FR2528050A1

FR2528050A1 - Facteurs 1, 2, 3, 4 et 5 isoles purs de la teichomycine a2 utiles notamment comme medicaments antibiotiques et procede pour leur preparation

Info

Publication number: FR2528050A1
Application number: FR8309522A
Authority: FR
Inventors: Angelo Borghi; Rosa Pallanza; Carolina Coronelli; Giovanni Cassani
Original assignee: Gruppo Lepetit SpA; Lepetit SpA
Current assignee: Gruppo Lepetit SpA
Priority date: 1982-06-08
Filing date: 1983-06-08
Publication date: 1983-12-09
Also published as: IE831329L; ZA833607B; IT8321432A0; KR900008246B1; JPH02288887A; HU193538B; FR2528050B1; NO159104C; NZ204480A; ES522941A0; ES8503689A1; JPH0517237B2; MY8700002A; SE8303211D0; PT76831B; FI831660A0; GR78267B; GB2121401B; JPH0224278B2; DK245883D0

Abstract

FACTEURS 1, 2, 3, 4 ET 5 ISOLES PURS DE LA TEICHOMYCINE A UTILES NOTAMMENT COMME MEDICAMENTS ANTIBIOTIQUES ET PROCEDE POUR LEUR PREPARATION; ON RECUPERE CES FACTEURS SELON DES METHODES DE CHROMATOGRAPHIE TRES EFFICACES A PARTIR DE LA TEICHOMYCINE A QUI EST UNE SUBSTANCE ANTIBIOTIQUE CONNUE; LES FACTEURS 1, 2, 3, 4 ET 5, QUI ONT DES PROPRIETES PHYSICO-CHIMIQUES CARACTERISTIQUES (FIGURE), DIFFERENT NOTAMMENT DE LA TEICHOMYCINE A PAR UNE ACTIVITE ANTIBIOTIQUE ACCRUE VIS-A-VIS DES MICRO-ORGANISMES SENSIBLES.

Description

La présente invention concerne des substances antibiotiques individuelles

choisies parmi le groupe constitué par le facteur 1 de la Teichomycine A 2 P le facteur 2 de la Teichomycine A 2 e le facteur 3 de la Teichomycine A 2, le facteur 4 de la Teichomycine A 2 et le facteur 5 de la Teichomycine A 2 sous une forme essen- tiellement pure,utiles notamment comme médicaments antibiotiques

et un procédé pour leur préparation.

La Teichomycine A 2 est une des substances antibiotiques

différentes que l'on obtient par culture de la souche Actino-

planes Teichomyceticus nov sp ATCC 31121 dans un milieu de culture contenant des sources assimilables de carbone et d'azote et des sels minéraux (voir le brevet belge N O 839 259) Selon le mode opératoire décrit dans le brevet précité, on récupère un mélange d'antibiotiques contenant les Teichomycines Al, A 2 et A 3 dans le bouillon de fermentation séparé, par extraction avec un solvant organique approprié nfon miscible à l'eau et précipitation dans le solvant d'extraction selon des techniques courantes On sépare ensuite la Teichomycine A 2 du mélange des antibiotiques ainsi obtenu par chromatographie sur une colonne de Sephadex La Teichomycine, après qu'on l'ait encore purifiée par passage à travers une résine de polystyrène sulfoné, est caractérisée par une série importante de paramètres physico-chimiques, y compris les Rf, dans un ensemble de systèmes de chromatographie sur papier et en couche mince dans lesquels ce composé se comporte comme un

véritable produit unique.

La demanderesse a découvert que,de façon inattendue, la Teichomycine A 2 est en tait constituée d'un mélange de plusieurs matières antibiotiques coproduites étroitement apparentées, dont

les facteurs principaux ont été appelés facteur 1 de la Teichomy-

cine A 2, facteur 2 de la Teichomycine A 2, facteur 3 de la Teicho-

mycine A 2, facteur 4 de la Teichomycine A 2 et facteur 5 de la Teichomycine A 2 * La demanderesse a également découvert que ces facteurs isolés purs se différencient du point de vue biologique du complexe constitué par la Teichomycine A 2 en ce au'ils ont un degré accru d'activité antibiotique contre les micro-organismes sensibles. On prépare les substances antibiotiques de l'invention à partir de la Teichomycine A 2 qui est décrite dans le brevet belge précité par séparation du complexe antibiotique en les facteurs isolés selon des méthodes très efficaces de chromatographie et

par récupération des substances principales.

Les termes "Teichomycine A 2 t', "complexe Teichomycine A 2 " ou "complexe d'antibiotiques", tels qu'on les emploie dans la

présente description, désignent le mélange contenant les cinq

facteurs antibiotiques coproduits ci-dessus que l'on peut obte-

nir par exemple comme indiqué dans le brevet belge N O 839 259

et qui y sont appelés Teichomycine A 2.

La séparation du complexe en les facteurs principaux isolés purs peut être obtenue par chromatographie de partage en phase inverse ou par chromatographie d'échange d'ions Dans le premier cas, on emploie de façon pratique un gel de silice inactivé comme

garnissage de la colonne et un gradient d'élution d'acétonitrile/-

formiate d'ammonium aqueux comme système de développement, tandis

que,dans le second cas, on emploie de façon appropriée un échan-

geur d'anions de type gel faible comme phase stationnaire et des

tampons aqueux ou des mélanges de tampons aqueux et de solvants -

non aqueux comme systèmes d'élution ' En particulier, on a obtenu desrésultats optimaux de la séparation par passage d'une solution de Teichomycine A 2 dissoute dans un mélange de formiate d'ammonium aqueux dilué et d'acétonitrile à travers une colonne de gel de

silice silanisé en développant la colonne avec un gradient d'élu-

tion dans le même système solvant On obtient également de bons

résultats en employant le dérivé diéthylaminoéthylique de l'aga-

rose comme phase stationnaire et en effectuant la séparation par élution progressive avec des solutions tampons ou des mélanges

de solutions tampons et de solvants non aqueux miscibles à l'eau.

On suit la séparation par chromatographie liquide haute pression (CLHP) On combine les fractions ayant un profil de CLHP semblables si on le désire, puis on purifie par CLHP préparative _ 5 et on élimine les sels A partir de ces solutions, on récupère

ensuite les facteurs isolés par évaporation des solvants orga-

niques, élimination de l'eau jusqu'à un faible volume et addition d'un excès d'un solvant organique dans lequel les composés ne

sont pas solubles pour précipiter les produits obtenus.

L'exemple particulier suivant est présenté pour mieux illustrer le procédé de l'invention Cependant, on ne doit pas considérer que les conditions particulières décrites dans cet

exemple limitent l'invention.

Séparation des facteurs 1, 2, 3, 4 et 5 de la Teichomycine A 2 On dissout 10 g du complexe Teichomycine A 2 obtenu dans le procédé décrit dans le brevet belge n 839 259 dans 1 1 d'un mélange 9/1 de formiate d'ammonium à 0,2 % et d'acétonitrile et on ajuste à p H 7,5 avec de l'hydroxyd de sodium 1 N On fait passer cette solution à travers une colonne contenant 500 g de

gel de silice 60 silanisé (Merck).

On élue ensuite la colonne avec un gradient linéaire de

% à 20 % d'acétonitrile dans une solution de formiate d'ammo-

nium à 0,2 % avec unvolume total de 10 1.

On recueille des fractions d'environ 20 ml qu'on contrôle

par CLHP.

Les temps de rétention (t R) des facteurs 1, 2, 3, 4 et 5 de la Teichomycine A 2, dans une séparation CLHP représentative, figurent dans le tableau I suivant (les conditions opératoires

figurent en dessous du tableau).

