Procédé de préparation d'antibiotiques La présente invention a pour objet un procédé pour la préparation de substances thérapeutiques nouvelles que l'on a identifiées comme étant des antibiotiques du groupe de la chlordéméthyltétracy- cline et de la bromdéméthyltétracycline et leurs épi- mères.
Ce procédé est caractérisé par le fait qu'on fait fermenter, dans des conditions d'aérobiose, un milieu nutritif aqueux contenant une source de carbone assi milable, de l'azote et des substances minérales, com prenant des ions chlorure et/ou bromure au moyen d'une souche de<I>Streptomyces</I> auréofaciens produc trice de déméthyltétracycline.
On peut également obtenir les épimères de la déméthyltétracycline, de la chlordéméthyltétracycline ou de la bromdéméthyltétracycline en ajoutant le pH d'une solution concentrée de la déméthyltétracycline correspondante à une valeur comprise entre 3,0 et 5,0 et en laissant reposer la solution jusqu'à ce que l'isomérisation ait atteint un équilibre.
Chacun des antibiotiques tétracycline antérieure ment connus qui sont produits par fermentation avec le S. auréofaciens dans des conditions particulières, à savoir la chlortétracycline et la bromtétracycline possède sa contrepartie dans la nouvelle série d7anti- biotiques.
Dans un milieu exempt de chlorures, l'antibiotique qui prédomine est l'analogue non chloruré de la tétra cycline. Dans un milieu riche en brome, il se forme l'antibiotique bromé ; et dans un milieu riche en chlore, l'antibiotique prédominant sera un antibiotique chloré analogue à la chlorotétracycline.
Les nouveaux antibiotiques peuvent être convertis en épimères comme décrit ci-après, de façon similaire à la conversion des tétracyclines en quatrimycines. Des analyses chimiques, et l'examen des proprié tés chimiques et physiques des nouveaux composés, indiquent qu'ils diffèrent essentiellement des tétracy clines correspondantes par le fait qu'ils contiennent un groupe méthyle en moins. Le groupe méthyle en question est très vraisemblablement celui qui occupe la position 6 sur le noyau naphtacène des tétracycli nes.
En conséquence, l'analogue de la chlortétracy- cline s'appellera 7-chlor-4-diméthylamino-1,4,4a,5, 5a,6,11,12a-octahydro-3,6,10,12,12a-pentahydroxy-1, 11-dioxo-2-naphtacène-carboxamide.
Les nouveaux antibiotiques sont produits par cer taines souches mutantes de S. auréo f aciens. Ces souches sont sans aucun doute de l'espèce<I>Streptomy-</I> <I>ces</I> auréofaciens, puisqu'elles dérivent de la souche primitive A-377 isolée par le Dr B.
M. Duggar, et déposée aux Northem Régional Research Laborato- ries à Peoria (Illinois, Etats-Unis), et indexées en ce Laboratoire sous le NI, NRRL 2209.
Les mutations comportant un traitement de la souche A-377 par des agents mutagènes, comprenant successivement l'irra diation ultraviolette, la nicotine et le chlorhydrate de 2,2-dichloro-N-méthyldiéthylamine, ont été utilisées pour créer l'une des souches. Diverses autres souches ont été obtenues par mutation spontanée et par trai tement à l'aide d'agents mutagènes.
Ces diverses souches qui produisent les nouveaux antibiotiques en différentes proportions et avec des rendements divers, présentent les caractéristiques générales de l'espèce <I>S.</I> auréofaciens. Elles diffèrent un peu entre elles et aussi des souches de S. auréofaciens antérieurement décrites, principalement par leur pigmentation et leur propriété de produire les nouveaux antibiotiques.
Dans la plupart des cas, on note un pigment brun rougeâtre lorsque les micro-organismes sont cultivés sur des milieux de culture ordinaires. Les nuances du pigment varient de la nuance pêche ou du brun cuivré jusqu'à un acajou foncé, suivant la souche particulière et le milieu nutritif utilisé. Bien que la propriété de produire les nouveaux antibiotiques soit généralement associée à des souches qui présentent ce type de pigmentation, cette formation de pigment et la production des nouveaux antibiotiques ne sont pas nécessairement des propriétés solidaires.
Toutes les souches étudiées produisent de la chlorotétra- cycline, et généralement de la tétracycline, bien que les proportions relatives de ces antibiotiques varient considérablement suivant la nature du milieu de fermentation, les conditions de fermentation et la souche particulière choisie. Dans certains cas, la pro duction de chlorotétracycline et de tétracycline est très faible, de l'ordre de quelques % sur le total de l'antibiotique produit par la fermentation.
Les souches mutantes qui produisent les nou veaux antibiotiques possèdent les mêmes caractéristi ques générales que les souches qui produisent les tétracyclines, et elles diffèrent entre elles de la même façon générale que les souches productrices de tétra cycline diffèrent l'une de l'autre, ainsi qu'on l'a expli qué dans plusieurs articles scientifiques qui ont été publiés. Bien que de nombreuses souches de S.
auréo- faciens soient à la disposition du public dans les col lections de cultures et aient été décrites dans la litté rature scientifique, les données suivantes serviront à illustrer le type de variation des nouvelles souches, par rapport à la souche primitive A-377 qui se trouve sous la désignation NRRL 2209.
<I>Comparaison des souches de S.</I> auréofaciens <I>S-604 et A-377 sur divers milieux</I> Le<I>Streptomyces</I> auréofaciens souche S-604 qui produit la chlorodéméthyltétracycline et la déméthyltétra- cycline a été comparé au<I>Streptomyces</I> auréofaciens souche A-377 (NRRL 2209) par observation des carac téristiques de croissance sur divers milieux incubé à 26-27o C.
Les observations faites sont les suivantes
EMI0002.0028
<I>1. <SEP> Glycérol, <SEP> asparagine, <SEP> extrait <SEP> de <SEP> bceuf, <SEP> agar-agar</I>
<tb> Glycérol <SEP> ..........................................._............._....... <SEP> 1,0 <SEP> %
<tb> Asparagine-L <SEP> <B>.............</B> <SEP> .<B>...........</B> <SEP> .<B>............................</B> <SEP> 0,05%
<tb> Extrait <SEP> de <SEP> boeuf <SEP> <B>.....</B> <SEP> _<B>....</B> <SEP> __<B>..........</B> <SEP> .<B>...................</B> <SEP> ...._ <SEP> 0,2 <SEP> %
<tb> #2P04 <SEP> ............................................................_..... <SEP> 0,05%
<tb> Agar-agar <SEP> Bacto <SEP> <B>.........</B> <SEP> .<B>................</B> <SEP> __<B>.........</B> <SEP> .<B>........</B> <SEP> 1,5 <SEP> %
<tb> Eau <SEP> distillée, <SEP> q.s. <SEP> pour <SEP> ..........' <SEP> . <SEP> _..
<SEP> <B>__ <SEP> ........</B> <SEP> 100 <SEP> %
<tb> Ajustement <SEP> du <SEP> pH <SEP> par <SEP> KOH <SEP> à <SEP> 50% <SEP> : <SEP> <B>......</B> <SEP> 7,0
<tb> pH <SEP> après <SEP> stérilisation <SEP> <B>.....................................</B> <SEP> 7,1
<tb> <I>Streptomyces <SEP> auréofaciens</I>
<tb> Souche <SEP> S-604 <SEP> Souche <SEP> A-377
<tb> Croissance <SEP> Abondante, <SEP> couleur <SEP> <SEP> Venetian <SEP> red <SEP> <SEP> ( <SEP> ) <SEP> Assez <SEP> abondante
<tb> Hyphes <SEP> aériens <SEP> Abondants, <SEP> blanc <SEP> à <SEP> <SEP> Rose <SEP> grey <SEP> <SEP> (*) <SEP> Blancs, <SEP> uniformes
<tb> Sporulation <SEP> Légère, <SEP> devenant <SEP> abondante <SEP> Aucune
<tb> Pigment <SEP> diffusible <SEP> Brun <SEP> rougeâtre <SEP> Jaune
<tb> Envers <SEP> <SEP> Brown <SEP> Mahogany <SEP> <SEP> (*) <SEP> Jaune <SEP> à <SEP> jaune,
<SEP> orange <SEP> clair
<tb> (*) <SEP> Désignation <SEP> des <SEP> nuances <SEP> d'après <SEP> le <SEP> <SEP> Color <SEP> Harmony <SEP> Manual <SEP> <SEP> 3e <SEP> édition, <SEP> édité <SEP> par <SEP> Container <SEP> Corporation
<tb> of <SEP> America.
<tb> <I>2. <SEP> Dextrine, <SEP> Czapek-Dox, <SEP> agar-agar</I>
<tb> Dextrine <SEP> .<B>.......</B> <SEP> __<B>..............</B> <SEP> .<B>.........</B> <SEP> .<B>.................</B> <SEP> .<B>.........</B> <SEP> 1,0 <SEP> ô
<tb> NaN03 <SEP> ...._......._..._......................................__......... <SEP> 0,2 <SEP> <B>%</B>
<tb> K2HP04._........___..._...._..............._........................
