Procédé de préparation d'un antibiotique La présente invention n pour objet un procédé pour la préparation de la déméthyltétracycline et ses épinières.
Le nouvel antibiotique en question se forme dans un processus de fermentation .dans lequel on utilise des souches mutantes :de Streptomyces aureofaciens. Le nouvel antibiotique semble étroitement apparenté aux membres de la famille tétracycline décrite anté rieurement, mais il en est nettement différent. Il est caractérisé par une stabilité marquée aussi bien en milieu alcalin qu'en milieu .acide,
et est supérieur aux tétracyclines à cet égard. Il a une activité antibiotique similaire et peut servir aux mêmes usages, et de la même façon générale, que les tétracyclines actuelle ment connues.
Suivant l'invention, on fournit un procédé pour la préparation de l'antibiotique déméthyltétracycAine et ses épinières, ce procédé étant caractérisé par le fait qu'on fait fermenter, dans des conditions a6ro- bies, un milieu nutritif aqueux renfermant une source assimilable de carbone, d'azote et de substances mi nérales avec une souche :de<I>S.</I> aureofaciens produc trice de déméthyltétracycline.
En effet, on a constaté qu'en utilisant certaines souches mutantes de<I>S.</I> aureofaciens qui seront plus particulièrement décrites ci-après, on obtient une substance antibiotique similaire ,à la tétracycline. Le nouvel antibiotique particulier qui se forme à ;la suite du processus de fermentation dépend de la nature du milieu nutritif .et des autres conditions du processus. Dans un milieu exempt de chlorures, l'antibiotique qui .prédomine est l'analogue non chloruré de la té tracycline.
Dans un milieu riche en brome, il se forme l'antibiotique bromé ; et dans un milieu riche en chlore, l'antibiotique prédominant sera un antibioti que chloré analogue à la chlorotétracycline. Ordinai- rement, il se forme aussi de la tétracycline, de la chlomotétracycline et/ou de la bromotétracycline pen dant le @processus de fermentation, et leurs propor tions relatives dépendent -de la teneur du milieu en ions chlorure et/ou bromure, et de la souche d e micro organisme utilisée.
En sélectionnant soigneusement la souche de<I>S.</I> aureofaciens, il est possible d'éliminer presque complètement la formation de ces antibioti ques connus du groupe tétracycline.
Le nouvel antibiotique peut être converti en épi- mères comme décrit ci-après, de façon similaire à la conversion de la tétracycline en quatrimycines.
Des @analyses chimiques, et l'examen des proprié tés chimiques et physiques du nouveau composé indi quent qu'il diffère essentiellement des tétracyclines par le fait qu'ils contiennent un groupe -méthyle en moins.
Le groupe méthyle en question est très vrai semblablement celui qui occupe la position 6 sur le noyau naphtacène des tétracyclines. En conséquence, l'analogue de la tétracycline s'appellera 4-diméthyl amino-1,4,4a,5,5a,6,11,12a-octahydro-3,6,10,12,12a- pentahydroxy -1,11 -dioxo-2-naphtacène-carboxamid@e. Le nom courant approprié d e ce nouvel antibiotique serait déméthyltétracycline, et on utilisera ici cette nomenclature.
Mais il est entendu que la structure postulée n'a pas été prouvée par une synthèse non équivoque, et pourrait être trouvée erronée par la suite. La présente invention concerne un procédé déterminé pour la préparation de composés qui pos sèdent des propriétés déterminées, et dent pas limitée par un système partiewlier -de nomenclature ni par une s tructure probable.
Le nouvel antibiotique est produit par certaines souches mutantes de<I>S.</I> aureofaciens. Ces souches sont sans aucun doute <I>de</I> l'espèce<I>Streptomyces</I> au- reofaciens, puisqu'elles dérivent de la souche priani- tive A-377 isolée par le D.r B.M. Duggar,
et déposée aux Northern Regional Research Laboratories à Peoria (Illinois, Etats-Unis), .et indexées en ce Labo ratoire sous le N NRRL 2.209.
Les mutations com- portant un traitement de la souche A-377 par des agents mutagènes, comprenant successivement l'irra diation ultraviolette, la nicotine et le chlorhyd :
rate de 2,2=dichloro-N-méthyldiéthylarnine, ont été utilisées pour créer l'une des souches. Diverses autres. souches ont été obtenues par mutation spontanée .et par trai- tement à l'aide d'agents mutagènes. Ces diverses sou ches qui produisent les nouveaux antibiotiques en dif férentes proportions et avec des .rendements divers,
présentent les caractéristiques générales de l'espèce <I>S.</I> aureofaciens. Elles différent un peu entre elles et aussi des :souches de S. aureofaciens antérieurement décrites, principalement par leur ,pigmentation et leur propriété de produire les nouveaux antibiotiques. Dans la plupart des cas, on note un ;pigment brun rougeâtre lorsque les micro-organismes sont culti vés sur des milieux de culture ordinaires.
Les nuan ces du pigment varient de la nuance pêche ou du brun cuivré jusqu'à un acajou foncé, suivant la sou che particulière et le milieu nutritif utilisé. Bien que la propriété de produire le nouvel antibiotique de la présente invention soit généralement associée à des souches qui présentent ce type de :pigmentation, cette formation de pigmente la production des nouveaux antibiotiques ne sont pas nécessairement des proprié tés :solidaires.
Toutes les souches étudiées produisent de la chloro@tétracycline, et généralement de la tétra cycline, bien que les proportions relatives de ces anti biotiques varient considérablement suivant la nature du milieu de fermentation, les conditions de fermen tation et la souche particulière choisie.
Dans certains cas, la production de chlorotétracycline et de tétra- cyeline est très faible, de l'ordre de quelques pour- cent sur le ,total de l'antibiotique produit par la fer mentation.
Les :souches mutantes qui produisent le nouvel antibiotique de la :présente invention possèdent les mêmes caractéristiques générales que les souches qui produisent la tétracycline, et -elles diffèrent entre elles de la même façon générale que -les souches productri ces de tétracycline diffèrent l'une de l'autre, :ainsi qu'on l'a expliqué :dans .plusieurs articles scientifiques qui ont été :publiés.
Bien que :de nombreuses souches de S. aureofaciens soient à la disposition du publie dans les collections ide cultures et aient été décrites dans des brevets et,dans la littérature scientifique, les données suivantes serviront à illustrer le type de va riation des nouvelles souches, par rapport à la .souche primitive A-377 qui :se trouve :sous la désignation NRRL 2.209.
<I>Comparaison des souches de S.</I> au.reofaciens <I>S-604 et A-377 sur divers milieux</I> Le<I>Streptomyces</I> aureofaciens souche S-604, qui produit la chlorodéméthyltétracycline et la déméthyl- tétracyclin:e a été comparé au<I>Streptomyces aureofa-</I> ciens souche A-377 (NRRL 2.209) par observation des caractéristiques de croissance sur divers milieux incubés à 26-27 C.
