CH657139A5

CH657139A5 - Facteurs 1, 2, 3, 4 et 5 isoles purs de la teichomycine a(2) utiles notamment comme medicaments antibiotiques et procede pour leur preparation.

Info

Publication number: CH657139A5
Application number: CH3124/83A
Authority: CH
Inventors: Angelo Borghi; Rosa Pallanza; Carolina Coronelli; Giovanni Cassani
Original assignee: Lepetit Spa
Priority date: 1982-06-08
Filing date: 1983-06-07
Publication date: 1986-08-15
Also published as: IL68819A0; PT76831A; KR900008246B1; DK159117C; JPH02291278A; GR78267B; AU1496883A; GB2121401A; BG60529B2; IE831329L; JPH0224278B2; FI831660A0; PT76831B; AU560966B2; JPH0517237B2; CA1208204A; JPH0517236B2; MY8700002A; NO831754L; JPH02291279A

Description

La présente invention concerne des substances antibiotiques individuelles choisies parmi le groupe constitué par le facteur 1 de la Teichomycine A2, le facteur 2 de la Teichomycine A2, le facteur 3 de la Teichomycine A2, le facteur 4 de la Teichomycine A, et le facteur 5 de la Teichomycine A2 sous une forme essentiellement pure, utiles notamment comme médicaments antibiotiques et un procédé pour leur préparation.

La Teichomycine A2 est une des substances antibiotiques différentes que l'on obtient par culture de la souche Actinoplanes teicho-myceticus nov. sp. ATCC 31121 dans un milieu de culture contenant des sources assimilables de carbone et d'azote et des sels minéraux (voir le brevet belge N° 839 259). Selon le mode opératoire décrit dans le brevet précité, on récupère un mélange d'antibiotiques contenant les Teichomycines A], A2 et A3 dans le bouillon de fermentation séparé, par extraction avec un solvant organique approprié non miscible à l'eau et précipitation dans le solvant d'extraction selon des techniques courantes. On sépare ensuite la Teichomycine A, du mélange des antibiotiques ainsi obtenu par Chromatographie sur une colonne de Sephadex. La Teichomycine, après qu'on l'a encore purifiée par passage à travers une résine de polystyrène sulfoné, est caractérisée par une série importante de paramètres physico-chimiques, y compris les Rr, dans un ensemble de systèmes de Chromatographie sur papier et en couche mince dans lesquels ce composé se comporte comme un véritable produit unique.

La titulaire a découvert que, de façon inattendue, la Teichomycine A2 est en fait constituée d'un mélange de plusieurs matières antibiotiques coproduites étroitement apparentées, dont les facteurs principaux ont été appelés facteur 1 de la Teichomycine A2, facteur 2 de la Teichomycine A2, facteur 3 de la Teichomycine A2, facteur 4 de la Teichomycine A2 et facteur 5 de la Teichomycine A2. La titulaire a également découvert que ces facteurs isolés purs se différencient du point de vue biologique du complexe constitué par la Teichomycine A2 en ce qu'ils ont un degré accru d'activité antibiotique contre les micro-organismes sensibles.

On prépare les substances antibiotiques de l'invention à partir de la Teichomycine A2 qui est décrite dans le brevet belge précité par séparation du complexe antibiotique en les facteurs isolés selon des méthodes très efficaces de Chromatographie et par récupération des substances principales.

Les termes «Teichomycine A2», «complexe Teichomycine A2» ou «complexe d'antibiotiques», tels qu'on les emploie dans la présente description, désignent le mélange contenant les cinq facteurs antibiotiques coproduits ci-dessus que l'on peut obtenir par exemple comme indiqué dans le brevet belge N° 839 259 et qui y sont appelés Teichomycine A2.

La séparation du complexe en les facteurs principaux isolés purs peut être obtenue par Chromatographie de partage en phase inverse ou par Chromatographie d'échange d'ions. Dans le premier cas, on emploie de façon pratique un gel de silice inactivê comme garnissage de la colonne et un gradient d'élution d'acétonitrile, formiate d'ammonium aqueux comme système de développement, tandis que, dans le second cas, on emploie de façon appropriée un échangeur d'anions de type gel faible comme phase stationnaire et des tampons aqueux ou des mélanges de tampons aqueux et de solvants non aqueux comme systèmes d'élution. En particulier, on a obtenu des résultats optimaux de la séparation par passage d'une solution de Teichomycine A2 dissoute dans un mélange de formiate d'ammonium aqueux dilué et d'acétonitrile à travers une colonne de gel de silice silanisé en développant la colonne avec un gradient d'élution dans le même système solvant. On obtient également de bons résultats en employant le dérivé diéthylaminoéthylique de l'agarose comme phase stationnaire et en effectuant la séparation par élution progressive avec des solutions tampons ou des mélanges de solutions tampons et de solvants non aqueux miscibles à l'eau.

On suit la séparation par Chromatographie liquide haute pression (CLHP). On combine les fractions ayant un profil de CLHP semblable si on le désire, puis on purifie par CLHP préparative et on élimine les sels. A partir de ces solutions, on récupère ensuite les facteurs isolés par évaporation des solvants organiques, élimination de l'eau jusqu'à un faible volume et addition d'un excès d'un solvant organique dans lequel les composés ne sont pas solubles pour précipiter les produits obtenus.

L'exemple particulier suivant est présenté pour mieux illustrer le procédé de l'invention. Cependant, on ne doit pas considérer que les conditions particulières décrites dans cet exemple limitent l'invention.

Séparation des facteurs 1, 2, 3, 4 et 5 de la Teichomycine A:

On dissout 10 g du complexe Teichomycine A2 obtenu dans le procédé décrit dans le brevet belge N° 839 259 dans 1 1 d'un mélange 9 1 de formiate d'ammonium à 0,2% et d'acétonitrile et on ajuste à pH 7,5 avec de l'hydroxyde de sodium 1 N. On fait passer cette solution à travers une colonne contenant 500 g de gel de silice 60 silanisé (Merck).

On élue ensuite la colonne avec un gradient linéaire de 10% à 20% d'acétonitrile dans une solution de formiate d'ammonium à 0,2% avec un volume total de 10 1.

On recueille des fractions d'environ 20 ml qu'on contrôle par CLHP.

Les temps de rétention (tR) des facteurs 1, 2, 3, 4 et 5 de la Teichomycine A2, dans une séparation CLHP représentative, figurent dans le tableau I suivant (les conditions opératoires figurent en dessous du tableau).

( Tableau en tête de la colonne suivante )

Phase mobile: gradient linéaire de 0% de B à 50% de B dans A en 40 minutes

A) mélange 9 1 de NaII2P04 25 mM acétonitrile tamponné à pH 6,0 avec du NaOH 0.1 N

B) mélange 31 de NaH,P04 25 mM acétonitrile tamponné à pH 6.0 avec NaOH 0,1 N

Débit: 2 ml min

Détecteur: photomètre U.V. à 254 nm

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

5

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Tableau I

Facteur de la Teichomycine A2

Temps de rétention (minutes)

1

i

21 2 22,6

3

23,3

4

25,8

5

26,4

Dihydroxy-3,5 toluène

(étalon interne)

8,84

Colonne: Zorbax ODS 5

(Du Pont)

On combine les fractions ayant un profil de CLHP semblable et on évapore le solvant organique sous pression réduite. On fait passer les solutions aqueuses résiduelles à travers une colonne contenant 10 g de gel de silice silanisé (60) (Merck). On lave la colonne avec de l'eau distillée pour éliminer le formiate d'ammonium puis on élue avec de racétonitrile aqueux à 50%.