<SEP> 0,1 <SEP> %
<tb> MgS04 <SEP> - <SEP> 7H20 <SEP> <B>...........</B> <SEP> .<B>...........</B> <SEP> .<B>...........................</B> <SEP> <I>0,05 <SEP> %</I>
<tb> KCl <SEP> ......_...__....................................._................... <SEP> 0,05
<tb> FeS04 <SEP> # <SEP> 7H20 <SEP> <B>..........</B> <SEP> .<B>..............................</B> <SEP> .<B>............ <SEP> 0,001%</B>
<tb> Agar-agar <SEP> Bacto <SEP> <B>........</B> <SEP> _<B>...............</B> <SEP> .<B>.......</B> <SEP> .<B>..............</B> <SEP> 1,5 <SEP> %
<tb> Eau <SEP> distillée, <SEP> q.s.
<SEP> pour <SEP> .<B>..................</B> <SEP> -<B>.........</B> <SEP> -<B>....</B> <SEP> 100,0 <SEP> %
<tb> pH <SEP> après <SEP> stérilisation <SEP> <B>-----</B> <SEP> .<B>--------------</B> <SEP> _<B>.........</B> <SEP> .<B>....</B> <SEP> 7,0
<tb> <I>Streptomyces <SEP> auréofaciens</I>
<tb> Souche <SEP> S-604 <SEP> Souche <SEP> A-377
<tb> Croissance <SEP> Rare, <SEP> hyaline <SEP> Profuse
<tb> Hyphes <SEP> aériens <SEP> Absents <SEP> Abondants, <SEP> <SEP> lead <SEP> grey <SEP> <SEP> (*)
<tb> Globules <SEP> superficiels <SEP> incolores
<tb> Sporulation <SEP> Aucune <SEP> Abondante
<tb> Pigment <SEP> diffusible <SEP> Aucun <SEP> Léger: <SEP> jaune <SEP> pâle
<tb> Envers <SEP> Non <SEP> pigmenté <SEP> Non <SEP> pigmenté
<tb> (*) <SEP> Voir <SEP> note <SEP> précédente.
EMI0003.0001
<I>3. <SEP> Liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> mais, <SEP> agar-agar</I>
<tb> Liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> maïs <SEP> .................. <SEP> 0,4 <SEP> %
<tb> Sucrose <SEP> ....._............................................................ <SEP> 1,0 <SEP> %
<tb> MgS04 <SEP> - <SEP> 7H20 <SEP> <B>....................</B> <SEP> --<B>.........</B> <SEP> .<B>.........</B> <SEP> .<B>......</B> <SEP> 0,025%
<tb> KH2P04....................................-........................... <SEP> 0,2 <SEP> %
<tb> (NH4)2HP04......................................................... <SEP> 0,2 <SEP> %
<tb> Agar-agar <SEP> Bacto <SEP> <B>............. <SEP> ..................................</B> <SEP> 2,0 <SEP> %
<tb> Eau <SEP> du <SEP> robinet, <SEP> q.s. <SEP> pour <SEP> <B>.....................
<SEP> ........</B> <SEP> 100,0
<tb> pH <SEP> après <SEP> stérilisation <SEP> .................................... <SEP> 6,3 <SEP> %
<tb> <I>Streptomyces <SEP> auréofaciens</I>
<tb> Souche <SEP> S-604 <SEP> Souche <SEP> A-377
<tb> Croissance <SEP> Profuse <SEP> Profuse
<tb> Hyphes <SEP> aériens <SEP> Abondants <SEP> <SEP> rose <SEP> taupe <SEP> <SEP> (*) <SEP> foncé <SEP> Abondants, <SEP> <SEP> Beaver <SEP>
<tb> Sporulation <SEP> Très <SEP> abondante, <SEP> uniforme <SEP> Très <SEP> abondante, <SEP> uniforme
<tb> Pigment <SEP> diffusible <SEP> Très <SEP> concentré, <SEP> <SEP> deep <SEP> brown <SEP> <SEP> à <SEP> jaune <SEP> verdâtre <SEP> clair
<tb> <SEP> deep <SEP> brown <SEP> Mahogany <SEP>
<tb> Envers <SEP> <SEP> Brown <SEP> Mahogany <SEP> <SEP> foncé <SEP> (*) <SEP> <SEP> Covert <SEP> Brown <SEP> <SEP> (C*)
<tb> (*)
<SEP> Voir <SEP> notes <SEP> précédentes.
<tb> <I>4. <SEP> Autres <SEP> milieux</I>
<tb> <I>Streptomyces <SEP> auréofaciens</I>
<tb> Souche <SEP> S-604 <SEP> Souche <SEP> A-377
<tb> Agar-agar <SEP> nutritif <SEP> Croissance <SEP> médiocre, <SEP> <SEP> Taupe <SEP> Croissance <SEP> assez <SEP> abondante. <SEP> Pas
<tb> brown <SEP> <SEP> à <SEP> <SEP> dark <SEP> brown <SEP> <SEP> (*). <SEP> d'hyphes <SEP> aériens. <SEP> Envers <SEP> :
<SEP> jaune
<tb> Pas <SEP> d'hyphes <SEP> aériens. <SEP> Envers <SEP> pâle. <SEP> Pigment <SEP> soluble <SEP> jaune <SEP> à
<tb> <SEP> Taupe <SEP> brown <SEP> <SEP> (*). <SEP> Pigment <SEP> jaune <SEP> brunâtre <SEP> clair
<tb> soluble <SEP> brun <SEP> rougeâtre
<tb> Glucose, <SEP> asparagine, <SEP> extrait <SEP> de <SEP> Croissance <SEP> abondante. <SEP> Gros <SEP> hy- <SEP> Croissance <SEP> assez <SEP> abondante. <SEP> Hy viande, <SEP> agar-agar <SEP> phes <SEP> aériens <SEP> bigarrés <SEP> :
<SEP> <SEP> rose <SEP> phes <SEP> aériens <SEP> blancs <SEP> devenant <SEP> de
<tb> taupe <SEP> <SEP> à <SEP> <SEP> fawn <SEP> <SEP> ou <SEP> <SEP> carcel <SEP> <SEP> plus <SEP> en <SEP> plus <SEP> gris <SEP> quand <SEP> la <SEP> for (*). <SEP> Sporulation <SEP> abondante. <SEP> En- <SEP> mation <SEP> de <SEP> spores <SEP> augmente. <SEP> En vers<B>:</B> <SEP> <SEP> Taupe <SEP> brown <SEP> <SEP> (*). <SEP> Pig- <SEP> vers <SEP> : <SEP> jaune <SEP> clair. <SEP> Pigment <SEP> solu ment <SEP> soluble <SEP> brun <SEP> rougeâtre <SEP> ble <SEP> jaune <SEP> clair
<tb> Pomme <SEP> de <SEP> terre <SEP> Croissance <SEP> profuse <SEP> humide, <SEP> lisse, <SEP> Croissance <SEP> profuse <SEP> lisse, <SEP> humide,
<tb> nodulée <SEP> : <SEP> <SEP> Dark <SEP> brown <SEP> Maho- <SEP> nodulée <SEP> :
<SEP> <SEP> Light <SEP> Mellon <SEP> yel gany <SEP> <SEP> (*) <SEP> avec <SEP> trace <SEP> de <SEP> <SEP> peach <SEP> low <SEP> <SEP> <B>(</B>*) <SEP> à <SEP> <SEP> Antique <SEP> rose <SEP> <SEP> (*).
<tb> tan <SEP> <SEP> (*). <SEP> Hyphes <SEP> aériens <SEP> : <SEP> ab- <SEP> Hyphes <SEP> aériens <SEP> :
<SEP> trace. <SEP> -Pas <SEP> de
<tb> sents <SEP> à <SEP> abondants, <SEP> devenant <SEP> pigment <SEP> soluble
<tb> blancs <SEP> à <SEP> <SEP> carcel <SEP> <SEP> (*). <SEP> Sporula tion <SEP> abondante <SEP> dans <SEP> les <SEP> zones
<tb> de <SEP> forte <SEP> formation <SEP> d'hyphes <SEP> aé riens. <SEP> Pigment <SEP> soluble <SEP> <SEP> choco late <SEP> <SEP> (*) <SEP> à <SEP> <SEP> chocolate <SEP> brown <SEP>
<tb> Lait <SEP> pourpre <SEP> Léger <SEP> collier <SEP> de <SEP> croissance <SEP> Léger <SEP> collier <SEP> de <SEP> croissance <SEP> blanc
<tb> <SEP> Deep <SEP> red <SEP> Mahogany <SEP> <SEP> (*). <SEP> Peu <SEP> à <SEP> jaune <SEP> pâle.
<SEP> Peu <SEP> de <SEP> variation
<tb> de <SEP> variation <SEP> notable <SEP> du <SEP> pH, <SEP> peu <SEP> notable <SEP> du <SEP> pH, <SEP> peu <SEP> de <SEP> peptoni de <SEP> peptonisation <SEP> apparente. <SEP> Lé- <SEP> sation <SEP> apparente <SEP> en <SEP> 15 <SEP> jours
<tb> gère <SEP> réaction <SEP> colorée <SEP> faussement
<tb> alcaline <SEP> due <SEP> à <SEP> la <SEP> diffusion <SEP> du
<tb> pigment <SEP> soluble
<tb> (*) <SEP> Voir <SEP> notes <SEP> précédentes.
