CA1052308A - Substance anticoccidienne 30.504 rp de streptomyces gallinarius - Google Patents

Abstract

: Nouvelle substance antibactérienne et anticoccidienne désignée per le numéro 30.504 RP, ses sels métalliques et sels avec les bases azotées, sa préparation par culture de Streptomyces gallinarius DS 25.881 (NRRL 5.785) et les compositions pour l'alimentation animale qui la contiennent.

Description

~0~'~3~
~ a présente invention concerne une nouvelle substance antibio-tique désignée ci-après par le numéro 30~504 RP, ses sels métalliques et ses sels avec les bases azotées, son pro-cédé de préparation et les composltions qui la contiennent.
~ e 30.504 RP présente un intérêt tout par-ticulier par suite de l'activité anticoccidienne qu'il manifeste à côté
de son activité antibactérienne et de son activité antimalari-que.
le 30.504 RP peut être obtenu à partir des milieux de culture appropriés d'un nouveau microorganisme identifié
plus complètement ci-après, appartenant au genre Streptomyces et d~signé par l'appellation Strep-tomyces gallinarius DS 25.
~1 (NRIU. 5.785).
I,e ~0.50~ R:P est caract~r.is~ par le--~ propriétés phy-sico-chimiques suivantes:
- aspect : poudre microcristalline blanche : - solubilité: le 30.504 RP es-t facilement soluble dans les sol-vants chlorés tels que le chlorure de méthylane et le chloro-forme, les alcools tels que le méthanol~ et dans le dimethyl-20 formamide; i.l est relativement soluble dans l.'acétone et l'acétate d'éthyle, peu soluble d~ns l'hexane et pratiquement insolubl.e dans l'eau (no~ation selon la Pharmacopée F~ança.i.se IX Edition, 2ème par-tie, page 13, (1972).
- composition centésimale : le 30.504 RP contient du carbone, de l'hydrogène et de l'oxygène. Sa composition centésimale est :. voisine de :
C ~ = 69,4 H ~0 = 9,0 0% = 21,0 - cquivalent neutre : le 30.504 ~P est unc substance à carac-:: .
; t~re acide dont l'équivalent neutre (déterminé en solution dans l.e dime-thylformamLde par dosa~e avcc l'hydroxyté-trabutylammo-nium) est de 830.

- Point dc fusion : (dét~miné au banc Knlfer) : voisin de 200~

~` - pouvoir rotatoire : déterminé en solution à 1% dans le métha-.~
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3 ~ ~
nol. ~e pouvoir rota-toire spécifique du 30~504 RP est ~oisin de:

[ ~ = ~79 [a ~ = -188 ra 1 _ -378 : D 436 . L J ~65 - æ~_ctre ultra-violet : le 30.504 RP ne présente pas d~absorp-tion caractéristique dans l9ultra-violet - s~ e infra-rou~e : ~détermination à partir de comprimés en m~lange a~ec KBr).
Ce spectre est représenté par la figure 1 dans laquel~
le on a porté en abscisses9 d~une part les longueurs d'ondes exprimées en microns ~échelle supérieure) et d'autre part les - nombres dlondes en cm 1 (échelle inférieure) et en ordonnées les densités optiques.
Dans le tableau I~ on indi~ue les principales bandes ~ d~absorption infra-rouge pour ce produit exprimées en nombre dlondes (cm 1).
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TAB~lAI] I
.
3440 F1325 m 915 m 3030 ép.1~15 ép. ~80 f 2960 F1295 ep, 865 tf 2938 F1272 m 845 tf 2880 ~1225 f 825 f 2855 ép.1200 tf 792 m 2640 tf1172 m 775 f 2060 tf1140 m 735 1945 tf1115 ép. 700 f 1900 tf1100 ép. 675 ép.
1785 ép.1085 F 655 f 1705 F1070 ép. 630 ép.
l632 m10~5 ep. 615 m 1622 ép.1038 F 565 ép.
1535 tf1012 m 525 m 1458 F980 F 495 m 1405 ép.958 F 465 tf 1380 F935 m 445 f tI~` = tras forte F = for-te m ~ moyenne f = faible tf ~ tre~ faible ép.= épaulement - Migrations chromato~raphique 8-~ e 30.504 RP peu-t être caractérisé par chroma-tographie ascendante ~ur couche mince de gel de silice en utilisant deux systèmes de mélange-solvant:
: . .~. .
- acétate d'éthyle/cyclohexane/eau/butanol (50/50/25/5 en volu-mes) : Rf = 0~45 - chlorure de méthylène/méthanol (94/6 en volumes):
~f = 0,55 ., .

