
<tb> <SEP> ethyl acetate / <SEP> butanol,
<tb> Antibiotic <SEP> pH <SEP> 4.7, <SEP> buffer <SEP> HsPO4 <SEP> aqueous
<tb> citrate-phosphate <SEP> 0.3M + 0.1o / o
<tb> (Mac <SEP> Elvain) <SEP> acid <SEP> trichlor acetic,
<tb> pH <SEP> 1.9
<tb> Chlorotetracycline <SEP> 0.76-0.80 <SEP> 0.61
<tb> Bromotetracycline <SEP> 0.76-0.80 <SEP> 0.61
<tb> Tetracycline <SEP> 0.46-0.47 <SEP> 0.20
<tb> Quatrimycin <SEP> 0.14-0.16 <SEP> 0.12
<tb> Chloroquatrimycin <SEP> 0;

  27-0.28 <SEP> 0.33
<tb> Bromoquatrimycin <SEP> 0.27-0.28 <SEP> 0.33
<tb> Oxyquatrimycin <SEP> 0.00-0.06 <SEP> 0.11
<tb> Chlorodemethyltetracy cline <SEP> 0.68-0.72 <SEP> 0.39
<tb> Demethyltetracycline <SEP> 0.27 <SEP> 0.22
<tb> Epichlorodemethyltetra cyclin <SEP> 0.25-0.27 <SEP> 0.20
<tb> Epidemethyltetracycline <SEP> 0.09 <SEP> 0.10 Several strains of <I> S. </I> aureofaciens which produce the new antibiotics have been deposited with the American Type Culture Collection, in Washington, and are cataloged under Nos ATCC 12551, 12552, 12553 and 12554.

   It is understood that mutants which also produce the new antibiotics can be derived from these strains by current methods, and indeed it is to be expected that some of them will possess the property of producing higher yields. one or more of the new antibiotics, under favorable conditions.

   These mutants may vary somewhat in their general morphological characteristics, as can the various strains of the species S. aureofaciens. It is also expected that other strains of S. aureofaciens producing demethyltetracyclin could be found in nature and then be created from currently isolated strains of <I> S. </I> aureofaciens. that do not produce these new antibiotics.



  Chemical analyzes of highly purified samples of chlorodemethyltetracycline agree with the calculated empirical formula C., 1H #, tCl0g, the error being within the experimental range.



  The melting point of chlorodemethyltetracycline as the free base, measured on a hot platform, is 170-1750 C with decomposition. The melting point of chlorotetracycline is 168-169 C.

        Here are other comparisons between chlorotetracycline and chlorodemethyltetracycline. Chlorodemethyltetracycline has a <B> pH ,, </B> index of 4.45 in a 50/50 mixture of dimethylformamide and water. The optical rotation of chlorodemethyltetracycline in 0.03 N hydrochloric acid at a concentration of 0.5% is [] D = <B> 2610 </B>; for chlorotetracycline, we find - 2430.

   Demethyltetracyclines appear to be more soluble in water than the corresponding tetracyclines. For example, chlorodemethyltetracycline hydrochloride is soluble in water at a rate of about 45 mg / cm3, against about 14 mg / cm3 for chlorotetracycline. The antibacterial activity of tetracyclines and demethyltetracyclines is generally similar, but with marked differences as will be seen from the following table.



  This table compares the concentrations of chlorotetracycline and chlorodemethyltetracycline which are necessary to achieve half-maximum growth inhibition, expressed in micrograms of antibiotic per cm3 of solution, over time periods varying from 4 to 48 hours. with various microorganisms. Lower numbers indicate more effective growth inhibition.

    
EMI0005.0034
  
    Table <SEP> I
<tb> <I> Antibiotic </I>
<tb> Microorganism <SEP> Chlorotetracycline <SEP> Chlorodemethyltetracycline
<tb> Time <SEP> in <SEP> hours <SEP> Time <SEP> in <SEP> hours
<tb> 4 <SEP> 8 <SEP> 24 <SEP> 48 <SEP> 4 <SEP> 8 <SEP> 24 <SEP> 48
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> ATCC
<tb> 6538 <SEP> P <SEP> ... <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> ..................... <SEP> 0.041 <SEP> 0.072 <SEP> 0.57 <SEP> 4.1 <SEP> 0.065 <SEP > 0.094 <SEP> 0.41 <SEP> 0.68
<tb> Staphylococcus <SEP> albus <SEP> ........................ <SEP> 7.5 <SEP> 20.5 <SEP> > 50.0 <SEP>> 50.0 <SEP> 16.5 <SEP> 50.0 <SEP>> 50.0 <SEP>> 50.0
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> .............................. <SEP> 0.12 <SEP> 0.27 <SEP> 1.5 <SEP> 10.2 <SEP> 0.16 <SEP> 0.3 <SEP> 0.66 <SEP> <l, 56
<tb>> 0.8
<tb> Salmonella <SEP> gallinarum <SEP> ..

   <SEP> 0.4 <SEP> 0.74 <SEP> 4.65 <SEP> 37.0 <SEP> 0.4 <SEP> 0.56 <SEP> 1.06 <SEP> 1.1
<tb> Bacillus <SEP> cereus <SEP> <B> .................... </B> <SEP> _ <B> ..... ........ </B> <SEP> <0.025 <SEP> 0.035 <SEP> 0.15 <SEP> 1.1 <SEP> <0.015 <SEP> 0.039 <SEP> 0.077 <SEP> 0 , 19
<tb> Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> ...... <SEP> 0.31 <SEP> 0.56 <SEP> 6.3 <SEP> 35.0 <SEP> 0.94 <SEP> 1.3 <SEP> 4.3 <SEP> 6.7
<tb> Streptococcus <SEP> pyrogenes <SEP> beta <SEP> h- <SEP> - molytic <SEP> <B> ... <SEP> ................ ................ </B> <SEP> 11.5 <SEP> 43.0 <SEP>> 50.0 <SEP>> 50.0 <SEP> 14 , 4 <SEP> 41.0 <SEP>> 50.0 <SEP>> 50;

  0
<tb> Proteus <SEP> vulgaris <SEP> <B> ............. <SEP> ..... </B> ........... <SEP> 0.28 <SEP> 0.56 <SEP> 9.2 <SEP> 50.0 <SEP> 0.62 <SEP> 1.12 <SEP> 1.38 <SEP> 4.4
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> ATCC <SEP> 9637 <SEP> ...... <SEP> 0.54 <SEP> 1.18 <SEP> 6.6 <SEP> 34.0 < SEP> 0.43 <SEP> 0.67 <SEP> 0.97 <SEP> 1,

  8 Similar results are observed when comparing bromotetracycline to bromodemethyltetracycline. It was also found that demethyltetracyclines are considerably superior to oxytetracycline in the same type of test.