Sur tous les agar-agars, excepté destrine Czapek-Dox, mais y compris la culture inclinée sur pomme de terre, le S. auréofaciens souche S-604 produit une pigmentation foncée caractéristique, apparaissant généra lement avec la croissance. De même, il est facile d'observer le pigment caractéristique soluble brun rougeâtre.
EMI0004.0001
<I>5. <SEP> Observations <SEP> microscopiques</I>
<tb> <I>Streptomyces <SEP> auréofaciens</I>
<tb> Souche <SEP> S-604 <SEP> Souche <SEP> A-377
<tb> Milieu <SEP> Mycélium <SEP> Spores <SEP> Mycélium <SEP> Spores
<tb> Glycérol, <SEP> aspa.ca- <SEP> Sinueux, <SEP> continu, <SEP> Sphéroïdaux <SEP> Sinueux, <SEP> continu, <SEP> Sphéroïdaux
<tb> gine, <SEP> extrait <SEP> de <SEP> ramifié. <SEP> Diamètre <SEP> à <SEP> ovoïdaux. <SEP> Dia- <SEP> ramifié. <SEP> Diamètre <SEP> à <SEP> ovoïdaux.
<SEP> Dia boeuf, <SEP> agar-agar <SEP> 0,8à <SEP> > <SEP> 1,0 <SEP> mi- <SEP> mètre <SEP> 1,5 <SEP> - <SEP> 2,0 <SEP> 0,7à <SEP> > <SEP> 1,0 <SEP> mi- <SEP> mètre <SEP> 1,5 <SEP> - <SEP> 2,0
<tb> cron <SEP> microns <SEP> cron <SEP> microns
<tb> Liqueur <SEP> de <SEP> macé- <SEP> Sinueux, <SEP> continu, <SEP> Sphéroïdaux <SEP> Sinueux, <SEP> continu, <SEP> Sphéroïdaux
<tb> ration <SEP> de <SEP> maïs, <SEP> ramifié. <SEP> Diamètre <SEP> à <SEP> ovoïdaux. <SEP> Dia- <SEP> ramifié. <SEP> Diamètre <SEP> à <SEP> ovoïdaux.
<SEP> Dia agar-agar <SEP> 0,8à <SEP> > <SEP> 1,0 <SEP> mi- <SEP> mètre <SEP> 1,5 <SEP> - <SEP> 2,0 <SEP> 0,8à <SEP> > <SEP> 1,0 <SEP> mi- <SEP> mètre <SEP> 1,5 <SEP> - <SEP> 2,0
<tb> cron <SEP> microns <SEP> cron <SEP> microns La morphologie du mycélium et des spores pour la souche S-604 est apparemment similaire à celle obser vée pour la souche A-377. Les deux souches montrent un mycélium continu, sinueux, ramifié, avec tendance occasionnelle des hyphes aériens à la spiralisation. Les spores caractéristiques sont ovoïdaux à sphéroïdaux.
Pour illustrer les variations de couleur parmi les différentes souches<I>de S.</I> auréofaciens qui produisent les déméthyltétracyclines, on a cultivé quatre souches sélectionnées sur de l'agar-agar avec liqueur de macération de maïs, et on a fait les observations suivantes
EMI0004.0007
<I>Observations <SEP> de <SEP> couleur <SEP> (*) <SEP> ;
<SEP> Streptomyces <SEP> auréofaciens</I>
<tb> Agar-agar <SEP> avec <SEP> liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> maïs <SEP> (AP4)
<tb> Incubation <SEP> 4 <SEP> jours <SEP> à <SEP> 27 <SEP> C
<tb> Souche <SEP> Colonies <SEP> isolées <SEP> Croissance <SEP> en <SEP> masse
<tb> S-604M1 <SEP> <SEP> Deep <SEP> red <SEP> mahogany <SEP> <SEP> <SEP> Deep <SEP> red <SEP> mahogany <SEP>
<tb> S1071 <SEP> <SEP> Copper <SEP> brown <SEP> <SEP> <SEP> Deep <SEP> brown <SEP> mahogany <SEP> <SEP> à <SEP> <SEP> Red
<tb> mahogany <SEP>
<tb> V-62 <SEP> Large <SEP> zone <SEP> marginale <SEP> <SEP> peach <SEP> tan<B>,
></B>
<tb> devenant <SEP> <SEP> light <SEP> copper <SEP> brown <SEP> <SEP> au <SEP> <SEP> Light <SEP> copper <SEP> brown <SEP>
<tb> centre <SEP> de <SEP> la <SEP> colonie
<tb> B-740 <SEP> <SEP> Dark <SEP> Wine <SEP> <SEP> <SEP> Burgundy <SEP>
<tb> (*) <SEP> Couleurs <SEP> suivant <SEP> l'ouvrage <SEP> déjà <SEP> cité. Une méthode relativement simple pour sélection ner une souche de<I>S.</I> auréofaciens capable de pro duire les nouveaux antibiotiques, consiste à choisir une souche de S. auréofaciens qui présente des colo nies marron foncé quand on la cultive sur un milieu d'agar-agar et de liqueur de macération de maïs.
On prépare des inocula avec ces colonies et on conduit une fermentation comme expliqué dans les exemples 1 et 2 ci-après.
Les indices Rf de quelques tétracyclines, quatri- mycines et déméthyltétracyclines dans deux systèmes solvants précis indiqués dans le tableau suivant.
EMI0004.0016
90/10
<tb> chloroforme/
<tb> Acétate <SEP> d'éthyle/ <SEP> butanol,
<tb> Antibiotique <SEP> pH <SEP> 4,7, <SEP> tampon <SEP> HsPO4 <SEP> aqueux
<tb> citrate-phosphate <SEP> 0,3M+0,1o/o
<tb> (Mac <SEP> Elvain) <SEP> acide <SEP> trichlor acétique,
<tb> pH <SEP> 1,9
<tb> Chlorotétracycline <SEP> 0,76-0,80 <SEP> 0,61
<tb> Bromotétracycline <SEP> 0,76-0,80 <SEP> 0,61
<tb> Tétracycline <SEP> 0,46-0,47 <SEP> 0,20
<tb> Quatrimycine <SEP> 0,14-0,16 <SEP> 0,12
<tb> Chloroquatrimycine <SEP> 0;
27-0,28 <SEP> 0,33
<tb> Bromoquatrimycine <SEP> 0,27-0,28 <SEP> 0,33
<tb> Oxyquatrimycine <SEP> 0,00-0,06 <SEP> 0,11
<tb> Chlorodéméthyltétracy cline <SEP> 0,68-0,72 <SEP> 0,39
<tb> Déméthyltétracycline <SEP> 0,27 <SEP> 0,22
<tb> Epichlorodéméthyltétra cycline <SEP> 0,25-0,27 <SEP> 0,20
<tb> Epidéméthyltétracycline <SEP> 0,09 <SEP> 0,10 Plusieurs souches de<I>S.</I> auréofaciens qui produi sent les nouveaux antibiotiques ont été déposées à l'American Type Culture Collection, à Washington, et sont cataloguées sous les Nos ATCC 12551, 12552, 12553 et 12554.
Il est entendu que des mu tantes produisant aussi les nouveaux antibiotiques peuvent être tirées de ces souches par des méthodes courantes, et en fait, il faut s'attendre à ce que cer taines d'entre elles possèdent la propriété de produire des rendements plus élevés d'un ou plusieurs des nouveaux antibiotiques, dans des conditions favora bles.
Ces mutantes peuvent varier quelque peu quant à leurs caractéristiques morphologiques générales, de même que les diverses souches de l'espèce S. auréo- faciens. On s'attend aussi à ce que d'autres souches de S. auréofaciens productrices de déméthyltétra- cycline puissent être trouvées dans la nature et puis sent être créées à partir des souches actuellement iso lées de<I>S.</I> auréofaciens qui ne produisent pas ces nouveaux antibiotiques.
Les analyses chimiques d'échantillons très purifiés de chlorodéméthyltétracycline concordent avec la for mule empirique calculée C.,1H#,tCl0g, l'erreur se si tuant dans la marge expérimentale.
Le point de fusion de la chlorodéméthyltétracy- cline sous forme de base libre, mesuré sur une plate- forme chaude, est de 170-1750 C avec décomposition. Le point de fusion de la chlorotétracycline est de 168-169 C.
Voici d'autres comparaisons entre la chlorotétra- cycline et la chlorodéméthyltétracycline. La chloro- déméthyltétracycline présente un indice<B>pH,,</B> de 4,45 dans un mélange de diméthylformamide et d'eau à 50/50. La rotation optique de la chlorodéméthylté- tracycline dans l'acide chlorhydrique 0,03 N à une concentration de 0,5 % est [ ]D =<B>2610</B> ; pour la chlorotétracycline, on trouve - 2430.