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~ ~ 5'~ 3 ~ ~

- Acti~it~ bactériostatique in vitro :
~ e 30.504 RP montre une activité bactériostati~ue qui s~exerce en particulier sur certaines bactéries prenant la co-loration de GramO
~ 'activité bactériostatique du 30.504 RP vis-à-vis d~un certain nombre de germes a été dé-terminée par une des méthodes de dilution couramment employ~es à cet effet. Pour cha~ue germe on a déterminé la plus petite concentration de substance active qui, dans des conditions définies9 empêche son développement visible dans un bouillon nutritif approprié.
~es résultats des diverses déterminations sont rassemblés dans le tableau II ci.-après où les co~oentrations bact~rios-tati~ues minimales sont exprimées en microgrammes de substance par cm3 de milieu d~essai :

:, :
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~AB1EAU II
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_ Concen~rations Organismes bactériens essayés minimales bactériostatiaues - (en ~g/om~) Staphylococcus aureus, souche 209 P -ATCa 6538 P 0,2 Staphylococcus aureus, souche Smith ~5 Sarcina lutea - A~C~ 9341 0,9 Streptococcus faecalis - ATCC 8043 0,1 Streptococcus pyogenes hemolyticus, souche Dig (Institut Pasteur) ` 0,2 Diplococcus pneumon~ae~ souohe Til (In~titut Pasteur) 0,05 Neisseria oatarrhalis (A 152, Institut Pasteur) 6 Baoillus subtills - A~CC 6633 0~2 Bacillus oereus - A~a 6630 0,1 Myaobacterium species ATCO 607 ~
Escherichia coli - A~CC 9637 ~ 150 Shigella dysenteriae~ Shiga L
(Institut Pasteur) ~ 150 Salmonella parat phi A (souche Lacasse~
Institut Pasteur~ > 150 Salmonella ~chottmuelleri (paratyphi B) -(souche Fougenc, In~titut Pasteur) > 150 Proteus vulgaris ~ 150 Pseudomonas aeruginosa ~ 150 ' - Toxicité : ~
hez le pousæin, la doæe létale 50% (DL50) est de ~;
85 m ~ kg p.o. en administration unique.
- Activit~_anticoccidienne : -. . . ~
~activité anticoccidienne a été détermin~e che~ le poussin infesté notamment par Eimeria tenella et ~imeria acer vulina.
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~activité anticoccidienne du 30.504 RP incorporé à
la nourriture du poussin se manifeste à des concentrations non toxiques comprises entre 0~005 ~0 et 0,04 % en poids de produit contenu dans l~aliment.
- Activité antimalarique :
~e 30.504 RP exerce en outre une activité antimala-xique dans le3 infections expérimentales à plasmodium de la souris et du poussin.
rganisme producteur de l'ant'ibiotique 30.504 RP
est une souche de streptomyces qui a été isolée à partir d~un échantillon de terre prélevé en Inde, et à laquelle a été
attribué le numéro DS 25.881. Un échantillon de cet organisme a ét~ déposé au ~orthern Regional Research $aboratory de l~U.S.
Department of Agriculture a Peoria~ Ill. (~tats-Unis) où il a été enxegistr~ sous la référence ~RR~ 5785.
Cet organisme, présentant des caractères ~ui n~ont pas permis de l~identifier à une espèce déja décrite, doit être ¢onsidéré comme une espèce nouvelle et a été dé~igné par l~ap-' pellation Streptomyces gallinarius~ D~ 25~8810 ~'isolement de cette souche a éte effectué en suivant la méthode générale qui consiste à mettre une petite quantité
de terre en suspension dans de lleau dis-tillée stérile~ à
diluer la suspension à différente~ concen-tra-tions~ et à étaler unPe-tit volume de chaque dilution sur la surface de boites de ` Pétr-i contenant un milleu nutritif gélosé. hprès u~e incuba-'~ tion de quelques jours à 26C, qui permet aux ~icroorg~Lismes de se développer, les colonies que 170~ veut isoler pour en poursui~re l~étude sont'prélevées et repiquées sur des géloses nutritives afin d~en obtenir des cultures plu5 abondantes.
~orme des spores ~;' cylindriques à o~ales, mesurant 1,0 à 1,2 ju / 0,8 à 1,0 ~ ;
ses ~porophores sont en grappe~; les filaments spor:ifères~

