BE544035A

BE544035A -

Info

Publication number: BE544035A
Authority: BE

Description


   <Desc/Clms Page number 1> 
 



   La présente invention est relative à un nouvel antibiotique utile appelé P.A. 105 et, plus particulièrement, à sa production par fermentation, aux procédés pour sa récu- pération et sa concentration à partir de solutions brutes, telles que des bouillons de fermentation, aux procédés pour sa purification et aux procédés pour la préparation de ses sels. L'invention englobe dans sa portée l'antibiotique sous ses formes diluées, notamment sous forme de concentrais bruts, et sous ses formes cristallisées pures. Ces nouveaux pro- duits conviennent spécialement pour combattre des microorga- nismes pathogènes,,en particulier les microorganismes à Gram positif. 



   Le nouvel antibiotique est formé pendant la culture, dans des conditions contrôlées, d'une nouvelle souche d'un genre de microorganisme connu sous la dénomination   Strepto-   myces antibioticus, qui a été identifié par inoculation et essai   d'une   culture de ca microorganisme sur des milieux normalement utilisés pour l'identification de ces microorga- nismes. Une culture du microorganisme a été déposée dans la collection dite n American Type Culture Collection" à Washington ,D.C. et ajoutée à sa collection de microorganis- mes sous la dénomination ATCC   11.891 .   L'identification de cette nouvelle souche, désignée par " Isolate n  15.784-1, dans la collection de cultures de la. société Chas. Pfizer & Co, Inc . de Brooklijn, N.

   Y. a été effectuée à l'aide de l'ouvrage de Bergey intitulé " Manual of Determinative   Bacte-     riologytt ,   6  édition,   1948.   



   Les caractéristiques de culture de la nouvelle souche'de S.   antibioticus   sont données dans le tableau sui- vant. Sauf indication contraire, les résultats sont basés 

 <Desc/Clms Page number 2> 

 
 EMI2.1 
 sur six zc:a7..i.tu; i.ncub pendant aeux slMs* Le-.5 Coti , leurs suivies de 1'inrlle,; H uoub celles de de Hid;\'la.y "Go101' Stud.'rdc aud Id>st=.:uc.ê(oc  ". 



  '1'itL'ir::.rJ :C 
 EMI2.2 
 Strcntomycos antibioticuG ATCC 11691 C01l1eur Degré de l-iyccliufa aérien Pigment :..1.li:m croissance et sPo]:.<:'lt'2!¯-E.s>Jub tG; @.±(2..':1.2r- 
 EMI2.3 
 
<tb> Glucose-aspa- <SEP> modéré <SEP> mycélium <SEP> aérien <SEP> milieu <SEP> brun
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> racine <SEP> blanc; <SEP> piètre <SEP> à <SEP> brun <SEP> foncé <SEP> : <SEP> envers <SEP> brun;
<tb> 
 
 EMI2.4 
 zgar sporulation Ol1:L :LOp 101"63 en grapim:;

   pas 
 EMI2.5 
 
<tb> de <SEP> spirales;
<tb> spores <SEP> 0,65 <SEP> X
<tb> 1,0
<tb> 
<tb> Gélatine <SEP> ' <SEP> modéré <SEP> gris, <SEP> mycélium <SEP> brun <SEP> foncé <SEP> bonne <SEP> liquéfadcireux, <SEP> pas <SEP> de <SEP> tion
<tb> sporulation
<tb> 
<tb> Lait <SEP> écrémé <SEP> modéré <SEP> aime <SEP> au <SEP> blanc <SEP> brun <SEP> foncé <SEP> pas <SEP> de <SEP> coagula-
<tb> 
 
 EMI2.6 
 (2Ô C) .crémeux tion; hydrolyse. 
 EMI2.7 
 
<tb> pas <SEP> de <SEP> change-
<tb> 
<tb> 
<tb> ment <SEP> de <SEP> pH.
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 



  Glucose-agar <SEP> modéré <SEP> brun <SEP> clair, <SEP> ci- <SEP> brun <SEP> clair <SEP> '-envers
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> reux, <SEP> croissan- <SEP> brun <SEP> clair
<tb> 
<tb> 
<tb> ce <SEP> transparente;
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> pas <SEP> de <SEP> sporulation
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Malate <SEP> de <SEP> piètre <SEP> à <SEP> mycélium <SEP> aérien <SEP> .néant <SEP> 'envers <SEP> blanc
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> calcium <SEP> modéré <SEP> blanc; <SEP> 'sporula- <SEP> crémeux, <SEP> malate
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> tion <SEP> piètre; <SEP> de <SEP> calcium <SEP> di-
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> blanc <SEP> grisâtre, <SEP> géré.
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 