TABLEAU I

Temps de rétention Facteur de la Teichomycine A 2 (minutes)

1 21,2

2 22,6

3 23,3

4 25,8

26,4

dihydroxy-3,5 toluène (étalon interne) 8,84 Colonne: Rorbax ODS 5 pm (Du Pont) Phase mobile: gradient linéaire de O Z de B à 50 % de B dans A en 40 minutes

A) mélange 9/1 de Na H 2 PO 4 25 m M/acétonitrile tam-

ponné à p H 6,0 avec du Na OH 0,1 N B) mélange 3/7 de Na H 2 PO 4 25 m M/acétonitrile tam- ponné à p H 6,0 avec Na OH 0,1 N Débit: 2 ml/min

Détecteur: photomètre U V à 254 nm.

On combine les fractions ayant un profil de CLHP semblable et on évapore le solvant organique sous pression réduite On fait passer les solutions aqueuses résiduelles à travers une colonne contenant 10 g de gel de silice silanisé ( 60) (Merck) On lave la colonne avec de l'eau distillée pour éliminer le formiate

d'ammonium puis on élue avec de l'acétonitrile aqueux à 50 %.

On concentre l'éluat sous un faible volume avec addition

de butanol pour faciliter l'évaporation de l'eau puis on préci-

pite avec un mélange 1/1 d'acétone et d'éther éthylique On ob-

tient selon le mode opératoire ci-dessus 410 mg du facteur 1 pur

de la Teichomycine A 2 et 770 mg du facteur 2 pur.

Le facteur 3 de la Teichomycine A 2, en mélange 1/1 avec le facteur 2 de la Teichomycine, est de plus purifié par CLHP sur une colonne semipréparative dans les conditions opératoires suivantes. Colonne: Partisil ODS M 9 10/50 Whatman Phase mobile: formiate d'ammonium à 0,2 % dans H 20/acétonitrile

( 76/24)

Débit: 4,5 ml/min Détecteur: photomètre U V à 254 nm

Charge: 20 mg.

Dans ce cas également, on suit la purification par contr 8 le

de chaque fraction par CLHP.

On combine les fractions contenant le facteur 2 de la Tei-

chomycine A 2 pur ainsi que les fractions contenant le facteur 3 de la Teichomycine A 2 pur, on élimine les sels et on précipite comme précédemment décrit (rendement: 510 mg de facteur 2 de la s

Teichomycine A 2 et 520 mg de facteur 3 de la Teichomycine A 2).

On combine les fractions contenant les facteurs 4 et 5

dans la proportion de 1/1 (environ 500 mg) provenant de la pre-

mière colonne avec un autre ensemble de fractions contenant un mélange des facteurs 4 et 5 (environ 490 mg) obtenus de façon semblable dans une seconde séparation parallèle et on les sépare

par CLHP semi-préparative en employant les mêmes conditions opé-

ratoires que celles indiquées ci-dessus pour la préparation du facteur 3 de la Teichomycine A 2 pour obtenir 350 mg de facteur

4 de la Teichomycine A 2 et 300 mg de facteur 5 de la Teichomy-

cine A 2.

Caractéristiques physico-chimiques des facteurs isolés purs de la Teichomycine A 2 Le facteur 1 de la Teichomycine A 2 est une poudre amorphe blanche qui, par chauffage, commence à noircir à environ 220 C

et est complètement décomposée à 255 C et qui a les caractéris-

tiques suivantes: a) Il est facilement soluble dans l'eau à p H> 7,0 ou à p H< 2, dans le diméthylformamide, dans le diméthylsulfoxyde et dans le propylèneglycol; faiblement soluble dans le méthylcellosolve et le glycérol; très peu soluble dans le méthanol et l'éthanol, presque insoluble dans le chloroforme, le benzène, l'hexane normal, l'acétonitrile,

l'éther éthylique, l'acétone, l'acétate d'éthyle et le tétrachlo-

rure de carbone; b) un spectre d'absorption ultraviolette qui est illustré

par la figure 1 du dessin annexé qui présente les maximums d'ab-

sorption suivants: dans l'acide chlorhydrique 0,1 N: 1 max 278 nm; (E 1 %= 49,5) max 1 cm dans le tampon phosphate à p H 7,4: 1 % kmax:278 nm; (E% = 50,0) dans l'hydroxyde de sodium 0,1 N: : 297 nm (E 1 % = 72,1)

c) un spectre d'absorption infrarouge dans le nujol, illus-

tré par la figure 2 des dessins annexés, avec les maximums d'ab-

sorption suivants: 3700-3100, 2960-2840 (nujol), 1645, 1590, 1510, 1460 (nujol), 1375 (nujol), 1305, 1230, 1180, 1155, 1060, 1025, 970, 890, 845, 815, 720 (nujol); d) une analyse élémentaire après séchage préalable de l'échantillon à environ 1400 C sous atmosphère inerte (%p = 8,5) qui indique la composition (moyenne) suivante exprimée en pourcentages: carbone: 56,70 %; hydrogène: 4,90 %; azote: 6,65 %; chlore: 3,80 %; oxygène (par différence): 27,95 %; e) un temps de rétention (t R) de 21,2 minutes lorsqu'on l'analyse par CLHP en phase inverse avec une colonne de Zorbax ODS de 5 pm et qu'on élue avec un gradient linéaire de O % à % de solution B dans la solution A en 40 minutes (solution A: Na H 2 PO 4 25 r M/acétonitrile ( 9/1) tamponnée à p H 6,0 avec Na OH 0,1 N; solution B: Na H 2 PO 4 25 m M/acétonitrile ( 3/7) tamponnée à p H 6,0 avec Na OH 0,1 N) avec un débit de 2 ml/min; (étalon interne: dihydroxy-3,5 toluène; t R: 8,84 minutes); f) les groupes suivants de signaux dans le spectre de IU 4 N-1 H à 270 M Hz (la totalité du spectre est illustrée par la figure 3 des dessins annexés) enregistré dans le DMSO-d 6 avec addition de quelques gouttes de D 20 (concentration: 25 mg/0,5 ml)

(TMS comme étalon interne: È= 0,00 ppm): 0,8-1,5 (m); 1,7-

2,3 (m); 2,7-4,0 (m); 4,0-4,7 (m); 4,8-5,8 (m); 6,2-8,1 (m) g) une fonction acide capable de former des sels; h) une fonction basique salifiable; i) un poids moléculaire d'environ 1 875 comme déterminé

par l'analyse de spectrométrie de masse avec un bombardement ato-

mique rapide (BAR) comme source d'ions (pour un exposé de la spectrométrie de masse BAR, voir par exemple M Barber et cell,

Nature, 293, n 5830, 270-75 ( 1981)).