  The demethyltetracyclines were also compared with the tetracyclines in <I> in vivo tests, </I> and it was found that there is no appreciable difference in the antibacterial activity of the demethyltetracyclines compared with their analogues. tetracycline.



  The ultraviolet absorption spectra of tetra cyclines and demethyltetracyclines are very similar. Fig. 2 of the drawings shows the comparison between the ultraviolet absorption spectrum of chlorotetracycline and chlorodemethyltetracycline at the same concentration. As will be appreciated, the shape of the curves is essentially the same, but there is a slight friction in the absorption spectrum of chlorodemethyltetracycline around 260 mil limicrons.



  Another comparison of the ultraviolet absorption spectra of the tetracyclines is seen in Table II, which indicates the extinction coefficients <B> E1, ". </B> (spectrophotometric absorption of a solution at 1 % measured in a 1 cm cell) measured at the maxima and minima of the minima of the different antibiotics. The values were calculated from the UV absorption curves, correcting to 1% the concentrations at which were obtained. made the tests.

   All samples were measured in 0.1N H2SO4 solution.
EMI0005.0069
  
    Table <SEP> II
<tb> Max. <SEP> Min. <SEP> Max. <SEP> Min. <SEP> Max.
<tb> <I> Antibiotic </I> <SEP> É <SEP> ci <SEP> milli- <SEP> É <SEP> 11i0 <SEP> milli- <SEP> É <SEP> king <SEP> milli- <SEP> É <SEP> 0 / <SEP> milli- <SEP> É <SEP> c <B> / </B> <SEP> milli i <SEP> cm <SEP> micron <SEP> i <SEP> cm <SEP> micron <SEP> i <SEP> cm <SEP> micron <SEP> i <SEP> cm <SEP> micron <SEP> i <SEP> cm <SEP> micron
<tb> Chlorotetra cyline <SEP> hydrochloride <SEP> <SEP> ........ <SEP>. <SEP> _ <SEP> .......... <SEP> ........ <SEP>.

   <SEP> 209 <SEP> 368 <SEP> <B> 135 </B> <SEP> 302 <SEP> 356 <SEP> 265 <SEP> 288 <SEP> 242 <SEP> 343 <SEP> 228
<tb> Epichlorotetracycline <SEP> -NH4 <SEP> 170 <SEP> 368 <SEP> 100 <SEP> 302 <SEP> 332 <SEP> 254 <SEP> 290 <SEP> 242 <SEP> 342 <SEP> 228
<tb> <SEP> Chlorodeme Thyltetracycline Hydrochloride <SEP> <SEP> <B> .......... <SEP> - <SEP> .. </B> .. <SEP> 249 <SEP > 368 <SEP> 160 <SEP> 299 <SEP> 362 <SEP> 268 <SEP> 270 <SEP> 238 <SEP> 357 <SEP> 227
<tb> Epichlorode Methyltetracycline Hydrochloride <SEP> <SEP> <B> ............ </B> <SEP> 242 <SEP> 368 <SEP> 130 <SEP> 300 < SEP> 348 <SEP> 254 <SEP> 289 <SEP> 238 <SEP> 346 <SEP> 227 The infrared absorption spectra of several of the new products are shown in the other figures of the drawing.

   Fig. 3 is a representation of the infrared absorption spectrum of chlorodemethyltetracycline hydrochloride.



  These curves were obtained on a spectrophotometer. automatic infrared recorder Perkin-Ehner model 21, with solid phase antibiotics, compressed into a disc with KBr. Here is some other data: prism - NaCl; resolution - 2; response - 1 - 1; gain - 5; speed 1/2 min / micron; deletion - 2; and scale: 50.8 mm for one micron.



  As indicated above, bromodemethyltetracycline can be obtained as the main fermentation antibiotic by controlling the halogen content of the fermentation medium. Generally, the aqueous nutrient medium should contain at least 50 parts per million bromide ions and the chloride ion content should be kept as low as possible, less than about 50 parts per million chloride ions.

   The bromide ion can be provided by any water soluble bromide, for example potassium bromide, which releases bromide ions to serve in the biological synthesis of the antibiotic.



  Apart from controlling the halogen ion content of the fermentation, the process for preparing bromodemethyltetracycline is similar to that for preparing chlorodemethyltetraeycline, described above. Strains of <I> S. </I> aureofaciens that produce demethyltetracycline can also be used to produce the brominated analogue.



  Bromodemethyltetracycline has approximately the same antibacterial activity as chlorodemethyltetracycline, and it can be used for the same uses and in the same way.



  It is not necessary to separate bromodemethyltetracycline from other antibiotics which may concurrently form during fermentation, since a mixture of the various demethyltetracyclines is useful for many uses; for example, the fermented nutrient medium can be concentrated and used directly for its antibiotic content.

   Another way to use it is to acidify the fermented liquor, filter to remove mycelium and insolubles; neutralize and concentrate to obtain a dry powder which can be mixed with animal feed. Mixed antibiotics are useful in stimulating the growth of many animals.



  A crude form of bromodemethyltetracycline, and mixtures of this with other antibiotics, can be used to preserve meats, poultry and fish in the same way that tetracyclines are currently used. In these compositions, it is hardly necessary to pay attention to the proportions of the various tetracyclines which they may contain.



  If it is desired to separate the bromodemethyltetracycline from the other antibiotics contained in the fermented liquor, this can be done by several means which will be apparent to those skilled in the art. For example, the treatment with an acid destroys the tetra cyclin, and the treatment with an alkali destroys the chlorotetracycline in the fermented liquor.

   Bromodemethyltetracycline can be recovered from the resulting solutions by fraction chromatography using diatomaceous earth in the column. A mixture of chloroform and butanol at about pH 2.0 elutes antibiotics from diatomaceous earth.