  Agar <SEP> synthé- <SEP> piètre <SEP> sporulation <SEP> néant <SEP> envers <SEP> blanc
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> tique <SEP> -- <SEP> gris <SEP> souris(R) <SEP> - <SEP> à <SEP> gris <SEP> clair
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Agar <SEP> nutri- <SEP> piètre <SEP> brun <SEP> clair, <SEP> ci- <SEP> brun <SEP> moyen <SEP> envers <SEP> brun
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> tif <SEP> 'reux,croissan- <SEP> . <SEP> clair
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> ce <SEP> transpareh- <SEP> . <SEP> 
<tb> 
<tb> 
<tb> te
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Agar <SEP> dénier-, <SEP> piètre <SEP> à <SEP> gris <SEP> clair <SEP> à- <SEP> brun <SEP> foncé <SEP> envers <SEP> brun
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> son <SEP> . <SEP> modéré <SEP> ' <SEP> jaune, <SEP> cireux, <SEP> ' <SEP> - <SEP> 'clair
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> mycélium <SEP> ondulé;

  
<tb> 
<tb> 
<tb> pas <SEP> de <SEP> sporula-
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> tion
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Cellulose <SEP> piètre <SEP> mycélium <SEP> aérien <SEP> brun <SEP> clair'
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> -blanc
<tb> 
 
 EMI2.8 
 Bouillon piètre - néant ' # nitrateu H,'.l détrôna ni- réduit;

   1', "!, l,', 

 <Desc/Clms Page number 3> 

 
 EMI3.1 
 
<tb> Disques <SEP> sur <SEP> modéré <SEP> sporulation <SEP> brun <SEP> foncé
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> pommes <SEP> de <SEP> preque <SEP> gris <SEP> à <SEP> noir
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> terre <SEP> naissant(R)
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Plaquettes <SEP> piètre <SEP> jaune <SEP> à <SEP> brun, <SEP> néant <SEP> envers <SEP> jaune
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> d'amidon <SEP> croissance <SEP> ci- <SEP> foncé <SEP> à <SEP> gris;

  
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> reuse, <SEP> sporula- <SEP> pas <SEP> d'hydrolyse
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> tion <SEP> presque
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> gris <SEP> Hathi <SEP> (R)
<tb> 
 Certaines des différences significatives entre 
 EMI3.2 
 la nouvelle souche n  15-784 -1 et la description du S.   antibioticus   dans le manuel de Bergey sont données dans le   tabbau   suivant : 
TABLEAU II 
 EMI3.3 
 Milieu Souche ATCC 11Ô91 Description de Bergey 
 EMI3.4 
 
<tb> Gélatine <SEP> mycélium <SEP> cireux <SEP> gris <SEP> ; <SEP> de <SEP> croissance <SEP> brun <SEP> foncé <SEP> 
<tb> 
<tb> spores <SEP> sur <SEP> surface <SEP> avec <SEP> des
<tb> 
<tb> 
<tb> morceaux <SEP> de <SEP> mycélium
<tb> 
<tb> 
<tb> aérien <SEP> gris.
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 



  Lait <SEP> au <SEP> tour- <SEP> (dans <SEP> da <SEP> lait <SEP> écrèmé, <SEP> pas <SEP> de <SEP> Anneau <SEP> brunâtre <SEP> épais <SEP> à
<tb> 
<tb> 
<tb> nesol <SEP> tournesol) <SEP> anneaux <SEP> crémeux <SEP> la <SEP> surface <SEP> du <SEP> lait. <SEP> My-
<tb> 
<tb> 
<tb> blanc <SEP> à <SEP> brun <SEP> foncé <SEP> ; <SEP> coagula-célium <SEP> aérien <SEP> gris <SEP> ti-
<tb> 
<tb> 
<tb> tion <SEP> et <SEP> hydrolyse <SEP> rant <SEP> vers <SEP> le <SEP> vert;

   <SEP> croie
<tb> 
<tb> 
<tb> sance <SEP> devient <SEP> brune, <SEP> pas
<tb> 
<tb> 
<tb> de <SEP> coagulation <SEP> du <SEP> lait,
<tb> 
<tb> 
<tb> pas <SEP> de <SEP> -clarification;
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Tous <SEP> milieux <SEP> pigment <SEP> soluble <SEP> brun <SEP> léger <SEP> à <SEP> pigment <SEP> soluble <SEP> brun
<tb> 
<tb> 
<tb> contenant <SEP> des <SEP> brun <SEP> foncé <SEP> foncé.
<tb> 
<tb> substances <SEP> or-
<tb> 
<tb> 
<tb> ganiques
<tb> 
 
La souche de   S.antibioticus   décrite dans le manuel de Bergey produit l'antibiotique dénommé   "actinomycine",   qui d'après les données mentionnées plus loin, s'est clairement révélé différent de l'antibiotique P.A.105 . 



   Il est évident que, pour la production du   P.A.105,   la présente invention n'est pas limitée à cet organisme par- ticulier ou à des organismes répondant entièrement à la description donnée plus haut,qui n'est donnée qu'à titre il- 
 EMI3.5 
 lustratif. En fait, l'utilisation de mutandes produites à   @   partir de l'organisme décrit par divers moyens, notamment par rayonnement X, rayonnement ultra-violet, moutardes azotées et analogues, est spécialement désiré et envisagé. 