Le facteur 2 de la Teichomycine A 2 est une poudre amorphe blanche qui commence à noircir lorsqu'on la chauffe à 210 C et

qui est complètement décomposée à 250 C et qui a les caractéris-

tiques suivantes: a) Il est facilement soluble dans l'eau à p H> 7,0 ou à p H< 2, dans le diméthylformamide, le diméthylsulfoxyde et le propylèneglycol; faiblement soluble dans le méthylcellosolve et le glycérol; très peu soluble dans le méthanol et l'éthanol; presque inso-

luble dans le chloroforme, le benzène, l'hexane normal, l'acéto-

nitrile, l'éther éthylique, l'acétone, l'acétate d'éthyle et le tétrachlorure de carbone; b) un spectre d'absorption ultraviolette qui est illustré par la figure 4 des dessins annexés, qui présente les maximums d'absorption suivants: dans l'acide chlorhydrique 0,1 N: max: 278 nm; (E 1 % = 48) max cm dans le tampon phosphate à p H 7,4: 1 15 1 max: 278 nm; (E 1 % = 49,0) 1 cm dans l'hydroxyde de sodium O,1 N kmax:297 nm; (E 1 = 70,0) max 1 cm

c) un spectre d'absorption infrarouge dans le nujol, illus-

tré par la figure 5 des dessins annexés, avec les maximums d'ab-

sorption observables suivants: 3700-3100, 2960-2860 (nujol), 1645, 1590, 1510, 1460 (nujol), 1375 (nujol), 1300, 1260, 1230,

1180, 1150, 1060, 1025, 970, 890, 845, 815, 720 (nujol).

d) une analyse élémentaire, après séchage préalable de l'échantillon à environ 140 C sous atmosphère inerte (%Ap = 9,8)

qui indique la composition (moyenne) suivante exprimée en pour-

centages: carbone: 56,15 %; hydrogène: 5,15 %; azote: 6,30 %; chlore: 3, 90 %; oxygène (par différence): 28,50 %; e) un temps de rétention (t R) de 22,6 minutes lorsqu'on l'analyse par CLHP en phase inverse avec une colonne de Zorbax ODS de 5 pm en éluant avec un gradient linéaire de O % à 50 % de solution B dans la solution A en 40 minutes; (solution A: Na H 2 PO 425 m M/acétonitrile ( 9/1) tamponnée à p H 6,0 avec Na OH 0,1 N; Solution B: Na H 2 PO 4 25 m M/acétonitrile ( 3/7) tamponnée à p H 6,0 avec Na OH 0,: Ni, avec un débit de 2 ml/nin; (talon intern-ie: dihydroxy3,5 toluène; t R: 8,84 minutes); f) les groupes suivants de signaux dans le spectre de R%'N-1 H à 270 M Hz (la totalité du spectre est illustrée par la figure 6 des dessins annexés) enregistré dans le DMISO-d 6 avec addition de quelques gouttes de D 20 (concentration 25 mg/0,5 ml) (TMDIS comme étalon interne: = 0,00 ppm): 0,7-1,5 (m);

1,8-2,2 (m); 2,7-4,5 (m); 4,6-5,7 (m); 6,2-8,1 (m).

g) une fonction acide capable de former des sels; h) une fonction basique salifiable; i) un poids moléculaire d'environ 1 877 comme déterminé

par la spectrométrie de masse BAR.

Le facteur 3 de la Teichomycine A 2 est une poudre amorphe blanche qui, par chauffage, commence à se décomposer à 205 C et est complètement décomposée à 250 C et qui a les caractéristiques suivantes: a) Il est facilement soluble dans l'eau à p H> 7,0 ou à p H< 2, dans le diméthylformamide, le diméthylsulfoxyde et le propylèneglycol; faiblement soluble dans le méthylcellosolve et le glycérol;

très peu soluble dans le méthanol et l'éthanol; presque inso-

luble dans le chloroforme, le benzène, l'hexane normal, l'acéto-

nitrile, l'éther éthylique, l'acétone, l'acétate d'éthyle et le tétrachlorure de carbone; b) un spectre d'absorption ultraviolette, qui est illustré par la figure 7 des dessins annexés, qui présente les maximums d'absorption suivants: dans l'acide chlorhydrique 0,1 N: 1 m max: 278 nm; (E 1 cm = 49,2) dans le tampon phosphate à p H 7,4: max: 278 nm; (E = 50,8) max ' 1 cm dans l'hydroxyde de sodium 0,1 N: ma: a 297 nm; (E = 72,7) ax 1 cm

c) un spectre d'absorption infrarouge dans le nujol, illus-

tré par la figure 8 des dessins annexés, avec les maximums d'ab-

sorption observables suivants: 3700-3100; 2960-2850 (nujol), 1645, 1590, 1510, 1460 (nujol), 1375 (nujol), 1300, 1230, 1180,

1150, 1120, 1060, 1030, 970, 890, 845, 820, 800, 720 (nujol).

d) une analyse élémentaire, après séchage préalable de l'échantillon à environ 140 C sous une atmosphère inerte (% Z Ap = 12,0) qui indique la composition (moyenne) suivante exprimée en pourcentages: carbone: 56,26 Z; hydrogène: 5,20 %; azote: 6,69 %; chlore: 3,95 %; oxygène (par différence): 27,90 %; e) un temps de rétention (t R) de 23,3 minutes lorsqu'on l'analyse par CLHP en phase inverse avec une colonne de Zorbax ODS de 5 pm en éluant avec un gradient linéaire de O % à 50 % de solution B dans la solution A en 40 minutes (solution A: Na H 2 PO 4 25 m M/acétonitrile ( 9/1) tamponnée à p H 6,0 avec Na OH 0,1 N; solution B: Na H 2 PO 4 25 m M/acétonitrile ( 3/7) tamponnée à p H

6,0 avec Na OH 0,1 N), avec un débit de 2 ml/min; (étalon inter-

ne: dihydroxy-3,5 toluène; t R: 8,84 minutes); f) les groupes suivants de signaux dans le spectre de RMN-1 H à 270 M Hz (la totalité du spectre est illustrée par la figure 9 des dessins annexés) enregistré dans le DMSO-d 6 avec addition de quelques gouttes de D 20 (concentration 25 mg/0,5 ml) (TMS comme étalon interne; 8 = 0,00 ppm): 0,7-1,5 (m); 1,8-2,0 (m); 2,7-4, 5 (m); 4,6-5,7 (m); 6,2-8,0 (m); g) une fonction acide capable de former des sels; h) une fonction basique salifiable; i) un poids moléculaire d'environ 1 877 comme déterminé

par la spectrométrie de masse BAR.

Le facteur 4 de la Teichomycine A 2 est une poudre amorphe blanche qui, par chauffage, commence à noircir à environ 210 C et est complètement décomposée à 250 C et a les caractéristiques suivantes: a) Il est facilement soluble dans l'eau à p H> 7,0 ou à p H< 2, dans le diméthylformamide, le diméthylsulfoxyde et le propylèneglycol; faiblement soluble dans le méthylcellosolve et le glycérol; très peu soluble dans le méthanol et l'étnanoi; presque insoluble dans le chloroforme, le benzène, l'hexane normal, l'acétonitrile,

l'éther éthylique, l'acétone, l'acétate d'éthyle et le tétrachlo-

rure de carbone b) il a un spectre d'absorption ultraviolette qui est illustré par la figure 10 des dessins annexés qui présente les maximums d'absorption suivants: dans l'acide chlorhydrique 0,1 N: max: 278 nm; (E 1 = 52,5) max 1 cm dans le tampon phosphate à p H 7,4: x 278 nm; (E 1 = 52,5) max 1 cm dans l'hydroxyde de sodium 0,1: 1 % max: 297 nm; (E 1 cm = 75,5) max 1 cm

c) un spectre d'absorption infrarouge dans le nujol, illus-

tré par la figure 11 des dessins annexés, avec les maximums d'ab-

sorption suivants: 3700-3100, 2960-2840 (nujol), 1645, 1590, 1510, 1460 (nujol), 1375 (nujbl), 1300, 1230, 1175, 1140, 1060, 1025, 970, 890, 840, 815, 720 (nujol); d) une analyse élémentaire, après séchage préalable de l'échantillon à environ 140 C sous une atmosphère inerte (% Ap = 9,8) qui indique la composition (moyenne) suivante exprimée en pourcentages; carbone; 56,50 %; hydrogène: 5,10 %; azote: 6,50 Z; chlore: 3,80 %; oxygène (par différence): 28,10 Z; e) un temps de rétention (t R) de 25,8 minutes lorsqu'on l'analyse par CLHP en phase inverse avec une colonne Zorbax ODS de 5 pm en éluant avec un gradient linéaire de O % à 50 Z de solution B dans la solution A en 40 minutes; (solution A: Na H 2 PO 4 25 m /acétonitrile ( 9/1) tamponnée à p H 6,0 avec Na OH 0,1 N; solution B: Na H 2 PO 4 25 M/acétonitrile ( 3/7) tamponnée à p H 6,0 avec Na OH 0,1 N) avec un débit de 2 ml/min; (étalon interne: dihydroxy-3,5 toluène; t R: 8,84 minutes); f) une fonction acide capable de former des sels; g) une fonction basique salifiable; h) un poids moléculaire d'environ 1 891 comme déterminé

par la spectrométrie de masse BAR.