On concentre l'éluat sous un faible volume avec addition de butanol pour faciliter l'évaporation de l'eau puis on précipite avec un mélange 1/1 d'acétone et d'éther éthylique. On obtient selon le mode opératoire ci-dessus 410 mg du facteur 1 pur de la Teichomycine A2 et 770 mg du facteur 2 pur.

Le facteur 3 de la Teichomycine A2, en mélange 1,1 avec le facteur 2 de la Teichomycine, est de plus purifié par CLHP sur une colonne semi-préparative dans les conditions opératoires suivantes. Colonne: Partisil ODS M 9 10/50 Whatman Phase mobile: formiate d'ammonium à 0,2% dans H20 acétonitrile (76/24)

Débit: 4,5 ml/min

Détecteur: photomètre U.V. à 254 nm Charge: 20 mg

Dans ce cas également, on suit la purification par contrôle de chaque fraction par CLHP.

On combine les fractions contenant le facteur 2 de la Teichomycine A2 pur ainsi que les fractions contenant le facteur 3 de la Teichomycine A2 pur, on élimine les sels et on précipite comme précédemment décrit (rendement: 510 mg de facteur 2 de la Teichomycine A2 et 520 mg de facteur 3 de la Teichomycine A2).

On combine les fractions contenant les facteurs 4 et 5 dans la proportion de 1/1 (environ 500 mg) provenant de la première colonne avec un autre ensemble de fractions contenant un mélange des facteurs 4 et 5 (environ 490 mg) obtenus de façon semblable dans une seconde séparation parallèle et on les sépare par CLHP semi-préparative en employant les mêmes conditions opératoires que celles indiquées ci-dessus pour la préparation du facteur 3 de la Teichomycine A2 pour obtenir 350 mg de facteur 4 de la Teichomycine A2 et 300 mg de facteur 5 de la Teichomycine A2.

Caractéristiques physico-chimiques des facteurs isolés purs de la Teichomycine A 2

Le facteur 1 de la Teichomycine A2 est une poudre amorphe blanche qui, par chauffage, commence à noircir à environ 220' C et est complètement décomposée à 255 C et qui a les caractéristiques suivantes:

a) Il est facilement soluble dans l'eau à pH > 7,0 ou à pH < 2, dans le diméthylformamide, dans le dimêthylsulfoxyde et dans le propylèneglycol:

faiblement soluble dans le méthylcellosolve et le glycérol; très peu soluble dans le méthanol et l'éthanol. presque insoluble dans le chloroforme, le benzène, l'hexane normal, l'acétonitrile, l'éther éthylique, l'acétone, l'acétate d'éthyle et le tétrachlorure de carbone;

b) il a un spectre d'absorption ultraviolette qui est illustré par la figure 1 du dessin annexé qui présente les maximums d'absorption suivants:

— dans l'acide chlorhydrique 0,1 N:

^,n„: 278 nm; {Hi= 49,5)

— dans le tampon phosphate à pH 7,4:

278 nm; (Eljj, = 50,0)

s — dans l'hydroxyde de sodium 0,1 N :

^„:297 nm;(Eiä = 72,1)

c) un spectre d'absorption infrarouge dans le nujol, illustré par la figure 2 des dessins annexés, avec les maximums d'absorption sui-

io vants: 3700-3100, 2960-2840 (nujol), 1645, 1590,1510, 1460 (nujol), 1375 (nujol), 1305, 1230, 1180, 1155, 1060, 10,25, 970, 890, 845, 815, 720 (nujol);

d) une analyse élémentaire après séchage préalable de l'échantillon à environ 140' C sous atmosphère inerte (% Ap = 8,5) qui

15 indique la composition (moyenne) suivante exprimée en pourcentages: carbone: 56,70%; hydrogène: 4,90%; azote: 6,65%; chlore: 3,80% ; oxygène (par différence): 27,95%;

e) un temps de rétention (tR) de 21,2 minutes lorsqu'on l'analyse par CLHP en phase inverse avec une colonne de Zorbax ODS de

20 5 nm et qu'on élue avec un gradient linéaire de 0% à 50% de solution B dans la solution A en 40 minutes (solution A: NaH2P04 25 mM/acétonitrile (9/1) tamponnée à pH 6,0 avec NaOH 0,1 N;

solution B: NaH2PO+ 25 mM/acétonitrile (3/7) tamponnée à pH 6,0

25 avec NaOH 0,1 N) avec un débit de 2 ml/min; (étalon interne: dihy-droxy-3,5 toluène; tR: 8,84 minutes);

f) les groupes suivants de signaux dans le spectre de RMN-'H à 270 MHz (la totalité du spectre est illustrée par la figure 3 des dessins annexés) enregistré dans le DMSO-d6 avec addition de quel-

30 ques gouttes de D20 (concentration: 25 mg/0,5 ml) (TMS comme étalon interne: 5 = 0,00 ppm): 0.8-1,5 (m); 1,7-2,3 (m); 2,7-4,0 (m); 4,0-4,7 (m); 4,8-5,8 (m); 6,2-8,1 (m)

g) une fonction acide capable de former des sels;

h) une fonction basique salifiable;

35 i) un poids moléculaire d'environ 1875 comme déterminé par l'analyse de spectrométrie de masse avec un bombardement atomique rapide (BAR) comme source d'ions [pour un exposé de la spectrométrie de masse BAR, voir par exemple M. Barber et coll., «Nature», 293, N° 5830, 270-75 (1981)].

40 Le facteur 2 de la Teichomycine A2 est une poudre amorphe blanche qui commence à noircir lorsqu'on la chauffe à 210" C et qui est complètement décomposée à 250 C et qui a les caractéristiques suivantes:

a) Il est facilement soluble dans l'eau à pH > 7,0 ou à pH < 2,

45 dans le diméthylformamide, le dimêthylsulfoxyde et le propylèneglycol;

faiblement soluble dans le méthylcellosolve et le glycérol; très peu soluble dans le méthanol et l'éthanol; presque insoluble dans le chloroforme, le benzène, l'hexane normal, l'acétonitrile, l'éther éthyli-

50 que, l'acétone, l'acétate d'éthyle et le tétrachlorure de carbone;

b) il a un spectre d'absorption ultraviolette qui est illustré par la figure 4 des dessins annexés, qui présente les maximums d'absorption suivants:

55 — dans l'acide chlorhydrique 0,1 N:

278 nm; (EÜ = 48)

— dans le tampon phosphate à pH 7,4:

Âm„: 278 nm; (Ej^ = 49,0)

— dans l'hydroxyde de sodium 0,1 N :

60 XTOa:297nm;(E!ä, = 70,0)

c) un spectre d'absorption infrarouge dans le nujol, illustré par la figure 5 des dessins annexés, avec les maximums d'absorption observables suivants: 3700-3100, 2960-2860 (nujol), 1645, 1590, 1510, 1460 (nujol), 1375 (nujol), 1300, 1260, 1230, 1180, 1150, 1060, 1025,