Les observations faites sont les suivantes
EMI0002.0078
<I>1. <SEP> Glycérol, <SEP> asparagine, <SEP> extrait <SEP> de <SEP> bceuf,</I>
<tb> <I>agar-agar</I>
<tb> Glycérol <SEP> 1,0 <SEP> %
<tb> Asparagine-L <SEP> 0,05%
<tb> Extrait <SEP> de <SEP> boeuf <SEP> .. <SEP> . <SEP> 0,02%
<tb> KH2P04 <SEP> . <SEP> .... <SEP> 0,05 <SEP> /o
<tb> Agar,agar <SEP> Bacto <SEP> 1,5 <SEP> 0/0
<tb> Eau <SEP> distillée, <SEP> q.s. <SEP> pour <SEP> ... <SEP> .. <SEP> . <SEP> 100 <SEP> %
<tb> Ajustement <SEP> du <SEP> pH <SEP> par <SEP> KOH
<tb> à <SEP> 50 <SEP> % <SEP> . <SEP> .. <SEP> .. <SEP> . <SEP> 7,0 <SEP> 0/0
<tb> pH <SEP> après <SEP> stérilisation <SEP> 7,1 <SEP> 0/0
<tb> <I>Streptomyces <SEP> aureofaciens</I>
<tb> <I>Souche <SEP> S-604 <SEP> Souche <SEP> A-377</I>
<tb> Croissance <SEP> .
<SEP> Abondante, <SEP> cou- <SEP> Assez <SEP> abondante
<tb> leur <SEP> <SEP> Venetian
<tb> red <SEP> <SEP> ( )
<tb> Hyphes <SEP> aériens <SEP> Abondants, <SEP> Blancs, <SEP> unifor blanc <SEP> à <SEP> <SEP> Rose <SEP> mes
<tb> grey <SEP> <SEP> ( )
<tb> Sporulation <SEP> Légère, <SEP> deve- <SEP> Aucune
<tb> nant <SEP> abondante
<tb> Pigment <SEP> diffusible <SEP> Brun <SEP> rougeâtre <SEP> Jaune
<tb> Envers <SEP> <SEP> Bmown <SEP> Maho- <SEP> Jaune <SEP> à <SEP> jaune
<tb> gany <SEP> <SEP> ( ) <SEP> orange <SEP> clair
<tb> ( ) <SEP> Désignation <SEP> des <SEP> nuances <SEP> d'après <SEP> le <SEP> <SEP> Color <SEP> H@ar mony <SEP> Manual <SEP> <SEP> 3e <SEP> édition, <SEP> édité <SEP> par <SEP> Container
<tb> Corporation <SEP> of <SEP> America.
EMI0002.0079
<I>2. <SEP> Dextrine, <SEP> Czapek-Dox, <SEP> agar-agar</I>
<tb> Dextrine <SEP> 1,0 <SEP> 0/0
<tb> NaN03 <SEP> ....... <SEP> 0,2 <SEP> 0/0
<tb> K.HP04 <SEP> 0,1 <SEP> %
<tb> MgSO,. <SEP> 7H.0 <SEP> 0,05 <SEP> lo
<tb> KCl <SEP> ... <SEP> 0,05 <SEP> %
<tb> FeSO4. <SEP> 7H.0 <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> <B>0,001%</B>
<tb> Agar-agar <SEP> Bacto <SEP> .. <SEP> 1,5 <SEP> %
<tb> Eau <SEP> distillée, <SEP> q:s. <SEP> ,pour <SEP> . <SEP> 100,0 <SEP> %
<tb> pH <SEP> après <SEP> .stérilisation <SEP> 7;
0 <SEP> 0/0
<tb> <I>Streptomyces <SEP> aureofaciens</I>
<tb> <I>Souche <SEP> S-604 <SEP> Souche <SEP> A-377</I>
<tb> Croissance <SEP> Rare,hyagine <SEP> Profuse
<tb> Hyphes <SEP> .aériens <SEP> Absents <SEP> Abondants,
<tb> <SEP> lead <SEP> grey <SEP> <SEP> ( )
<tb> Globules <SEP> su perficiels <SEP> inco lores
<tb> Sporulation <SEP> Aucune <SEP> Abondante
<tb> Pigment <SEP> diffusible <SEP> Aucun <SEP> Léger, <SEP> jaune
<tb> pâle
<tb> Envers <SEP> _.--.-<B>------- <SEP> ----</B> <SEP> Non <SEP> pigmenté <SEP> Non <SEP> pigmenté
<tb> ( ) <SEP> voir <SEP> note <SEP> précédente
EMI0003.0001
<I>3. <SEP> Liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> maïs, <SEP> agar-agar</I>
<tb> Liqueur <SEP> ide <SEP> macération <SEP> de <SEP> maïs <SEP> 0,4 <SEP> %
<tb> Sucrose <SEP> ---- <SEP> --..
<SEP> -- <SEP> - <SEP> 1,0 <SEP> % <SEP> Sporulation <SEP> Très <SEP> abondante, <SEP> Très <SEP> abondante,
<tb> MgS04. <SEP> 7H0 <SEP> 0,025% <SEP> uniforme <SEP> uniforme
<tb> KH204 <SEP> ...-. <SEP> <B>-------</B> <SEP> -.. <SEP> -..-.-..- <SEP> . <SEP> -..- <SEP> ..-- <SEP> 0,2 <SEP> %
<tb> (NlÎ4)2HP04 <SEP> --..----.--........0,2 <SEP> % <SEP> Pigment <SEP> diffusible <SEP> Très <SEP> concentré, <SEP> jaune <SEP> verdâtre
<tb> A.gar-agar <SEP> Bacto <SEP> .-. <SEP> . <SEP> . <SEP> ... <SEP> 2,0 <SEP> % <SEP> deep <SEP> brown <SEP> clair
<tb> Eau <SEP> du <SEP> robinet, <SEP> q.s.
<SEP> .pour <SEP> __ <SEP> 100,0 <SEP> % <SEP> à <SEP> deep <SEP> brown
<tb> pH <SEP> après <SEP> stérilisation <SEP> -- <SEP> - <SEP> 6,3 <SEP> /o <SEP> Mahogany
<tb> <I>Streptomyces <SEP> aureofaciens</I> <SEP> Envers <SEP> <B>-------</B> <SEP> Brown <SEP> Covert <SEP> Brown
<tb> <I>Souche <SEP> S-604 <SEP> Souche <SEP> A-377</I>
<tb> Mahogany <SEP> (C )
<tb> Croissance <SEP> <B>---------</B> <SEP> . <SEP> Profuse <SEP> Profuse <SEP> foncé <SEP> ( )
<tb> Hyphes, <SEP> aériens. <SEP> - <SEP> Abondants <SEP> Abondants,
<tb> rose,taupe <SEP> ( ) <SEP> Beaver
<tb> foncé <SEP> ( ) <SEP> voir <SEP> notes <SEP> précédentes
<tb> <I>4.