   The bromodemethyltetracycline exits the column ahead of the demethyltetracycline and can be recovered from the eluent. Bromodemethyltetracycline can also be separated to obtain a single antibiotic component, using Craig's countercurrent distribution technique.



  The spines of the demethyltetracyclines obtained by the process according to the present invention are isomers of the demethyltetracyclines. The structural difference appears to be based on a rearrangement of the dimethylamine group on the carbon atom in the 4-position. Apparently, under certain conditions which will be described in more detail below, the inversion occurs and a mixture is obtained. balance of demethyltetracycline and its spinal cord. The two can be separated to obtain practically pure products.

   For each of the bodies, chlorodemethyltetracycline and bromodemethyltetracycline, there is a corresponding isomer which: we will call epichlorodemethyltetracycline and epibromodemethyltetracyclineDemethyltetracyclines can be converted into their isomeric forms by simply adjusting the pH of a concentrated solution of l 'antibiotic between 3.0 and 5,

  0 and allowing the solution to stand until the isomerization has reached equilibrium. The most important conditions that need to be set to convert the demethyltetracyclines to their isomers are concentration, pH, time and temperature.



  The most convenient is to carry out the isomerization at room temperature, but at higher temperatures a higher conversion rate is obtained. The pH should be between 3.0 and 5.0 approximately, preferably between 3.5 and 4.5. Some epimerization occurs at pHs outside this range, and even in distilled water; but the speed is very low.

   The concentration of the antibiotic in the aqueous solution should be as high as possible if faster epimerization rates are to be obtained. Complete equilibration may take about 24 hours at 250 ° C., but satisfactory equilibration can be obtained in a much shorter time under specified conditions. Usually, however, the best results are obtained by allowing the solution to stand for periods of a week or more.

   It seems that equilibrium is reached, in most cases, at about 50%; that is, at equilibrium about half of the demethyltetracycline is converted to the spinal cord.



       Since concentration is an important factor in obtaining high yields in short periods of time, a solvent system should be chosen which gives the highest concentration of demethyltetracycline. These soil systems must be buffered to obtain a pH within the preferential range.

   The various solvents include methanol, ethanol, butanol, acetone, 2-ethoxyethanol, 2-methoxypropanol, tetrahydrofuran, dimethylformamide, and mixtures of these solvents. Still other solvents can be used. A preferred buffer is monosodium phosphate, but other buffers and pairs of buffers can be used which maintain the pH in the desired range.



  The epimers of the demethyltetracyclines can be recovered from aqueous solutions, in the same general way as the tetracyclines are recovered. Although they have slightly less antibacterial activity, in vitro and in vivo, than demethyltetracyclines, they are still very useful in the treatment of diseases caused by bacteria, due to their appreciable antibacterial activity.



  As one would expect, the demethyltetracyclines form salts and complexes of the same type, and in the same general way, as the tetracyclines. Treatment with acids at a pH below about 4 results in the formation of acid salts. The free base can be obtained at a pH of about 4 to 6; and at pH greater than 6, salts with bases, for example the calcium salt, are obtained. Likewise, salts of the epimers are formed.



  As indicated above, the process of the present invention for the preparation of demethyltetracyclines differs in particular from the process for preparing chlorotetracycline, tetracycline and bromotetracycline, by the fact that a mutant strain is chosen. of <I> S. </I> aureofaciers which produces the desired demethyltetracycline instead of one of the tetracyclines.



  In order that the fermentation process according to the invention may be more fully understood, it will now be described with reference to the specific examples which follow Example 1 A suitable medium for the preparation of inocula intended for these fermentations can be prepared with the substances following
EMI0007.0035
  
    30 <SEP> g / 1
<tb> (NH4) 2S04 <SEP> <B> ----- </B> <SEP>. <B> --------------------- ----- </B> <SEP>. <B> --------------- </B> <SEP>. <B> ----- </ B > <SEP> 2 <SEP> g / 1
<tb> CaCO3 <SEP> <B> ...................... </B> <SEP>. <B> ------- ------------ <SEP> ----------- <SEP> ----- </B> <SEP> 7 <SEP> g / 1
<tb> Liqueur <SEP> of <SEP> maceration <SEP> of <SEP> corn <SEP> <B> ............ </B> <SEP> 16,

  5 <SEP> c13 / 1 The pH of the medium thus obtained is approximately 6.8. An 8 cm portion is measured and introduced into a 20 cm Brewer tube, and sterilized at 1200 C for 20 minutes. The sterilized medium is then inoculated with 0.5 cm3 of an aqueous suspension of spores of a strain of S.

       aureofaciens capable of producing chlorodemethyltetracycline, eg strain S-604, the suspension containing about 40-60 million spores per cm3. The inoculated medium is incubated for 24 hours at 280 ° C., on a reciprocating shaker operating at 110 cycles per minute.



  A suitable fermentation medium contains water and a typical medium which is suitable for producing chlorodemethyltetracycline is as follows
EMI0007.0050
  
    <SEP> corn starch <SEP> <B> .... </B> <SEP> _ <B> ..... </B> <SEP> __ <B> .... ......... </B> <SEP> __ <B> ......... </B> <SEP> 55 <SEP> g / 1
<tb> CaC03 ...........................-.................. ................... <SEP> 57 <SEP> g / 1
<tb> (NH4) sSd4 <SEP> <B> ............... <SEP> ............... <SEP>. ..................... <SEP> 5 <SEP> g / i </B>
<tb> FeS04. <SEP> 7H20 <SEP> <B> ....... <SEP> .............................. .......... </B> <SEP> 40 <SEP> mg / 1
<tb> MnS04.

   <SEP> 4H20 <SEP> <B> ...... </B> <SEP> ..... <B> .......... </B> <SEP>. < B> ..................... </B> <SEP>. <B> .... </B> <SEP> 50 <SEP> mg / 1
<tb> ZnS04 <SEP> 7H20 <SEP> <B> ............... <SEP> .............. <SEP>. ................ </B> <SEP> 100 <SEP> mg / 1
<tb> CoC12 <SEP> 6H20 <SEP> <B> ............... <SEP> ................ <SEP > <SEP> ....... <SEP> ..... </B> <SEP> 5 <SEP> mg / 1
<tb> Liqueur <SEP> of <SEP> maceration <SEP> of <SEP> corn <SEP> ............... <SEP> 30 <SEP> g / 1
<tb> Flour <SEP> of <SEP> seed <SEP> of <SEP> cotton <SEP> ........................ <SEP> 2 <SEP> g / 1
<tb> Lard <SEP> Oil <SEP> <SEP> ._ <B> .............................. ....... </B> <SEP> ..