65 970, 890, 845, 815, 720 (nujol).

d) une analyse élémentaire après séchage préalable de l'échantillon à environ 140 C sous atmosphère inerte (% Ap = 9,8) qui indique la composition (moyenne) suivante exprimée en pourcenta

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6

ges: carbone: 56,15%; hydrogène: 5,15%; azote: 6,30%; chlore: 3,90%; oxygène (par différence): 28,50%;

e) un temps de rétention (tR) de 22,6 minutes lorsqu'on l'analyse par CLHP en phase inverse avec une colonne de Zorbax ODS de

5 nm en éluant avec un gradient linéaire de 0% à 50% de solution B dans la solution A en 40 minutes:

(solution A: NaH2P04 25 mM/acétonitrile (9/1) tamponnée à pH 6,0 avec NaOH 0,1 N;

solution B: NaH,P04 25 mM/acétonitrile (3;7) tamponnée à pH 6,0 avec NaOH 0,1 N), avec un débit de 2 ml'min; (étalon interne: dihy-droxy-3,5 toluène; tR: 8,84 minutes):

f) les groupes suivants de signaux dans le spectre de RMN-'H à 270 MHz (la totalité du spectre est illustrée par la figure 6 des dessins annexés) enregistré dans le DMSO-d6 avec addition de quelques gouttes de D20 (concentration 25 m/0,5 ml) (TMS comme étalon interne; 8=0,00 ppm): 0,7-1,5 (m); 1,8-2.2 (m); 2,7-4,5 (m): 4,6-5,7 (m); 6,2-8,1 (m).

g) une fonction acide capable de former des sels;

h) une fonction basique salifiable;

i) un poids moléculaire d'environ 1877 comme déterminé par la spectrométrie de masse BAR.

Le facteur 3 de la Teichomycine A2 est une poudre amorphe blanche qui, par chauffage, commence à se décomposer à 205 C et est complètement décomposée à 250 C et qui a les caractéristiques suivantes:

a) II est facilement soluble dans l'eau à pH > 7,0 ou à pH < 2, dans le diméthylformamide, le dimêthylsulfoxyde et le propylèneglycol;

faiblement soluble dans le méthylcellosolve et le glycérol; très peu soluble dans le méthanol et l'éthanol; presque insoluble dans le chloroforme, le benzène, l'hexane normal, l'acétonitrile, l'éther êthyli-que, l'acétone, l'acétate d'éthyle et le tétrachlorure de carbone;

b) il a un spectre d'absorption ultraviolette, qui est illustré par la figure 7 des dessins annexés, qui présente les maximums d'absorption suivants:

— dans l'acide chlorhydrique 0,1 N:

Àraax: 278 nm; (Ej^ = 49,2)

— dans le tampon phosphate à pH 7,4:

278 nm: (EJ°m = 50,8)

— dans l'hydroxyde de sodium 0,1 N :

XmM: 297 nm; (Ejä = 72,7)

c) un spectre d'absorption infrarouge dans le nujol, illustré par la figure 8 des dessins anexês, avec les maximums d'absorption observables suivants: 3700-3100, 2960-2850 (nujol), 1645, 1590. 1510, 1460 (nujol), 1375 (nujol), 1300, 1230, 1180, 1150, 1120, 1060, 1030, 970, 890, 845, 820, 800, 720 (nujol);

d) une analyse élémentaire après séchage préalable de l'échantillon à environ 140 C sous une atmosphère inerte (% Ap = 12,0) qui indique la composition (moyenne) suivante exprimée en pourcentages: carbone: 56,26%; hydrogène: 5,20%; azote: 6,69%; chlore: 3,59%; oxygène (par différence): 27,90%;

e) un temps de rétention (tR) de 23,3 minutes lorsqu'on l'analyse par CLHP en phase inverse avec une colonne de Zorbax ODS de

5 nm en éluant avec un gradient linéaire de 0% à 50% de solution B dans la solution A en 40 minutes

(solution A: NaH2P04 25 mM/acétonitrile (9/1) tamponnée à pH 6,0

avec NaOH 0,1 N;

solution B: NaH2P04 25 mM/acétonitrile (3/7) tamponnée à pH 6,0 avec NaOH 0,1 N), avec un débit de 2 ml/min; (étalon interne: dihy-droxy-3,5 toluène; tR: 8,84 minutes);

f) les groupes suivants de signaux dans le spectre de RMN-'H à 270 MHz (la totalité du spectre est illustrée par la figure 9 des dessins annexés) enregistré dans le DMSO-dâ avec addition de quelques gouttes de D20 (concentration 25 mg/0,5 ml) (TMS comme étalon interne; 5 = 0,00 ppm): 0,7-1,5 (m); 1,8-2,0 (m): 2,7-4,5 (m): 4,6-5,7 (m); 6,2-8,0 (m);

g) une fonction acide capable de former des sels;

h) une fonction basique salifiable;

Le facteur 4 de la Teichomycine A2 est une poudre amorphe blanche qui, par chauffage, commence à noircir à environ 210 C et est complètement décomposée à 250 C et a les caractéristiques suivantes :

a) Il est facilement soluble dans l'eau à pH > 7,0 ou à pH < 2, dans le diméthylformamide, le dimêthylsulfoxyde et le propylèneglycol:

faiblement soluble dans le méthylcellosolve et le glycérol; très peu soluble dans le méthanol et l'éthanol; presque insoluble dans le chloroforme, le benzène, l'hexane normal, l'acétonitrile, l'éther éthyli-que, l'acétone, l'acétate d'éthyle et le tétrachlorure de carbone;

b) il a un spectre d'absorption ultraviolette qui est illustré par la figure 10 des dessins annexés qui présente les maximums d'absorption suivants:

— dans l'acide chlorhydrique 0,1 N:

/W 278 nm; (E^ = 52,5)

— dans le tampon phosphate à pH 7,4:

Âm„: 278 nm; (Ej = 52,5)

— dans l'hydroxyde de sodium 0,1 N :

297 nm; (Ej°^ = 75,5)

c) un spectre d'absorption infrarouge dans le nujol, illustré par la figure 11 des dessins annexés, avec les maximums d'absorption suivants: 3700-3100, 2960-2840 (nujol), 1645, 1590, 1510,1460 (nujol), 1375 (nujol), 1300, 1230, 1175, 1140, 1060, 1025, 970, 890, 840, 815, 720 (nujol);

d) une analyse élémentaire après séchage préalable de l'échantillon à environ 140: C sous une atmosphère inerte (% Ap = 9,8) qui indique la composition (moyenne) suivante exprimée en pourcentages: carbone: 56,50%; hydrogène: 5,10%; azote: 6,50%; chlore: 3,80%; oxygène (par différence): 28,10%;

e) un temps de rétention (tR) de 25,8 minutes lorsqu'on l'analyse par CLHP en phase inverse avec une colonne Zorbax ODS de 5 nm en éluant avec un gradient linéaire de 0% à 50% de solution B dans la solution A en 40 minutes;

(solution A: NaH2P04 25 mM/acétonitrile (9/1 ) tamponnée à pH 6,0 avec NaOH 0,1 N;

solution B: NaH2P04 25 mM/acétonitrile (3'7) tamponnée à pH 6,0 avec NaOH 0,1 N) avec un débit de 2 ml/'min; (étalon interne: dihy-droxy-3,5 toluène; tR: 8,84 minutes);

f) une fonction acide capable de former des sels;

g) une fonction basique salifiable;

h) un poids moléculaire d'environ 1891 comme déterminé par la spectrométrie de masse BAR.