Les déméthyl- tétracyclines semblent être plus solubles dans l'eau que les tétracyclines correspondantes. Par exemple, le chlorhydrate de chlorodéméthyltétracycline est so luble dans l'eau à raison d'environ 45 mg/cm3, contre environ 14 mg/cm3 pour la chlorotétracycline. L'activité antibactérienne des tétracyclines et des déméthyltétracyclines est généralement similaire, mais avec des différences nettes comme on le verra par le tableau suivant.
Ce tableau compare les concentrations de chloro- tétracycline et de chlorodéméthyltétracycline qui sont nécessaires pour réaliser une inhibition demi-maxi- mum de la croissance, exprimées en microgrammes d'antibiotique par cm3 de solution, en des laps de temps variant de 4 à 48 heures avec divers micro organismes. Les chiffres faibles indiquent une inhibi tion plus efficace de la croissance.
EMI0005.0034
Tableau <SEP> I
<tb> <I>Antibiotique</I>
<tb> Micro-organisme <SEP> Chlorotétracycline <SEP> Chlorodéméthyltétracycline
<tb> Temps <SEP> en <SEP> heures <SEP> Temps <SEP> en <SEP> heures
<tb> 4 <SEP> 8 <SEP> 24 <SEP> 48 <SEP> 4 <SEP> 8 <SEP> 24 <SEP> 48
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> ATCC
<tb> 6538 <SEP> P <SEP> ... <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> ..................... <SEP> 0,041 <SEP> 0,072 <SEP> 0,57 <SEP> 4,1 <SEP> 0,065 <SEP> 0,094 <SEP> 0,41 <SEP> 0,68
<tb> Staphylococcus <SEP> albus <SEP> ........................ <SEP> 7,5 <SEP> 20,5 <SEP> >50,0 <SEP> >50,0 <SEP> 16,5 <SEP> 50,0 <SEP> >50,0 <SEP> >50,0
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> .............................. <SEP> 0,12 <SEP> 0,27 <SEP> 1,5 <SEP> 10,2 <SEP> 0,16 <SEP> 0,3 <SEP> 0,66 <SEP> < l,56
<tb> >0,8
<tb> Salmonella <SEP> gallinarum <SEP> ..
<SEP> 0,4 <SEP> 0,74 <SEP> 4,65 <SEP> 37,0 <SEP> 0,4 <SEP> 0,56 <SEP> 1,06 <SEP> 1,1
<tb> Bacillus <SEP> cereus <SEP> <B>....................</B> <SEP> _<B>.............</B> <SEP> < 0,025 <SEP> 0,035 <SEP> 0,15 <SEP> 1,1 <SEP> < 0,015 <SEP> 0,039 <SEP> 0,077 <SEP> 0,19
<tb> Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> ...... <SEP> 0,31 <SEP> 0,56 <SEP> 6,3 <SEP> 35,0 <SEP> 0,94 <SEP> 1,3 <SEP> 4,3 <SEP> 6,7
<tb> Streptococcus <SEP> pyrogenes <SEP> bêta <SEP> hé- <SEP> - molytique <SEP> <B>... <SEP> ................................</B> <SEP> 11,5 <SEP> 43,0 <SEP> >50,0 <SEP> >50,0 <SEP> 14,4 <SEP> 41,0 <SEP> >50,0 <SEP> >50;
0
<tb> Proteus <SEP> vulgaris <SEP> <B>............. <SEP> .....</B>........... <SEP> 0,28 <SEP> 0,56 <SEP> 9,2 <SEP> 50,0 <SEP> 0,62 <SEP> 1,12 <SEP> 1,38 <SEP> 4,4
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> ATCC <SEP> 9637 <SEP> ...... <SEP> 0,54 <SEP> 1,18 <SEP> 6,6 <SEP> 34,0 <SEP> 0,43 <SEP> 0,67 <SEP> 0,97 <SEP> 1,
8 On observe des résultats similaires quand on com pare la bromotétracycline à la bromodéméthyltétra- cycline. On a trouvé aussi que les déméthyltétracy- cline sont considérablement supérieures à l'oxytétra- cycline dans le même type de test.
On a aussi comparé les déméthyltétracyclines avec les tétracyclines dans des tests<I>in vivo,</I> et on a trouvé qu'il n'y a pas de différence appréciable dans l'activité antibactérienne des déméthyltétracyclines en compa raison de leurs analogues tétracycline.
Les spectres d'absorption d'ultraviolet des tétra cyclines et des déméthyltétracyclines sont très similai res. La fig. 2 des dessins montre la comparaison entre le spectre d'absorption d'ultraviolet de la chlorotétra- cycline et de la chlorodéméthyltétracycline à la même concentration. Comme on le notera, la forme des courbes est essentiellement la même, mais il y a tou tefois un léger frottement du spectre d'absorption de la chlorodéméthyltétracycline au voisinage de 260 mil limicrons.
On voit une autre comparaison des spectres d'ab sorption d'ultraviolet des tétracyclines dans le tableau II, qui indique les coefficients d'extinction<B>El,",.</B> (ab sorption spectrophotométrique d'une solution à 1 % mesurée dans une cellule de 1 cm) mesurés au maxima et aux minima des minima des différents antibiotiques. On a calculé les valeurs d'après les courbes d'absorp tion d'ultraviolet, en corrigeant à 1 % les concentra tions auxquelles on a fait les essais.
Tous les échan- tillons ont été mesurés dans une solution de H2SO4 0,1 N.
EMI0005.0069
Tableau <SEP> II
<tb> Max. <SEP> Min. <SEP> Max. <SEP> Min. <SEP> Max.
<tb> <I>Antibiotique</I> <SEP> É <SEP> ci <SEP> milli- <SEP> É <SEP> 11i0 <SEP> milli- <SEP> É <SEP> roi <SEP> milli- <SEP> É <SEP> 0/ <SEP> milli- <SEP> É <SEP> c<B>/</B> <SEP> milli i <SEP> cm <SEP> micron <SEP> i <SEP> cm <SEP> micron <SEP> i <SEP> cm <SEP> micron <SEP> i <SEP> cm <SEP> micron <SEP> i <SEP> cm <SEP> micron
<tb> Chlorhydrate <SEP> de <SEP> chlorotétra cyline <SEP> ........ <SEP> . <SEP> _ <SEP> .......... <SEP> ........ <SEP> .
<SEP> 209 <SEP> 368 <SEP> <B>135</B> <SEP> 302 <SEP> 356 <SEP> 265 <SEP> 288 <SEP> 242 <SEP> 343 <SEP> 228
<tb> Epichlorotétracycline <SEP> -NH4 <SEP> 170 <SEP> 368 <SEP> 100 <SEP> 302 <SEP> 332 <SEP> 254 <SEP> 290 <SEP> 242 <SEP> 342 <SEP> 228
<tb> Chlorhydrate <SEP> de <SEP> chlorodémé thyltétracycline <SEP> <B>.......... <SEP> - <SEP> ..</B>.. <SEP> 249 <SEP> 368 <SEP> 160 <SEP> 299 <SEP> 362 <SEP> 268 <SEP> 270 <SEP> 238 <SEP> 357 <SEP> 227
<tb> Chlorhydrate <SEP> d'épichlorodé méthyltétracycline <SEP> <B>............</B> <SEP> 242 <SEP> 368 <SEP> 130 <SEP> 300 <SEP> 348 <SEP> 254 <SEP> 289 <SEP> 238 <SEP> 346 <SEP> 227 Les spectres d'absorption d'infrarouge de plu sieurs des produits nouveaux sont représentés sur les autres figures du dessin.
La fig. 3 est une représenta tion du spectre d'absorption d'infrarouge du chlorhy- drate de chlorodéméthyltétracycline.
Ces courbes ont été obtenues sur un spectrophoto- mètre. automatique enregistreur à infrarouge Perkin- Ehner modèle 21, avec les antibiotiques en phase solide, comprimés en un disque avec KBr. Voici d'au tres données : prisme - NaCl ; résolution - 2 ; ré ponse - 1 - 1 ; gain - 5 ; vitesse 1/2 mn/micron ; suppression - 2 ; et échelle: 50,8 mm pour un micron.
Comme on l'indique plus haut, on peut obtenir la bromodéméthyltétracycline comme antibiotique principal de la fermentation, en réglant la teneur en halogène du milieu de fermentation. Généralement, le milieu nutritif aqueux doit contenir au moins 50 par ties par million d'ions bromure et la teneur en ions chlorure doit être maintenue aussi basse que possible, moins de 50 parties par million environ d'ions chlo rure.
L'ion bromure peut être fourni par n'importe quel bromure soluble dans l'eau, par exemple le bro mure de potassium, qui libère des ions bromure pour servir à la synthèse biologique de l'antibiotique.
A part le réglage de la teneur en ions halogènes de la fermentation, le procédé de préparation de la bromodéméthyltétracycline est similaire à celui de préparation de la chlorodéméthyltétraeycline, décrit plus haut. Les souches<I>de S.</I> auréofaciens qui pro duisent la déméthyltétracycline peuvent aussi servir à produire l'analogue bromé.