 <Desc/Clms Page number 4> 

 



   L'antibiotique P. A. 105 se révèle fortement actif vis-à-vis d'une grande variété de microorganismes. Comme men-   tionne     précédemment,   il s'avère particulièrement intéressant dans son action sur les organismes à gram positif. Bien que- cet antibiotique présente une certaine activité vis-à-vis des organisme à gram négatif, cette activité est générale- ment quelque peu moindre. Le tableau suivant illustre le spectre antibiotique du P.A. 105 vis-à-vis d'une variété de   microorganismes   à gram négatif et à gram positif. Ces es- sais ont été effectués en ensemençant du bouillant nutritif contenant des concentrations diverses de l'antibiotique pur à l'aide du microorganisme particulier spécifié.

   La "con- centration inhibitrice minimum" indiquée dans le tableau III est la concentration minimum de l'antibiotique (en microgram- mes/millilitre) à laquelle la croissance du microorganisme ne se produit plus. Etant donné que la concentration la plus élevée employée dans cet essai était de 100   mcg/ml,   la "con- centration inhibitrice minimum" n'est pas indiquée de maniè- re précise, dans les cas où cette concentration excédait apparemment 100 mcg/ml. L'essai a été exécuté dans des condi- tions standardisées. 



   TABLEAU   III.-   
 EMI4.1 
 
<tb> Spectre <SEP> du <SEP> P.A. <SEP> 105
<tb> 
<tb> Organismes <SEP> Concentration <SEP> inhibitrice
<tb> minimum
<tb> Organismes <SEP> à <SEP> gram <SEP> négatif <SEP> P.A. <SEP> 105 <SEP> : <SEP> meg/ml
<tb> 
<tb> Brucella <SEP> bronchiseptica <SEP> 25
<tb> 
<tb> A. <SEP> aerogenes <SEP> 2 <SEP> 100
<tb> 
<tb> E. <SEP> coli <SEP> 21 <SEP> 100
<tb> 
<tb> Proteus <SEP> Sp. <SEP> 1 <SEP> >100
<tb> 
<tb> Ps. <SEP> aeruginosa <SEP> 173 <SEP> 100
<tb> 
<tb> Salmonella <SEP> Typhosa <SEP> 344 <SEP> 100
<tb> 
<tb> K. <SEP> pneumoniae <SEP> 132 <SEP> 100
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 5> 

 
 EMI5.1 
 taule, au '.[±l -;;u i.C .- 
 EMI5.2 
 . rajrynia A134 ].Ou B139 1UU Listeria monocytogenes 3,12 uei sseria goiiorrlieae <-> ,2'j catarrhalis 3 > i;

  ,¯, 
 EMI5.3 
 
<tb> meningitidis <SEP> 6,25
<tb> 
 
 EMI5.4 
 Organismes à 7,rain positif Strep. faecalis 121 155. 



  .Licrococcus 1, pyogenes var. aureus 5 0,19 
 EMI5.5 
 
<tb> 209 <SEP> <0,19
<tb> 
 
 EMI5.6 
 m. pyogenes var. albus 3 0, 7f, subtilis 2iy o39 
 EMI5.7 
 
<tb> Diplococcus <SEP> pneumoniae, <SEP> Type <SEP> I <SEP> 6,25
<tb> 
 
 EMI5.8 
 Type I, A.T.C.C. U > 1q Type 111 3>12 Type V 3,12 Erysipelothrix rhusiopathiae, z1 U 3 E-l .

   0,7 
 EMI5.9 
 
<tb> G-2 <SEP> 0,7
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> G-3 <SEP> 0,5
<tb> 
 
 EMI5.10 
 Corynebacterium xerose 6j25 Clostridium perfringens 1,5 spcrogenes l5 
 EMI5.11 
 
<tb> tetani <SEP> 1,5
<tb> 
<tb> Bacillus <SEP> anthracis <SEP> 0,7
<tb> 
<tb> Fungi
<tb> 
 
 EMI5.12 
 Candida albicans f3 100 Le tableau IV montre les résultats d'essais   similai-   
 EMI5.13 
 res effectués dans un autre laboratoire sur des organisncs ou souches différents de ceux indiqués dans le tableau   III   
 EMI5.14 
 et illustre encore le spectre du '.A. 105. Dans ces essais, la concentration maximum do l'antibiotique était de ';)ùu ttlcg/   1 il 1.    

 <Desc/Clms Page number 6> 

 
 EMI6.1 
 ÏAULEAU IV.- 
 EMI6.2 
 Spectre P. A. 105, Nicroorr;mlisrne adûity-T:zl Organismes Concentration inhibitri #" ce Minimum P.

   A. lu5 : TC1C j;TTtl. 
 EMI6.3 
 
<tb> 



  Organismes <SEP> à <SEP> gram <SEP> négatif.-
<tb> 
 
 EMI6.4 
 E. coli 2îi5 #E. coli ####''<) 
 EMI6.5 
 
<tb> E. <SEP> typhosa <SEP> 225
<tb> 
<tb> Salmonella <SEP> sp. <SEP> 450
<tb> 
<tb> Aerobacter <SEP> aerogenes <SEP> 225
<tb> S. <SEP> paratyphosa <SEP> 900
<tb> 
 
 EMI6.6 
 lebsie11a pneumoniae 225 
 EMI6.7 
 
<tb> Brucella <SEP> bronchisepticus <SEP> 7
<tb> 
<tb> B. <SEP> Pyocyaneus <SEP> 900
<tb> 
<tb> 
<tb> NA <SEP> II.SM <SEP> Re <SEP> sist. <SEP> 112
<tb> 
<tb> 
<tb> NA <SEP> IV <SEP> S. <SEP> typhosa <SEP> 112
<tb> 
<tb> 
<tb> E. <SEP> typhi-murium <SEP> 225
<tb> 
 
 EMI6.8 
 S. ty phi-nlycrium 225 S, neTnort # 450 S. elzteritidis 225 S.cholera suis 225 
 EMI6.9 
 
<tb> Proteus <SEP> vulgaris <SEP> 900
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Organismes <SEP> à <SEP> gram <SEP> positif <SEP> ' <SEP> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Strep.hemo.