Le facteur 5 de la Teichomycine A2 est une poudre amorphe blanche qui commence à noircir lorsqu'on la chauffe à 210r C et qui est complètement décomposée à 250 C et qui a les caractéristiques suivantes:

a) Il est facilement soluble dans l'eau à pH > 7,0 ou à pH < 2, dans le diméthylformamide, le dimêthylsulfoxyde et le propylèneglycol;

b) il a un spectre d'absorption ultraviolette qui est illustré par la figure 12 des dessins annexés, qui présente les maximums d'absorption suivants:

— dans l'acide chlorhydrique 0,1 N :

W.278 nm:(Ei:.; = 49,6)

— dans le tampon phosphate à pH 7,4:

Âmj,: 278 nm: (E|^ = 51,8)

— dans l'hydroxyde de sodium 0,1 N:

Kl.,,:- 297 nm: (Eic:l = 78,8)

5

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25

30

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c) un spectre d'absorption infrarouge dans le nujol, illustré par la figure 13 des dessins annexés avec les maximums d'absorption observables suivants: 3700-3100, 2960-2840 (nujol), 1645, 1590, 1510, 1460 (nujol), 1375 (nujol), 1300, 1230, 1175, 1145, 1060, 1025, 970, 890, 840,815, 720 (nujol):

d) une analyse élémentaire après séchage préalable de l'échantillon à environ 140" C sous atmosphère inerte (% Ap = 10,1) qui indique la composition (moyenne) suivante exprimée en pourcentages: carbone: 56,60%; hydrogène: 5,05%; azote: 6,63%; chlore: 3,85%; oxygène (par différence): 27,87%;

e) un temps de rétention (tR) de 26,4 minutes lorsqu'on l'analyse par CLHPO en phase inverse avec une colonne de Zorbax ODS de

5 |im en éluant avec un gradient linéaire de 0% à 50% de solution B dans la solution A en 40 minutes;

f) une fonction acide capable de former des sels;

g) une fonction basique salifiable;

Chacun des facteurs 1, 2, 3, 4 et 5 de la Teichomycine A2 contient une fonction acide qui est capable de former des sels. Les sels de métal alcalin, de métal alcalino-terreux et les sels d'ammonium acceptables en pharmacie des facteurs 1, 2, 3, 4 et 5 de la Teichomycine A2 constituent d'autres objets de l'invention.

Des sels de métaux alcalins et de métaux alcalino-terreux caractéristiques comprennent les sels de sodium, de potassium, de lithium, de calcium et de magnésium. Les sels d'ammonium comprennent les sels d'ammonium et les sels d'alkyl(CI-C4)ammonium et d'hydroxy-alkyl(C1-C4)ammonium primaires, secondaires ou tertiaires.

On prépare les sels de métaux alcalins et alcalino-terreux selon les modes opératoires habituels couramment utilisés pour préparer les sels métalliques. Par exemple, on dissout le facteur 1, 2, 3, 4 ou 5 de la Teichomycine A2 sous la forme de l'acide libre dans un solvant approprié tel que le propylèneglycol et on ajoute progressivement la quantité stœchiométrique d'une base minérale appropriée choisie à la solution obtenue.

On récupère ensuite le sel de métal alcalin ou alcalino-terreux formé par précipitation avec un non-solvant et filtration.

Sinon, on peut préparer ces sels sous une forme essentiellement anhydre par lyophilisation; dans ce cas, on filtre, pour éliminer toute matière insoluble, les solutions aqueuses contenant les sels désirés résultant de la salification de la forme acide libre avec un carbonate ou un hydroxyde de métal alcalin ou de métal alcalino-terreux choisi de façon appropriée en une quantité telle qu'on obtienne un pH entre 7 et 8 et on lyophilise.

On peut préparer les sels d'ammonium organiques soit par addition de l'amine convenablement choisie à une solution de la forme s acide libre des facteurs 1, 2, 3, 4 et 5 de la Teichomycine A2 dans un solvant approprié, tel que le propylèneglycol, puis élimination par évaporation du solvant et de l'excès d'amine réagissante, soit par contact des deux composés réagissants dans le minimum d'eau puis précipitation des sels obtenus par addition d'un non-solvant, io Comme précédemment indiqué, chacun des facteurs 1, 2, 3, 4 et 5 de la Teichomycine A2 contient également une fonction basique pouvant être salifiée. Leurs sels d'addition d'acides acceptables en pharmacie préparés de façon connue dans l'art par contact des facteurs isolés purs avec un acide assez fort, de préférence avec un acide 15 minéral, constituent un autre objet de l'invention.

Préparation du sel de sodium du facteur 2 de la Teichomycine A:

On porte à 8,0 le pH de 15 ml d'une solution aqueuse de 150 mg 20 du facteur 2 de la Teichomycine A2 par addition goutte à goutte d'hydroxyde de sodium 0,1 N. On filtre la solution obtenue, on la transfère dans la chambre d'un système de lyophilisation et on congèle. Après achèvement de la congélation, on place la chambre sous un vide de 0,13 mbar et on sublime la glace en portant la 25 plaque chauffante à 0 C. On poursuit l'opération jusqu'à ce que le produit soit presque sec (environ 1 % d'humidité). Le titrage d'une solution du sel de sodium du facteur 2 de la Teichomycine A2 ainsi obtenu dans 25 ml d'un mélange 3/1 de méthylcellosolve et d'eau avec de l'acide chlorhydrique 0,1 N montre la présence de deux 30 fonctions titrables caractérisées par les pK suivants: 7,03 et 4,78.

En reprenant le mode opératoire décrit ci-dessus mais en partant des facteurs 1, 3, 4 et 5 de la Teichomycine A2, on obtient les sels de sodium correspondants. La détermination de la quantité de sodium des sels finals confirme la formation d'un sel de monosodium. 35 L'activité antibactérienne in vitro des facteurs 1, 2, 3, 4 et 5 de la Teichomycine A2, qui se sont révélés être principalement actifs contre les bactéries à gram positif, a été déterminée relativement à des isolats cliniques de staphylocoques et de streptocoques selon une méthode de dilution de raison 2 dans un système de microtitration. 40 On a employé respectivement pour les staphylocoques et les streptocoques le Penassay-broth (Difco) et le Todd-Hewitt broth (Difco). On dilue des bouillons de culture d'une nuit pour que l'inoculum final contienne environ 103 unités formatrices de colonies/ml. On détermine la concentration minimale inhibitrice (CMI) comme étant la 45 concentration minimale pour laquelle on n'observe pas de culture visible après 18 à 24 heures d'incubation à 37° C. Les résultats obtenus sont résumés dans le tableau II ci-dessous.