<SEP> Autres <SEP> milieux</I>
<tb> <I>Streptomyces <SEP> aureofaciens</I>
<tb> <I>Souche <SEP> S-604 <SEP> Souche <SEP> A-377</I>
<tb> Agar@agar <SEP> nutritif <SEP> Croissance <SEP> médiocre, <SEP> <SEP> Taupe <SEP> brown <SEP> <SEP> à <SEP> Croissance <SEP> assez <SEP> abondante. <SEP> Pas <SEP> d'hyphes
<tb> <SEP> dark <SEP> brown <SEP> <SEP> ( ). <SEP> Pas. <SEP> d'hyphes <SEP> aé- <SEP> aériens. <SEP> Envers <SEP> :
<SEP> jaune <SEP> pâle. <SEP> Pigment <SEP> so riens. <SEP> Envers <SEP> <SEP> Taupe <SEP> brown <SEP> <SEP> ( ). <SEP> Pig- <SEP> luble <SEP> jaune <SEP> à <SEP> jaune <SEP> brunâtre <SEP> clair
<tb> ment <SEP> soluble <SEP> brun <SEP> rougeâtre
<tb> Glucose, <SEP> asparagine, <SEP> Croissance <SEP> abondante. <SEP> Gros <SEP> hyphes <SEP> aé- <SEP> Croissance <SEP> assez <SEP> abondante. <SEP> Hyphes <SEP> aé extrait <SEP> de <SEP> viande, <SEP> riens <SEP> bigarrés: <SEP> <SEP> rose <SEP> taupe <SEP> <SEP> à <SEP> <SEP> Fawn <SEP> <SEP> riens <SEP> blancs <SEP> devenant <SEP> de <SEP> plus <SEP> :en <SEP> plus
<tb> agar-agar <SEP> ou <SEP> <SEP> carcel <SEP> <SEP> ( ). <SEP> Sporulation: <SEP> abon- <SEP> gris <SEP> quand <SEP> la <SEP> formation <SEP> de <SEP> isporcs <SEP> aug dante. <SEP> Envers:
<SEP> <SEP> Taupe <SEP> brown <SEP> <SEP> ( ). <SEP> Pig- <SEP> mente. <SEP> Envers: <SEP> Jaune <SEP> clair. <SEP> Pigment <SEP> so m,ent <SEP> soluble <SEP> brun <SEP> rougeâte <SEP> luble <SEP> jaune <SEP> clair
<tb> Pomme <SEP> de <SEP> .terre <SEP> Croissance <SEP> profuse <SEP> humide, <SEP> lisse, <SEP> modulée <SEP> : <SEP> Croissance <SEP> profuse <SEP> lisse, <SEP> humide, <SEP> nodu < <SEP> Dark <SEP> brown <SEP> Mahogany <SEP> <SEP> ( ) <SEP> avec <SEP> trace <SEP> iée <SEP> : <SEP> <SEP> Light <SEP> Mellon <SEP> Yellow <SEP> <SEP> ( ) <SEP> à <SEP> <SEP> An de <SEP> <SEP> peach <SEP> tan <SEP> <SEP> ( ). <SEP> Hyphes <SEP> aériens <SEP> : <SEP> tique <SEP> . <SEP> rose <SEP> <SEP> ( ). <SEP> Hyphes <SEP> aériens <SEP> :
<SEP> trace.
<tb> absents <SEP> à <SEP> abondants, <SEP> devenant <SEP> blancs <SEP> à <SEP> Pas <SEP> de <SEP> pigment <SEP> soluble
<tb> <SEP> carcel <SEP> <SEP> .( ). <SEP> Sporulation <SEP> abondante
<tb> dans <SEP> les <SEP> zones <SEP> de <SEP> fonte <SEP> formation <SEP> d'hy phes <SEP> aériens. <SEP> Pigment <SEP> soluble <SEP> <SEP> choco late <SEP> <SEP> ( ) <SEP> à <SEP> <SEP> chocodate <SEP> brown <SEP> <SEP> ( )
<tb> Lait <SEP> pourpre <SEP> Léger <SEP> collier <SEP> de <SEP> croissance <SEP> <SEP> Deep <SEP> red <SEP> Léger <SEP> collier <SEP> de <SEP> croissance <SEP> blanc <SEP> à <SEP> jaune
<tb> Mahogany <SEP> <SEP> ( ). <SEP> Peu <SEP> de <SEP> variation <SEP> nota- <SEP> pâle.
<SEP> Peu <SEP> de <SEP> variation <SEP> notable <SEP> du <SEP> pH,
<tb> ble <SEP> du <SEP> pH, <SEP> peu <SEP> de <SEP> peptonisation <SEP> appa- <SEP> peu <SEP> de <SEP> peptonisation <SEP> apparente <SEP> en <SEP> 15
<tb> rente. <SEP> Légère <SEP> réaction <SEP> colorée <SEP> faussement <SEP> jours
<tb> alcaline <SEP> due <SEP> à <SEP> la <SEP> diffusion <SEP> du <SEP> pigment
<tb> soluble
<tb> ( ) <SEP> voir <SEP> -notes <SEP> précédentes Sur tous les agar-agars,excepté dextrine Czapek- Dox, mais y compris la culture inclinée sur pomme de terre, le S.
aureofaciens souche S-604 produit une pigmentation foncée caractéristique, apparaissant gé néralement avec la croissance. De même, il :est facile d'observer le pigment caractéristique soluble brun rougeâtre.