   <SEP> 1,7
<tb> 
 
 EMI6.10 
 D.pneumooniae < 1,7 
 EMI6.11 
 
<tb> Staph <SEP> h <SEP> ' <SEP> <. <SEP> 1,7
<tb> 
<tb> B. <SEP> subtilis <SEP> < <SEP> 1,7
<tb> 
<tb> Enterococcus <SEP> 1,7
<tb> 
 
 EMI6.12 
 Z. rre lchü 7 aaph. aureus 235 's. 1 7 Fungi Mouilla c.Z.)J."Ttlû > 00 

 <Desc/Clms Page number 7> 

 
 EMI7.1 
 Le nouvel antibiotique s'esb ave". ré également c.t'1.'i- cace vis-à-vis d'organismes résistant aux aiibibiotiqtlos usu- els se trouvant dans le commerce. Ainsi, certaines couches résistantes de lIlicrococcus pyogcnes var. aureus, isolées de cas cliniques ont été soumises a l'antibiotique 1). . 10 tes qu'indique nlus haut, on vue de déterminer la ,:,oz<;futr-. tion inhibitrice minimum.

   La concentration inhibitrio mini- mus d'une variété d'antibiotLqucs bien connus a ( ;:..tlL-I!J('Ilt, été déterminée à des fins de contrôles et les résultats de ces essais apparaissent dans le tableau V. 



   TABLEAU V.- 
Antibiotiques : 
 EMI7.2 
 
<tb> Concentration <SEP> inhibitrice <SEP> minimum <SEP> en
<tb> 
 
 EMI7.3 
 111O.r-:/ml 
 EMI7.4 
 
<tb> Souche <SEP> de <SEP> M. <SEP> Chlor- <SEP> Chlor- <SEP> Baci- <SEP> Néo- <SEP> Peni-
<tb> 
<tb> 
<tb> pyogenes <SEP> var. <SEP> P. <SEP> A. <SEP> Oxytétra- <SEP> tétra- <SEP> amphé- <SEP> tra- <SEP> my- <SEP> cilli- <SEP> Polymyx
<tb> 
<tb> 
<tb> aureus <SEP> 105 <SEP> cycliae*.

   <SEP> cycline <SEP> nicol <SEP> cine <SEP> cine <SEP> ne <SEP> ine
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 1 <SEP> 0,78 <SEP> > <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 6,25 <SEP> 56 <SEP> 3,12 <SEP> 60 <SEP> 250
<tb> 
 
 EMI7.5 
 2 3,12 lo0 56 6,25 28 3,1z 15,0 >250 3 .1,56 100 50 6,25 28 z56 7, 5 z5o 
 EMI7.6 
 
<tb> 4 <SEP> 1,56 <SEP> > <SEP> loo <SEP> 100 <SEP> 12,5 <SEP> 14 <SEP> 25,00 <SEP> 60 <SEP> 250
<tb> 
<tb> 5 <SEP> 1,56 <SEP> 100 <SEP> 50 <SEP> 6,25 <SEP> 14 <SEP> 1,56 <SEP> 15,0 <SEP> >250
<tb> 
<tb> 6 <SEP> 3;

  12 <SEP> >100 <SEP> 50 <SEP> 12,5 <SEP> 28 <SEP> 50,0 <SEP> 7,50 <SEP> 250
<tb> 7 <SEP> 0,78 <SEP> >100 <SEP> 100PI' <SEP> 6, <SEP> 25 <SEP> 28 <SEP> 0,78 <SEP> 60,0 <SEP> 7250
<tb> 
 
 EMI7.7 
 8 1,56 >100 100 6,25 14 1,56 3,75 250 9 0,78 >100 50PI 3,12 56 1,56 60 ?z5a 10 0,78 >100 >10û 6, 25 14 3,12 60 7250 il 0178 0,7$ 0,39 3,12PI 28 6,0 3,75250 12 o, 7 >100 7100 6, 25 .4 o, 7$ 60 250 13 0, 7$ >100 50 6, 25 28 3,12 0,1..7,250 Il..