La bromodéméthyltétracycline a à peu près la même activité antibactérienne que la chlorodéméthyl- tétracycline, et elle peut servir aux mêmes usages et de la même façon.
II n'est pas nécessaire de séparer la bromodémé- thyltétracycline des autres antibiotiques qui peuvent se former concurremment durant la fermentation, car un mélange des diverses déméthyltétracyclines est utile à de nombreux usages ; par exemple, on peut concentrer le milieu nutritif fermenté et l'utiliser di rectement pour sa teneur en antibiotiques.
Une autre façon de l'utiliser est d'acidifier la liqueur fermentée, de filtrer pour éliminer le mycélium et les matières insolubles ; de neutraliser et de concentrer pour obte nir une poudre sèche que l'on peut mélanger à des aliments pour animaux. Les antibiotiques mélangés sont utiles pour stimuler la croissance de nombreux animaux.
Une forme brute de bromodéméthyltétracycline, et des mélanges de celle-ci avec d'autres antibiotiques, peuvent servir à préserver les viandes, volailles et poissons de la même façon que l'on emploie actuelle ment les tétracyclines. Dans ces compositions, il n'est guère nécessaire de faire attention aux proportions des diverses tétracyclines qu'elles peuvent contenir.
Au cas où l'on désire séparer la bromodéméthyl- tétracycline des autres antibiotiques contenus dans la liqueur fermentée, on peut le faire par plusieurs moyens qui apparaîtront à l'homme de l'art. Par exemple, le traitement par un acide détruit la tétra cycline, et le traitement par un alcali détruit la chloro- tétracycline dans la liqueur fermentée.
On peut récu pérer la bromodéméthyltétracycline à partir des solu tions résultantes, grâce à une chromatographie frac tionnée en utilisant de la terre d'infusoires dans la colonne. Un mélange de chloroforme et de butanol au pH 2,0 environ élue les antibiotiques de la terre d'infusoires.
La bromodéméthyltétracycline sort de la colonne en avant de la déméthyltétracycline et on peut la récupérer à partir de l'éluant. On peut aussi séparer la bromodéméthyltétracycline pour obtenir un seul constituant antibiotique, grâce à la technique de distribution à contre-courant de Craig.
Les épinières des déméthyltétracyclines obtenues par le procédé selon la présente invention sont des isomères des déméthyltétracyclines. La différence structurale semble être basée sur un réarrangement du groupe diméthylamine sur l'atome de carbone en position 4. Apparemment, dans certaines conditions qui seront décrites plus en détail ci-après, l'inversion se produit et on obtient un mélange à l'équilibre de déméthyltétracycline et de son épinière. On peut sé parer les deux pour obtenir des produits pratique ment purs.
Pour chacun des corps, chlorodéméthyl- tétracycline et bromodéméthyltétracycline, il existe un isomère correspondant que: l'on appellera épichlo- rodéméthyltétracycline et épibromodéméthyltétracy- cline On peut convertir les déméthyltétracyclines en leurs formes isomères en ajustant simplement le pH d'une solution concentrée de l'antibiotique entre 3,0 et 5,
0 et en laissant reposer la solution jusqu'à ce que l'isomérisation soit parvenue à un équilibre. Les conditions les plus importantes qu'il est nécessaire de régler pour convertir les déméthyltétracyclines en leurs isomères sont la concentration, le pH, le temps et la température.
Le plus commode est de réaliser l'isomérisation à la température ambiante, mais à des températures plus élevées, on obtient un taux de conversion plus élevé. Le pH doit être compris entre 3,0 et 5,0 envi ron, de préférence entre 3,5 et 4,5. Il se produit une certaine épimérisation à des pH sortant de cet inter valle, et même dans l'eau distillée ; mais la vitesse est très faible.
La concentration de l'antibiotique dans la solution aqueuse doit être aussi élevée que possible si l'on veut obtenir des vitesses d'épimérisation plus grandes. L'équilibrage complet peut nécessiter une durée d'environ 24 heures à 250 C, mais on peut obtenir un équilibrage satisfaisant en un temps beau coup plus court dans des conditions déterminées. Or dinairement toutefois, on obtient les meilleurs résul tats en laissant reposer la solution pendant des durées d'une semaine ou davantage.
Il semble que l'équilibre soit atteint, dans la plupart des cas, à 50 % environ ; autrement dit, à l'équilibre la moitié environ de la déméthyltétracycline est convertie en épinière.
Etant donné que la concentration est un facteur important pour obtenir des rendements élevés en de courts laps de temps, il faut choisir un système sol vant qui donne la plus forte concentration de démé- thyltétracycline. Il faut tamponner ces systèmes sol vants pour obtenir un pH compris dans l'intervalle préférentiel.
Les divers solvants comprennent le mé thanol, l'éthanol, le butanol, l'acétone, le 2-éthoxy- éthanol, le 2-méthoxypropanol, le tétrahydrofurane, la diméthylformamide et les mélanges de ces solvants. On peut utiliser d'autres solvants encore. Un tampon préférentiel est le phosphate monosodique, mais on peut utiliser d'autres tampons et couples de tampons qui maintiennent le pH dans l'intervalle désiré.
On peut récupérer les épimères des déméthyltétra- cyclines à partir des solutions aqueuses, de la même façon générale que l'on récupère les tétracyclines. Bien qu'ils aient une activité antibactérienne, in vitro et in vivo, légèrement inférieure à celle des déméthyl- tétracyclines, ils sont encore très utiles dans le trai tement des maladies causées par les bactéries, grâce à leur activité antibactérienne appréciable.
Comme on pourrait s'y attendre, les déméthylté- tracyclines forment des sels et des complexes du même type, et de la même façon générale, que les tétracyclines. Le traitement par les acides à un pH inférieur à 4 environ aboutit à la formation de sels d'acides. On peut obtenir la base libre à un pH de 4 à 6 environ; et aux pH supérieurs à 6, on obtient des sels avec des bases, par exemple le sel de calcium. De même, on forme des sels des épimères.
Comme on l'a indiqué précédemment, le procédé de la présente invention pour la préparation des déméthyltétracyclines, se distingue notamment du procédé de préparation de la chlorotétracycline, de la tétracycline et de la bromotétracycline, par le fait que l'on choisit une souche mutante de<I>S.</I> auréofa- cierrs qui produit la déméthyltétracycline désirée au lieu de l'une des tétracyclines.
Afin que le processus de fermentation suivant l'invention puisse être plus complètement compris, on le décrira maintenant en se référant aux exemples précis qui suivent Exemple 1 On peut préparer un milieu approprié pour la préparation d'inocula destinés à ces fermentations, avec les substances suivantes
EMI0007.0035
30 <SEP> g/1
<tb> (NH4)2S04 <SEP> <B>-----</B> <SEP> .<B>--------------------------</B> <SEP> .<B>---------------</B> <SEP> .<B>-----</B> <SEP> 2 <SEP> g/1
<tb> CaCO3 <SEP> <B>......................</B> <SEP> .<B>------------------- <SEP> ----------- <SEP> -----</B> <SEP> 7 <SEP> g/1
<tb> Liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> maïs <SEP> <B>............</B> <SEP> 16,
5 <SEP> c13/1 Le pH du milieu ainsi obtenu est d'environ 6,8. On mesure une portion de 8 crn9 que l'on introduit dans un tube Brewer de 20 cm, et on stérilise à 1200 C pendant 20 minutes. On inocule alors le milieu stérilisé avec 0,5 cm3 d'une suspension aqueuse de spores d'une souche de S.
auréofaciens capable de produire de la chlorodéméthyltétracycline, par exem ple la souche S-604, la suspension contenant environ 40-60 millions de spores par cm3. On fait incuber le milieu inoculé pendant 24 heures à 280 C, sur une secoueuse alternative fonctionnant à 110 cycles par minute.
Un milieu de fermentation approprié contient de l'eau et un milieu typique qui convient pour pro duire de la chlorodéméthyltétracycline est le suivant
EMI0007.0050
Amidon <SEP> de <SEP> maïs <SEP> <B>....</B> <SEP> _<B>.....</B> <SEP> __<B>.............</B> <SEP> __<B>.........</B> <SEP> 55 <SEP> g/1
<tb> CaC03...........................-..................................... <SEP> 57 <SEP> g/1
<tb> (NH4)sSd4 <SEP> <B>............... <SEP> ............... <SEP> ...................... <SEP> 5 <SEP> g/i</B>
<tb> FeS04. <SEP> 7H20 <SEP> <B>....... <SEP> ........................................</B> <SEP> 40 <SEP> mg/1
<tb> MnS04.
<SEP> 4H20 <SEP> <B>......</B> <SEP> .....<B>..........</B> <SEP> .<B>.....................</B> <SEP> .<B>....</B> <SEP> 50 <SEP> mg/1
<tb> ZnS04 <SEP> 7H20 <SEP> <B>............... <SEP> .............. <SEP> .................</B> <SEP> 100 <SEP> mg/1
<tb> CoC12 <SEP> 6H20 <SEP> <B>............... <SEP> ................ <SEP> <SEP> ....... <SEP> .....</B> <SEP> 5 <SEP> mg/1
<tb> Liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> maïs <SEP> ............... <SEP> 30 <SEP> g/1
<tb> Farine <SEP> de <SEP> graine <SEP> de <SEP> coton <SEP> ........................ <SEP> 2 <SEP> g/1
<tb> Huile <SEP> de <SEP> saindoux <SEP> ._<B>.....................................</B> <SEP> ..