   <SEP> 2.0%
<tb> in <SEP> volume When the chloride ion content of this medium is restricted, it tends to increase the quantity of demethyltetracycline at the expense of the production of chlorodemethyltetracycline. EXAMPLE 2 A fermentation is carried out in sewer flasks which results in the formation of a certain quantity of demethyltetracycline and of chlorodemethyltetracycline,

      with a medium prepared as follows
EMI0007.0062
  
    Liqueur <SEP> of <SEP> maceration <SEP> of <SEP> but <SEP> ............... <SEP> 30 <SEP> g / 1
<tb> Lard <SEP> oil <SEP> <SEP> ................................... ....... <SEP> 2 <SEP>%
<tb> in <SEP> volume
<tb> Starch <SEP> of <SEP> maize <SEP> ................................... ....... <SEP> 55 <SEP> g / 1
<tb> Flour <SEP> of <SEP> seed <SEP> of <SEP> cotton <SEP> ........................ <SEP> 2 <SEP> g / 1
<tb> CaC03 .............................................. .................... <SEP> 7 <SEP> g / 1
<tb> (ffl4) aS04 <SEP> <B> ................................... <SEP > ........... <SEP> ...... </B> <SEP> 5 <SEP> g / 1
<tb> NH4Cl <SEP> ......................:

  ........................................... <SEP> 1.5g / 1
<tb> FeS04.7H20 <SEP> ......................................... ....... <SEP> 40 <SEP> mg / 1
<tb> ZnS04. <SEP> 7H20 <SEP> <B> .... <SEP> ................... <SEP> ........... ............. </B> <SEP> 100 <SEP> mg / 1
<tb> MnS04 <SEP> '<SEP> 4H20 <SEP> <B> ........... <SEP> ................. < SEP> - <SEP> ..... <SEP> ........ </B> <SEP> 50 <SEP> mg / 1
<tb> CoC12 <SEP> - <SEP> 6H20 <SEP> ................................... .............

   <SEP> 5 <SEP> mg / 1 A 25 cm3 portion is measured which is introduced into a 250 cm3 Erlenmeyer flask, sterilized for 20 minutes at 120 ° C. and inoculated with 1 cm3 of the mycelial culture prepared as in example 1.

   After incubation for 120 hours at 26o C on a rotary shaker at 186 rpm, the liquor is titrated and found to contain no more than about 70 micrograms of chlorotetracycline per cm3, about 450 micrograms of demethyltetracycline per cm3 ,

      and about 900 micrograms of chlorodemethyltetracycline per em3. Example 3 An inoculation medium is prepared as described in Example 1 and inoculated with spores of a race of <I> Streptomyces </I> aureofaciens which produces demethyltetracycline. This inoculum is incubated for 24 hours at 280 ° C. in a reciprocating culture shaker.

   A fermentation medium is prepared containing
EMI0008.0002
  
    <SEP> corn flour <SEP> <B> ........... </B> <SEP>. <B> ............. .... </B> <SEP> - <B> ........... </B> <SEP> 14.5 <SEP> g / 1
<tb> Starch <SEP> of <SEP> corn <SEP> <B> ..... </B> <SEP>. <B> ............. </ B > <SEP> .._ .. <B> .................. </B> <SEP> 47.5 <SEP> g / 1
<tb> Liqueur <SEP> from <SEP> maceration <SEP> of <SEP> corn, <SEP> to
<tb> 50 <SEP>% <SEP> of <SEP> materials <SEP> solids <SEP> <B> ........ </B> <SEP> 22.5 <SEP> g / 1
<tb> CaCO3 <SEP> 9,0 <SEP> g / 1
<tb> (NH4) 2SO4 <SEP> <B> ........... </B> <SEP>. <B> ----- </B> <SEP> - <B > .... </B> <SEP> ..... <B> ---- </B> <SEP>. <B> --------------- ------ </B> <SEP> 5.85 <SEP> g / 1
<tb> 4 <SEP> 1.66 <SEP> g / 1
<tb> MnS04 <SEP> (70 <SEP>%) <SEP> -...- <B> ......... </B> <SEP>. <B> ..... ... </B> <SEP> .._.__. <B> ---------- </B> <SEP> ...

   <SEP> 56 <SEP> mg / 1
<tb> COCl2 <SEP> - <SEP> 5H20 <SEP> _. <B> ............ </B> <SEP>. <B> ....... .. </B> <SEP> __.... <B> ------- </B> <SEP> ._... <SEP> 5 <SEP> mg / 1
<tb> Bacon <SEP> <SEP> <SEP> <B> ...... </B> <SEP> -. <B> .............. ......................... </B> <SEP> 25 <SEP> m1 / 1 This medium is distributed at the rate of 30 ml each in 250 ml Erlenmeyer flasks. The sterilized vials are capped and inoculated with 1 ml of the ino-for 20 minutes at 1210 C.

   After cooling, the sterilized vials are inoculated with 1 ml of the inoculate, incubated for 24 hours, of the breed described above. The inoculated fermentation flasks are incubated in a rotary motion culture shaker, at a temperature not exceeding 280 ° C. The fermentation is allowed to continue for 140 hours.

   A sample of this fermented broth is then analyzed for its content of chlorotetracycline, using the method, described in this application, consisting in measuring the change in absorption in the ultraviolet before and after alkaline degradation. The calculated content of chlorotetracycline is less than 50.1 / m1,

      that is to say, the guaranteed sensitivity of this analytical method. By chromatography on fermented broth paper, only traces of chlorotetracycline were found. By the spectrophotometric analysis method described in this application, there is a content of demethylchlorotetracycline and demethyltetracycline corresponding to 2090.1 / ml. Chromatography on paper shows that these two demethyltetracyclines are found in approximately equal proportions.