1 il Le facteur 5 de la Teiçhomycine A 2 est une poudre amorphe blanche qui commence à noircir lorsqu'on la chauffe à 210 C et

qui est complètement décomposée à 250 C et qui a les caractéris-

tiques suivantes: a) Il est facilement soluble dans l'eau à p H> 7,0 ou à p H< 2, dans le diméthylformamide, le diméthylsulfoxyde et le propylèneglycol; faiblement soluble dans le méthylcellosolve et le glycérol;

très peu soluble dans le méthanol et l'éthanol; presque insolu-

ble dans le chloroforme, le benzène, l'hexane normal, l'acéto-

nitrile, l'éther éthylique, l'acétone, l'acétate d'éthyle et le tétrachlorure de carbone; b) il a un spectre d'absorption ultraviolette qui est illustré par la figure-12 des dessins annexés, qui présente les maximums d'absorption suivants: dans l'acide chlorhydrique 0,1 N: max: 278 nm; (E 1 % = 49,6) max (E 1 cm dans le tampon phosphate à p H 7,4: X:278 nm; (E 1 % = 51,8) max 1 cm dans l'hydroxyde de sodium 0,1 N: mx:297 nm; (E 1 % = 78,8) max 1 cm

c) un spectre d'absorption infrarouge dans le nujol, il-

lustré par la figure 13 des dessins annexés avec les maximums d'absorption observables suivants: 3700-3100, 2960-2840 (nujol), 1645, 1590, 1510, 1460 (nujol), 1375 (nujol), 1300, 1230, 1175, 1145, 1060, 1025, 970, 890, 840, 815, 720 (nujol); d) une analyse élémentaire, après séchage préalable de l'échantillon à environ 140 C sous atmosphère inerte (%l Xp = 10,1)

qui indique la composition (moyenne) suivante exprimée en pourcen-

tages: carbone: 56,60 %; hydrogène: 5,05 %; azote: 6,63 %; chlore: 3,85 %; oxygène (par différence): 27,87 %; e) un temps de rétention (t R) de 26, 4 minutes lorsqu'on l'analyse par CLHP en phase inverse avec une colonne de Zorbax ODS de 5 pm en éluant avec un gradient linéai-e o v M 50 % de solution B dans la solution A en 40 minutes;

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(solution A: Na H 2 PO 4 25 Mf/acétonitrile ( 9/1) tamponnée à p H 6,0 avec Na OH 0,1 N; solution B: Na H 2 PO 4 25 m M/acétonitrile ( 3/7) tamponnée à p H 6,0 avec Na OH 0,1 N), avec un débit de 2 ml/min; (étalon interne dihydroxy-3,5 toluène; t R: 8,84 minutes) f) une fonction acide capable de former des sels; g) une fonction basique salifiable; h) un poids moléculaire d'environ 1 891 comme déterminé

par la spectrométrie de masse BAR.

Chacun des facteurs 1, 2, 3, 4 et 5 de la Teichomycine A 2

contient une fonction acide qui est capable de former des sels.

Les sels de métal alcalin, de métal alcalino-terreux et les sels d'ammonium acceptables en pharmacie des facteurs 1, 2, 3, 4 et de la Teichomycine A 2 constituent d'autres objets de l'inven-

tion.

Des sels de métaux alcalins et de métaux alcalino-terreux caractéristiques comprennent les sels de sodium, de potassium, de lithium, de calcium et de magnésium Les sels d'ammonium coma prennent les sels d'ammonium et les sels d'alkyl(C 1-C 4)ammonium

et d'hydroxyalkyl(C 1-C 4)ammonium primaires, secondaires ou ter-

tiaires. On prépare les sels de métaux alcalins et alcalino-terreux selon les modes opératoires habituels couramment utilisés pour préparer les sels métalliques Par exemple, on dissout le facteur 1, 2, 3, 4 ou 5 de la Teichomycine A 2 sous la forme de l'acide libre dans un solvant approprié tel que le propylèneglycol et on ajoute progressivement la quantité stoechiométrique d'une base

minérale appropriée choisie à la solution obtenue.

On récupère ensuite le sel de métal alcalin ou alcalino-

terreux formé par précipitation avec un non-solvant et filtration.

Sinon, on peut préparer ces sels sous une forme essentiel-

lement anhydre par lyophilisation; dans ce cas, on filtre, pour

éliminer toute matière insoluble, les solutions aqueuses conte-

nant les sels désirés résultant de la salification de la forme acide libre avec un carbonate ou un hydroxyde de métal alcalin ou de métal alcalino-terreux choisi de façon approprié en une

quantité telle qu'on obtienne un p H entre 7 et 8 et on lyophi-

lise. On peut préparer les sels d'ammonium organiques, soit par addition de l'amine convenablement choisie à une solution de la

forme acide libre des facteurs 1, 2, 3, 4 et 5 de la Teichomy-

cine A 2 dans un solvant approprié, tel que le propylèneglycol, puis élimination par évaporation du solvant et de l'excès d'amine réagissante, soit sinon par -contact des deux composés réagissants dans le minimum d'eau puis précipitation des sels obtenus par

addition d'un non-solvant.

Comme précédemment indiqué, chacun des facteurs 1, 2, 3, 4 et 5 de la Teichomycine A 2 contient également une fonction basique pouvant être salifiée Leurs sels d'addition d'acides acceptables en pharmacie préparés de facon connue dans l'art par contact des facteurs isolés purs avec un acide assez fort, de préférence avec un acide minéral, constituent un autre objet

de l'invention.

Préparation du sel de sodium du facteur 2 de la Teichomycine A On porte à 8,0 le p H de 15 ml d'une solution aqueuse de mg du facteur 2 de la Teichomycine A 2 par addition goutte à

goutte d'hydroxyde de sodium 0,1 N On filtre la solution obte-

nue, on la transfère dans la chambre d'un système de lyophili-

sation et on congèle Après achèvement de la congélation, on place la chambre sous un vide de 0,13 mbar et on sublime la glace en portant la plaque chauffante àO O C On poursuit l'opération

jusqu'à ce que le produit soit presque sec (environ 1 % d'humi-

dité) Le titrage d'une solution du sel de sodium du facteur 2 de la Teichomycine A 2 ainsi obtenu dans 25 ml d'un mélange 3/1 de méthylcellosolve et d'eau avec de l'acide chlorhydrique 0,1 N, montre la présence de deux fonctions titrables caractérisées par

les p K suivants: 7,03 et 4,78.

En reprenant le mode opératoire décrit ci-dessus mais en

partant des facteurs 1, 3, 4 et 5 de la Teichomycine A,, on ob-

tient les sels de sodium correspondants La détermination de la quantité de sodium des sels finals confirme la formation d'un

sel de monosodium.