EMI0004.0010
<I>5. <SEP> Observations <SEP> microscopiques</I>
<tb> <I>Streptomyces <SEP> aureofaciens</I>
<tb> <I>Milieu <SEP> Souche <SEP> S-604 <SEP> Souche <SEP> A-377</I>
<tb> <I>Mycélium <SEP> Spores <SEP> Mycélium <SEP> Spores</I>
<tb> Glycérol, <SEP> asparagine, <SEP> Sinueux, <SEP> continu, <SEP> Sphéroïdaux <SEP> à <SEP> ovoï- <SEP> Sinueux, <SEP> continu, <SEP> Sphér6ïdaux <SEP> à <SEP> ovoï extrait <SEP> de <SEP> b#uf, <SEP> ramifié. <SEP> Diamètre <SEP> Baux. <SEP> Diamètre <SEP> ramifié. <SEP> Diamètre <SEP> daux. <SEP> Diamètre
<tb> agar-agar <SEP> 0,8 <SEP> à <SEP> > <SEP> 1,0 <SEP> mi- <SEP> 1,5 <SEP> - <SEP> 2,0 <SEP> microns <SEP> 0,7à <SEP> > <SEP> 1,0 <SEP> micron <SEP> 1,5 <SEP> - <SEP> 2,0 <SEP> microns
<tb> :cron
<tb> Liqueur <SEP> de <SEP> macéra- <SEP> Sinueux, <SEP> :
continu, <SEP> Sphéroïdaux <SEP> -à <SEP> ovoï- <SEP> Sinueux, <SEP> continu, <SEP> Sphéroïdaux <SEP> à <SEP> 0voï tion <SEP> de <SEP> maïs, <SEP> agar- <SEP> ramifié. <SEP> Diamètre <SEP> daux. <SEP> Diamètre <SEP> ramifié. <SEP> Diamètre <SEP> daux. <SEP> Diamètre
<tb> agar <SEP> 0,8 <SEP> à <SEP> > <SEP> 1,0 <SEP> mi- <SEP> 1,5 <SEP> à <SEP> 2,0 <SEP> microns <SEP> 0,8à <SEP> > <SEP> 1,0 <SEP> micron <SEP> 1,5 <SEP> - <SEP> 2,0 <SEP> microns
<tb> cron La morphologie du mycélium et des spores pour la souche S-604 est apparemment :similaire à celle observée pour la souche A-377.
Les deux souches montrent un mycélium continu, sinueux, ramifié, avec tendance occasionnelle des hyphes aériens à la spira- lisation. Les spores caractéristiques sont ovoïdaux à sphérdïda:ux.
Pour illustrer les variations de couleur parmi les différentes souches de S. aureofaciens qui produisent les déméthyltétracyclines, on :a cultivé quatre souches sélectionnées sur de l'agar-agar avecliqueur de macé ration de maïs, et on a fait les observations sui vantes
EMI0004.0027
<I>Observations <SEP> de <SEP> couleur <SEP> (0)</I>
<tb> <I>Streptomyces <SEP> aureofaciens</I>
<tb> <I>Agar-agar <SEP> avec <SEP> liqueur <SEP> de <SEP> macération</I>
<tb> <I>de <SEP> mais <SEP> (AP4)
</I>
<tb> <I>Incubation <SEP> 4 <SEP> jours <SEP> à <SEP> <B>270C</B></I>
<tb> <I>Souche <SEP> Colonies <SEP> isolées <SEP> Croissance</I>
<tb> <I>en <SEP> masse</I>
<tb> S-604M1 <SEP> <SEP> Deep <SEP> red <SEP> Maho- <SEP> <SEP> Deep <SEP> .red <SEP> Maho gany <SEP> <SEP> gany <SEP>
<tb> S-1071 <SEP> <SEP> Cepper <SEP> brown <SEP> <SEP> <SEP> Deep <SEP> brown
<tb> Mahogany <SEP> <SEP> à
<tb> <SEP> Red <SEP> Mahogany <SEP>
<tb> V-62 <SEP> Large <SEP> zone <SEP> margi- <SEP> <SEP> Light <SEP> copper
<tb> hale <SEP> <SEP> peach <SEP> tan<B> </B> <SEP> brown <SEP>
<tb> devenant <SEP> <SEP> light
<tb> copper <SEP> brown <SEP>
<tb> au <SEP> centre <SEP> de <SEP> la
<tb> colonie
<tb> B-740 <SEP> <SEP> Dark <SEP> Wine <SEP> <SEP> < <SEP> Burgundy <SEP>
<tb> (o) <SEP> couleurs <SEP> suivant <SEP> l'ouvrage <SEP> déjà <SEP> cité.
Une méthode relativement simple pour sélec tionner une souche de<I>S.</I> aureofaciens capable de produire les nouveaux .antibiotiques consiste à choi sir une :souche de<I>S.</I> aureofaciens qui présente des ; colonies marron foncé quand on la cultive sur un milieu d'agar-agar et de liqueur de macération de maïs. On prépare des inocula avec ces colonies et on conduit une fermentation comme expliqué dans les exemples 1 .et 2 ci-après.
A la fin de la période de fermentation, on acidifie une :certaine quantité de la liqueur de fermentation à un pH voisin de 1,5 pour solubiliser l'antibiotique .et on filtre pour obtenir une solution aqueuse limpide. On place une ou deux gout tes du filtrat sur une bande de papier et on les chro- matographie par les méthodes ordinaires de dévelop- pement chromatographique. On utilise comme solvant du butanol équilibré avec -un tampon phosphate aqueux 0,3M,au pH 3.
On développe les bandes de papier par chromatographie descendante avec la phase solvant du mélange équilibré. L'emplacement des taches correspondant à l'antibiotique est facile à déterminer par inspection aux rayons ultraviolets. Une autre méthode plus sensible, consiste à placer la bande sur un plateau d'agar-agar ensemencé avec des micro-organismes sensibles aux antibiotiques tels que le Bacillus cereus ou le<I>Bacilles</I> subtilis, et à faire incuber les plateaux.
Des zones .d'inhibition apparais sent dans les régions correspondant aux taches d'anti biotiques. La comparaison des taches<I>avec</I> des échan tillons témoins d'antibiotique pur et les indices Rf donnés ci-après, fournissent une base pour détecter la -présence du nouvel antibiotique dans la liqueur fermentée, et une base semi-quantitative pour déter miner la quantité présente.
On peut :donner une illustration de cette technique à l'aide de la fig. 1 du dessin qui montre comment la chromatographie sur bande de papier peut séparer et détecter les diverses tétracyclines et les ,produits de la présente invention. Le dessin représente une bande de papier 1, sur laquelle on a placé, au point 2, une petite quantité d'une solution d'antibiotique contenant de la tétracycline,
@de la chlorodéméthyl- tétracycline, de la déméthyltétracycdine et de la cholrodéméthyltétracycline. L'activité antibiotique to tale de la solution placée au point 2 est de 30 micro- grammes, exprimée en ;tétracycline. On développe alors les bandes de papier comme décrit plus haut. Au bout d'un certain temps, on examine les bandes aux rayons ultraviolets, avec les résultats indiqués sur le dessin.
Le front du solvant s'est avancé jusqu'au point indiqué par le trait plein, 3. Le constituant tétracycline de la .solution mixte d'antibiotiques s'est avancé jusqu'au point 5 .et la chlorotétracycline s'est avancée jusqu'au .point 7. Le nouvel antibiotique, dé- méthyltétracyclin:e, s'@est avancé jusqu'au point 4, et l'antibiotique chlorodéméthyltétracycline se trouve au point 6.