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~0~'~3~1 lâches ct fl.exueux, s'enroulent souven-t à leur extrêmité 50it en prenant une forme lég~rcment recourbée, soit en form~nt un tour spiralé ou occasionnell.ement quelques tours. Par son mo-de de sporulation, cette souche se classe dans la Section Reti-naculum-Apertum de la classification de Pridham.
Streptom~ces gallinarius DS 25.881 se développe bien à 26C et à 37C, mais pas à 50C. Il présente un mycélium aérien sporulé de couleur grise. ~a colorati.on de son mycélium végétatif va en général, suivant les milieux de cul-ture, du jau-ne ou jaune grisâtre au jaune brun ou br~m jaune. A part uneproduction particulière de pigment soluble violet rose brun~-tre sur gélose de Hickey e-t Tresner, il donne sur l'ensemble des milieux de culture où il. a é-té observé une production de pigmen-t soluble en géneral pcu :intenGe, all.ant dc ,jaune bru-n~tre ou gris brun~tre à brun jaune.
D~ns ses culture~ effectuees à 26C, il présente les caract~res biochimiques suivants:
. .
. - production de mélanine : négative - production de H2S : négative : - tyrosinase : négative - liquéfaction de la géla-tine : posi-tive - uti:l:Lsation de la cellulose : posi-tive - production de nitrites à partir : fortement positive, des nitrates aussi bi.en sur bouil-.~ lon nu-tritif nitraté .
.~ que sur milieux syn-thétiques - hydrolyse de l'amidon : positive ~ :
- culture sur lai-t écrémé : peptonisation sans coagula-ti.on; très légèr~ acidifica-tion du pH
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~es caractères culturaux de strePto~ces {~allina ius DS 25.881 sont rassemblés dans le tableau ci-apras. Ce sont ceux de cultures arri~ées à un bon stade de développement, ; c'est-à-dire d'environ 2 à 3 semaines à 26C sau~ indications contraires. Ces caractères ont été observés sur des géloses nutritives et des bouillons habituellement utilisés pour déter-miner les caractères morphologiques des souches de streptomyces, les cultures sur milieux gélosés étant effectuées sur des gélo-ses inclinées. Un certain nombre de milieux de culture employés ont été préparés d'après les formules indiquées dans "The Actinomycetes", S. A. W~KSMA~, p. 193-197, Chronica Botanica Company, Waltham, Mass., U.S.A., 1950; dans ce cas ils sont indigués par la lettre W suivie du numéro ~ui leur a été attri-bu~ dans "The Actinomycete~". Les références ou constitutions des autres milieux sont les suivants:
- Réf. A -"Hickey and Tresner's Agar" - ~.G. PRIDHAM et col. -Antibiotics Annual, 1956-1957, P- 950 - Ré~. B -"Ben~ett's Agar" - S.A. ~ KSMAN - The Actinomycetes, vol. 2, p. 331 - n 30 - The Williams and ~ in~
Company, Baltimore, 1961 - Réf. a -~ormule ~ 23, additionnée de 2~o de gélose ; - Réf~ D -"Yeast Extract Agar". T~G. PRIDHAM et col. ~ Anti~
bioti¢~ Annual, 1956-1957~ p~ 950 - R~ -"Tomato Paste Oatmeal Agar" - T.G. PRID~4~I et col. -Antibiotics Annual~ 1956-1957~ p. 950 - Réf. ~ -"Melanin ~ormation medium" -S.AO ~/AKSM*M - ~he Acti-nomycetes~ ~olO 2~ p~ 33~ n 42 - ~he Williams and Wilkins Company~ ~altimore, 1961 - Ré~. G -W.E. GRUNDY et col~ - Antibiotics and ChemO 2~ 401 - R~f. H -"Inorganic Salts - Starch Agar" - ~.G. PRIDHAM et col. A~tibiotics An~ual 1g56-1957, p. 951 . .

3~05;~3~8 - Réf. I - correspond a la formule W-1, où 3 % de saccharose sont remplacés par 1,5 % de glucose - Réf. J - correspond à la formule ~-1, où 3 % de saccharose son-t remplacés par 1,5 ~ de glycérol - Réf~ K - correspond à la formule W-18, où 3 ~ de saccharose sont remplacés par 1,5 ~ de glucose - Réf. L - correspond à la formule W-18, ou le saccharose est supprimé et remplacé par de petites bandes de papier filtre immergées partiellement dans le liquide ., .
- Réf. ~ - "Manual of Methods for Pure ~ulture ~tudy of Bacte ria" - Soeiety of Ameriean Baeteriologists - Geneva, - Réf. N - "Plain gelatlnl' - préparé suivan-t les indications du ~Manual of ~e-thods for Pure Culture Study of ~acteria"
- Sooiety of ~merican Bacteriologists - Gene~a, N.Y.

- Réf. P - Lait écrémé en poudre eommereial - recons-titué selon les indications du fabrieant - Réf. Q - Milieu indi~ué pour la reeherche de la production de H2S par: H.D. ~RES~R et P. DA~GA - Journal of ~ae-ter1ology~ 239-244, 1958 ., ...... -'.

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105;~3Q~

Streptomyces ~allinarius DS 25.881 présente un ensem- :
ble de ca.ractères qui ne coincide exactemen-t avec aucl~ de ceux des souches déjà décrites, et c'est pourquoi on doi-t le consi-dérer comme une espèce nouvelle.
En considérant les espèces dont la description est - donnée dans "The Actinomycetes" (vol. 2, S.A. WAKSMAN, ~he ',~illiams and Wilkins Company, Baltimore, 1961) ainsi que dans le "Bergey's Manual of Determinat.ive Bacteriology (7ème édition, The Williams and Wilkins Company, Bal.timore, 1957), l'espece ~
laquelle on pourrait logiquement le comparer cst Stre~tomyces `.
hygroscopicus. Comme ce dernier en effe-t, S. gallinarius DS
~5.8~1 développc un mycélium végétatif en géneral jaune ou ;jaune grisatre à jaune brun ou brun jalme e-t présente un myce-lium aérien sporulé gris; il ne forme pas de pigmen-t soluble mélanique sur les milieux organiques, ne produit pas de H2S, liquéfie lentement la gélatine sur laquelle il ne forme pas.-de pigment sol.uble; sur l'ensemble de ses milieux de culture, aussi bien synthétiques qu'organiques, ou il ne donne pas de pigment soluble ou il ne donne que des pigments solubles en général peu intenses, allan-t de jaune brunâtre ou gris brunâ-: tre à brun jaune. En plus de ces carac-tères, S. ~allinarius DS 25.881 possède la proprieté de produire d'une m~nière par-. .
ticulière9 sur l'un des milieux où il a été cul-tivé ~gélose .
de Hickey et Tresner), un pigment soluble violet rose brunâtre, caractère reconnu par H.D. lRESNER et E.J. BACKUS - (Applied ; Microbiology 4, 243-250, 1956) à de nombreu.ses souches apparte- :
nant ~ l'espèce S hygroscopicus et observé sur des milieux va-riables suivant les souches. Toutefois, il diffère de cette espèce par 2 ou 3 caractères essentiels par lesquels elle es-t définie: d'une part la forme de ses sporophores, qui ne corres-pond pas à celle des sporophores de l'espèce S. hygroscopicus, d'autre part le fait de ne former dans aucun cas dans son myGél.ium : -15-, ; .:

~ ~5,,,~3~
aérien sporul.é les zones noires brill~ntes caractéri,stiques de l'espèce S. h,ygrosco,oicus.
S. gallinarius_DS 25.881 pourrait également être rap-proché de S-treptomyces aureofacien.s qui ne produit pas non plus de mélanine, forme en général un mycélium végétatif jaune à
jaune orangé ou brunâtre, présente un mycélium aérien sporulé
gris; de plus, S. aureofaci,ens ne donne pas de pigment soluble sur de nombreux milieux de culture et, lorsqu'il le fait, donne des pigments solubles de coloration jaune à brunâtre d'une ma-ni~re en général assez faible. :Dans certalns cas, le mycé],iumvégétatif de S. aureofaciens se colore en brun rouge à pourpre, mais dans ce cas il s'agit d'un pi~nent ne diffusant pas dans le milieu et qui de ce fait ne peut correspondre au pigment soluble violet rose brunâtre que S. gallinarius I)S 25.881 est susceptible de produire. De plu9, S. aureofac.iens ne liqué~ie pas la gélatine sur laquelle il forme un mycél.ium végétatif . cr~me et ne coagule ni ne peptonise le fait écréme, alors que '' S. gallinarius DS 25.881 liquéfie la gél.atine sur laquelle il forme un mycélium végétatif brun jaune et donne une peptonisa-tion nette et régul.ière du lait écremé. On voit donc que S.
; allinarius DS 25.881 diffère éga].ement de cette dern.ière espèce.
~ a capacité de S. gallinarius DS 25.881 à utiliser diverses sources de carbone ou d'aæote pour assurer son déve-,, loppemen-t a été déterminée suivan-t le principe de la méthode de ~' Pridham et Gottlieb (J. of Bact. 56, 107-114, 1948); le degré
de développement a été observé sur l.e milieu de base indiqué
par les auteurs en remplaçant soi.t le glucose par les diverses sources de carbone respectivement essayées, soit S04(NH4)2 par les diverses sources d'azote respectivement essayées. Les ré-;; '30 sultats sont indi:qués dans le tableau suivant:

-16- .

~lO5i~301~
.

¦ Sources de car- Utilisation Sources d'azote Utilisation .
bone essayees essayees _ l D-Ribo~e négative N03Na positive D-Xylose positive N2Na positive L-Arabinose positive $04(NH4)2 ~ positive L-Rhamnose positive P04H(NH4)2 positive D-Glucose positive Urée positive D~Galactose positive L-Asparagine positive D-~ruc-tose positive GlucoYamine positive D-Mannose positive Glycocolle positive .
~-Sorbose négative Sarcosine négative . Lactose positive DL-Alanine positive ,~ Maltose positive DL-Valine positive Saccharose positive Acide D~-~ . aspartique positive ? Tréhalose positive Acide L- :
. . . glutamique positive ~ Cellobiose positive L-Arginine positive Raffinose négative L-Lysine positive Dextrine positive DL-Serine positive Inuline négative DL-Thréonine positive ; Amidon positive DL-Methionine positive si, Glycogène positive Taurine négati~e Glycérol positive D~-Phénylalanine positive .~ Erythritol n~gative L-Tyrosine positive :~
., Adonitol négative DL-Proline positive 1 Dulcitol négative L~Hydroxyproline positive .. D-Mannitol positive L~ryptophane positive D-Sorbitol névative Bétaine négative Inositol positive Salicine positive _ _ _ _ _ _ _ ~

'1 :
, .
t~ - 17 -., Los~3~
Le procédé de préparation du 30.504 RP consiste essen--tiellement à cultiver Streptomyces gallinarius ])S 25.881 ou ses mutants producteurs, sur un milieu et dans des conditions appro-priees et à séparer le produit formé au cours de la culture.
~a culture de Streptomyces gallinarius DS 25.881 peu-t être effectuée par toute méthode de culture a.érobie en surface ou en profondeur mais cette dernière est à préférer pour des raisons de commodité. On utilise à cette fin les différents types d'appareils qui sont d'un usage courant da,ns l'indus-trie des fermentations.
On peut en particulier adopter la marche suivan-te pour .~ la conduite des opérations:
Streptomyces gallinarius DS 25.8~1 - stock cul.ture sur gélose culture en fiole agitée culture inoculum en fermen-teur ..

.: culture de production en fermenteur ~e milieu de fermentation doit contenir essentielle-ment une source de carbone et une source d'azote asslmi.lables, des eléments minéraux, en par-ticu.L.ier des chLoxures, et cven-tuellement des facteurs d~ croissance, tous ces élémen-ts pou-vant être apportes sous forme de produits bien définis ou par des mélanges complexes, tels qu'on en rencon-tre dans des pro-duits biologiques d'origines diverses.
Comme sources de carbone assimilable, on peu-t utiliser des hydratcs de carbone tels que le glucose, le saccharose, le maltose, les dextrines, l'amidon ou d'autres substances hydro-carbonées comme des sucres alcools (glycérol) ou comme certains acides organiquesi: acides lac-tique, citrique. Certaines huilcs ., animales ou végétales comme l'hui.]e de lard ou l'hui-te de soja : .