Tableau II

Activité antibactérienne des facteurs 1, 2, 3, 4 et 5 de la Teichomycine A2

C.M.I. ((Xg/ml)

Nombre

Facteur 1

Facteur 2

Facteur 3

Facteur 4

Facteur 5

Micro-organisme de souches de la de la de la de la de la

étudiées

Teichomycine

a2

Staphvlococcus aureus

5

0,8-1,6

0,4-0,8

0,2-0,8

Staphylococcus epidermidis

4

0,2-1,6

0,1-1,6

0,2-0,8

Streptococcus pyogenes

7

0,05-0,1

0,025-0,1

0,025-0,05

0,006-0,05

Streptococcus pneumoniae

6

0,1-0,2

0,05-0,1

Streptococcus faecalis

5

0,2-0,4

0,1-0,4

0,1-0,2

0,1-0,4

Streptococcus mitis

1

0,025

0,0125

0,025

Streptococcus salivarius

1

0,2

0,1

0,05

Streptococcus sanguis

1

0,1

0,05

Streptococcus bovis

1

0.4

0,4

0,2

0,4

Streptococcus agalactiae

1

0,1

0,05

0,1

657 139

8

L'activité microbiologique des facteurs 1, 2, 3, 4 et 5 individuels par rapport au complexe Teichomycine A, pris comme standard a été déterminée selon la méthode de diffusion en gélose avec S. aureus ATCC 6538 comme germe d'essai.

En particulier, on a dissous des quantités appropriées de facteur I de la Teichomycine A2, de facteur 2 de la Teichomycine A2, de facteur 3 de la Teichomycine A2, de facteur 4 de la Teichomycine A2, de facteur 5 de la Teichomycine A, et du complexe Teichomycine A, employé comme standard pour obtenir des concentrations dans le diméthylformamide de 2000 |ig, ml. On a encore dilué ces solutions avec du tampon phosphate 0,067 M à pH 7,4 additionné de 1% de sérum bovin pour obtenir les concentrations suivantes: 2,5, 5, 10 et 20 n 'ml.

On a ensuite fait tremper des disques de papier-filtre dans les solutions des échantillons et on a placé les disques à des intervalles réguliers sur la surface de boîtes de gélose ensemencées avec une suspension du micro-organisme d'essai. On a incubé les boîtes à 37; C pendant 18 heures puis on a mesuré les diamètres des zones d'inhibition. Les valeurs obtenues ont été introduites dans un ordinateur pour calculer l'activité des facteurs individuels par rapport au complexe.

Les résultats obtenus figurent ci-dessous:

Facteur 1 de la Teichomycine A; 841 U.mg

Facteur 2 de la Teichomycine A2 1086 U/mg

Facteur 3 de la Teichomycine A2 1131 U/mg

Facteur 4 de la Teichomycine A, 1066 U,mg

Facteur 5 de la Teichomycine A2 954 U mg

Complexe Teichomycine A, 1000 U mg

On a également étudié l'action des facteurs 2, 3, 4 et 5 de la Teichomycine A2 sur des infections expérimentales de la souris provoquées par S. pneumoniae et S. pvogenes. Les expériences ont été effectuées comparativement avec le complexe Teichomycine A2. Les résultats obtenus figurent dans le tableau III ci-dessous.

Tableau III

Activité antibactérienne in vivo

Composé

DE5i) (mg/kg.j) s.c.

S. pneumoniae L 44

5. pyogenes L 49

Facteur 2 de la Teichomycine A2 Facteur 3 de la Teichomycine A2 Facteur 4 de la Teichomycine A, Facteur 5 de la Teichomycine A, Complexe de la Teichomycine A2

0,28 (0,22-0,34) 0,27 (0,23-0,32) 0,12(0,10-0,14) 0,13(0,10-0,15) 0,35 (0,28-0,44)

0,15(0,13-0,18) 0.13(0,11-0,16) 0,098 -(0,073-0,11) 0,10(0,098-0,13) 0,18 (-)

La toxicité aiguë approximative chez la souris (i.p.) des facteurs 1, 2, 3, 4 et 5 de la Teichomycine A2 figure dans le tableau IV ci-dessous.

Tableau IV

Toxicité aiguë chez la souris (i.p.)

Composé

DL.-, approximative (mg/kg)

Facteur 1 de la Teichomycine A2 Facteur 2 de la Teichomycine A2 Facteur 3 de la Teichomycine A2 Facteur 4 de la Teichomycine Az Facteur 5 de la Teichomycine A,

>1500 <2000 >1500 < 2000 >1000<1500

> 500 <1000

Les résultats ci-dessus montrent que les composés de l'invention que sont le facteur 1 de la Teichomycine A2, le facteur 2 de la Teichomycine A2, le facteur 3 de la Teichomycine A2, le facteur 4 de la Teichomycine A2 et le facteur 5 de la Teichomycine A, peuvent être employés de façon efficace comme ingrédient actif dans des préparations antimicrobiennes employées en médecine humaine et vétérinaire pour la prévention et le traitement de maladies infectieuses provoquées par des bactéries pathogènes sensibles aux ingrédients actifs. Dans de tels traitements, ces composés peuvent être employés tels quels ou sous la forme des facteurs individuels isolés ou, en raison de la similitude des profils d'activité, également sous forme de mélanges de deux ou plusieurs des cinq facteurs en des proportions quelconques.-

Les composés de l'invention peuvent être administrés par voie orale, locale ou parentérale; cependant, on préfère particulièrement l'administration parentérale. Selon la voie d'administration, ces composés peuvent être présentés sous diverses formes d'administration. Les préparations pour l'administration orale peuvent être sous forme de capsules, de comprimés ou de solutions ou suspensions liquides. Comme il est bien connu dans l'art, les capsules et les comprimés peuvent contenir, en plus de l'ingrédient actif, des excipients classiques tels que des diluants comme le lactose, le phosphate de calcium, le sorbitol et similaires, des lubrifiants comme le stéarate de magnésium, le talc, le polyéthylèneglycol, des liants comme la poly-vinylpyrrolidone, la gélatine, le sorbitol, la gomme adragante, la gomme arabique, des agents d'aromatisation et des agents de désintégration et agents mouillants acceptables. Les préparations liquides qui sont généralement sous forme de solutions ou de suspensions aqueuses ou huileuses peuvent contenir des additifs classiques tels que des agents de suspension. Pour l'emploi local, les composés de l'invention peuvent également être préparés sous des formes appropriées à l'absorption par la peau, les muqueuses du nez et de la gorge ou les tissus bronchiques, et peuvent, de façon pratique, être sous forme de pulvérisations ou de produits à inhaler liquides, de pastilles ou de collutoires. Pour le traitement des yeux ou des oreilles, les préparations peuvent être présentées sous une forme liquide ou semi-liquide. Les présentations à usage local peuvent être préparées avec des bases hydrophobes ou hydrophiles sous forme de pommades. de crèmes, de lotions, de badigeons ou de poudres.

Les compositions injectables peuvent être sous forme de suspensions, solutions ou émulsions dans des véhicules huileux ou aqueux et peuvent contenir des agents de formulation tels que des agents de suspension, de stabilisation et ou de dispersion. Sinon, l'ingrédient actif peut être sous la forme d'une poudre qu'on reconstitue au moment de l'emploi avec un véhicule approprié tel que de l'eau stérile.