Les indices Rf de ces antibiotiques sont aussi indiqués sur le .dessin. L'indice Rf ,est par défi nition la distance entre la tache et le point d'origine 2, divisée par la distance entre le front de solvant 3 et l'origine 2, et bien entendu il est toujours inférieur à 1.
On peut utiliser divers systèmes solvants pour ob tenir une série d'indices Rf pour tel ou tel antibioti que particulier, et ces indices sont considérés comme très précieux pour identifier les antibiotiques et les distinguer :d'autres.
Les indices Rf de quelques tétracyclines, quatri- mycines et déméthyltétracyclines dans deux systèmes solvants précis sont indiqués dans le .tableau suivant
EMI0005.0053
Acétate <SEP> d'éthyle <SEP> <B>pH <SEP> 4,7,</B> <SEP> 90/10
<tb> tampon <SEP> chloroforme%butanol,
<tb> Antibiotique <SEP> citratep#ho@sphate <SEP> H3P04 <SEP> aqueux
<tb> (Mac <SEP> Elvain) <SEP> 0,3M <SEP> -I- <SEP> 0,1 <SEP> %
<tb> acide <SEP> trichlozacétique,
<tb> pH <SEP> 1,9
<tb> Chlorotétracycline <SEP> .. <SEP> ... <SEP> . <SEP> <B>0,76-0,80</B> <SEP> 0,61
<tb> Bromotétracycaine <SEP> <B>.... <SEP> 0,76-0,80 <SEP> 0,61</B>
<tb> Tétracycline <SEP> . <SEP> ..
<SEP> ... <SEP> ... <SEP> .. <SEP> . <SEP> <B>......... <SEP> ...</B> <SEP> 0,46-0,47 <SEP> 0,20
<tb> Quatrimycine <SEP> ........ <SEP> . <SEP> .. <SEP> .. <SEP> ... <SEP> ..... <SEP> 0,14-0,16 <SEP> 0,12
<tb> Chloroqnatrimycine <SEP> . <SEP> .... <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> <B>0,27-0,28</B> <SEP> 0,33
<tb> B.romoquatrimycine <SEP> <B>0,27-0,28</B> <SEP> 0,33
<tb> Oxyquatrimycine <SEP> .. <SEP> . <SEP> . <SEP> <B>0,00-0,06</B> <SEP> 0,11
<tb> Chlorodéméthyltétracycline <SEP> . <SEP> .. <SEP> <B>0,68-0,72</B> <SEP> 0,39
<tb> Déméthyltétracycline <SEP> 0,27 <SEP> 0,22
<tb> Epichlo#rodéméthydtétracycline <SEP> <B>0,25-0,27</B> <SEP> 0,20
<tb> Epidéméthyltétracycline <SEP> 0,09 <SEP> 0,10 Plusieurs souches de S.
aureofaciens qui produi sent le nouvel antibiotique ont été déposées à d'ARne- rican Type Culture Collection, à Washington. Elles sont cataloguées sous les Nos ATCC 12 551, 12 552, 12 553 et 12 554.
Il est entendu que des mutantes, produisant aussi les nouveaux.antibiatiques peuvent être tirées de ces souches par des méthodes couran tes, et en fait il faut s'attendre à ce que certaines. d'entre elles possèdent la propriété de produire des rendements plus élevés d'un ou plusieurs des nou veaux antibiotiques, dans des conditions favorables. Ces mutants peuvent varier quelque peu quant à leurs caractéristiques morphologiques générales,
de même que les diverses souches de l'espèce<I>S.</I> aureo- faciens. On s'attend aussi à ce que d'autres souches de<I>S.</I> aureofaciens productrices de déméthyhétracy- cline puissent être trouvées @dans la nature et puis sent "être créées à partir des .souches actuellement iso lées de<I>S.</I> aureofaciens qui ne produisent pas. ce non vol antibiotique.
L'un des avantages les plus importants de la dé méthykétracycline sur les tétracyclines décrites anté rieurement est sa stabilité accrue en milieu acide et alcalin. L'insta#bilté de la tétracycline en milieu acide et l'instabilité d @e la chlorotétracycline en milieu alca- Un sont bien, connues. La déméthyltébracyclinie ne perd qu',
environ 33 0/0 de son activité dans l'acide chlorhydrique II à 100o C en 6 mn. Dans la soude 0,1N ,à 500 C, la déméthyltétracycli.ne a une demi-vie d@environ 20 heures, contre 3,3 heures pour la tétra cycline.
Ces propriétés inattendues sont très précieu ses, étant donné que l'instabilité de la tétracycline en milieu acide et l'instabilité de la chlorotétracycline en milieu .alcalin limitent ou empêchent complètement l'emploi de ces substances précieuses dans de nom breuses applications.
Grâce -à la stabilité bien meil- Jeure des nouveaux antibiotiques, il est possible de préparer de nombreux produits pharmaceutiques qui ne pouvaient pas être préparés de façon satisfaisante avec .les tétracyclines.
La stabilité accrue permet aussi d'améliorer les procédés de récupération et de raffinage, car on peut avoir recours à des conditions plus rigoureuses de pH et de température, .et on peut donc améliorer l'efficacité -de .diverses étapes du pro cédé.
On a comparé la déméthyltétracycline avec les tétracyclines dans des tests<I>in vivo,</I> et on a trouvé qu'il n'y a pas de différence appréciable ,dans l'acti vité antibactérienne des déméthyltétracyclines en comparaison de leurs analogues tétracycline. On en conclut donc que 1e nouvel antibiotique peut servir au traitement des mânes maladies, de la même façon générale que les tétracyclines actuellement :employées.
Les spectres d'absorptions d'ultraviolet des tétra- cyclines et la déméthyltétracycline sont très simi laires.
On voit une comparaison des spectres d'absorp- don d'ultraviolet des tétracyclines :dans <B>la</B> tableau<B>1,</B> qui indique les coefficients d'extinction Ei @m (absorp- tion spectrophotométrique d'une solution à 1 % me surée dans une cellule de 1 cm)
mesurés au maxima et aux minima des minima des différents antibioti ques. On a calculé les valeurs d'après les courbes d'absorption d'ultraviolet, en corrigeant à 1<B>()/0</B> les concentrations auxquelles on a fait les essais. Tous les échantillons ont été mesurés dans. une solution de H2SO4 O,1N.