<SEP> 2,0%
<tb> en <SEP> volume Quand on restreint la teneur de ce milieu en ions chlorure cela tend à augmenter la quantité de démé- thyltétracycline aux dépens de la production de chlo- rodéméthyltétracycline. Exemple 2 On conduit une fermentation en flacons de se- coueuse qui aboutit à former une certaine quantité de déméthyltétracycline et de chlorodéméthyltétracy- cline,
avec un milieu préparé comme suit
EMI0007.0062
Liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> mais <SEP> ............... <SEP> 30 <SEP> g/1
<tb> Huile <SEP> de <SEP> saindoux <SEP> .......................................... <SEP> 2 <SEP> %
<tb> en <SEP> volume
<tb> Amidon <SEP> de <SEP> maïs <SEP> .......................................... <SEP> 55 <SEP> g/1
<tb> Farine <SEP> de <SEP> graine <SEP> de <SEP> coton <SEP> ........................ <SEP> 2 <SEP> g/1
<tb> CaC03.................................................................. <SEP> 7 <SEP> g/1
<tb> (ffl4)aS04 <SEP> <B>................................... <SEP> ........... <SEP> ......</B> <SEP> 5 <SEP> g/1
<tb> NH4Cl <SEP> ......................:
........................................... <SEP> 1,5g/1
<tb> FeS04.7H20 <SEP> ................................................ <SEP> 40 <SEP> mg/1
<tb> ZnS04. <SEP> 7H20 <SEP> <B>.... <SEP> ................... <SEP> ........................</B> <SEP> 100 <SEP> mg/1
<tb> MnS04 <SEP> ' <SEP> 4H20 <SEP> <B>........... <SEP> ................. <SEP> - <SEP> ..... <SEP> ........</B> <SEP> 50 <SEP> mg/1
<tb> CoC12 <SEP> - <SEP> 6H20 <SEP> ................................................
<SEP> 5 <SEP> mg/1 On mesure une portion de 25 cm3 que l'on intro duit dans un flacon Erlenmeyer de 250 cm3, on stéri lise pendant 20 minutes à 120o C et on inocule avec 1 cm3 de culture mycélienne préparée comme dans l'exemple 1.
Après incubation de 120 heures à 26o C sur une secoueuse rotative à 186 t/mn, on titre la liqueur et on trouve qu'elle ne contient pas plus de 70 microgrammes environ de chlorotétracycline par cm3, environ 450 microgrammes de déméthyltétracy- cline par cm3,
et environ 900 microgrammes de chlo- rodéméthyltétracycline par em3. Exemple 3 On prépare un milieu d'inoculation comme décrit à l'exemple 1 et on l'inocule avec des spores d'une race de<I>Streptomyces</I> auréofaciens productrice de dé- méthyltétracycline. On laisse incuber cet inoculai pen- dant 24 heures à 280 C dans un agitateur de culture à mouvement alternatif.
On prépare un milieu de fermentation contenant
EMI0008.0002
Farine <SEP> de <SEP> maïs <SEP> <B>...........</B> <SEP> .<B>.................</B> <SEP> -<B>...........</B> <SEP> 14,5 <SEP> g/1
<tb> Amidon <SEP> de <SEP> maïs <SEP> <B>.....</B> <SEP> .<B>.............</B> <SEP> .._..<B>..................</B> <SEP> 47,5 <SEP> g/1
<tb> Liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> du <SEP> maïs, <SEP> à
<tb> 50 <SEP> % <SEP> de <SEP> matières <SEP> solides <SEP> <B>........</B> <SEP> 22,5 <SEP> g/1
<tb> CaCO3 <SEP> 9,0 <SEP> g/1
<tb> (NH4)2SO4 <SEP> <B>...........</B> <SEP> .<B>-----</B> <SEP> -<B>....</B> <SEP> .....<B>----</B> <SEP> .<B>---------------------</B> <SEP> 5,85 <SEP> g/1
<tb> 4 <SEP> 1,66 <SEP> g/1
<tb> MnS04 <SEP> (70 <SEP> %) <SEP> -...-<B>.........</B> <SEP> .<B>........</B> <SEP> .._.__.<B>----------</B> <SEP> ...
<SEP> 56 <SEP> mg/1
<tb> COCl2 <SEP> - <SEP> 5H20 <SEP> _.<B>............</B> <SEP> .<B>.........</B> <SEP> __....<B>-------</B> <SEP> ._... <SEP> 5 <SEP> mg/1
<tb> Huile <SEP> de <SEP> lard <SEP> <B>......</B> <SEP> -.<B>.......................................</B> <SEP> 25 <SEP> m1/1 Ce milieu est réparti à raison de 30 ml chacun dans des flacons d'Erlenmeyer de 250 ml. On bouche les flacons stérilisés sont inoculés avec 1 ml de l'ino- pendant 20 minutes à 1210 C.
Après refroidissement, les flacons stérilisés sont inoculés avec 1 ml de l'ino- culat, incubé pendant 24 heures, de la race décrite ci-dessus. Les flacons de fermentation inoculés sont soumis à une incubation dans un agitateur de culture à mouvement rotatif, à une température ne dépassant pas 280 C. On laisse la fermentation se poursuivre pendant 140 heures.
Un échantillon de ce bouillon fermenté est alors analysé quant à sa teneur en chlo- rotétracycline, en se servant de la méthode, décrite dans cette demande, consistant à mesurer le change ment d'absorption dans l'ultraviolet avant et après dégradation alcaline. La teneur calculée en chloroté- tracycline est inférieure à 50 ,1/m1,
c'est-à-dire à la sensibilité garantie de cette méthode d'analyse. Par chromatographie sur papier du bouillon fermenté, on ne trouve que des traces de chlorotétracycline. Par la méthode d'analyse spectrophotométrique décrite dans cette demande, on trouve une teneur en déméthyl- chlorotétracycline et déméthyltétracycline correspon dant à 2090 ,1/m1. La chromatographie sur papier montre que ces deux déméthyltétracyclines se trou vent en proportions à peu près égales.
Exemple 4 On prépare un milieu d'inoculation comme dans l'exemple 1, et on l'inocule avec des spores d'une race de S. auréofaciens productrice de déméthyltétra- cycline. Cet inoculai est incubé comme décrit à l'exemple 1.
On prépare un milieu de fermentation contenant
EMI0008.0041
Farine <SEP> de <SEP> maïs <SEP> <B>--------------------------------</B> <SEP> 67,0 <SEP> g/1
<tb> Liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> du <SEP> maïs, <SEP> à
<tb> <B>50%</B> <SEP> de <SEP> matières <SEP> solides <SEP> <B>..............
<SEP> _.</B> <SEP> 25,0 <SEP> g/1
<tb> CaC03 <SEP> pulvérisé <SEP> .<B>..................</B> <SEP> .<B>---------------</B> <SEP> .<B>......</B> <SEP> 9,0 <SEP> g/1
<tb> 4)2S04 <SEP> <B>....</B> <SEP> __<B>.............</B> <SEP> .<B>....</B> <SEP> -<B>.............</B> <SEP> ....-<B>.......</B> <SEP> 6,75 <SEP> g/1
<tb> 4 <SEP> 2,0 <SEP> g/1
<tb> MnS04 <SEP> (70 <SEP> %) <SEP> <B>.................</B> <SEP> .._.....<B>------</B> <SEP> .<B>......</B> <SEP> _<B>.....</B> <SEP> 100 <SEP> mg/1
<tb> CoC12 <SEP> - <SEP> 6H20 <SEP> ....<B>....</B> <SEP> _...-<B>....</B> <SEP> ___<B>............
<SEP> .......</B> <SEP> 5 <SEP> mg/1
<tb> Huile <SEP> de <SEP> lard <SEP> <B>....</B> <SEP> .<B>........</B> <SEP> _.....<B>................</B> <SEP> __<B>-----</B> <SEP> 30 <SEP> ml/1 Ce milieu est traité, inoculé et incubé comme dans l'exemple (3). Le bouillon récolté est analysé aussi bien par spectrophotométrie que par chromatographie sur papier.
On ne décèle pas de chlorotétracycline. La plus grande partie du produit est de la déméthylchlo- rotétracycline. On trouve une teneur totale corres pondant à 2540 y/ml de déméthyltétracyclines, dont 2200 y/ml sont formés de déméthylchlorotétracycline. La chromatographie sur papier confirme que seule une petite quantité de déméthyltétracycline s'est for mée.
Exemple 5 On effectue une fermentation comme dans l'exem ple (4), sauf que l'on utilise une race différente de <I>S.</I> auréofaciens productrice de déméthyltétracycline en tant qu'agent de fermentation. Le bouillon fer menté est analysé comme dans l'exemple (4).