      Example 4 An inoculation medium is prepared as in Example 1, and inoculated with spores of a race of S. aureofaciens producing demethyltetracycline. This inoculum is incubated as described in Example 1.

   A fermentation medium is prepared containing
EMI0008.0041
  
    Corn <SEP> <SEP> <SEP> <B> -------------------------------- </ B > <SEP> 67.0 <SEP> g / 1
<tb> Liqueur <SEP> from <SEP> maceration <SEP> of <SEP> corn, <SEP> to
<tb> <B> 50% </B> <SEP> of <SEP> <SEP> solids <SEP> <B> ..............

   <SEP> _. </B> <SEP> 25.0 <SEP> g / 1
<tb> CaC03 <SEP> sprayed <SEP>. <B> .................. </B> <SEP>. <B> ------ --------- </B> <SEP>. <B> ...... </B> <SEP> 9,0 <SEP> g / 1
<tb> 4) 2S04 <SEP> <B> .... </B> <SEP> __ <B> ............. </B> <SEP>. <B > .... </B> <SEP> - <B> ............. </B> <SEP> ....- <B> ...... . </B> <SEP> 6.75 <SEP> g / 1
<tb> 4 <SEP> 2,0 <SEP> g / 1
<tb> MnS04 <SEP> (70 <SEP>%) <SEP> <B> ................. </B> <SEP> .._... .. <B> ------ </B> <SEP>. <B> ...... </B> <SEP> _ <B> ..... </B> <SEP > 100 <SEP> mg / 1
<tb> CoC12 <SEP> - <SEP> 6H20 <SEP> .... <B> .... </B> <SEP> _...- <B> .... </B> < SEP> ___ <B> ............

   <SEP> ....... </B> <SEP> 5 <SEP> mg / 1
<tb> Bacon <SEP> <SEP> <SEP> <B> .... </B> <SEP>. <B> ........ </B> <SEP> _ oil. .... <B> ................ </B> <SEP> __ <B> ----- </B> <SEP> 30 <SEP> ml / 1 This medium is treated, inoculated and incubated as in Example (3). The broth collected is analyzed both by spectrophotometry and by chromatography on paper.

   Chlorotetracycline is not detected. Most of the product is demethylchlorotetracycline. There is a total content corresponding to 2540 y / ml of demethyltetracyclines, of which 2200 y / ml is formed of demethylchlorotetracycline. The paper chromatography confirms that only a small amount of demethyltetracycline has formed.

      Example 5 A fermentation is carried out as in Example (4), except that a different race of <I> S. </I> aureofaciens producing demethyltetracycline is used as the fermentation agent. The iron broth is analyzed as in example (4).

   Chromatography on paper does not allow the presence of chlorotetracycline to be detected. Spectrophotometric analysis gives a total content of demethyltetracyclines of 1430 y / ml, including 300 y / ml of demethylchlorotetracycline. By chromatography on pa pier, it is ensured that the rest of the totality of the antibiotic substances is formed by demethyltetracycline, the content of which, calculated by difference,

   is 1130 y / ml. Example 6 Fermentation is carried out under the conditions described in Example (3), except that a different race of <I> S. </I> aureofaciens producing demethyltetracycline is used as the fermentation agent and that the fermentation medium contains
EMI0008.0073
  
    <SEP> corn flour <SEP> <B> ------- </B> <SEP> - <B> ---- </B> <SEP> ... <B> --------------------- </B> <SEP> 16.9 <SEP> g / 1
<tb> Starch <SEP> of <SEP> corn <SEP> <B> ----- <SEP> ------------------------ --- <SEP> -------- </B> <SEP> 66.42 <SEP> g / 1
<tb> Liquor <SEP> of <SEP> maceration <SEP> of <SEP> corn,

   <SEP> to
<tb> 50 <SEP>% <SEP> of <SEP> materials <SEP> solids <SEP> <B> ------------------ </B> <SEP > 27.5 <SEP> g / 1
<tb> CaCOs <SEP> sprayed <SEP> <B> ---------------------------- <SEP> .... < / B> <SEP>. <SEP> ..... <SEP> 11.43 <SEP> g / 1
<tb> (NH4) 2S04 <SEP> <B> -------------------- </B> <SEP>. <B> ----- < / B> <SEP>.-..-. <B> ------ </B> <SEP> ... <B> -------- </B> <SEP> 9 , 0 <SEP> g / 1
<tb> NH4Cl <SEP> <B> ----- </B> <SEP>. <B> ------------------------ --------- </B> <SEP> -...- <B> ---------- </B> <SEP> 2,0 <SEP> g / 1
<tb> MnS04 <SEP> (70 <SEP>%) <SEP> <B> ---- </B> <SEP> .- <B> -------------- ------------ <SEP> ------- <SEP> 160 </B> <SEP> mg / 1
<tb> CoCl2 <SEP> - <SEP> 6H20 <SEP> <B> ---------------------------- <SEP> - ---------------- <SEP> - </B> <SEP> 5 <SEP> mg / 1
<tb> Bacon <SEP> oil <SEP> <SEP> <B> ------------------------------- < / B> <SEP> -.... <B> ----- </B> <SEP> 33,

  3 <SEP> m1 / 1 Fermentation is allowed to continue for 140 hours. As the paper chromatography indicates, the fermentation broth contains only demethyltetracycline. A biological test of the broth reveals a content of demethyltetracycline corresponding to 810 µ / ml, vis-à-vis Staphylococcus aureus.



  Example 7 The procedure is analogous to that of example (3). An inoculation medium is prepared containing:
EMI0008.0080
  
    Liqueur <SEP> of <SEP> maceration <SEP> of <SEP> corn, <SEP> to <SEP> 50 <SEP>% <SEP> of
<tb> materials <SEP> solids <SEP> <B> --------------- <SEP> ----------------- < / B> <SEP> - <B> ----------- </B> <SEP> 20 <SEP> g / 1
<tb> Dextrose <SEP> .. <SEP>. <SEP> .. <SEP> .... <SEP> ...... <SEP> .......... <SEP> .30 <SEP> g / 1
<tb> (NH4) 2S04 <SEP> <B> ------------------------- <SEP> ----- <SEP> - --------- <SEP> - <SEP> ---------------- </B> <SEP> 2 <SEP> g / 1
<tb> CaCO3 <SEP> ....___..._._...........__...._...._.......... ...................... <SEP> 7 <SEP> g / 1 This medium is sterilized and inoculated with spores of a race of S .

       demethyltetracycline-producing aureofaciens. It is subjected to incubation, as in example (3). After a growth period of 24 hours, this inocula is used to inoculate a fermentation medium containing The following examples illustrate the recovery, refining and separation of antibiotics.