L'activité antibactérienne in vitro des facteurs 1, 2, 3,

4 et 5 de la Teichomycine A 2 qui se sont révélés être principa-

lement actifs contre les bactéries à gram positif, a été déter- minée relativement à des isolats cliniques de staphylocoques et de streptocoques selon une méthode de dilution de raison 2 dans un système de microtitration On a employé respectivement pour les staphylocoques et les streptocoques le Penassay-broth (Difco)

et le Todd-Hewitt broth (Difco) On dilue des bouillons de cul-

ture d'une nuit pour que l'inoculum final contienne environ 103 unités formatrices de colonies/ml On détermine la concentration minimale inhibitrice (CMI) comme étant la concentration minimale pour laquelle on n'observe pas de culture visible après 18 à 24 heures d'incubation à 37 C Les résultats obtenus sont résumés

dans le tableau II ci-dessous.

T A BL EAU 1 Il Activité antibactérienne des facteurs 1, 2, 3, 4 et 5 de la Teichornycine A 2 Nombre C M I (iigltnl) de Facteur 1 Fact-eur 2 Facteur 3 Facteur 4 Fac:teur 5 Micro-organisme souches de la de la de la de la de la étudiées Teichonivcin,- Teichomicyne Teichomicyne Teichomycine Teicliomlycine

A A A A A

________ ________ ________ 2 2 2 A 2 2

Staphylococcus aureus 5 0,8-1,6 0,8-1,6 0,4-0,8 0,2-0,8 0,2-0,8 Staphylococcus epidermidis 4 0,2-1,6 0,1-1,6 0,2-0,8 0,2-0,8 0,2-0,8 Streptococcus pyogenes 7 0,05-0,1 0,025-0,1 0,025-0,05 0,006-0,05 0,006-0, 05 Str-ptococcus pncumoniae 6 0,1-0,2 0,05-0,1 0,05-0,1 0,05-0,1 0,05-0,1 Streptococcus faecalis 5 0,2-0,4 0,1-0,4 0,1-0,2 0,1-0,4 0,1-0,4 Streptococcus mitis 1 0,025 0,025 0,0125 0,025 0,025 Streptococcus salivarius 1 0,2 0,2 0,1 0,05 0,05 Streptococcus sanguis 1 0,1 0,1 0,1 0, 05 0,05 Streptococcus bovis 1 0,4 0,4 0,2 0,4 0,4 Streptococcus agalactiae 1 0,1 0,1 0,05 0,1 0,1 PQ Co

2528050.

L'activité microbiologique des facteurs 1, 2, 3, 4 et 5 individuels par rapport au complexe Teichomycine A 2 pris comme standard a été déterminée selon la méthode de diffusion en

gélose avec S aureus ATCC 6538 comme germe d'essai.

En particulier, on a dissout des quantités appropriées de facteur 1 de la Teichomycine A 2, de facteur 2 de la Teichomycine

A 2, de facteur 3 de la Teichomycine A 2, de facteur 4 de la Tei-

chomycine A 2, de facteur 5 de la Teichomycine A 2 et du complexe

Teichomycine A 2 employé comme standard pour obtenir des concen- trations dans le diméthylformamide de 2 000 pg/ml On a encore dilué ces

solutions avec du tampon phosphate 0,067 M à p H 7,4 additionné de 1 % de sérum bovin pour obtenir les concentrations

suivantes: 2,5, 5, 10 et 20 pg/ml.

On a ensuite fait tremper des disques de papier-filtre dans les solutions des échantillons et on a placé les disques à des intervalles réguliers sur la surface de boîtes de gélose ensemencées avec une suspension du micro-organisme d'essai On a incubé les boîtes à 37 C pendant 18 heures puis on a mesuré les diamètres des zones d'inhibition Les valeurs obtenues ont été introduites dans un ordinateur pour calculer l'activité des

facteurs individuels par rapport au complexe.

Les résultats obtenus figurent ci-dessous.

Facteur 1 de la Teichomycine A 2 841 U/mg Facteur 2 de la Teichomycine A 2 1086 U/mg Facteur 3 de la Teichomycine A 2 1131 U/mg Facteur 4 de la Teichomycine A 2 1066 U/mg Facteur 5 de la Teichomycine A 2 954 U/mg Complexe Teichomycine A 2 1000 U/mg On a également étudié l'action des facteurs 2, 3, 4 et 5 de la Teichomycine A 2 sur des infections expérimentales de la souris provoquées par S pneumoniae et S pyogenes Les expériences ont

été effectuées comparativement avec le complexe Teichomycine A 2.

Les résultats obtenus figurent dans le tableau III ci-dessous.

TABLEAU III

Activité antibactérienne in vivo Composé Facteur 2 de la Teichomycine A 2 Facteur 3 de la Teichomycine A 2 Facteur 4 de la Teichomycine A 2 Facteur 5 de la Teichomycine A 2 Complexe de la Teichomycine A 2 DE 50 (mg/kg j) S pneumoniae L 44

0,28 ( 0,22-0,34)

0,27 ( 0,23-0,32)

0,12 ( 0,98-0,14

0,13 ( 0,10-0,15)

0,35 ( 0,28-0,44)

s.c. S pyogenes L 49

0,15 ( 0,13-0,18)

0,13 ( 0,11-0,16)

0,098-( 0,073-0,11)

0,10 ( 0,098-0,13)

0,18 (-)

La toxicité aiguë approximative chez la souris (i p) des facteurs 1, 2, 3, 4 et 5 de la Teichomycine A 2 figure dans le

tableau IV ci-dessous.

TABLEAU IV

Toxicité aiguë chez la souris (i p)

Les résultats ci-dessus montrent que les composés de l'in-

vention que sont le facteur 1 de la Teichomycine A 2, le facteur 2 de la Teichomycine A 2, le facteur 3 de la Teichomycine A 2, le

facteur 4 de la Teichomycine A 2 et le facteur 5 de la Teichomy-

cine A 2 peuvent être employés de fa Con efficace comme ingrédient

actif dans de, préperatiorv -;;-obiennes employées e, l T,-(T-

Composé |DL 50 approximative (mg/kg) Facteur 1 de la Teichomycine A 2 > 1500 < 2000 Facteur 2 de la Teichomycine A 2 > 1500 < 2000 Facteur 3 de la Teichomycine A 2 > 1000 < 1500 Facteur 4 de la Teichomycine A 2 > 500 < 000 Facteur 5 de la Teichomycine A 2 > 500 < 1000 Facteur 5 de la Teichomycine A 2 > 500 < 1000

-2528050.

humaine et vétérinaire pour la prévention et le traitement de maladies infectieuses provoquées par des bactéries pathogènes sensibles aux ingrédients actifs Dans de tels traitements, ces

composés peuvent être employés tels quels ou sous forme desfac-

teurs individuels isolés ou, en raison de la similitude des pro- fils d'activité, également sous forme de mélanges de deux ou

plusieurs des cinq facteurs en des proportions quelconques.