La chromatographie sur papier ne permet pas de déceler la présence de chlorotétracycline. L'analyse spectro- photométrique donne une teneur totale en déméthyl- tétracyclines de 1430 y/ml, dont 300 y/ml de démé- thylchlorotétracycline. Par chromatographie sur pa pier, on s'assure que le reste de la totalité des substan ces antibiotiques est formé de déméthyltétracycline, dont la teneur, calculée par différence,
est de 1130 y/ml. Exemple 6 On effectue une fermentation dans les conditions décrites à l'exemple (3), sauf que l'on utilise une race différente de<I>S.</I> auréofaciens productrice de déméthyl- tétracycline comme agent de fermentation et que le milieu de fermentation contient
EMI0008.0073
Farine <SEP> de <SEP> maïs <SEP> <B>-------</B> <SEP> -<B>----</B> <SEP> ...<B>---------------------</B> <SEP> 16,9 <SEP> g/1
<tb> Amidon <SEP> de <SEP> maïs <SEP> <B>----- <SEP> --------------------------- <SEP> --------</B> <SEP> 66,42 <SEP> g/1
<tb> Liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> du <SEP> maïs,
<SEP> à
<tb> 50 <SEP> % <SEP> de <SEP> matières <SEP> solides <SEP> <B>------------------</B> <SEP> 27,5 <SEP> g/1
<tb> CaCOs <SEP> pulvérisé <SEP> <B>---------------------------- <SEP> ....</B> <SEP> . <SEP> ..... <SEP> 11,43 <SEP> g/1
<tb> (NH4)2S04 <SEP> <B>--------------------</B> <SEP> .<B>-----</B> <SEP> .-..-.<B>------</B> <SEP> ...<B>--------</B> <SEP> 9,0 <SEP> g/1
<tb> NH4Cl <SEP> <B>-----</B> <SEP> .<B>---------------------------------</B> <SEP> -...-<B>----------</B> <SEP> 2,0 <SEP> g/1
<tb> MnS04 <SEP> (70 <SEP> %) <SEP> <B>----</B> <SEP> .-<B>-------------------------- <SEP> ------- <SEP> 160</B> <SEP> mg/1
<tb> CoCl2 <SEP> - <SEP> 6H20 <SEP> <B>---------------------------- <SEP> ----------------- <SEP> -</B> <SEP> 5 <SEP> mg/1
<tb> Huile <SEP> de <SEP> lard <SEP> <B>-------------------------------</B> <SEP> -....<B>-----</B> <SEP> 33,
3 <SEP> m1/1 On laisse la fermentation se poursuivre pendant 140 heures. Comme l'indique la chromatographie sur papier, le bouillon de fermentation ne contient que de la déméthyltétracycline. Un essai biologique du bouillon révèle une teneur en déméthyltétracycline correspondant à 810 y/ml, vis-à-vis du staphylococcus aureus.
Exemple 7 On procède de façon analogue à celle de l'exem ple (3). On prépare un milieu d'inoculation conte nant:
EMI0008.0080
Liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> du <SEP> maïs, <SEP> à <SEP> 50 <SEP> % <SEP> de
<tb> matières <SEP> solides <SEP> <B>--------------- <SEP> -----------------</B> <SEP> -<B>-----------</B> <SEP> 20 <SEP> g/1
<tb> Dextrose <SEP> .. <SEP> . <SEP> .. <SEP> .... <SEP> ...... <SEP> .......... <SEP> .30 <SEP> g/1
<tb> (NH4)2S04 <SEP> <B>------------------------- <SEP> ----- <SEP> ---------- <SEP> - <SEP> ----------------</B> <SEP> 2 <SEP> g/1
<tb> CaCO3 <SEP> ....___..._._...........__...._...._................................ <SEP> 7 <SEP> g/1 On stérilise ce milieu et on l'inocule avec des spores d'une race de S.
auréofaciens productrice de déméthyltétracycline. On le soumet à l'incubation, comme dans l'exemple (3). Après une période de croissance de 24 heures, cet inocula est utilisé pour ensemencer un milieu de fermentation contenant Les exemples suivants illustrent la récupération, le raffinage et la séparation des antibiotiques.
Exemple A Raffinage <I>de la</I> chlorodéméthyltétracycline <I>et de la</I> déméthyltétracycline
EMI0009.0014
CaCO3 <SEP> <B>.......</B> <SEP> .<B>......</B> <SEP> .<B>......................... <SEP> ...... <SEP> ..........</B> <SEP> - <SEP> 10,0 <SEP> g/1
<tb> (NH3)2S04 <SEP> ....<B>............................</B> <SEP> .<B>..................</B> <SEP> 9,84 <SEP> g/1
<tb> FeSO., <SEP> - <SEP> 7H20 <SEP> <B>......</B> <SEP> .<B>..............................</B> <SEP> .<B>..........</B> <SEP> 60,0 <SEP> mg/1
<tb> ZnSO4 <SEP> - <SEP> 7H20 <SEP> <B>------------------</B> <SEP> -<B>..........</B> <SEP> .<B>---- <SEP> ------------</B> <SEP> 100,0 <SEP> mg/1
<tb> MnSO4 <SEP> ' <SEP> HZO <SEP> <B>-------</B> <SEP> ....._....._..<B>-------------</B> <SEP> ..
<SEP> ........... <SEP> 50,0 <SEP> mg/1
<tb> CoN03 <SEP> - <SEP> 6H20 <SEP> <B>..................................... <SEP> ...........</B> <SEP> 5,0 <SEP> mg/1
<tb> MgSO4. <SEP> 7H20 <SEP> ....<B>......................................</B> <SEP> .<B>.....</B> <SEP> 2,0 <SEP> g/1
<tb> 1,48 <SEP> g/1
<tb> H2P0.j <SEP> (85 <SEP> %) <SEP> <B>................................... <SEP> ------------</B> <SEP> 400,0 <SEP> mg/1
<tb> Amidon <SEP> _<B>...........</B> <SEP> __<B>..........................................</B> <SEP> 55,0 <SEP> g/1
<tb> l-méthionine <SEP> <B>-----</B> <SEP> .<B>..............</B> <SEP> -<B>................... <SEP> ........</B> <SEP> . <SEP> 600,0 <SEP> mg/1
<tb> l-histidine <SEP> <B>....................</B> <SEP> .<B>....</B> <SEP> .<B>........</B> <SEP> .<B>.....
<SEP> ........</B> <SEP> .<B>.....</B> <SEP> 800,0 <SEP> mg/1
<tb> Huile <SEP> de <SEP> lard <SEP> <B>.....................................</B> <SEP> .<B>-------</B> <SEP> _ <SEP> 20 <SEP> m1/1 Ce milieu est réparti dans des flacons et stérilisé à 1201, C pendant 15 minutes. Après inoculation, les flacons sont soumis à une incubation dans un agita teur de culture à mouvement rotatif, à une tempéra ture ne dépassant pas 28o C. Après une durée de fermentation de 51 heures, on ajoute du KBr82 radio actif (environ 800 millicuries par gramme) en quan tité suffisante pour obtenir une concentration de 2 mi crocuries par ml du milieu.
Après une nouvelle pé riode de fermentation de 15 heures, on sépare un filtrat du bouillon acidifié, en ajustant le pH du bouil lon à 1,3 au moyen d'acide oxalique puis en filtrant. Ce filtrat acide est alors analysé par chromatographie sur papier, en se servant d'un système de n-butanol de pH 3,0.
Dans ce système, une halogénodéméthyl- tétracycline se déplace vers l'avant, par rapport à la déméthyltétracycline. L'examen de radioactivité du fil- trat de fermentation montre deux pointes de radio activité, l'une au point de départ, correspondant au brome résiduaire, non employé dans le métabolisme, l'autre immédiatement en avant de la déméthyltétra- cycline, ce.
qui démontre que du brome82 a été incor poré par le microorganisme, donnant lieu à la for mation de déméthylbromotétracycline. Exemple 8 <I>Fermentation en cuve</I> On conduit une fermentation de 40 litres dans une cuve pilote, essentiellement suivant la méthode décrite à l'exemple 2. Après avoir préparé le milieu, on le stérilise pendant 25 minutes à 125,1 C et on l'inocule avec un inoculum de souche S-604 préparé comme indiqué par Duggar, brevet des Etats-Unis d'Améri que No 2482055.
On conduit la fermentation avec agitation continue à une température de 280 C pen dant les 24 premières heures, et 250 C jusqu'à achè vement, en 135 heures. On introduit de l'air stérile à raison de 0,3 1/1/mn pendant les seize premières heures, puis à raison de 0,5 1/1/mn jusqu'à la récolte. On prépare 25,8 litres de liqueur comme dans l'exemple 3, on les traite par 200 cm3 d'acide chlor hydrique concentré pour ajuster le pH à 1,5.
On filtre la liqueur traitée, après l'avoir mélangée à 2,8 kg d'un adjuvant de filtration, pour obtenir 16,3 litres de filtrat. On reprend le tourteau de filtration par 25 litres d'eau à une température d'environ 500 C et on ajuste au pH 1,5. Après avoir agité pendant 30 minutes, on filtre le tourteau délayé et on réunit le filtrat au filtrat précédent, pour former une masse de 42,3 litres. On traite le filtrat réuni avec 6,76 kg de chlorure de sodium et on extrait à quatre reprises par le butanol à raison de 15% du volume du filtrat.