.
.~ .

5'~;3~
peuven-t rcmplacer avantageusemerlt ces différen-tes sources hy-drocarbonées, ou leur ~tre adjointes.
~ es sources convenables d'azote assimilable sont ex-trêmement variées. Elles peuvent ~tre des subs-tances chimiques très simples comme les sels minéraux ou organiques d'ammonium, l'urée, certains acides aminés. Elles peuvent aussi être ap-portées par des substances complexes contenan-t principalement de l'azote sous forme protidique: caséine, lactalbumine, g]u-ten et leurs hydrolysats, farine de soja, d'arachide, de poisson, extraits de viande, de levurc, distillers' solubles, corn-steep. :
Par~i les ~léments minéraux ajoutes, certains peuvent avoir un ef~et tampon ou neu-tralisant comme les phosphates al-calins ou alcalino-terreux ou les carbonates de ca]cium ou de rnagnesium. D'autres apportent l'équilibre ionique nécessaire au développement dc Streptom~cc~ ga:l.lirlarius ~S 25.~81 et à
l'élaboration du 30.504 RP comme les chlorures et sulfates de métaux alcalins et alcalino-terreux. Enfin certains agissent plus spécialement comme activateurs des réactions métaboliques de Streptomyces ~llinarius DS 25.881, ce son-t les sels de zinc, de cobalt, de fer, de cuivre, de manganèse.
Les ~acteurs de croissance sont des produits de nature vi-taminique tels que la riboflavine, l'acide folique, l'aclde panto-thénique.
~ e pH du milieu de fermentation au départ de la cul-ture doit etre compris entre 5,8 et 7,8 et de préférence en-tre 6,2 et 7,4. ~a -température optimale pour la fcrm~n-tation est comprise entre 25 et 30C, mais une production satisfaisante es-t obtenue pour des températures comprises entre 23 et 33C.
L'aéxation de Ia fermentation peut varier entre des valeurs assez larges. On a cependant trouvé que dc~ aérations de 0,3 à 3 litres d'air par litre de bouillon et par minute convien-~;, . `

.
~ . . . .

~ 05 ~ 3 ~ ~nent particulièrement bien. ~e rendement maximal en ~0.50~ RP
est obtenu après 2 à 8 jours de culture~ ce temps dépendant essentiellement du ~lilieu utilisé.
D'après ce qui précède, on c~lçoit que les condi-tions générales de la culture de Streptomyces gallinarius DS 25.881 pour la production du ~0.504 RP peuvent varier dans une large mesure et être adaptées à chaque nécessité particulière.
~ e 30.504 RP peut être isolé des mo~ts de fermenta-tion de la manière suivante:
Le moût est filtré à un pH acide, généralement compris entre 3 et 6 et de préférence voisin de 5, en présence d'un adjuvant de filtrati~n.
~ 'aotivite retenue dans le gâteau de filtration en es-t extraite à l'aide d'un solvant organique approprié, alcool in-férieur tel ~ue le méthanol ou solvant chloré tel que le chlo-rure de méthylène. ~e produit brut peut être isolé à partir des solutions organiques mentionn~es ci-dessus par cristallisa-tion après ooncentration de oes solutions sous presslon réduite, addition é~entuelle d'un mauvais solvant ou d'un non solvant et ~20 séjour en chambre froide.
~ e 30.504 RP peut être puri~ié par les méthodes clas-siques en usage~ telle que la recristallisation, la chromato-graphie sur di~ers agents adsorbants ou la distribution à contre-courant.
L'exemple suivant, donné à titre ~on limQtatif~ montre comment l'invention peut être mise en pratiqueO

a) - ~erm_n_at~o~: `
On charge dans un fermenteur de 170 litres:
- Peptone o- 1200 g - ~xtrait de levure 0... 600 g - Glucose monohydraté .~. 1200 g ., l~S;~3~3 - Amidon partiellement hydrolysé ... 2400 g - Eau de villc complément pour ... 110 litres ~ e pH est ajusté à 7,3 par addition de 50 cm3 de soude 10 N. On stérilise le milieu par barbotage de vapeur à
122C pendan-t 40 minutes; après refroidissemen-t, du fait de la condensation de vapeur au cours de la stérilisation, l.e volume du bouillon est de 120 litres et le pH est de 6,90.
On ensemence avec 200 cm3 d'un culture en erlenmeyer agité du Streptomyces gallinarius DS 25.881. ~a culture est développé pendant 21 heures en agi-tant et en aérant avec de 19 air stérile; elle est alors convenable pour l'ensemencemen-t de la culture productrice.