La quantité de principe actif à administrer dépend de divers facteurs tels que la taille et l'état du sujet à traiter, la voie et la fréquence d'administration et l'agent causal impliqué.

Les facteurs 1, 2, 3,4 et 5 de la Teichomycine A2 sont généralement efficaces à une dose journalière comprise entre environ 0,1 et environ 20 mg d'ingrédient actif par kilogramme de poids corporel, éventuellement divisée en deux prises journalières. Les compositions particulièrement souhaitables sont celles préparées sous forme de doses unitaires contenant environ 50 à environ 250 mg par unité.

Des exemples caractéristiques de préparations de compositions pharmaceutiques figurent ci-après:

On prépare une solution parentérale avec:

100 mg du sel de sodium du facteur 2 de la Teichomycine A2 dissous dans 2 ml d'eau stérile injectable.

On prépare une solution parentérale avec:

250 mg du sel de sodium du facteur 3 de la Teichomycine A2 dissous dans 3 ml d'eau stérile injectable.

On prépare une pommade à usage local avec:

200 mg du facteur 2 de la Teichomycine A2

600 mg de polyéthylèneglycol 4000 U.S.P.

1,2 g de polyéthylèneglycol 400 U.S.P.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

9

En plus de leur activité comme médicament, les composés de l'invention peuvent être utilisés comme agents favorisant la croissance des animaux.

A cet effet, on administre un ou plusieurs des composés de l'invention par voie orale dans un aliment approprié. La concentration 5 exacte employée est celle nécessaire pour apporter une quantité d'agent actif efficace pour favoriser la croissance lorsque des quantités normales d'aliment sont consommées.

On ajoute de préférence les composés actifs de l'invention à un aliment pour animaux par préparation d'un prémélange alimentaire 10 approprié contenant les composés actifs en une quantité efficace et incorporation du prémélange à la ration complète.

657 139

Sinon, on peut mélanger à l'aliment un concentré intermédiaire ou un additif alimentaire contenant l'ingrédient actif.

La façon dont de tels prémélanges alimentaires et de telles rations complètes peuvent être préparés et administrés est décrite dans des ouvrages de référence (par exemple «Applied Animal Nutrition», W.H. Freedman and Co., San Francisco USA, 1969, ou «Livestock Feeds and Feeding», O. and B. Books, Corvallis, Oregon, USA, 1977).

Bien entendu, diverses modifications peuvent être apportées par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédés qui viennent d'être décrits uniquement à titre d'exemples non limitatifs sans sortir du cadre de l'invention.

R

13 feuilles dessins

Claims

657139

2

REVENDICATIONS

1. Composé antibiotique individuel essentiellement pur, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi le groupe constitué par le facteur 1 de la Teichomycine A2, le facteur 2 de la Teichomycine A2, le facteur 3 de la Teichomycine A,, le facteur 4 de la Teichomycine A2 et le facteur 5 de la Teichomycine A2, identifiés respectivement par les caractéristiques physico-chimiques suivantes :

— le facteur 1 de la Teichomycine A2 est une poudre amorphe blanche qui, par chauffage, commence à noircir à environ 220 C et est complètement décomposée à 225 C et qui a) est facilement soluble dans l'eau à pH > 7,0 ou à pH <2, dans le diméthylformamide, dans le dimêthylsulfoxyde et dans le propylè-neglycol;

faiblement soluble dans le méthylcellosolve et le glycérol ; très peu soluble dans le méthanol et l'éthanol, presque insoluble dans le chloroforme, le benzène, l'hexane normal, l'acétonitrile, l'éther éthyli-que, l'acétone, l'acétate d'éthyle et le tétrachlorure de carbone;

b) a un spectre d'absorption ultraviolette qui est illustré par la figure 1 du dessin annexé qui présente les maximums d'absorption suivants:

— dans l'acide chlorhydrique 0,1 N:

Xmj5: 278 nm; (EL'* = 49,5)

— dans le tampon phosphate à pH 7,4:

: 278 nm: (EL'; = 50,0)

— dans l'hydroxyde de sodium 0,1 N:

Xm„:297 nm;(ELm = 72,1)

c) a un spectre d'absorption infrarouge dans le nujol, illustré par la figure 2 des dessins annexés, avec les maximums d'absorption suivants: 3700-3100, 2960-2840 (nujol), 1645, 1590, 1510, 1460 (nujol), 1375 (nujol), 1305, 1230, 1180, 1155, 1060, 1025, 970, 890, 845, 815, 720 (nujol);

d) a une analyse élémentaire après séchage préalable de l'échantillon à environ 140 C sous atmosphère inerte (%Ap = 8,5) qui indique la composition (moyenne) suivante exprimée en pourcentages: carbone: 56,70%; hydrogène: 4,90%; azote: 6,65%; chlore: 3,80%; oxygène (par différence): 27.95%;

e) a un temps de rétention (tR) de 21,2 minutes lorsqu'on l'analyse par CLHP en phase inverse avec une colonne de Zorbax ODS de 5 nm et qu'on élue avec un gradient linéaire de 0% à 50% de solution B dans la solution A en 40 minutes

(solution A: NaH2P04 25 mM acêtonitrile (9/1) tamponnée à pH 6,0 avec NaOH 0,1 N ;

solution B: NaH,P04 25 mM/acétonitrile (3/7) tamponnée à pH 6,0 avec NaOH 0,1 N) avec un débit de 2 ml/min; (étalon interne: dihy-droxy-3,5 toluène; tR: 8,84 minutes);

f) a les groupes suivants de signaux dans le spectre de RMN-'H à 270 MHz (la totalité du spectre est illustrée par la figure 3 des dessins annexés) enregistré dans le DMSO-dö avec addition de quelques gouttes de D20 (concentration de 25 mg/0,5 ml) (TMS comme étalon interne: S = 0,00 ppm): 0,8-1,5 (m); 1,7-2,3 (m); 2,7-4,0 (m); 4,0-4,7 (m); 4,8-5,8 (m); 6,2-8,1 (m):

g) a une fonction acide capable de former des sels;

h) a une fonction basique salifiable;

i) a un poids moléculaire d'environ 1875 comme déterminé par l'analyse de spectrométrie de masse avec un bombardement atomique rapide (BAR) comme source d'ions;

— le facteur 2 de la Teichomycine A2 est une poudre amorphe blanche qui commence à noircir lorsqu'on la chauffe à 210 C et qui est complètement décomposée à 250 C et qui a) est facilement soluble dans l'eau à pH > 7,0 ou à pH < 2, dans le diméthylformamide, le dimêthylsulfoxyde et le propylèneglycol; faiblement soluble dans le méthylcellosolve et le glycérol; très peu soluble dans le méthanol et l'éthanol; presque insoluble dans le chloroforme, le benzène, l'hexane normal, l'acétonitrile, l'éther éthyli-que, l'acétone, l'acétate d'éthyle et le tétrachlorure de carbone;

b) a un spectre d'absorption ultraviolette qui est illustré par la figure 4 des dessins annexés, qui présente les maximums d'absorption suivants:

— dans l'acide chlorhydrique 0,1 N:

Xmsx: 278 nm; (EL,; = 48)