On réunit les extraits, on les clarifie par filtration et on les concentre sous vide à 25-300 C jusqu'à un volume final de 6 litres. Exemple B <I>Séparation</I> chromatographique <I>de la</I> chlorodéméthyltétracycline <I>et de la</I> déméthyltétracycline On divise le concentré au butanol de l'exemple A en deux portions égales, on concentre l'une à 900 cm3 et on concentre l'autre à 610 cm3 sous vide. On filtre les concentrés et on les ajuste au pH 2 avec de la soude à 50 %.
Pour préparer le système solvant utilisé pour la séparation chromatographique, on équilibre un mé lange à 80 % de butanol et 20 % de chloroforme avec de l'eau ajustée au pH 2 au moyen d'acide chlorhydrique. Les colonnes sont des colonnes de verre de 15 cm de diamètre garnies de 2,8 kg die terre d'infusoires lavée à l'acide. On équilibre les colonnes avec la phase aqueuse du système solvant avant l'usage.
On traite les deux concentrés au butanol, sur des colonnes séparées. On verse doucement les concentrés dans le haut des colonnes. Puis on élue les colonnes avec la phase solvante que l'on fait passer au travers à raison d'environ 10 litres par heure. Dans chaque cas, on prend 40 tranches de 500 cm3, et on déter mine la teneur en antibiotique de chacune par chro matographie sur bande de papier.
Dans la portion de 900 cm3, les tranches 6 à 17 contiennent la chloro- déméthyltétracycline et la chlorotétracycline, et les tranches 24 à 40 contiennent la déméthyltétracycline et la tétracycline. Dans la portion de 610 cm3, les tranches 7 à 18 contiennent la chlorodéméthyltétra- cycline et la chlôrotétracycline,
et les tranches 19 à 31 contiennent la déméthyltétracycline et la tétracy cline. Exemple C <I>Récupération de la</I> chlorodéméthyltétracycline <I>à partir de fractions de colonne</I> On réunit les fractions contenant de la chlorodé- méthyltétracycline et provenant de l'exemple B, pour obtenir un volume d'environ 12 litres. On ajoute une égale quantité d'eau, et on concentre le mélange sous vide jusqu'à 1810 cm3 de solution aqueuse.
On ajuste le pH du concentré à 2,3-1,9 par addition d'acide chlorhydrique. On lave à deux reprises le concentré acidifié avec 180 cmu de chloroforme, on filtre et on concentre, sous vide jusqu'à un volume de 360 cm3. On ajuste le pH du concentré entre 1,2 et 2,8 avec de la soude à 50 %. On sèche la solution par con gélation pour donner 18,56 g de chlorhydrate de chlorodéméthyltétracycline amorphe, titrant 550 mi crogrammes par mg.
Exemple D <I>Cristallisation</I> <I>du chlorhydrate de</I> chlorodéméthyltétracycline <I>par le mélange acétone-éther</I> On prend 18,56g de chlorodéméthyltétracycline séchée par congélation comme dans l'exemple C, on agite dans un mélange de 55 em3 d'acétone, 7,4 cm3 d'eau et 3,7 cm3 d'acide chlorhydrique concentré. On filtre la solution et on rince les solides à deux repri ses avec un total de 55 cm3 d'acétone contenant 1,85 em3 d'eau.
On réunit les filtrats, le pH étant de 0,8, et on traite par 55 cm8 d'éther. On ensemence le mélange, on laisse vieillir 18 heures à la tempéra ture ambiante avec agitation constante, et on enlève par filtration les cristaux qui se forment. On lave le produit avec un mélange d'acétone, d'eau et d'éther, puis avec de l'acétone et finalement avec de l'éther, et on sèche sous vide à 400 C. On obtient un rende ment de 4,74 g de chlorhydrate de chlorodéméthyl- tétracycline cristallin titrant 1090 microgrammes par mg, ce qui représente un rendement d'opération de 50,6 %.
Le produit contient 11 % de chlorotétracy- cline. Exemple E <I>Cristallisation</I> <I>du chlorhydrate de</I> chlorodéméthyltétracycline <I>à partir d'un mélange</I> butanol-cellosolve On prend une portion de 50,4 g de chlorodémé- thyltétracycline séchée par congélation, préparée comme dans l'exemple C, et titrant 700 microgram- mes par mg, on la délaie dans 22,5 cm3 de cellosolve,
et à la solution résultante on ajoute, au total, 205 cm3 de butanol. On ajuste le pH à 0,8 par addition de 11 cm3 d'acide chlorhydrique concentré et on laisse vieillir le mélange 51 heures avec agitation. On en lève les cristaux obtenus par filtration, on lave avec un mélange à 90/10 de butanol et de cellosolve, puis avec du chloroforme et on sèche sous vide.
On ob tient un rendement de 30,6 g de chlorhydrate de chlorodéméthyltétracycline, titrant 1053 microgram- mes par mg, soit un rendement de 84 %. Exemple F <I>Recristallisation de la</I> chlorodéméthyltétracycline <I>de manière à détruire la</I> chlorotétracycline On prend 1 g de la chlorodéméthyltétracycline préparée dans l'exemple D, on la délaie dans 3 cm3 de mélange à 90 % de butanol et 10 % de cellosolve,
et on y ajoute 3 cm3 de triéthylamine pour ajuster le pH à 10,4. On laisse reposer la solution incomplète à la température ambiante pendant 24 heures pour détruire la chlorotétracycline qui peut être présente, et au bout de ce temps on ajoute de l'acide chlorhy drique concentré pour abaisser le pH à 0,8, et on laisse vieillir le mélange pendant 24 heures avec agi tation.
On filtre le produit cristallin, on le lave avec un mélange; à 90 % de butanol et 10 % de cello- solve, puis au chloroforme et on sèche sous vide à 40 C. On obtient un rendement de 0,36 g de chlor- hydrate de chlorodéméthyltétracycline, titrant 1228 microgrammes par mg et contenant environ 2,5 % de chlorotétracycline, ce qui représente un rende ment de 40 %.
Les exemples suivants illustrent la conversion des antibiotiques en diverses formes Exemple G Bromhydrate <I>de</I> chlorodéméthyltétracycline On dissout 1,0g de chlorodéméthyltétracycline- ammonium dans 20 cm3 d'eau et on traite la solution par 0,6 cm2 d'acide bromhydrique à 48 % pour ajus ter le pH à 1,6.
On laisse vieillir le mélange pendant 18 heures en agitant, à la température ambiante, et au bout de ce temps on trouve des cristaux en aiguil les allongées de bromhydrate de chlorodéméthyltétra- cycline. On filtre le produit, on le lave avec 6 cm3 d'eau ajustée au pH 2,2 avec de l'acide bromhydri que, et on sèche sous vide pendant 5 heures à 44,1 C. On obtient un rendement de 750 mg de bromhydrate de chlorodéméthyltétracycline.
Analyse calculée pour C21H22N@ClBr08 C : 46,2; H : 4,1 ; N : 5,1 ;<B>CI:</B> 6,5 ; Br : 14,6 ; O : 23,4.
Analyse effective C : 45,94; H: 4,44 ;<B>N:</B> 4,71 ;<B>CI:</B> 6,78 ; 6,47 ; Br : 13,74 ; O (différence) : 24,39 ; 24,70. Exemple H <I>Préparation du sel d'ammonium</I> <I>de</I> chlorodéméthyltétracycline On prend une portion de 100 mg de la chlorodé- méthyltétracycline préparée;
dans l'exemple D, on la dissout dans 0,5 cm3 de mélange à 90 % de butanol et<B>10%</B> de cellosolve, et on fait barboter du gaz ammoniac dans la solution jusqu'à ce qu'il apparaisse un solide épais. On dilue la bouillie avec une petite quantité d'ammoniaque aqueuse concentrée, on laisse reposer à la température ambiante pendant 5 heures et on filtre. On lave: le produit avec un mélange à 90 % de butanol et 10 % de cellosolve, puis à l'acé tone, et on sèche sous vide.
On obtient un rendement de 41,4 mg de sel d'ammonium de chlorodéméthyl- tétracycline, titrant 1148 microgrammes par mg en chlorhydrate de chlorotétracycline (rendement 44 % ). Exemple I <I>Préparation de la</I> chlorodéméthyltétracycline <I>neutre</I> On prend une portion de 50 mg de la chlorodé- méthyltétracycline obtenue dans l'exemple D; titrant 1090 microgrammes par mg, on la dissout dans 1,3 cm3 d'eau et on traite la solution par le carbonate de sodium à sec jusqu'à un pH de 7-8.
On élimine par centrifugation le précipité amorphe obtenu, et on ajuste au pH 5,4 le liquide limpide de décantation, et on le laisse vieillir 16 heures à la température am biante. On filtre le produit, on le lave à l'eau et on le sèche sous vide à 35o C, pour obtenir 21,9 mg de chlorodéméthyltétracycline neutre cristalline ti trant 1250 grammes par mg (rendement<B>50%).</B>