    '70 >100 100 6,25 14 ( U 7$ 60 ?250 15 1156 100 loopi 3,12 7 <O,78 0,93250 16 1,56 100 50 6,25 56 c,0'7 z5,o ? z5u 17 0'78 -100 100 3,12 28 3,12 60 250 18 0,7H 1U0 100 3yi2pi, lis 3,12 60 z250 r 

 <Desc/Clms Page number 8> 

 PI = inhibition partielle = vendu sous la dénomination commerciale 
 EMI8.1 
 lt'2eri-al(lycille" 
En plus de l'efficacité de l'antibiotique vis-à- vis de ces souches résistantes, ces essais révèlent égale- ment que l'antibiotique   P.A.   lu5 diffère de l'oxytétracycli- ne, de la chlortétracycline, du chloramphénicol, de la baci- tracine, de la néomycine, de la   pénicilline   et de la poly-   mixine.   



   L'antibiotique   P.A.   105 s'est également révélé efficace vis-à-vis d'une variété de mycobactéries, comme indi- qué dans le tableau   VI,   qui donne les résultats des essais effectués sur ces mycobactéries. Dans ce cas, des bes de milieu liquide de Dubos ont été utilisés comme milieu d'es- sai. L'antibiotique a été ajouté au milieu dans les différen- tes concentrations indiquées dans la première colonne du tableau. Les tubes de milieu contenant ces concentrations de l'antibiotique ont ensuite été ensemencées à l'aide de cultures des diverses myoobactéries spécifiées, l'identité   de -l'espèce   étant indiquée à la partie supérieure de chacune des colonnes du tableau.

   L'essai a ensuite été conduit en incubant les tubes dans des conditions stériles pendant   36   heures et en les observant ensuite, en vue de déterminer la présence ou l'absence d'une croissance des mycobactéries. 



  L'absence de croissance dans les tubes à la fin   de-¯la   période d'essai est indiquée par un signe - et la croissance est in- diquée par un signe   + .   

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 EMI9.1 
 l'.iii.ats :ill ÎL1 , ..- 
 EMI9.2 
 Activité du 1'.3. 1u5 v:ts-h-viG elt;r.:; 1\'ly<.:mb:cL(Jl'lo CK/jnl. !:. 1'A :?2,:'P¯<:t.:r,¯1- ()!:J1. 
 EMI9.3 
 
<tb> 25,0 <SEP> -
<tb> 
 
 EMI9.4 
 1;

   , :5 - 
 EMI9.5 
 
<tb> 0,25 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> -
<tb> 
<tb> 3,12 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> -
<tb> 
<tb> 1,56 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> -
<tb> 
<tb> 0,78 <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> 
<tb> 0,39 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> 
<tb> 0,19 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> 
 
 EMI9.6 
 Ou a constaté que l'antibiotique P.A. lux possède un degré. relativement faible de toxicité, lorsqu'il est uti- lisé dans des essais sur animaux. Ainsi, la dose léthale LD0, lorsque   l'antibiotioue   est administrée, par la voie intraveineuse, sous forme d'une solution aqueuse, à des sou- ris est   approximativement   de 15 mgr par 20 grammes de poids de souris. La toxicité pour d'autres espèces et par d'autres voies d'administration est comparable. 



   On a constaté encore que l'antibiotique P.A. 105 possède un degré élevé d'activité in vivo   vis-à-vis   de dm- vers microorganismes pathogènes. Des souris de poids   sensi-   blement uniforme ont été infectées, par la voie   intrapérito-   
 EMI9.7 
 néale, à l'aide de certaines souches de 3treD.Ileinolyticus, de D.pneumoniae et de 1\1. pyogenes var. aur eus. et ont été trai- tées à l'aide de l'antibiotique, par injection sous-cutanée, en deux doses quotidiennes de 5 mgr pendant 2 1/2 jours.

   L'ef- 
 EMI9.8 
 ficacité de l'antibiotioue P.A. 105 vis-à-vis de ces microor-   ganismes   chez les souris ainsi traitées ressort clairement 
 EMI9.9 
 du tableau VII, oui indiqué comparativement If) pourcentage de survivance des souris t?\o.ît-'5os nt non t,)., Ul"C':'1. 

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  TABLEU VII 
 EMI10.1 
 
<tb> activité <SEP> de <SEP> P.A. <SEP> 105 <SEP> in <SEP> vivo.-
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Organisme <SEP> Animal <SEP> : <SEP> traité <SEP> . <SEP> non <SEP> traité <SEP> %Survivance
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 48 <SEP> 90 <SEP> h. <SEP> -'/ <SEP> jours <SEP> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Strep.hemo <SEP> traité <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> C203Hv <SEP> non <SEP> traité <SEP> ,

   <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> D.pneumoniae <SEP> traité <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 90
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 1/230 <SEP> non <SEP> traité <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> M.pyogenes <SEP> traité <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> var.aureus
<tb> 
<tb> 
<tb> No.235 <SEP> non <SEP> traité <SEP> 20 <SEP> 20 <SEP> 20
<tb> 
 
L'invention est relative à un procédé pour faire croître le microorganisme   S.antibioticus.   La culture de ce microorganisme s'opère de préférence, dans des milieux nutri- tifs aqueux à une température d'environ   24-30 C   et dans des conditions immergées d'agitation et d aération.