— dans le tampon phosphate à pH 7,4:

X.,3„: 278 nm; (EL,; = 49,0)

— dans l'hydroxyde de sodium 0,1 N :

ÂmM:297nm;(ELi = 70,0)

c) a un spectre d'absorption infrarouge dans le nujol, illustré par la figure 5 des dessins annexés, avec les maximums d'absorption observables suivants: 3700-3100, 2960-2860 (nujol), 1645, 1590, 1510, 1460 (nujol). 1375 (nujol). 1300, 1260, 1230, 1180, 1150,1060, 1025, 970, 890, 845, 815, 720 (nujol);

d) a une analyse élémentaire après séchage préalable de l'échantillon à environ 140: C sous atmosphère inerte (%Ap = 9,8) qui indique la composition (moyenne) suivante exprimée en pourcentages: carbone: 56,15%; hydrogène: 5,15%; azote: 6,30%; chlore: 3,90% ; oxygène (par différence) : 28,50% ;

e) a un temps de rétention (tR) de 22,6 minutes lorsqu'on l'analyse par CLHP en phase inverse avec une colonne de Zorbax ODS de 5 nin en éluant avec un gradient linéaire de 0% à 50% de solution B dans la solution A en 40 minutes;

(solution A: NaH2P04 25 mM/acétonitrile (9/1) tamponnée à pH 6,0 avec NaOH 0,1 N:

solution B: NaH2P04 25 mM/acétonitrile (3/7) tamponnée à pH 6,0 avec NaOH 0,1 N), avec un débit de 2 ml/min; (étalon interne: dihy-droxy-3,5 toluène; tR: 8,84minutes):

f) a les groupes suivants de signaux dans le spectre de RMN-'H à 270 MHz (la totalité du spectre est illustrée par la figure 6 des dessins annexés) enregistré dans le DMSO-da avec addition de quelques gouttes de D,0 (concentration 25 mg/0,5 ml) (TMS comme étalon interne; 5 = 0,00 ppm): 0,7-1,5 (m); 1,8-2,2 (m); 2,7-4,5 (m); 4,6-5,7 (m); 6,2-8,1 (m);

g) a une fonction acide capable de former des sels;

h) a une fonction basique salifiable;

i) a un poids moléculaire d'environ 1877 comme déterminé par la spectrométrie de masse BAR:

— le facteur 3 de la Teichomycine A2 est une poudre amorphe blanche qui, par chauffage, commence à se décomposer à 205e C et est complètement décomposée à 250" C et qui a) est facilement soluble dans l'eau à pH > 7,0 ou à pH < 2, dans le diméthylformamide, le dimêthylsulfoxyde et le propylèneglycol; faiblement soluble dans le méthylcellosolve et le glycérol; très peu soluble dans le méthanol et l'éthanol; presque insoluble dans le chloroforme, le benzène, l'hexane normal, l'acétonitrile, l'éther éthyli-que, l'acétone, l'acétate d'éthyle et le tétrachlorure de carbone;

b) a un spectre d'absorption ultraviolette, qui est illustré par la figure 7 des dessins annexés, qui présente les maximums d'absorption suivants:

— dans l'acide chlorhydrique 0,1 N:

278 nm; (EL., = 49,2)

— dans le tampon phosphate à pH 7,4:

K-a,:- 278 nm: (EL™ = 50,8)

— dans l'hydroxyde de sodium 0,1 N:

A.ra.,x: 297 nm; (EL™ = 72,7)

c) a un spectre d'absorption infrarouge dans le nujol, illustré par la figure 8 des dessins annexés, avec les maximums d'absorption observables suivants: 3700-3100, 2960-2850 (nujol), 1645, 1590, 1510, 1460 (nujol), 1375 (nujol), 1300, 1230, 1180, 1150, 1120, 1060, 1030, 970, 890, 845, 820. 800, 720 (nujol);

d) a une analyse élémentaire après séchage préalable de l'échantillon à environ 140 C sous une atmosphère inerte (%Ap = 12,0) qui indique la composition (moyenne) suivante exprimée en pourcentages: carbone: 56,26%; hydrogène: 5,20%; azote: 6,69%; chlore: 3,95%: oxygène (par différence): 27,90%;

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

3

657 139

e) a un temps de rétention (tR) de 23,3 minutes lorsqu'on l'analyse par CLHP en phase inverse avec une colonne de Zorbax ODS de 5 |xm en éluant avec un gradient linéaire de 0% à 50% de solution B dans la solution A en 40 minutes

(solution A: NaH2P04 25 mM/acétonitrile (9/1) tamponnée à pH 6.0 avec NaOH 0,1 N;

solution B: NaH2P04 25 mM/acétonitrile (3/7) tamponnée à pH 6,0 avec NaOH 0,1 N), avec un débit de 2 ml/min; (étalon interne: dihy-droxy-3,5 toluène; tR: 8,84 minutes);

f) a les groupes suivants de signaux dans le spectre de RMN^H à 270 MHz (la totalité du spectre est illustrée par la figure 9 des dessins annexés) enregistré dans le DMSO-d6 avec addition de quelques gouttes de D20 (concentration 25 mg/0,5 ml) (TMS comme étalon interne; 5 = 0,00 ppm): 0,7-1,5 (m); 1,8-2,0 (m); 2,7-4,5 (m); 4.6-5,7 (m); 6,2-8,0 (m);

g) a une fonction acide capable de former des sels;

h) a une fonction basique salifiable;

i) a un poids moléculaire d'environ 1877 comme déterminé par la spectrométrie de masse BAR;

— le facteur 4 de la Teichomycine A2 est une poudre amorphe blanche qui, par chauffage, commence à noircir à environ 210° C et est complètement décomposée à 250° C et qui a) est facilement soluble dans l'eau à pH > 7,0 ou à pH < 2, dans le diméthylformamide, le dimêthylsulfoxyde et le propylèneglycol; faiblement soluble dans le méthylcellosolve et le glycérol; très peu soluble dans le méthanol et l'éthanol; presque insoluble dans le chloroforme, le benzène, l'hexane normal, l'acétonitrile, l'éther éthyli-que, l'acétone, l'acétate d'éthyle et le tétrachlorure de carbone;

b) a un spectre d'absorption ultraviolette qui est illustré par la figure 10 des dessins annexés qui présente les maximums d'absorption suivants :

— dans l'acide chlorhydrique 0,1 N:

278 nm; (E|°j, = 52,5)

— dans le tampon phosphate à pH 7,4;

À,mM: 278 nm; (Ej^ = 52,5)

— dans l'hydroxyde de sodium 0,1 N:

Xmax: 297 nm; (E^; = 75,5)

c) a un spectre d'absorption infrarouge dans le nujol, illustré par la figure 11 des dessins annexés, avec les maximums d'absorption suivants: 3700-3100, 2960-2840 (nujol), 1645, 1590, 1510, 1460 (nujol), 1375 (nujol), 1300, 1230, 1175, 1140, 1060. 1025, 970, 890, 840, 815, 720 (nujol);

d) a une analyse élémentaire après séchage préalable de l'échantillon à environ 140° C sous une atmosphère inerte (%Ap = 9,8) qui indique la composition (moyenne) suivante exprimée en pourcentages: carbone: 56,50%; hydrogène: 5,10%; azote: 6,50%; chlore: 3,80%; oxygène (par différence): 28,10%;

e) a un temps de rétention (tR) de 25,8 minutes lorsqu'on l'analyse par CLHP en phase inverse avec une colonne Zorbax ODS de