  Example A Refining <I> of </I> chlorodemethyltetracycline <I> and </I> demethyltetracycline
EMI0009.0014
  
    CaCO3 <SEP> <B> ....... </B> <SEP>. <B> ...... </B> <SEP>. <B> ........ ................. <SEP> ...... <SEP> .......... </B> <SEP> - <SEP> 10.0 <SEP> g / 1
<tb> (NH3) 2S04 <SEP> .... <B> ............................ </B> < SEP>. <B> .................. </B> <SEP> 9.84 <SEP> g / 1
<tb> FeSO., <SEP> - <SEP> 7H20 <SEP> <B> ...... </B> <SEP>. <B> ............. ................. </B> <SEP>. <B> .......... </B> <SEP> 60.0 <SEP > mg / 1
<tb> ZnSO4 <SEP> - <SEP> 7H20 <SEP> <B> ------------------ </B> <SEP> - <B> ... ....... </B> <SEP>. <B> ---- <SEP> ------------ </B> <SEP> 100.0 <SEP> mg / 1
<tb> MnSO4 <SEP> '<SEP> HZO <SEP> <B> ------- </B> <SEP> ....._....._ .. <B> - ------------ </B> <SEP> ..

   <SEP> ........... <SEP> 50.0 <SEP> mg / 1
<tb> CoN03 <SEP> - <SEP> 6H20 <SEP> <B> ................................ ..... <SEP> ........... </B> <SEP> 5.0 <SEP> mg / 1
<tb> MgSO4. <SEP> 7H20 <SEP> .... <B> .................................... .. </B> <SEP>. <B> ..... </B> <SEP> 2,0 <SEP> g / 1
<tb> 1.48 <SEP> g / 1
<tb> H2P0.j <SEP> (85 <SEP>%) <SEP> <B> ............................ ....... <SEP> ------------ </B> <SEP> 400.0 <SEP> mg / 1
<tb> Starch <SEP> _ <B> ........... </B> <SEP> __ <B> ................. ......................... </B> <SEP> 55.0 <SEP> g / 1
<tb> l-methionine <SEP> <B> ----- </B> <SEP>. <B> .............. </B> <SEP> - <B> ................... <SEP> ........ </B> <SEP>. <SEP> 600.0 <SEP> mg / 1
<tb> l-histidine <SEP> <B> .................... </B> <SEP>. <B> .... </ B > <SEP>. <B> ........ </B> <SEP>. <B> .....

   <SEP> ........ </B> <SEP>. <B> ..... </B> <SEP> 800.0 <SEP> mg / 1
<tb> Lard <SEP> <SEP> <SEP> <B> oil ................................ ..... </B> <SEP>. <B> ------- </B> <SEP> _ <SEP> 20 <SEP> m1 / 1 This medium is distributed in vials and sterilized at 1201 ° C for 15 minutes. After inoculation, the flasks are incubated in a rotary motion culture shaker, at a temperature not exceeding 28o C. After a fermentation time of 51 hours, radioactive KBr82 (approximately 800 millicuries per gram) in sufficient quantity to obtain a concentration of 2 mi crocuries per ml of the medium.

   After a further fermentation period of 15 hours, a filtrate is separated from the acidified broth, adjusting the pH of the broth to 1.3 with oxalic acid and then filtering. This acidic filtrate is then analyzed by chromatography on paper, using an n-butanol system of pH 3.0.

   In this system, a halodemethyltetracycline moves forward, relative to demethyltetracycline. Examination of the radioactivity of the fermentation filtrate shows two peaks of radioactivity, one at the starting point, corresponding to the residual bromine, not used in the metabolism, the other immediately in front of the demethyltetracycline, this .

   which demonstrates that bromine82 has been incorporated by the microorganism, giving rise to the formation of demethylbromotetracycline. Example 8 <I> Fermentation in tank </I> A 40 liter fermentation is carried out in a pilot tank, essentially according to the method described in Example 2. After having prepared the medium, it is sterilized for 25 minutes at 125, 1 C and inoculated with an inoculum of strain S-604 prepared as described by Duggar, United States Patent No. 2482055.

   The fermentation is carried out with continuous stirring at a temperature of 280 ° C. for the first 24 hours, and 250 ° C. until completion, in 135 hours. Sterile air is introduced at a rate of 0.3 1/1 / min during the first sixteen hours, then at a rate of 0.5 1/1 / min until harvest. 25.8 liters of liquor are prepared as in Example 3, they are treated with 200 cm3 of concentrated hydrochloric acid to adjust the pH to 1.5.

   The treated liquor is filtered, after having mixed it with 2.8 kg of a filter aid, to obtain 16.3 liters of filtrate. The filter cake is taken up in 25 liters of water at a temperature of about 500 ° C. and the pH is adjusted to 1.5. After stirring for 30 minutes, the diluted cake is filtered and the filtrate is combined with the previous filtrate, to form a mass of 42.3 liters. The combined filtrate is treated with 6.76 kg of sodium chloride and extracted four times with butanol in an amount of 15% of the volume of the filtrate.

    The extracts are combined, clarified by filtration and concentrated in vacuo at 25-300 ° C. to a final volume of 6 liters. Example B <I> Chromatographic </I> separation </I> of </I> chlorodemethyltetracycline <I> and </I> demethyltetracycline The butanol concentrate of Example A is divided into two equal portions, concentrated one to 900 cm3 and the other is concentrated to 610 cm3 under vacuum. The concentrates are filtered and adjusted to pH 2 with 50% sodium hydroxide.

      To prepare the solvent system used for the chromatographic separation, a mixture of 80% butanol and 20% chloroform is equilibrated with water adjusted to pH 2 by means of hydrochloric acid. The columns are glass columns 15 cm in diameter packed with 2.8 kg of acid washed diatomaceous earth. The columns are equilibrated with the aqueous phase of the solvent system before use.