Les spectres d'absorptions d'infrarouge .de quel ques produits nouveaux :sont représentés sur les .au tres figures du dessin. La fig. 2représente la compa raison des spectres d'absorption, d'infrarouge de la tétracycline base libre et ide ,la d:
éméthyltétracycline base libre. Comme on ale voit, il y a plusieurs diffé- rences nettes, et aussi des similitudes. La fig. 3 montre le spectre d'absorption d'infrarouge du chlor- hydrate d'épichlorodéméthyltétracycline. Ces courbes ont été obtenues sur un spectrophotomètre @automati- que enregistreur à infrarouge <RTI
ID="0006.0068"> Perkin-Elmer modèle 21, avec les ,antibiotiques en phase solide, comprimés en un disque avec KBr. Voici d'autres données prisme - NaCI ; résolution - 2 ; réponse - 1 - 1 ; gain 5 ; vitesse 1/2 ; suppression - 2 ; et échelle:<B>50,8</B> mm pour un micron.
Diverses méthodes ont été mises au point pour titrer les tétracyclines, et certaines d'entre elles peu vent servir à titrer les ,déméthyltétracyclines, avec bien entendu des modifications.
L'épidé#méthyltétracyrlinc de la présente inven tion est considérée comme un isomère de la dém6thyl- tétracycline. La différence structurale semble être basée sur un réarrangement du groupe diméthyl- amine sur l'atome <B>d</B>e carbone en position 4.
Appa remment, .dans certaines conditions qui :seront décrites plus en détail ci-après, l'inversion se produit st on obtient un :mélange à l'équilibre de démébhylt6tra- cycline et -de son épinière. On peut séparer les deux pour obtenir des produits pratiquement purs.
On peut convertir la déméthyltétracycline en sa forme isomère en ajustant simplement le pH d'une
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solution concentrée de l'antibiotique entre 3,0 et 5,0 et en, laissant reposer la solution jusqu'à ce que l'iso mérisation soit parvenue à un équilibre.
Les condi- tions les plus importantes qu'il est nécessaire de régler pour convertir da -déméthyltétracycline @en ses iso mères sont la concentration, le pH, le temps et la température.
Le plus commode est -de réaliser l'isomérisation à la température ambiante, ruais à des températures plus élevées, on obtient un taux de conversion plus <I>élevé. Le pH</I> doit être compris -entre 3,0 et 5,0 envi ron, de préférence entre 3,5 @et 4,5. Il se produit une certaine é:pimérisation à .des pH sortant de cet inter- valle, et même dans l'eau distillée<B>;</B> mais la vitesse est très faible.
La concentration de l'antibiotique dans la solution -aqueuse doit être aussi élevée que possible si l'on vent obtenir des vitesses d'épimérisiation plus grandes. rL'équilibrage complet peut nécessiter une durée d'environ 24 heures à<B>250</B> C, mais on peut obtenir un équilibrage satisfaisant en un temps beau- coupplus court dans des conditions déterminées. Or dinairement toutefois, on obtient les meilleurs résul tats en laissant reposer la solution pendant des durées d'une semaine ou davantage.
Il semble que l'équilibre soit atteint, dans la plupart des cas, à 50 0/0environ ; autrement dit, à l'équilibre la moitié environ de la déméthyltétracycline est convertie .en épimère.
Etant donné que la concentration est un facteur important pour obtenir des rendements élevés en de courts laps de temps, il faut choisir un système sol vant qui donne la plus forte concentration de dé- mé thyltétracycline. Il faut tamponner ces systèmes solvants pour obtenir un pH compris dans l'inter valle préférentiel.
Les divers solvants comprennent le méthanol, l'éthanol, le butanol, l'facétone, le 2-éthoxy- éthanol, le 2-méthoxypropanol, le tétrahydrofurrane, la diméthylformamide et les mélanges de ces solvants. On peut utiliser d'autres solvants encore.
Un -tampon préférentiel est le phosphate monoso@dique, mais. on peut utiliser d'autres tampons et couples de tampons qui maintiennent le pH dans l'intervalle désiré.
On peut récupérer ll'épimère de la présente inven tion à partir d'une ,solution aqueuse, rde la même façon générale que l'on récupère .les .tétracyclines. Bien qu'il ait une activité antibactérienne, <I>in vitro</I> et <I>in vivo,</I> légèrement inférieure à celle de la déméthyl- tétracycline, l'épimère est encore :
très utile -dans le traitement des maladies causées par les bactéries, grâce à son activité antibactérienne appréciable.
Comme on pourrait .s'y attendre, le déméthyl- tét:racycline forme des sels et des complexes du même type, et de la même façon générale, que -les tétra cyclines. Le traitement par les acides à un pH infé rieur à 4 environ aboutit à la formation de sels d'aci des.
On peut obtenir la base libre à un pH de 4 à 6 environ; et aux pH supérieurs à 6, on obtient !des sels avec des bases, par exemple le sel de ,calcium. De même, on forme des sels des épimères.
Comme on l'a indiqué @précédemment, le procédé de la présente invention pour da préparation de la déméthyltétracycline se distingue notamment du Pro cédé de préparation ;
de la chlorotétracycline, de la tétracycline et de la bromotétracycline, par le fait que l'on choisit une souche mutante de<I>S.</I> aureofaciens qui produit la déméthyltétracycline au lieu de l'une des tétracyclines. La composition du milieu de fer- mentation, la durée d'aération, la température, le réglage des ions d'hydrogènes, la méthode d'inocula tion, etc., utilisés lors :
de la production de chlor- tétracycline, -de bromtétracycline et de tétracycline se prêtent également pour la production :de da nou velle déméthyltétracycline.
Afin que lie processus de fermentation suivant l'invention puisse être plus complètement compris, on le ,décrira maintenant en se référant aux exemples .précis qui suivent <I>Exemple 1</I> On peut préparer un milieu .approprié pour la préparation d'inocula destinés à ces fermentations, avec les substances suivantes sucrose 30 g/1 (NH4)
2S04 .. ... .. .......... 2 g/1 CaC03 .... <B>------ .............</B> ..... .............. 7 g/1 ;liqueur de macération de mais .-.--- 16,5 cm3/1 Le pH du milieu ainsi obtenu ,est d'environ 6,8.
On mesure une portion de 8 cana que l'on introduit dans un tube B.rewer de 20 cm, et on stérilisé à 1200 C pendant 20 minutes. On inocule alors le milieu stéri lisé avec 0,5 cms d'une suspension aqueuse de spores d'une souche de<I>S.</I> aureofaciens capable de produire de la chlorodéméthyitétracycline, par .exemple la sou che S-604,
la suspension contenant environ 40 - 60 millions de spores par cm3. On fait incuber le milieu inoculé pendant 24 heures à<B>280</B> C, sur une ;secoueuse alternative fonctionnant à 110 cycles par minute.