   Les milieux nutritifs utilisables dans ce procédé comportent un hydrate de carbone, tel que sucres, amidon, glycérol, farine de maïs, et une source d'azote organique, telle que caséine, farine de graines de soja, farine de pistache, gluten de blé, farine de graines de coton, lactalbumine, produit de digestion enzy- matique de caséine, tryptone. Une source de substances de croissance, telle que solubles de distillerie, extrait de levure, résidus de fermentation de mélasses, de même que des sels minéraux, tels que chlorure de sodium, phosphate de po- tassium, nitrate de sodium, sulfate de magnésium, ainsi que des traces de métaux, tels que cuivre, zinc et fer,   pe uvent   aussi être utilisés avec des résultats désirables.

   S'il se produit un moussage excessif pendant la fermentation, des agents anti-mousse, tels que des huiles végétales, peuvnnt Être ajoutés au milieu de fermentation. Le pH de la fermen- tation tend à rester assez constant, mais si des variations sont constatées, un agent tampon, tel que du carbonate de 

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 calcium, peut aussi être ajouté au milieu* 
L'inoculum pour la préparation de l'antibiotique   P.

   A.   105 par la   croissance?   de S. antibiotious peut   être   obte- nu en opérant la croissance à l'aide de cultures   inclinées   sur des milieux tels que   l'agar   d'Emerson et le lactose de boeuf.   L'inoculum   peut "être utilisé pour inoculer soit des flacons à agiter, soit des réservoirs d'inoculum pour crois- sance submergée, ou bien encore les réservoirs   d'incolum   pau - vent être ensemencées à partir des flacons à agiter. La crois- sance du microorganisme atteint ordinairement son maximum au bout d'environ 2 ou 3 jours. Toutefois, des variations dans l'équipement utilisé, dans le degré d'aération, dans le degré d'agitation et analogues peuvent affecter la vitesse à laquelle l'activité maximum est atteinte.

   En général, une période d'une durée d'environ   24   heures à quatre jours est désirable pour produire l'antibiotique. L'aération du milieu dans des réservoirs pour croissance submergée est maintenue à raison d'environ 1/2 à 2 volumes d'air libre par volume de bouillon et par minute. L'agitation peut être entretenue par des types appropriés d'agitateurs généralement connus dans l'industrie des fermentations. Des conditions aseptiques doivent évidem lent être maintenues pendant le transfert de l'inoculum et pendant la croissance du microorganismes. 



   Après croissance du microorganismes, le   mycélium ,   qui est généralement très luxuriant et fin, peut être retiré du bouillon de fermentation par divers appareils classiques, tels que des filtres-presses, centrifuges et analogues. L'an- tibiotique P.A.105 peut être récupéré du bouillon de fermen- tation par plusieurs procédés différents.   Ou   bien, tout le bouillon peut être utilisé comme tel ou peut être séché. 



  L'antibiotique peut Stre purifié par divers moyens;   ainsi   le composé peut être extrait de la solution aqueuse à des pH 

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 neutre ou légèrement alcalins, de préférence entre environ 6 et environ 10, à   d'une   variété de solvants   organi-     ques   non miscibles à l'eau, notamment des éthers, des   hydro-   carbures aromatiques, des esters, des cétones, des alcools inférieurs et des hydrocarbures halogènes.

   Comme exemples de tels solvants, on peut citer l'éther   diéthylique,   le ben- zène, le toluène, l'acétate d'éthyle, l'acétate de butyle, la   méthylisobutylcétone ,   le butanol et le chloroforme. même à des pH acides, certaine de ces solvants extrayent une quan- titéappréciable d'antibiotique. Ceci est particulièrement vrai des alcools non miscibles à   l'eau.,   tels que butanol,   pentanols   et analogues.   L'antibiotique   peut être récupéré de la plupart des solutions de solvants par de l'eau acidi- fiée, de préférence à un pH inférieur à environ 2,5. Si on le désire, l'extrait solvant peut être concentré avant extraction dans de l'eau acidifiée.

   Par ajustement du pH à la   neutralité   ou à une alcalinité, l'antibiotique peut ê- tre re-extrait dans un des solvants indiqués plus haut. Par séchage du solvant et concentration de la solution, l'anti- biotique cristallise en longues aiguilles blanches. Le pro- duit peut être recristallisé par refroidissement d'une solu- tion de ce solvant dans de l'acétate d'éthyle, du chlorofor- me , du chlorure de méthylène ou dm dichlorure d'éthylène chaud. D'autres procédés de récupération, qui se suggèrent   d'eux-mêmes,   comprennent l'absorption sur charbon de bois a- vec   élution   subséquente, traitement avec des résines échan-   geuses     d'ions   et développement sur des colonnes   d'alumine.   



     L'antibiotique     P.A.105   est un composé organique a- morohe, blanc, basique, qui est soluble dans les acides a- queux dilués et est   modérément   soluble dans   l'eau..   Il est trèsoluble dans un   certain   nombre de solvants organisues, 

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 tels que l'alcool méthylique,   l'alcool   éthylique,   l'acétone   et le butanol. il est insoluble dans l'hexane, le tétrachloru- re de carbone et l'éther   di-n-butyliquc,   Une solution aqueuse du composé reste stable pendant plusieurs heures à températu- re ambiante, dans une large   rçaiume de   pH.   Toutefois,   il est très instable par chauffage en solution acide.