. ~
~ a culture productrice est effectuée dans un fermen-teu:r de 800 litre~ chargé avec les ~ub~tanccs suivantes:
- Distillers' solubles .. ~ 12,5 kg . - Saccharose ... 12,5 kg - Chlorure de sodium ... 2,5 kg : - Sulfate de magnésium heptahydraté ... 1,0 kg - Solution de chlorure de cobalt hexahydraté, à 20 g/l ... 0,5 litre ~ - Eau de ville complément pour ... 460 litres Le pH du rnilieu e~t a~jus-te à 7,5 par addition de 720 .. cm3 de soude 10 N, puis on stérili~e le milieu par barbotage ; de vapeur à 122C pendant 40 minutes. Après relroidissement, .
; du fait de la condensation de vapeur au cours de la stérilisa-.~. tion, le volume du bouillon est de 500 litres et le pH du miIieu est de 6,40; en ensemenoe avec 50 litres de la culture inoculum en fermenteur de 170 litres décrite ci-desaus. ~a culture est ~- -développé durant 116 heures à 27C en agi-tant avec une turbine .
tournant à 205 t/mn et en aérant avec un volume d'air stér.ile ~, de 20 m3/h. I.'abaissement du pll en début de culture est limite - ~.

à 6,5 par addition autom~-tique de soude 5 N (quanti-té totale -~-utilisée: 0,5 litre).

, ~05'~3~1~
En fin d'opération le pH de la culture est de 7,85 et le volume de 470 litres.
b) - ~xtraQtion : ' -1000 litres du moût obtenu dans les conditions indi-quées précédemment sont agités pendant une demi-heure après acidification à pH 5 par addition de 7 litres ~'une solution d~acide chlorhydrique 6 ~.
Apres mélange avec 35 kg d~adjuvant de ~iltration le moût est filtré sur filtre-presseO Le gâteau de ~iltration est lavé sur le flltre par 200 litres dleau dont le pH est ajusté à 5 par une solution d~acide chlorhydrique 6 N, ~e filtrat et le lavage son-t éliminésO
~ e gateau de ~iltra-tion est délit~ dan~ 700 litres de méthanol; le mélange obtenu est amené à p~I 7 par additi~n de 470 cm3 de soude 6 N et agité pendant une demi-heureO
~ e mélange est ~iltré sur filtre-presse et le gâ-teau ; de ~iltration lavé sur le filtre par 100 litres de méthanol~
, ~e filtrat et le lavage sont réunis et concentrés 90US pression réduite (5 à 10 mm de mercure) de ~açon ~ obtenir 60 litres de ¢oncentrat aqueux.
Ce concentrat est ajusté ~p~I3par addition de 580 cm3 de solution d~acide chlorhydrique 6 N et agité pendant 10 minu-teæ a~ec 40 litres de chlorure de méthylène. Les deux phasas ~ont séparées. On extrait encore la phase agueuse successive-ment par 30 litres et 20,1itres de chlorure de méthylèneO
Les extraits chlorométhyléniques sont réunis et agités avec 9 litres d~eau en acidifiant ausqu'à obtention de pH 3 dans la phase aqueuse ~20 cm3 diacide chlorhydrique 6 N). I,a -; phase organi'~ue est séparée, pUiB lavée a nou~eau par 18 litres d;leau, en ajoutant de la soude jus~u~à obtention de pH 9,5 dans la phase a~ueuse ~20 cm'~ de soude 6 N~. La phase chlorométhylé-~i~ue est concentrée ~ous pression réduite (5 à 10 mm de mercu-re.) jusqu'à un volume de 1 litre environO

_ 22 - ' - ~)5~3~3 Le concentré chlorométhylénique ainsi obtenu est ver-sé lentement dans 10 litres d'hexane. ~a solution est filtrée.
On sépare ainsi 7,5 g d'un insoluble inastif. ~e filtrat est concentré jusqu'à un volume de 1 litre environO ~e concentrat, additionné d'un litre d'acéta-te d'éthyleg est agité en présen-ce de 1 litre dteau. On ajuste le pH à 3 par addition de solu-~ tion chlorhydrique 6 N.
- ~a phase organique est séparée et concentrée à un vo-lume de 1 litre. Le 30.504 RP cristallise lentement par repos de la solution ~ ~40a. Les cristaux obtenus sont séparés par filtration et lavés par 50 cm3 d'hexane à 4a puis séchés a 35C sous pression rédui-te (5 à 10 mm de mercure). On obtient ainsi 76 g de 30.504 RP brut ~ous forme acide.
c) - Purification :
76 g de produit précédemment obtenu sont dissous ; dans 1520 cm3 d'acétone. On agite la solution pendant une demi- -heure en présence de charbon actif. La suspension est filtrée et le filtre lavé par 100 cm3 d'acétone. Le filtrat et le la-vage sont réunis; on ajoute alors 850 cm3 d'eau en agitant len-tement à 0C et on laisse reposer à,4C. ~es cristaux apparus sont séparés par filtration~ lavés par 100 cm3 du mélange acéto-ne-eau (1-3 en volumes) et séchés sous pression réduite (5 à 10 mm de mercure) ~ j5C. On obtient ainsi 68~5 g de 30.504 RP.
~ d) - Recristaalisation :
- 68 g du produi-t ainsi obtenu sont dissous dans 2,8 li~
tres d'hexane. La solution est agitée pendant 7 heures dura~t lesquelles le produit recristallise lentement~
La suspension est laissée en repos 15 heures à ~4C
puis les cristaux sont séparés par filtration, lavés par 100 cm3 d'hexane et séchés gUspression réduite ~5 à 10 mm de mercure~
pendant 12 heures à 35C. On obtient ainsi une première frac-tion de 54 ~ de 30.504 RP sous forme acide.
' ~ ~ - 23 -l[)S~'31~