Un milieu de fermentation ,approprié contient de l'eau et un milieu typique qui convient pour produire de la chloro:déméthyltétracycline est de suivant
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amidon <SEP> de <SEP> maïs <SEP> 55 <SEP> g/1
<tb> CaC03 <SEP> ._<B>-</B> <SEP> ....... <SEP> ...... <SEP> ... <SEP> 57 <SEP> g/1
<tb> (NH4)2S04 <SEP> .... <SEP> . <SEP> .. <SEP> ... <SEP> <B>---- <SEP> -------</B> <SEP> 5 <SEP> g/1
<tb> FeS04. <SEP> 7H20 <SEP> .. <SEP> ....... <SEP> ...... <SEP> . <SEP> 40 <SEP> mg/1
<tb> MnS04. <SEP> 4H20 <SEP> ....... <SEP> . <SEP> . <SEP> _ <SEP> <B>....... <SEP> <I>50</I></B> <SEP> mg/1
<tb> ZnS04. <SEP> 7<B>1-1</B>20 <SEP> .100 <SEP> mg/1
<tb> CoC12. <SEP> 6H20 <SEP> ..... <SEP> ...........
<SEP> 5 <SEP> mg/1
<tb> liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> maïs <SEP> _ <SEP> 30 <SEP> g/1
<tb> farine <SEP> de <SEP> graine <SEP> de <SEP> coton <SEP> .... <SEP> .... <SEP> . <SEP> .... <SEP> 2 <SEP> g/1
<tb> huile <SEP> de <SEP> saindoux <SEP> .. <SEP> . <SEP> .... <SEP> . <SEP> . <SEP> .. <SEP> 2,0%
<tb> en <SEP> volume Quand on restreint la teneur de ce milieu en ions chlorure, cela tend à augmenter la quantité ide dé- m6thyltétracycline aux dépens de la production de chlorordéméthyltébracychne.
<I>Exemple 2</I> On prépare un milieu d'inoculation comme décrit à l'exemple 1 et on l'inocule avec des .spores d'une race de<I>Streptomyces</I> aureofaciens productrice de dé- méthyltétracycline. On laisse incuber cet inoculat pendant 24 heures à 28 C dans un agitateur de culture à mouvement alternatif.
On prépare un milieu de fermentation contenant farine de maïs . .. ... . .. . 14,5 g/1 amidon de maïs<B>-------</B> .. .... <B>----</B> ........... 47,5 g/1 liqueur de macération du maïs à 50 % de matières solides----- . 22,5 g/1 9,0 g/1 (NH4)2S04 .....<B>--------------------------</B> .<B>------</B> .5,85 g/1 NH4Cl <B>---------------</B> ..<B>-----</B> .. <B>--------------</B> ....... . .
1,66 g/1- MnS04 (70 %)<B>------------------------------ -</B> .. 56 mg/1 COCI2 - 5H20 _.--------- ... .<B>-------</B> .. ._.. 5 mg/1 huile de lard<B>----------------</B> ....------ _ . 25 mil/1 Ce milieu est réparti à raison -de 30 ml chacun dans -des flacons d'Erlenmeyer de 250 ml.
On bouche les flacons avec des tampons d'ouate et les stérilise pendant 20 minutes à 121c) C. Après refroidissement, les flacons stérilisés sont inoculés avec 1 m1 de l'ino- culat, incubé pendant 24 heures, de la race décrite ci-dessus. Les flacons de fermentation inoculés sont soumis à une incubation dans un agitateur de culture à mouvement .rotatif, à une température ne dépassant pas 280 C. On laisse la fermentation -se poursuivre pendant 140 heures.
Un échantillon de ce bouillon fermenté est alors analysé quant â sa teneur en Chloro- tétracycline, en :se servant de la méthode, décrite dans cette !demande, consistant à mesurer le changement d'absorption dans l'ultraviolet avant et après dégrada tion alcaline. La .teneur calculée .en chlorotétracycline est inférieure à 40,y/ml, dest,à-,dire à la sensibilité garantie de cette méthode d'analyse.
Par chromato graphie sur papier du bouillon fermenté, on ne trouve que des .traces de chlorotétracycline. Par la ânéthodc d'analyse spectrophotométrique @décrite dans cette demande,
on trouve une teneur en déméthylchloro- tétracycline et déméthyltétracycline correspondant à 2090 y/ml. La chromatographie sur papier montre que ces deux déméthyltétracyclines se trouvent en proportions à peu près égales.
<I>Exemple 2a</I> On prépare un milieu d'inoculation comme dans l'exemple 1 :et on l'inocule ,avec des spores d'une race différente de<I>S.</I> aureofaciens productrice de déméthyl- tétracycline. Cet inoculat est incubé comme décrit à l'exemple 1.
On prépare un milieu de fermentation contenant: farine de mais ..<B>------------------ .....</B> . . 67,0 g/1 liqueur de macération du maïs à 50 % de matières solides. 25,0 g/1 CaCO3 pulvérisé .... ... .. ........ <B>-----</B> 9,0 g/1 (NH4)2S04 ......... ....... .. ..... <B>---- 6,75</B> g/1 4 2,
0 g/1 MnS04 (70 %) ._..- . .. ..... ... ._ 100 mg/1 CoC12. 6H20 ......... ... ... 5 mg/1 huile de lard .<B>--------</B> ... . ... ....... 30 m1/1 Cc milieu -est traité, inoculé et incubé comme dans l'exemple 2.
Le bouillon récolté est analysé aussi bien par spectrophotométrie que par chromato graphie sur papier. La chromatographie sur papier ne permet pas ide ,déceler la présence de chlorotétracy- cline. L'analyse spectrophotométrique donne une te neur totale en déméthyltétracycline de 1430 yAnl, dont 300 y/ml de déméthylchlorotétracycline. Par chromatographie sur papier, on s'assure que le reste de la totalité des substances antibiotiques est formé de déméthyltétracycline,
dont la teneur calculée par différence est de 1130 y/ml.
<I>Exemple 2b</I> On effectue une fermentation dans les conditions décrites à l'exemipel 2, sauf que l'on utilise une race différente ide S. aureofaciens productrice de déméthyl- tétracycline comme agent de fermentation et que le milieu de fermentation contient farine de maïs . .. .. 16,9 g/1 amidon<B>de</B> maïs .
66,42 g/1 liqueur de macération idumaïs, à 50 % de matières sodi@des . 27,5 g/1 CaCO3 pulvérisé 11,43 g/1 (NH4)2S04 9,0 g/1 NH4Cl ..... ....... ....... 2,0 g/1 MnS04 (70%) .. . .. 160 mg/1 CoCl2.6H20 5 mg/1 huile de lard ... ... ..
33,3 m1/1 On laisse la fermentation se poursuivre pendant 140 heures. Comme l'indique la chromatographie sur papier, le bouillon de fermentation ne contient que de la déméthyltétracycline. Un essai biologique du bouillon révèle une teneur en déméthyltétracycline correspondant à 810 ;,/ml, vis-à-vis du staphylo- coccus aureus.