   Il est stable à l'état sec ou en dissolution dans des solvants anhydres. 



  Le chlorhydrate de l'antibiotique anhydre et cristallisé fond à environ 125-128 C. Il révèle une pointe d'intensité large    et faible dans la région de l'ultra-violet à environ 286le   289 mu (10 mgr dans 10 ce de méthanol). Lorsqu'on dissout dans du chloroforme, l'antibiotique sous forme de base révèle un certain nombre de pointes caractéristiques dans la région infra-rouge dont les plus significatiyes sont les fréquen- ces suivantes (en centimètres réciproques) :

   3510, 2910,   2890,   2840, 2590, 1710, 1615,   1460,   1385, 1335, 1305, 1280,   1190,   1160, 1145, 1110,   1075,   1050, 1005, 985, 960, 935, 895, 885 et   860.   Lorsqu'il est mis en suspension dans une boulette de bromure de potassium, le chlorhydrate anhydre révèle également un certain nombre de pointes caractéristi- ques dans la région infra-rouge, dont les plus significati- ves sont les fréquences suivantes : 3380, 2930,   2880,   1710,   1640,     1465,   1380, 1330, 1250, 1190, 1160,   1115,   1075, 1055, 1010, 1000, 985, 935 ; 865, 828. Le .spectre infra-rouge est plus particulièrement illustré dans les dessins ci-annexés. 



  Dans les figures 1 et 2 de ces dessins, LUM désigne des lon- gueurs d'onde en microns, LOC des longueurs d'ondes en cm-1 et PT des pourcentages de   transmission.   La figure 1 montre le spectre infra-rouge de l'antibiotique sous forme de base et la figure 2 celui de son chlorhydrate anhydre. Le chlorhy-   drate dissous dans méthanol (C=1%) indice 25 280 . drate dissous dans le méthanol (C=1%) a un indice o D= -80 .   

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   Le poids moléculaire de l'antibiotique P.A. 105 base, déterminé nar la méthode ébullioscopique s'est avéré être d'environ   715.   



   Après séchage à   100 C   pendant 18 heures d'un échan- tillon de chlorhydrate de P.A.105 cristallisé dans de l'acé- tate de   l'éthyle,   on a remarqué une perte de poids de 5,0%. 



  La matière séchée a été analysée et on a constaté qu'elle contient les éléments suivants dans les proportions pondéra- les spécifiées. carbone 57,63 hydrogène   8,73   azote   1,87   chlore (ionique) 4,30 oxygène(par différence)   27,47   
Ceci correspond à la formule empirique probable C37H67NO13.HC1 pour le chlorhydrate anhydre. Le chlorhydrate se présente également sous diverses formes hydratées, telles que le dihydrate, correspondant à la formule empirique proba- ble C37H67NO13NCl.2H2O. 



   L'antibiotique   P.A.105   se différencie nettement d'autres antibiotiques par ses propriétés, comme le révèlent les propriétés décrites plus haut et les mesures de chromato- graphie sur papier. 



   Des sels utiles de l'antibiotique peuvent être pré- pâtés par des procédés bien connus dans la technique, notam- ment par traitement de la base à l'aide d'un acide approprié en solution aqueuse ou dans des conditions anhydres. Ainsi, le chlorhydrate peut être préparé en dissolvant la base dans de l'acétone et en faisant passer du chlorure d'hydrogène gazeux dans la solution. D'autres acides, tels que les aci- des sulfurique et phosphorique, peuvent être utilisés pour 

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 préparer les sels d'acides de l'antibiotique. 



   L'invention est illustrée davantage par les exemples suivants, qui ne doivent pas être considérés comme limitatifs. 
 EMI15.1 
 EXnJ.'iPLE I.- 
Une souche de S.antibioticus   ATCC     11891   sur de l'agar   d'Emerson   a été cultivée dans des conditions contr8- lées de manière à développer des spores dans le but d'inocu- ler un milieu nutritif' de composition suivante 
Cerelose 10 gr 
Farine de graines de 10 gr soja 
Chlorure de sodium 5 gr 
Solubles de distillateur 5 gr 
Carbonate de sodium 1 gr 
Le mélange de matières nutritives a été dilué jus- qu'à un volume d'un litre à l'aide d'eau, ajusté à un pH de 7 au moyen d'hydroxyde de potassium, et soumis à une stérilisa- tion thermique. Après cela, le milieu a été refroidi et les spores y ont été ajoutées dans des conditions aseptiques.

   La culture de l'organisme a été conduite dans des flacons agi- tés à environ 25 C pendant une période de deux jours. Le mélange de bouillon et de mycélium ainsi formé a alors été transféré dans 20 fois son volume d'un milieu de fermentation      stérile ayant la composition suivante : 
Cerelose 10 gr/litre 
Chlorure de sodium 5 
Curbay Bg 5 
Amidon de maïs 10 
Farine de graines de soja 10 
Ce milieu a été ajusté à un pH de 7 à l'aide d'hy- droxyde de potassium, traité avec 1 gr de carbonate de cal- cium par litre et stérilisé de la manière usuelle, avant d'y 

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   transférer   le bouillon et le mycélium.