On peu-t ob-tenir une deuxième fraction en concentrant les eaux-mères sous pression réduite (5 à 10 mm de mercure) jusqu'~ un volume de 0~4 litre e-t en laissant reposer 12 heu-res à +4C. ~es cristaux formés sont séparés par filtration, lavés par 20 cm3 d~hexane et séchés sou~ pression réduite (5 à
10 mm de mercure) pendant 12 heures à ~5C. On ob~tient ainsi une deuxième fraction de 10 g de 300504 RP sous forme acide.
Un autre objet de la présente in~ention est constitué
par les compositions ~nticoccidienne~ qui con-tiennent le 30.504 RP ou ses sels métalliques ou sels avec les bases azotées et9 plus particulièrement, par les aliments mixtes pour animaux ou les mélanges concentrés pour l'alimen-tation animale renfermant le 30.504 RP ou se3 sels métalli~ues ou sels avec les bases azot~e~ éventuellement en pr~sence d~un autre agent anticooci-dien.
La dose nécessaire pour produire un effet convenable peut naturellement varier dans dtassez larges limites suivan-t la valeur des aliments eux-memes.
D~une façon générale~ il suffit que les rations ali-mentaires mises à la disposition des animaux contiennent deOtO05 à 0~04 ~ en poids de ~0.504 RP ou de ses sels métalliques ou sels avec les bases azoteesO
~ e 30.504 RP ou ses sels metalliques ou sels avec les bases azotées peut être réparti en dispersion uniforme dans les aliments composés complets aux doses ci-dessus.
Il peut être réparti dans les aliments complémentaires, le plus so~vent avec dlautres additifs -tels que vitamines et sels minéraux. Ces aliments complémentaires peuvent être 50it mélangés à la ration, soit consommés tels quels, et représen-~0 tent habituellement 5 à 20 % de la ration~
~ es "premixes", u-tilisés pour la préparation des ra-tions complètes ou des aliments complémentaires contiennent . I ~
- , ~ ~ ~
. .
: ......... ~ . . .

~ 3 ~ ~

habituellement de 0905 à 20% de 30.504 RP ou de ses sels métal-liques ou sels avec les bases azotées dilué dans une charge alimentaireO Ils constituent unintermédiaire commode facili-tant la répartition uniforme du produit actif dans les aliments.
~es prémixes eux-même~ sont généralement obtenus ~ partir de ^ concentrés qui contiennent de 99,9 à 20 % de 30.504 RP ou de ses sels métalli~ues ou sels avec les bas'es azotées addition-né de dénaturants comestibles tels que'colorants alimentaires, aromatisants, agents dispersants ou évitant l'agglomération 0 et ch~rges alimentaires.
~es concentrés et prémixes 90nt généralement pulvéru-~ lents. ~es aliments complémentaires et les aliments composés '~ complets peuvent 8tre soit pulvérulents~ soit BOUS forme de g~anulés pr8parés selon les techni~ues habituelles.
~ exemple suivant, donné àtitre non limitatif~ illus-tre une composition selon l~in~ention : ' Exemple :
~ On prépare un'aliment de base ayant la composition '''~ suivante :
- farine des issues de céréales ...13,41 %
- farine d~orge .. 0 13,41 ~
- farine de maqs ...13,41 -%
- fari~e de blé ...~1~32 %
' - farine de poisson ...8,92 ~
- ~arine de'soja ...8,92 ~O
- farine de fourrage déshydraté .~. 4,56 %
extraits de levure ... 2~33 ~o - lait sec en poudre ... 2,68 %
- chlorure de sodium .. 0,09 ~0 ;~ SO - ¢hlorure de calcium ... 0~89 ~
~ ~ éléments minéraux .. 0 0,06 ~ ' .~ .
. , .

-~lO5;.d308 - complexe vitaminique:
vitamine A ... 4000 UI/kg vitamine D3 ... 1000 UI/kg chlorure de choline ... 11,5 mg/kg riboflavine ... 2,24 mg/kg A cet aliment, on ajoute et répartit uniformément 0 ~ 02~o de 30.504 RP.
Un autre obJ~t de la présente inven-tion est cons-titué
par les compositions à base de 30.504 RP et/ou de ses sels utilisables comme facteur de croissance chez les ruminants (bovins, ovins, caprins~ et comme agen-t de lutte contre la dysen-terie des porc~0 Ces compositions sont constituees par l.es aliments mixtes pour les ruminants et les porcs e-t par les mélanges con-; ce~ntrés pour l'alimentation anima:Le renfermant l'antibiotique 30,504 RP ou ses sels.
~ a dose nécessaire pour produire un efIet convenablepeut naturellement varier dans de larges limi-tes suivant les espèces animales et suivant la valeur nutri-tive des aliments eux-mêmes.
. Il est particulièrement avantageux de mettre à la d.ispositiorl des animaux une quantité journal:ière d'an-bibioti.-que 30.504 RP compri~e en-tre 50 e-t 250 mg par tête d'anima]..
De préference l'antibiotique 30.504 ~P est réparti dans des aliments complémentaires qui en contiennent de 0,01 à 0,1 a~u, le plus souvent avec d'autres additils tels que vita-. mines et sels minéraux. Ces aliments complémentaires peuvent .', être soit mélangé~ à la ra-tio soit consommé3 -tels quels e-t ils représenten-t habituellement environ 1 à 10 ~0 de la ra-tion jour- : .
nalière; le 30.50~ RP correspond a:insi à 0,0001-0101 % e.n poids -:
de la ration journaliere.
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0 5~ 30 ~