<I>Exemple 3</I> Fermentation <I>eh cuve</I> On conduit une fermentation de 40 litres dans une cuve pilote, essentiellement suivant la méthode décrite à l'exemple 2. Après avoir préparé 'le milieu, on le stérilise pendant 25 minutes à 125c C et on l'inocule avec un inoculum de souche S-604 préparé comme indiqué par Duggar, brevet des Etats-Unis d'Amérique No 2482055. On conduit la fermenta tion avec agitation continue à une température de 280 C pendant les 24 premières heures, et 25(, C jus qu'à achèvement, .en 135 heures.
On introduit de l'air stérile à raison ide 0,3 1/1/mn pendant les seize premières heures, puis .à raison de 0,51/1/mn jusqu'à la récolte.
Les exemples suivants illustrent la récupération, le raffinage et la séparation des antibiotiques. <I>Exemple A</I> <I>Raffinage de la</I> chlorodéméthyltétracycline <I>et de la</I> défnétlayltétracycline On prépare 25,81itres de liqueur comme dans l'exemple 3, on les traite par 200 cm2 d'acide chlor hydrique concentré pour ajuster le pH à 1,5. On filtre la liqueur traitée, après l'avoir mélangée à 2,8 kg d'un adjuvant de filtration, pour obtenir <B>16,3</B> litres de filtrat.
On reprend de .tourteau de filtration par 25 litres d'eau à une température d'environ 500 C et on ajuste au pH 1,5. Après avoir agité pendant 30 minutes, on filtre le .tourteau @délayé et on réunit le filtrat au filtrat précédent, pour former une masse de 42,3 litres. On traite le filtrat réuni avec 6,76 kg de chlorure de sodium et on extrait à quatre reprises par le butanol à raison de 15 0/0 :du volume du fil trat.
On réunit les extraits, on les clarifie par filtra tion et on des concentre sous vide à 25 - 300 C jus qu'à un volume final de 6 litres.
<I>Exemple B</I> <I>Séparation</I> chromatographique <I>de la</I> chlorodéméthyltétracycline <I>et de la</I> déméthyltétracycline On divise le concentré au butanol de l'exemple A en deux portions égales, on concentre :l'une à 900 cm3 et on concentre l'autre à 610 cm3 sous vide.
On filtre les concentrés et on les ajuste au pH 2 avec de la soude .à 50 %.
Pour préparer le système solvant utilisé pour la séparation chromatographique, on équilibre un mé- lange à 80 % ide butanol et 20 % de chloroforme avec ide l'eau ajustée -au .pH 2 au moyen d'acide chlorhydrique.
Les colonnes sont :des colonnes de verre de 15 cm de diamètre garnies ;de 2,8 kg de terre d'infusoires lavée à l'acide. On équilibre les colonnes avec la phase ,aqueuse du système solvant avant l'usage.
On traite les deux concentrés .au buroanol, :sur des colonnes séparées. On verse doucement les concen trés dans le haut des colonnes. Puis on élue les. co lonnes avec la phase solvante que l'on fait passer au travers à raison d'environ 10 litres par heure. Dans chaque cas, on prend 40 tranches de 500 cm3, et on détermine la teneur en antibiotique de chacune par chromatographie sur bande de papier.
Dans la por tion de 900 cm3, les tranches 6 à 17 contiennent la chlorodéméthyltétracycline et la chlorotétracycline, et les tranches 24 à 40 contiennent la déméthyltétra- cycline et la :
tétracycline. Dans la portion de 610 cm3, les tranches 7 à 18 contiennent la chlorodéméthyl- tétracycline et la chloroitétracycline, et les tranches 19 à 31 contiennent la déméthyltétracycline et la tétracycline.
<I>Exemple C</I> <I>Récupération de la</I> déméthyltétracycline <I>à partir de fractions de colonne</I> On réunit les tranches de l'exemple B qui con tiennent la déméthyltétracycline pour obtenir un vo lume de 14 litres. On -ajoute un égal volume d'eau et on concentre le mélangesous vide :à 241, C jusqu'à un volume de 565 cm3 de :solution aqueuse.
On ajuste le pH :du concentré à 1,65 en ajoutant de l'acide chlorhydrique concentré, et. on lave la solution à deux reprises avec 55 cm3 de :
chloroforme. On filtre la solution .lavée @et on l'ajuste au pH 5,8 avec ide la soude à 50 %. A.près vieillissement de 3 heures à la température ambiante, .et 15 heures à 4() C, on filtre la bouillie cristalline obtenue et on lave le pro duit à l'eau et on .sèche sous vide à 401)
C. On obtient un rendement de 4,7 g de ,dêmé@thyltétracycline neu tre brute titrant 880.microgrammes par mg exprimés en chlorhydrate de tétracycline, ce qui représente un rendement d'ensemble de 73 % à partir du concen- tré aqueux.
Les sels de déméthyltétracycline peuvent se for mer par un :traitement avec des acides et des bases. L'acide chlorhydrique est :un acide préférentiel parce que les sels de cet acide et des déméthyltétracyclines sont des produits très utiles. On peut communiquer des propriétés spéciales enutilisant d'autres ,acides;
tels que l'acide sulfurique, l'acide phosphorique, l'acide acétique, l'acide borique et les :autres acides organiques et inorganiques. On peut préparer des sels avec des bases, en utilisant les hydroxydes alca- lins tels que la soude et ales hydroxydes. alcalino- terreux, comme indiqué plus haut.
Le sel de calcium est particulièrement utile, et on peut le préparer en ajustant simplement au ,pH 6 - 10 une solution :aqueuse de déméthyltétracycline, avec au moins un équivalent molaire de calcium dans la solution.
On peut préparer les sels de baryum, de .magnésium, de strontium, :etc., de façon similaire. <B>Il</B> sue forme aussi des complexes de déméthyltétracychne .avec le bore, le zirconium et d'autres ions métalliques polyvalents, comme dans le cas des tétracyclines.
Evidemment si le milieu de fermentation ne con tient pas de chlore ni de brome, on ne peut pas for- mer .de chlorodéméthyltétracycline ni de bromodémé- thyltétracycline. En pareil cas, d'antibiotique princi- pal sera la déméthyltéroracycline. Quand on élève la teneur en ions chlorure,
particulièrement au-dessus de 50 .parties par million, il se forme des .quantités notables de chlorodéméthyltétracycline, car une par tie d'ions chlorure peut amener la formation d'envi ron 14 parties :de chlorodéméthyltétracycline.
Une petite concentration d'ions bromure dans le milieu de fermentation, d'environ 10 parties par mil lion ê plusieurs pour-cent, tend -à diminuer la forma tion .de chlorodéméthyltébracycline, et la formation de déméiacycline est généralement accrue.