   Après   ensemencement   au milieu à l'aide du microorganisme cultivé dans les flacons agités, le mélange a été soumis à une agitation et à une aération dans des conditions stériles pendant 3 jours. A ce moment, la teneur en principe actif du bouillon s'est avérée être de 70 mcg/ml. Le mycélium a été séparé par filtration et extrait à deux reprises avec un quart de volume de   méthyl-   isobutylcétone. Les phases solvant combinées ont été concen- trées au dixième de leur volume sous vide. L'antibiotique a alors été extrait dans de l'eau à un pH d'environ 2 à l'aide d'acide sulfurique. La phase aqueuse a été séparée, lavée au benzène pour éliminer la méthylisobutylcétone et ajustée à un pH de 6,5.

   Après cela, l'antibiotique a été ex- trait à plusieurs reprises avec de l'éther, dans lequel il a été séché sur du sulfate de sodium anhydre. Par distilla- tion de l'éther, l'antibiotique a cristallisé sous la forme de longues aiguilles blanches. Enfin, le produit a été recris- tallisé dans de l'acétate d'éthyle chaud. Le produit recris- tallisé ainsi obtenu s'est révélé très efficace vis-à-vis d'une variété de mycobactéries et de microorganismes à gram positif, comme indique dans les essais décrits plus haut. 



     EXEMPLE   II.- 
Un autre milieu de fermentation a été;préparé à l'aide des matières suivantes : 
Farine de graines de soja 15 gr 
 EMI16.1 
 Cerelose 20 gr bzz Amidon de   Mais   15 gr Chlorure de sodium 5 gr Solubles de distillateur a Gr 
 EMI16.2 
 NZ lt':31¯ Z-1 .. -v matières ant été ajoutées a un litre d'eau et 

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 le pH du mélange résultant a été ajusté à une valeur comprise entre 7 et 7,2 à l'aide d'hydroxyde de potassium.   Cinq   gram- mes de carbonate de calcium ont été ajoutés pour agir comme tampon pendant la fermentation.

   Le milieu a ensuite été au- toclavé et ensemencé dans des conditions ttériles avec un inoculum de S.antibioticus préparé par le procédé décrit dans l'exemple I. après avoir soumis le milieu inoculé à une aération et une agitation dans des conditions stériles à en- viron 28 C pendant deux jours, le bouillon filtré contenait 
100 microgrammes d'antibiotique   P.A.   105 par ml de solution. 



   REVENDICATIONS.- 
1.- Procédé de production d'un nouvel antibiotique (désigné dans le présent mémoire comme   P.A.105),   dans lequel on cultive du Streptomyces antibioticus ATCC 11891, tel que décrit plus haut, on une mutante orautre équivalent de ce microorganisme, dans un milieu nutritif aqueux dans des con- ditions aérobies submergées, jusqu'à ce qu'une activité an- tibactérienne substantielle soit communiquée audit milieu.

Claims

2.- Procédé suivant la revendication 1, dans le- quel la culture s'opère dans un milieu nutritif aqueux'dans des conditions aérobies submergées et an agitant, à une tempé- rature d'environ 24 à environ 30 C, pendant environ 1 jour à environ 4 ours.

@ 3. - Procédé suivant l'une ou l'autre des revendica- tions 1 et 2, dans lequel on récupère l'antibiotique produit dû bouillon de fermentation.

@ 4.- Procédé suivant la revendication 3, dans le- quel l'antibiotique est récupéré en filtrant le bouillon et en l'extrayant à l'aide d'un solvant non- miscible à l'eau dans des conditions de pH neutre à alcalins.

5. - Procédé de production de l'antibiotique P.A. <Desc/Clms Page number 18>

105, en substance, tel que décrit dans les exemples 1 et II.

6.-Lasubstance basique (désignée dans le présent mémoire comme P.A.105) capable d'inhiber la croissance de bactéries à grain positif et de mycobactéries et capable de former des sels avec des acides, laquelle substance basique est modérément soluble dans l'eau et très soluble dans des solvants organiques, le clorhydrate cristallisé séché de cet- te substance basique contenant.du carbone, de l'hydrogène, de l'azote, du chlore et de l'oxygène sensiblement dans les proportions pondérales suivantes :

carbone 57,63 hydrogène 8,73 azote 1,87 chlore ( ionique ) 4,30 oxygène (par différence) 27,47, le chlorhydrate cristallisé séché de la substance basique présentant une pointe d'intensité large et faible à environ 2b6-289 mu dans la région ultraviolette du spectre et présen- tant, lorsqu'il est en suspension dans une boulette de bromu- re de potassium, une absorption caractéristique dans la ré- gion infra-rouge aux fréquences suivantes exprimées en cen- timètres réciproques : 3380; 2930, 2880, 1710, 1640, 1465, 1360, 1330, 1250, 1190, 1160, 1115, 1075, 1055, 1010, 1000,- 985, 935; 865, 828.

7.- Sels d'acides de la substance basique suivant la revendication o, tel que le chlorhydrate .

8.- L'antibiotique (désigné comme P.A.105), en substance, tel que décrit plus haut.