~ es "prémixes", utilisés pour la prépa~ation des ra-tions complates ou des aliments complémentaires 9 contiennent généralement de 0~ à 5 ~ d~antibiotique 300504 RP dilué dans une charge alimentaire. Ils constituent un intermédiaire com mode facilitant la répartition uniforme de l'antibiotique 30.504 RP dans les aliments. ~es "prémixes" eux-mAeme~ sont généralement obtenus ~ partir de concentrés qui contiennent 99,9 à 5 ~ d'antibioti~ue 30.504 RP additionné de dénaturan-ts comestibles tels que colorants alimentaires, aromatisants, agents dispersants ou évitant l'agglomération et charges ali-mentaires~
~ es concentrés et "prémlxes" ~ont généralement pulvé-rulents. ~es aliments complémentaires peu~ent être soit pulvé_ rulents soit sous formc de granulés préparés selon les techni- ;
~ue~ habituelles. Dans oes compositions~ l'antibiotigue 300504 RP ou ses sels peut être sous forme de fines particules libres ou recouvertes d'un enrobage~
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Claims (6)

Les réalisations de l'invention au sujet desquelles un droit exclusif de propriété ou de privilège est revendiqué, sont définies comme il suit:

1. Procédé de préparation d'une nouvelle substance antibactérienne et anticoccidienne désignée par le numéro 30.504 RP ainsi que ses sels métalliques et ses sels avec les bases azotées, caractérisé en ce que l'on cultive de façon aérobie Streptomyces gallinarius DS 25.881 (NRRL 5.785), ou ses mutants producteurs, sur un milieu contenant une source de carbone et d'azote assimilables, et des éléments minéraux, à une température comprise entre 23° et 33°C pendant une période de 2 à 8 jours avec un pH au départ de la culture compris entre 5.8 et 7.8, et en ce que l'on isole le 30.504 RP formé au cours de la culture sous forme acide, ou l'un de ses sels métalliques ou en combinaison avec les bases azotées.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé
en ce que le pH du milieu de fermentation au départ de la culture est compris entre 6.2 et 7.4.

3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé
en ce que la température de la culture est comprise entre 25 et 30°C.

4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé
en ce que le milieu de culture est aéré à un taux de 0.3 à
3 litres d'air par litre de bouillon par minute.

5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé
en ce que le 30,504 RP est isolé par filtration du milieu de culture à un pH compris entre 3 et 6 et extraction du 30,504 RP du gâteau de filtration avec du méthanol ou du chlorure de méthylène.

6. Nouvelle substance antibactérienne et anticoccidienne désignée par le numéro 30.504 RP ainsi que ses sels métalliques et ses sels avec les bases azotées, caractérisée en ce que:
- c'est une poudre cristalline blanche facilement soluble dans les solvants chlorés tels que le chlorure de méthylène et le chloroforme, les alcools tels que le méthanol, dans le dimé-thylformamide, relativement soluble dans l'acétone et l'acétate d'éthyle, peu soluble dans l'hexane et pratiquement insoluble dans l'eau, - sa composition élémentaire est voisine de:
C % = 69,4 H % = 9,0 0 % = 21,0 -c'est une substance acide dont l'équivalent neutre (déterminé
en solution dans le diméthylformamide par dosage à l'hydroxy-tétrabutylammonium) est de 830, - son point de fusion (déterminé au banc Kofler) est voisin de 200°C, - son pouvoir rotatoire (déterminé dans le méthanol à la concen-tration de 1 % et pour diverses longueurs d'ondes) est voisin de:
[ .alpha. ] ? = -79° [ .alpha. ] ? = -188° [ .alpha. ] ? = -378°
- son spectre ultra-violet ne présente pas d'absorption caracté-ristique, - son spectre infra-rouge (déterminé à partir de comprimés en mélange avec KBr) présente les bandes d'absorption caractéristiques suivantes:
3440, 3030, 2960, 2938, 2880, 2855, 2640, 2060, 1945, 1900, 1785, 1705, 1632, 1622, 1535, 1458, 1405, 1380, 1325, 1315, 1295, 1272, 1225, 1200, 1172, 1140, 1115, 1100, 1085, 1070, 1045, 1038, 1012, 980, 958, 935, 915, 880, 865, 845, 825, 792, 775, 735, 700, 675, 655, 630, 615, 565, 525, 495, 465, 445 cm-1, - en chromatographie ascendante sur couche mince de gel de silice avec comme solvant le mélange acetate d'éthyle / cyclo-hexane / eau / butanol (50/50/25/5 en volumes) il a un Rf de 0,45 et avec le mélange chlorure de méthylène / méthanol (94/6 en volumes) un Rf de 0,55, - son activité anticoccidienne se manifeste chez le poussin a des concentrations comprises entre 0,005 et 0,04 % en poids dans la nourriture, chaque fois qu'ils sont obtenus par un procédé selon la revendication 1 ou ses équivalents chimiques manifestes.