Les composés de l'invention peuvent être administrés par

voie orale, locale ou parentale, cependant, on préfère particu-

lièrement l'administration-parentale Selon la voie d'administra-

tion, ces composés peuvent être présentés sous diverses formes d'administration Les préparations pour l'administration orale peuvent être sous forme de capsules, de comprimés ou de solutions ou suspensions liquides Comme il est bien connu dans l'art, les

capsules et les comprimés peuvent contenir, en plus de l'ingré-

dient actif, des excipients classiques tels que des diluants comme le lactose, le phosphate de calcium, le sorbitol et similaires,

des lubrifiants comme le stéarate de magnésium, le talc, le poly-

éthylèneglycol, des liants comme la polyvinylpyrrolidone, la gélatine, le sorbitol, la gomme adragante, la gomme arabique, des agents d'aromatisation et des agents de désintégration et agents

mouillants acceptables Les préparations liquides qui sont géné-

ralement sous forme de solutions ou de suspensions aqueuses ou huileuses peuvent contenir des additifs classiques tels que des

agents de suspension Pour l'emploi local, les composés de l'in-

vention peuvent également être préparés sous des formes appropriées à l'absorption par la peau, les muqueuses du nez et de la gorge ou les tissus bronchiques, et peuvent, de façon pratique, être sous,

forme de pulvérisations ou de produits à inhaler liquides, de pas-

tilles ou de collutoires Pour le traitement des yeux ou des oreilles, les préparations peuvent être présentées sous une forme liquide ou semiliquide Les présentations à usage local peuvent être préparées avec des bases hydrophobes ou hydrophiles sous forme

de pommades, de crèmes, de lotions, de badigeons ou de poudres.

Les compositions injectables peuvent être sous forme de sus-

pensions, solutions ou émulsions dans des véhicules huileux ou aqueux et peuvent contenir des agents de formulation tels que des agents de suspension, de stabilisation et/ou de dispersion Sinon

* l'ingrédient actif peut tre sous forme d'une poudre qu'on recons-

titue au moment de l'emploi avec un véhicule approprié tel que de

l'eau stérile.

La quantité de principe actif à administrer dépend de divers facteurs tels que la taille et l'état du sujet à traiter, la voie

et la fréquence d'administration et l'agent causal impliqué.

Les facteurs 1, 2, 3, 4 et 5 de la Teichomycine A 2 sont

généralement efficaces à une dose journalière comprise entre en-

viron 0,1 et environ 20 mg d'ingrédient actif par kilogramme de

poids corporel, éventuellement divisée en deux prises journalières.

Les compositions particulièrement souhaitables sont celles prépa-

rées sous forme de doses unitaires contenant environ 50 à environ

250 mg par unité.

Des exemples caractéristiques de préparations de composi-

tions pharmaceutiques figurent ci-après: On prépare une solution parentérale avec 100 mg du sel de sodium du facteur 2 de la Teichomycine

A 2 dissous dans 2 ml d'eau stérile injectable.

On prépare une solution parentérale avec 250 mg du sel de sodium du facteur 3 de la Teichomycine

A 2 dissous dans 3 ml d'eau stérile injectable.

On prépare Une pommade à usage local avec mg du facteur 2 de la Teichomycine A 2 600 mg de polyéthylèneglycol 4000 U S P. 1,2 g de polyéthylèneglycol 400 U S P. En plus de leur activité comme médicament, les composés de l'invention peuvent être utilisés comme agents favorisant la

croissance des animaux.

A cet effet, on administre un ou plusieurs des composés de

-l'invention par voie orale dans un aliment approprié La concen-

tration exacte employée est cille nécessaire pour -fp-r Per ne quantité d'agent actif efficace pour favoriser la croissance

lorsque des quantités normales d'aliment sont consommées.

On ajoute de préférence les composés actifs de l'invention

à un aliment pour animaux par préparation d'un prémélange alimen-

taire approprié contenant les composés actifs en une quantité efficace et incorporation du prémélange à la ration complète.

Sinon, on peut mélanger à l'aliment un concentré intermé-

diaire ou un additif alimentaire contenant l'ingrédient actif.

La façon dont de tels prémélanges alimentaires et de telles rations complètes peuvent être préparés et administrés est décrite

dans des ouvrages de référence (par exemple "Applied Animal Nutri-

tion", W H Freedman and Co, S Francisco USA, 1969, ou "Lives-

tock Feeds and Feeding", O and B Books, Corvallis, Oregon, USA,

1977).

Bien entendu, diverses modifications peuvent être apportées par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédés qui viennent d'être décrits uniquement à titre d'exemples non limitatifs sans

sortir du cadre de l'invention.

Claims

REVENDICATIONS

1 Composé antibiotique individuel essentiellement pur carac-

térisé en ce qu'il est choisi parmi le groupe constitué par le facteur 1 de la Teichomycine A 2, le facteur 2 de la Teichomycine A 2, le facteur 3 de la Teichomycine A 2, le facteur 4 de la Tei- chomycine A 2 et le facteur 5 de la Teichomycine A 2, identifiés respectivement par les caractéristiques physico-chimiques suivantes

le facteur 1 de la Teichomycine A 2 est une poudre amorphe blan-

che qui, par chauffage, commence à noircir à environ 220 C et est complètement décomposée à 255 C et qui a) est facilement soluble dans l'eau à p H> 7,0 ou à p H< 2, dans le diméthylformamide, dans le diméthylsulfoxyde et dans le propylèneglycol; faiblement soluble dans le méthylcellosolve et le glycérol; très peu soluble dans le méthanol et l'éthanol, presque insoluble dans le chloroforme, le benzène, l'hexane normal, l'acétonitrile,

l'éther éthylique, l'acétone, l'acétate d'éthyle et le tétrachlo-

rure de carbone; b) a un spectre d'absorption ultraviolette qui est illustré

par la figure 1 du dessin annexé qui présente les maximums d'ab-

sorption suivants: dans l'acide chlorhydrique 0,1 N: ax: 278 nm; (E 1 % = 49,5) max 1 cm dans le tampon phosphate à p H 7,4: x 278 nm; (E 1 = 50,0) max 1 cm dans l'hydroxyde de sodium 0,1 N: max:297 nm; (E 1 = 72,1) max 1 cm

c) a un spectre d'absorption infrarouge dans le nujol, illus-

tré par la figure 2 des dessins annexés, avec les maximums d'ab-

sorption suivants: 3700-3100, 2960-2840 (nujol), 1645, 1590, 1510, 1460 (nujol), 1375 (nujol), 1305, 1230, 1180, 1155, 1060, 1025, 970, 890, 845, 815, 720 (nujol); d) a une analyse élémentaire après séchage préalable de l'échantillon à environ 140 C sous atmosphère inerte (% Ap = 8,5) qui indique la composition (moyenne):uivarte exprimée te L jjdi Ya

2528050.

centages: carbone: 56,70 %; hydrogène: 4,90 %; azote: 6,65 %; chlore: 3, 80 %; oxygène (par différence): 27,95 %; e) a un temps de rétention (t R) de 21,2 minutes lorsqu'on l'analyse par CLHP en phase inverse avec une colonne de Zorbax ODS de 5 Mm et qu'on élue avec un gradient linéaire de O %Z à 50 Z de solution B dans la solution A en 40 minutes (solution A: Na H 2 PO 4 25 m M/acétonitrile ( 9/1) tamponnée à p H 6,0 avec Na OH 0,1 N; solution B: Na H 2 PO 4 25 m M/acétonitrile ( 3/7) tamponnée à p H 6,0 avec Na OH 0,1 N) avec un débit de 2 ml/min; (étalon interne: dihydroxy-3, 5 toluène; t R: 8,84 minutes); f) a les groupes suivants de signaux dans le spectre de RMN-1 H à 270 M Hz (la totalité du spectre est illustrée par la figure 3 des dessins annexés) enregistré dans le DMSO-d 6 avec addition de quelques gouttes de D 20 (concentration de 25 mg/0,5 ml)