  The two concentrates are treated with butanol on separate columns. The concentrates are slowly poured into the top of the columns. The columns are then eluted with the solvent phase which is passed through at a rate of about 10 liters per hour. In each case, 40 slices of 500 cm3 are taken, and the antibiotic content of each is determined by chromatography on a strip of paper.

   In the 900cc portion, slices 6 through 17 contain chlorodemethyltetracycline and chlorotetracycline, and slices 24 through 40 contain demethyltetracycline and tetracycline. In the 610 cm3 portion, slices 7 to 18 contain chlorodemethyltetracycline and chlorotetracycline,

      and slices 19 to 31 contain demethyltetracycline and tetracycline. Example C <I> Recovery of </I> chlorodemethyltetracycline <I> from column fractions </I> The fractions containing chlorodemethyltetracycline and from Example B are combined to obtain a volume of about 12 liters. An equal amount of water is added, and the mixture is concentrated in vacuo to 1810 cm3 of aqueous solution.

   The pH of the concentrate is adjusted to 2.3-1.9 by adding hydrochloric acid. The acidified concentrate is washed twice with 180 cmu of chloroform, filtered and concentrated in vacuo to a volume of 360 cm3. The pH of the concentrate is adjusted to between 1.2 and 2.8 with 50% sodium hydroxide. The solution was dried by freezing to give 18.56 g of amorphous chlorodemethyltetracycline hydrochloride, titrating 550 micrograms per mg.

      Example D <I> Crystallization </I> <I> of chlorodemethyltetracycline hydrochloride </I> with an acetone-ether mixture </I> 18.56g of chlorodemethyltetracycline is taken, dried by freezing as in Example C , stirred in a mixture of 55 em3 of acetone, 7.4 cm3 of water and 3.7 cm3 of concentrated hydrochloric acid. The solution is filtered and the solids rinsed twice with a total of 55 cm3 of acetone containing 1.85 em3 of water.

   The filtrates are combined, the pH being 0.8, and treated with 55 cm8 of ether. The mixture is seeded, left to age for 18 hours at room temperature with constant stirring, and the crystals which form are removed by filtration. The product is washed with a mixture of acetone, water and ether, then with acetone and finally with ether, and dried in vacuo at 400 C. A yield of 4 is obtained. 74 g of crystalline chlorodemethyltetracycline hydrochloride assaying 1090 micrograms per mg, which represents an operating yield of 50.6%.

   The product contains 11% chlorotetracycline. Example E <I> Crystallization </I> <I> of chlorodemethyltetracycline hydrochloride </I> from a butanol-cellosolve mixture </I> A portion of 50.4 g of chlorodemethyltetracycline is taken dried by freezing, prepared as in Example C, and titrating 700 micrograms per mg, it is stirred in 22.5 cm3 of cellosolve,

       and to the resulting solution is added a total of 205 cm 3 of butanol. The pH is adjusted to 0.8 by adding 11 cm3 of concentrated hydrochloric acid and the mixture is allowed to age for 51 hours with stirring. The crystals obtained are removed by filtration, washed with a 90/10 mixture of butanol and cellosolve, then with chloroform and dried under vacuum.

   A yield of 30.6 g of chlorodemethyltetracycline hydrochloride is obtained, assaying 1053 micrograms per mg, ie a yield of 84%. Example F <I> Recrystallization of </I> chlorodemethyltetracycline <I> so as to destroy </I> chlorotetracycline One takes 1 g of the chlorodemethyltetracycline prepared in example D, it is stirred in 3 cm3 of mixture at 90 % butanol and 10% cellosolve,

       and 3 cm3 of triethylamine is added thereto to adjust the pH to 10.4. The incomplete solution is left to stand at room temperature for 24 hours to destroy any chlorotetracycline which may be present, and at the end of this time concentrated hydrochloric acid is added to lower the pH to 0.8, and allowed to age. mixing for 24 hours with stirring.

   The crystalline product is filtered off, washed with a mixture; 90% butanol and 10% cellosolve, then with chloroform and dried under vacuum at 40 C. A yield of 0.36 g of chlorodemethyltetracycline hydrochloride is obtained, assaying 1228 micrograms per mg and containing approximately 2 , 5% chlorotetracycline, which represents a yield of 40%.



  The following examples illustrate the conversion of antibiotics into various forms Example G <I> de </I> chlorodemethyltetracycline hydrobromide 1.0 g of chlorodemethyltetracycline-ammonium is dissolved in 20 cm3 of water and the solution is treated with 0.6 cm2 of 48% hydrobromic acid to adjust the pH to 1.6.

   The mixture is allowed to age for 18 hours with stirring, at room temperature, and at the end of this time the crystals in needle form the chlorodemethyltetra-cycline hydrobromide are found. The product is filtered, washed with 6 cm3 of water adjusted to pH 2.2 with hydrobromic acid, and dried under vacuum for 5 hours at 44.1 C. A yield of 750 mg of chlorodemethyltetracycline hydrobromide.



  Analysis calculated for C21H22N @ ClBr08 C: 46.2; H: 4.1; N: 5.1; <B> CI: </B> 6.5; Br: 14.6; O: 23.4.



  Effective Analysis C: 45.94; H: 4.44; <B> N: </B> 4.71; <B> CI: </B> 6.78; 6.47; Br: 13.74; O (difference): 24.39; 24.70. Example H <I> Preparation of the Ammonium Salt </I> <I> of </I> Chlorodemethyltetracycline A 100 mg portion of the prepared chlorodemethyltetracycline is taken;

   in Example D, it was dissolved in 0.5 cc of a mixture of 90% butanol and <B> 10% </B> cellosolve, and ammonia gas was bubbled through the solution until a thick solid appears. The slurry is diluted with a small amount of concentrated aqueous ammonia, allowed to stand at room temperature for 5 hours and filtered. The product is washed with a mixture of 90% butanol and 10% cellosolve, then with acetone, and dried in vacuo.

   A yield of 41.4 mg of chlorodemethyltetracycline ammonium salt is obtained, assaying 1148 micrograms per mg of chlorotetracycline hydrochloride (44% yield). Example I <I> Preparation of </I> chlorodemethyltetracycline <I> neutral </I> A 50 mg portion of the chlorodemethyltetracycline obtained in Example D is taken; titrating 1090 micrograms per mg, it is dissolved in 1.3 cm3 of water and the solution is treated with dry sodium carbonate to a pH of 7-8.