5 |im en éluant avec un gradient linéaire de 0% à 50% de solution B dans la solution A en 40 minutes;

(solution A: NaH2P04 25 mM/acétonitrile (9/1) tamponnée à pH 6,0 avec NaOH 0,1 N;

solution B: NaH2P04 25 mM/acétonitrile (3/7) tamponnée à pH 6,0 avec NaOH 0,1 N) avec un débit de 2 ml/'min; (étalon interne: dihy-droxy-3,5 toluène; tR: 8,84 minutes);

f) a une fonction acide capable de former des sels;

g) a une fonction basique salifiable;

h) a un poids moléculaire d'environ 1891 comme déterminé par la spectrométrie de masse BAR;

— le facteur 5 de la Teichomycine A2 est une poudre amorphe blanche qui commence à noircir lorsqu'on la chauffe à 210e C et qui est complètement décomposée à 250e C et qui a) est facilement soluble dans l'eau à pH > 7,0 ou à pH < 2, dans le diméthylformamide, le dimêthylsulfoxyde et le propylèneglycol; faiblement soluble dans le méthylcellosolve et le glycérol; très peu soluble dans le méthanol et l'éthanol ; presque insoluble dans le chloroforme, le benzène, l'hexane normal, l'acétonitrile, l'éther éthyli-que, l'acétone, l'acétate d'éthyle et le tétrachlorure de carbone;

b) a un spectre d'absorption ultraviolette qui est illustré par la figure 12 des dessins annexés, qui présente les maximums d'absorp-

5 tion suivants:

— dans l'acide chlorhydrique 0,1 N:

A.max: 278 nm; (Ei^ = 49,6)

— dans le tampon phosphate à pH 7,4:

278 nm; (E^ = 51,8)

— dans l'hydroxyde de sodium 0,1 N:

Xmax: 297 nm; (E{°j, = 78,8)

c) a un spectre d'absorption infrarouge dans le nujol, illustré par la figure 13 des dessins annexés, avec les maximums d'absorption u observables suivants: 3700-3100, 2960-2840 (nujol), 1645, 1590, 1510, 1460 (nujol), 1375 (nujol), 1300, 1230, 1175, 1145,1060, 1025, 970, 890, 840, 815, 720 (nujol);

d) a une analyse élémentaire après séchage préalable de l'échantillon à environ 140e C sous atmosphère inerte (% Ap = 10,1) qui

20 indique la composition (moyenne) suivante exprimée en pourcentages: carbone: 56,60%; hydrogène: 5,05%; azote: 6,63%; chlore: 3,85%; oxygène (par différence): 27,87%;

e) a un temps de rétention (tR) de 26,4 minutes lorsqu'on l'analyse par CLHP en phase inverse avec une colonne de Zorbax ODS

25 de 5 nm en éluant avec un gradient linéaire de 0% à 50% de solution B dans la solution A en 40 minutes;

(solution A: NaH2P04 25 mM/acétonitrile (9/1) tamponnée à pH 6,0 avec NaOH 0,1 N;

solution B: NaH2P04 25 mM/acétonitrile (3/7) tamponnée à pH 6,0 30 avec NaOH 0,1 N), avec un débit de 2 ml/min; (étalon interne: dihy-droxy-3,5 toluène; tR: 8,84 minutes);

f) a une fonction acide capable de former des sels;

g) a une fonction basique salifiable;

h) a un poids moléculaire d'environ 1891 comme déterminé par 35 la spectrométrie de masse BAR,

et leurs sels acceptables en pharmacie.
2. Composé antibiotique individuel essentiellement pur selon la revendication 1, caractérisé en ce'qu'il est choisi parmi le groupe constitué par le facteur 1 de la Teichomycine A2, le facteur 2 de la

40 Teichomycine A2 et le facteur 3 de la Teichomycine A2, identifiés par les caractéristiques indiquées dans la revendication 1 et leurs sels de métaux alcalins, de métaux alcalino-terreux et leurs sels d'ammonium acceptables en pharmacie.
3. Composé antibiotique individuel essentiellement pur selon la 45 revendication 1, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi le groupe constitué par le facteur 2 de la Teichomycine A2 et ses sels acceptables en pharmacie.
4. Procédé pour préparer un composé selon la revendication 1, so caractérisé en ce qu'il consiste à séparer la Teichomycine A2 en les facteurs isolés par Chromatographie de partage en phase inverse ou par Chromatographie d'échange d'ions avec éventuellement conversion des composés obtenus en leurs sels acceptables en pharmacie correspondants.

55 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'on effectue la séparation par Chromatographie sur colonne en employant une colonne de gel de silice silanisé avec comme système de développement un gradient d'élution d'acétonitrile dans le formiate d'ammonium aqueux dilué.

60 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'on développe la colonne dans un gradient linéaire de 10 à 20% d'acétonitrile dans une solution de formiate d'ammonium à 0,2%.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé de plus en ce que, lorsqu'on récupère de la colonne un mélange de deux facteurs, on les 65 sépare en les facteurs isolés par Chromatographie sur colonne en phase inverse en employant une colonne d'octadécylsilane et comme système de développement un mélange 24/76 d'acétonitrile et de formiate d'ammonium aqueux à 0,2%.

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4
8. Procédé selon la revendication 6 pour la production du facteur 2 de la Teichomycine A2, caractérisé en ce qu'il consiste à dissoudre le complexe Teichomycine A2 dans un mélange 9/1 de formiate d'ammonium à 0,2% et d'acétonitrile, ajuster le pH à environ 7,5 par addition d'hydroxyde de sodium, faire passer la solution obtenue à travers une colonne de gel de silice silanisé, développer la colonne dans un gradient linéaire de 10 à 20% d'acétonitrile dans une solution à 0,2% de formiate d'ammonium, recueillir les fractions ayant le même profil de Chromatographie liquide haute pression caractéristique du facteur 2 de la Teichomycine A2, éliminer le solvant organique par évaporation sous pression réduite, éliminer les sels de la solution aqueuse résiduelle par passage de celle-ci à travers une colonne de gel de silice silanisé, laver la colonne avec de l'eau, l'éluer avec de l'acétonitrile aqueux à 50%, concentrer l'éluat à un faible volume et en précipiter le facteur 2 de la Teichomycine A2 par addition d'un non-solvant.
9. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'on effectue la séparation par Chromatographie sur colonne en employant le dérivé diéthylaminoéthylique de l'agarose comme phase stationnaire et des solutions tampons ou des mélanges de solutions tampons et de solvants non aqueux miscibles à l'eau comme éluants.
10. Médicaments utiles notamment comme antibiotiques, caractérisés en ce qu'ils contiennent comme produit actif au moins un des composés selon l'une des revendications 1 à 3 ou de leurs sels acceptables en pharmacie.
11. Médicaments selon la revendication 10, caractérisés en ce qu'ils contiennent de 50 à 250 mg du produit actif.