(TMIS comme étalon interne: &= 0,00 ppm): 0,8-1,5 (m); 1,7-

2,3 (m); 2,7-4,0 (m); 4,0-4,7 (m); 4,8-5,8 (m); 6,2-8,1 (m); g) a une fonction acide capable de former des sels; h) a une fonction basique salifiable; i) a un poids moléculaire d'environ 1 875 comme déterminé par l'analyse de spectrométrie de masse avec un bombardement atomique rapide (BAR) comme source d'ions;

le facteur 2 de la Teichomycine A 2 est une poudre amorphe blan-

che qui commence à noircir lorsqu'on la chauffe à 210 C et qui est complètement décomposée à 250 C et qui: a) est facilement soluble dans l'eau à p H> 7,0 ou à p H< 2,

dans le diméthylformamide, le diméthylsulfoxyde et le propylène-

glycol; faiblement soluble dans le méthylcellosolve et le glycérol; très peu soluble dans le méthanol et l'éthanol; presque insoluble dans le chloroforme, le benzène, l'hexane normal, l'acétonitrile,

l'éther éthylique, l'acétone, l'acétate d'éthyle et le tétrachlo-

rure de carbone; b) a un spectre d'absorption ultraviolette qui est illustré par la figure 4 des dessins annexés, qui présente les maximums d'absorption suivants: dans l'acide chlorhydrique 0,1 N: max 278 nm; (E 1 = 48) max 1 cm dans le tampon phosphate à p H 7,4: 1 % ma X: 278 nm; (E = 49,0) max 1 cm dans l'hydroxyde de sodium 0,1 N: max:297 nm; (E 1 = 70,0) max 1 cm c) a un spectre d'absorption infrarouge dans le nujol, illustré par la figure 5 des dessins annexés, avec les maximums d'absorption observables suivants: 3700-3100, 2960-2860 (nujol), 1645, 1590, 1510, 1460 (nujol), 1375 (nujol), 1300, 1260, 1230, 1180, 1150, 1060, 1025, 970, 890, 845, 815, 720 (nujol); d) a une analyse élémentaire, après séchage préalable de l'échantillon à environ 140 C sous atmosphère inerte (% àp = 9,8)

qui indique la composition (moyenne) suivante exprimée en pour-

centages: carbone: 56,15 %; hydrogène: 5,15 %; azote: 6,30 Z; chlore: 3, 90 %; oxygène (par différence): 28,50 %; e) a un temps de rétention (t R) de 22,6 minutes lorsqu'on l'analyse par CLHP en phase inverse avec une colonne de Zorbax ODS de 5 pm en éluant avec un gradient linéaire de O % à 50 % de solution B dans la solution A en 40 minutes; (solution A: Na H 2 PO 4 25 m M/acétonitrile ( 9/1) tamponnée à p H 6,0 avec Na OH 0,1 N; solution B: Na H 2 PO 4 25 m M/acétonitrile ( 3/7) tamponnée à p H 6,0 avec Na OH 0,1 N), avec un débit de 2 ml/min; (étalon interne: dihydroxy3,5 toluène; t R: 8,84 minutes); f) a les groupes suivants de signaux dans le spectre de RMN H à 270 M Hz (la totalité du spectre est illustrée par la figure 6 des dessins annexés) enregistré dans le DMSO-d 6 avec addition de quelques gouttes de D 20 (concentration 25 mg/0,5 ml) (TMS comme étalon interne; S= 0,00 ppm): 0,7-1,5 (m); 1,8-2,2 (m); 2,7-4,5 (m); 4,6-5,7 (m); 6,2-8,1 (m); g) a une fonction acide capable de former des sels; h) a une fonction basique salifiable; i) a un poids moléculaire d'environ 1 877 comme déterminé par la spectrométrie de masse BAR;

le facteur 3 de la Teichomycine A est une poudre amorphe blan-

che qui, par chauffage, commence à se déccmposer à 205 C et est complètement décomposée à 250 C et qui: a) est-facilement soluble dans l'eau à p H> 7,0 ou à p H< 2,

dans le diméthylformamide, le diméthylsuifoxyde et le propylène-

l'éther éthylique, l'acétone, l'acétate d'éthyleetle tétrachlo-

rure de carbone; b) a un spectre d'absorption ultraviolette, qui est illustré par la figure 7 des dessins annexés, qui présente les maximums d'absorption suivants: dans l'acide chlorhydrique 0,1 N: X: 278 nm: (E% = 49,2) max ( 1 cm dans le tampon phosphate à p H 7,4: mx:278 nm; (E 1 % = 50,8) max 1 cm dans l'hydroxyde de sodium 0,1 N: max:297 nm; (E 1 % = 72, 7) max (E 1 cm c) a un spectre d'absorption infrarouge dans le nujol, illustré par la figure 8 des dessins annexés, avec les maximums d'absorption observables suivants: 3700-3100, 2960-2850 (nujol), 1645, 1590, 1510, 1460 (nujoi), 1375 (nujol), 1300, 1230, 1180, 1150, 1120, 1060, 1030, 970, 890, 845, 820, 800, 720 (nujol); d) a une analyse élémentaire, après séchage préalable de l'échantillon à environ 140 C sous une atmosphère inerte (%Ap = 12,0) qui indique la composition (moyenne) suivante exprimée en pourcentages: carbone: 56,26 %; hydrogène: 5,20 %; azote: 6,69 %; chlore: 3,95 %; oxygène (par différence): 27,90 %; e) a un temps de rétention (t R) de 23,3 minutes lorsqu'on l'analyse par CLH? en phase inverse avec une colonne de Zorbax ODS de 5 pm en éluant avec un gradient linéaire de O % à 50 % de solution B dans la solution A en 40 minutes

2528050.

(solution A: Na H 2 PO 25 m M/acétonitrile ( 9/1) tamponnée à p H 6,0 2 4 avec Na OH 0,1 N; solution B: Na H 2 PO 4 25 m X/acétonitrile ( 3/7) tamponnée à p H 6,0 avec Na OH 0,1 N), avec un débit de 2 ml/min; (étalon interne: dihydroxy-3,5 toluène; t R: 8,84 minutes); f) a les groupes suivants de signaux dans le spectre de R> 2-1 H à 270 >Hz (la totalité du spectre est illustrée par la figure 9 des dessins annexés) enregistré dans le DMSO-d 6 avec addition de quelques gouttes de D 20 (concentration 25 mg/0,5 ml) (TMS comme étalon interne; S = 0,00 ppm): 0,7-1,5 (m); 1,8- 2,0 (m); 2,7-4,5 (m); 4,6-5,7 (m); 6,2-8,0 (m); g) a une fonction acide capable de former des sels; h) a une fonction basique salifiable; i) a un poids moléculaire d'environ 1 877 comme déterminé par la spectrométrie de masse BAR;

le facteur 4 de la Teichomycine A 2 est une poudre amorphe blan-

che qui, par chauffage, commence à noircir à environ 210 C et est complètement décomposée à 250 C et qui: a) est facilement soluble dans l'eau à p H> 7,0 ou à p H< 2,