   The amorphous precipitate obtained is removed by centrifugation, and the clear settling liquid is adjusted to pH 5.4, and left to age 16 hours at room temperature. The product is filtered, washed with water and dried under vacuum at 35o C, to obtain 21.9 mg of crystalline neutral chlorodemethyltetracycline with 1250 grams per mg (yield <B> 50%). </ B >

Claims (1)

REVENDICATION Procédé de préparation de la déméthylchlortétra- cycline et/ou de la déméthylbromtétracycline, carac térisé en ce qu'on fait fermenter, dans des conditions d'aérobiose, un milieu nutritif aqueux contenant une source de carbone assimilable, de l'azote et des subs tances minérales, comprenant des ions chlorure et/ou bromure au moyen d'une souche de<I>Streptomyces</I> auréofaciens productrice de déméthyltétracycline. SOUS-REVENDICATIONS 1. CLAIM A process for the preparation of demethylchlortetracycline and / or demethylbromtetracycline, characterized in that an aqueous nutrient medium is fermented under aerobic conditions containing a source of assimilable carbon, nitrogen and mineral substances, comprising chloride and / or bromide ions by means of a strain of <I> Streptomyces </I> aureofaciens producing demethyltetracycline. SUB-CLAIMS 1. Procédé suivant la revendication, caractérisé en ce qu'on utilise un milieu contenant au moins 50 par ties en poids par million d'ions chlorure. 2. Procédé suivant la revendication, caractérisé en ce qu'on utilise un milieu contenant au moins 50 parties en poids par million d'ions bromure et moins de 50 parties par million d'ions chlorure. 3. Process according to claim, characterized in that a medium containing at least 50 parts by weight per million chloride ions is used. 2. Method according to claim, characterized in that a medium containing at least 50 parts by weight per million bromide ions and less than 50 parts per million chloride ions is used. 3. Procédé suivant la revendication, caractérisé en ce que ledit milieu contient des ions de métaux alcalino-terreux et que, après fermentation, on ajuste le pH du milieu à une valeur de 6 à 10 de manière à précipiter les sels alcalino-terreux des antibiotiques. 4. Procédé suivant la revendication, caractérisé en ce que les antibiotiques -sont isolés à partir du milieu de fermentation. 5. Process according to claim, characterized in that said medium contains ions of alkaline earth metals and that, after fermentation, the pH of the medium is adjusted to a value of 6 to 10 so as to precipitate the alkaline earth salts of the antibiotics. 4. Method according to claim, characterized in that the antibiotics -are isolated from the fermentation medium. 5. Procédé suivant la revendication pour la prépa ration d'un épinière de la chlordéméthyltétracycline et/ou de la bromdéméthyltétracycline, caractérisé en ce qu'on ajuste le pH d'une solution concentrée de la déméthyltétracycline correspondante à une valeur comprise entre 3,0 et 5,0 et qu'on laisse reposer la solution jusqu'à ce que l'isomérisation ait atteint un équilibre. Process according to claim for the preparation of a spinal cord of chlordemethyltetracycline and / or bromdemethyltetracycline, characterized in that the pH of a concentrated solution of the corresponding demethyltetracycline is adjusted to a value between 3.0 and 5 0 and the solution is allowed to stand until the isomerization has reached equilibrium.
CH4642757A 1956-05-28 1957-05-23 Antibiotic preparation process CH380879A (en)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NL99951D NL99951C (en) 1956-05-28
FR739115A FR1235916A (en) 1956-05-28 1957-05-22 Process for the preparation of antibiotics of the demethyltetracycline group
CH1262663A CH398885A (en) 1956-05-28 1957-05-23 Method of preparing an antibiotic

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US1235916XA 1956-05-28 1956-05-28
US587518A US2878289A (en) 1956-05-28 1956-05-28 6-demethyltetracyclines and methods for preparing the same

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CH380879A true CH380879A (en) 1964-08-14

Family

ID=34830036

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CH4642757A CH380879A (en) 1956-05-28 1957-05-23 Antibiotic preparation process

Country Status (1)

Country Link
CH (1) CH380879A (en)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE2517316C2 (en) Clavulanic acid and its salts and medicinal products containing these compounds
BE530983A (en)
CH304875A (en) Process for the preparation of a new antibiotic substance.
CH293562A (en) Process for preparing an antibiotic substance.
FR2528050A1 (en) FACTORS 1, 2, 3, 4 AND 5 PURE ISOLES OF TEICHOMYCIN A2 USEFUL AS ANTIBIOTIC DRUGS AND PROCESS FOR THEIR PREPARATION
BE487301A (en)
JPS5920354B2 (en) Antifungal and antiprotozoan antibiotics and their production methods
CH380879A (en) Antibiotic preparation process
DE2652677C2 (en) Antibiotics 890A &amp;darr; 1 &amp;darr; and 890A &amp;darr; 3 &amp;darr;, processes for their preparation, and antibacterial agents containing these antibiotics
FR2642762A1 (en) JANTHINOMYCINE
FR1465395A (en) New compound, decoyinine and its manufacturing process
CH398885A (en) Method of preparing an antibiotic
BE557870A (en)
DE2424707A1 (en) ANTIBIOTIC NO. 1998, ITS SALT WITH ACIDS, PROCESS FOR ITS MANUFACTURING, MICRO-ORGANISMS FOR CARRYING OUT THE PROCESS AND MEDICINAL PRODUCTS
US3555075A (en) Novel antifungal agents
JPH0367077B2 (en)
CH414949A (en) Process for the preparation of a compound of the tetracycline series
JPS5826959B2 (en) Manufacturing method of new antibiotic 31559RP
BE566455A (en)
JPS61170396A (en) Novel carcinostatic antibiotic substance 83-16-a and preparation thereof
CH359700A (en) Process for preparing 1,4-pregnadienes
BE522647A (en)
BE542827A (en)
JPS5932120B2 (en) Method for producing 9-β-D arabinofuranosyl adenine
JPH02119786A (en) Production of l-carnitine