dans le diméthylformamide, le diméthylsulfoxyde et le propylène-

l'éther éthylique, l'acétone, l'acétate d'éthyle et le tétrachlo-

rure de carbone; b) a un spectre d'absorption ultraviolette qui est illustré par la figure 10 des dessins annexés qui présente les maximums d'absorption suivants: dans l'acide chlorhydrique 0,1 N: a X:278 nm; (E 1 = 52,5) max 1 cm dans le tampon phosphate à p H 7,4: max: 278 nm; (E 1 % = 52,5) max 1 cm dans l'hydroxyde de sodium 0,1 N: Àx 297 nm; (E 1 = 73,5) max 1 cm c) a un spectre d'absorption infrarouge dans le nujol, illustré par la figure 11 des dessins annexés, avec les maximums d'absorption suivants: 3700-3100, 2960-2840 (nujol), 1645, 1590, 1510, 1460 (nujol), 1375 (nujol), 1300, 1230, 1175, 1140, 1060, 1025, 970, 890, 840, 815, 720 (nujol); d) a une analyse élémentaire, après séchage préalable de l'échantillon à environ 140 C sous une atmosphère inerte (% zp = 9,8) qui indique la composition (moyenne) suivante exprimée en pourcentages: carbone: 56,50 %; hydrogène: 5,10 %; azote: 6,50 %; chlore: 3,80 %; oxygène (par différence): 28,10 %; e) a un temps de rétention (t R) de 25, 8 minutes lorsqu'on l'analyse par CLHP en phase inverse avec une colonne Zorbax ODS de 5 jm en éluant avec un gradient linéaire de O % à 50 % de solution B dans la solution A en 40 minutes; (solution A: Na H 2 PO 4 25 m M/acétonitrile ( 9/1) tamponnée à p H 6,0 avec Na OH 0,1 N; solution B: Na H 2 PO 4 25 m M/acétonitrile ( 3/7) tamponnée à p H 6,0 avec Na OH 0,1 N) avec un débit de 2 ml/min; (étalon interne: dihydroxy-3,5 toluène; t R: 8,84 minutes); f) a une fonction acide capable de former des sels; g) a une fonction basique salifiable; h) a un poids moléculaire d'environ 1 891 comme déterminé par la spectrométrie de masse BAR;

le facteur 5 de la Teichomycine A 2 est une poudre amorphe blan-

che qui commence à noircir lorsqu'on la chauffe à 2100 C et qui est complètement décomposée à 250 C et qui: a) est facilement soluble dans l'eau à p H> 7,0 ou à p H< 2,

dans le diméthylformamide, le diméthylsulfoxyde et le propylène-

l'éther éthylique, l'acétone, l'acétate d'éthyle et le tétrachlo-

rure de carbone; 33 b) a un spectre d'absorption ultraviolette qui est illustré par la figure 12 des dessins annexés, qui présente les maximums d'absorption suivants: dans l'acide chlorhydrique 0,1 N: À: 278 nm; (E 1 % = 49,6) max 1 cm dans le tampon phosphate à p H 7,4: ma X: 278 nm; (E 1 % = 51,8) max 1 cm dans l'hydroxyde de sodium 0,1 N: max 297 nm; (E 1 % = 78,8) max 1 cm c) a un spectre d'absorption infrarouge dans le nujol, illustré par la figure 13 des dessins annexés avec les maximums d'absorption observables suivants: 3700-3100, 2960-2840 (nujol), 1645; 1590, 1510, 1460 (nujol), 1375 (nujol), 1300, 1230, 1175, 1145, 1060, 1025, 970, 890, 840, 815, 720 (nujol); d) a une analyse élémentaire, après séchage préalable de l'échantillon à environ 140 C sous atmosphère inerte (%zip = 10,1)

qui indique la composition (moyenne) suivante exprimée en pour-

centages: carbone: 56,60 %; hydrogène: 5,05 %; azote: 6,63 %; chlore: 3, 85 %; oxygène (par différence): 27,87 Z; e) a un temps de rétention (t R) de 26,4 minutes lorsqu'on l'analyse par CLHP en phase inverse avec une colonne de Zorbax ODS de 5 jmm en éluant avec un gradient linéaire de O Z à 50 % de solution B dans la solution A en 40 minutes; (solution A: Na H 2 PO 4 25 m M/acétonitrile ( 9/1) tamponnée à pli 6,0 avec Na OH 0,1 N; solution B: Na H 2 PO 4 25 m l/acétonitrile ( 3/7) tamponnée à p H 6,0 avec Na OH 0,1 N), avec un débit de 2 ml/min; (étalon interne: dihydroxy3,5 toluène; t R: 8,84 minutes); f) a une fonction acide capable de former des sels; g) a une fonction basique salifiable; h) a un poids moléculaire d'environ 1 891 comme déterminé par la spectrométrie de masse BAR,

et leurs sels acceptables-en pharmacie.

2 Composé antibiotique individuel essentiellement pur, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi le groupe constitué par

le facteur 1 de la Teichomycine A 2, le facteur 2 de la Teichomy-

cine A 2 et le facteur 3 de la Teichomycine A 2, identifiés par les caractéristiques indiquées dans la revendication 1 et leurs sels de métaux alcalins, de métaux alcalino-terreux et leurs sels

d'ammsonium acceptables en pharmacie.

3 Composé antibiotique individuel essentiellement pur, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi le groupe constitué par le facteur 2 de la Teichomycine A 2 et ses sels acceptables en pharmacie. 4 Procédé pour préparer un composé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à séparer la Teichomycine A 2 en les facteurs isolés par chromatographie de partage en phase

inverse ou par chromatographie d'échange d'ions avec éventuelle-

-ment conversion des composés obtenus en leurs sels acceptables

en pharmacie correspondants selon des procédés connus en soi.

5 Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'on

effectue la séparation par chromatographie sur colonne en em-

ployant une colonne de gel de silice silanisé avec comme système de développement un gradient d'élution d'acétonitrile dans le

formiate d'ammonium aqueux dilué.

6 Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'on

développe la colonne dans un gradient linéaire de 10 à 20 % d'acé-

tonitrile dans une solution de formiate d'ammonium à 0,2 %.

7 Procédé selon la revendication 6, caractérisé de plus en

ce que, lorsqu'on récupère de la colonne un mélange de deux fac-

teurs, on les sépare en les facteurs isolés par chromatographie

sur colonne en phase inverse en employant une colonne d'octadécyl-

silane et comme système de développement un mélange 24/76 d'acéto-

nitrile et de formiate d'ammonium aqueux à 0,2 %.

8 Procédé selon la revendication 6 pour la production du facteur 2 de la Teichormycine A 2, caractérisé en ce qu'il consiste à dissoudre le complexe Teichomycine A 2 dans un mélange 9/1 de formiate d'ammonium à 0, 2 % et d'acétonitrile, ajuster le p H à environ 7,5 par addition d'hydroxyde de sodium, faire passer la solution obtenue à travers une colonne de gel de silice silanisé, développer la colonne dans un gradient linéaire de 10 à 20 % d'acétonitrile dans une solution à 0,2 % de formiate d'ammonium, recueillir les fractions ayant le même profil de chromatographie

liquide haute pression caractéristique du facteur 2 de la Teicho-

mycine A 2, éliminer le solvant organique par évaporation sous pression réduite, éliminer les sels de la solution aqueuse rési- duelle par passage de celle-ci à travers une colonne de gel de silice silanisé, laver la colonne avec de l'eau, l'éluer avec de l'acétonitrile aqueux à 50 %, concentrer l'éluat à un faible volume et en précipiter le facteur 2 de la Teichomycine A 2 par

addition d'un non-solvant.

9 Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'on

effectue la séparation par chromatographie sur colonne en em-

ployant le dérivé diéthylaminoéthylique de l'agarose comme phase stationnaire et des solutions tampons ou des mélanges de solutions

tampons et de solvants non aqueux miscibles à l'eau comme éluants.

Nouveaux médicaments utiles notamment comme antibioti-

ques, caractérisés en ce qu'ils contiennent comme produit actif

au moins un des composés selon l'une quelconque des revendications

1 à 3 ou de leurs sels acceptables en pharmacie.

11 Médicaments selon la revendication 10, caractérisés en

ce qu'ils sont conditionnés en vue de l'administration de quan-

tités correspondant à environ 50 à 250 mg du produit actif.