CN108623644B - 一类保罗霉素衍生物及其制备方法与应用 - Google Patents

一类保罗霉素衍生物及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一类保罗霉素衍生物palsimycins及其制备方法与应用。其结构式如式I所示。本发明采用直接向保罗霉素的产生菌Streptomyces paulus NRRL8115高产菌株中添加N‑乙酰基半胱胺，获得四个新结构保罗霉素衍生物。抗菌活性实验表明，palsimycin A、B对测试菌株的MIC与paulomycin A、B的MIC值处于同一水平。酸碱稳定性实验揭示，相同条件下，palsimycin A、B、C、D均比paulomycin A、paulomycin B更加稳定。本方法避免了从发酵液中直接分离纯化不稳定的保罗霉素，而且添加的SNAC易获得、对细胞无毒性，不影响菌体的生长。

Description

一类保罗霉素衍生物及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一类保罗霉素衍生物及其制备方法与应用。
背景技术
保罗霉素(paulomycin)是由链霉菌产生的一类结构特殊的糖苷类天然产物，主要由A环(ring A)、乙酰化的阿洛糖(acetylated D-allose)、保罗酸(paulic acid)和保罗糖(paulomycose)四部分(如图1)组成。保罗霉素对于革兰氏阳性菌有较好的抗菌活性，如金黄色葡萄球菌、酿脓链球菌、表皮葡萄球菌等以及对青霉素、链霉素、新霉素、大环内酯等具有抗性的细菌，可单独或者与其他抗菌剂组合用于防止或者减轻此类细菌感染如泌尿系统感染、衣原体感染。此外，动物实验结果显示保罗霉素对于肿瘤细胞如P-388白血病有很好的抑制效果。
由于保罗酸部分含有一个异硫氰基团(N＝C＝S)，使得保罗霉素在碱性溶液中易发生降解而失去生物活性，如保罗霉胺A、保罗霉胺B。对异硫氰基团进行H2S修饰而获得的保罗霉素类似物U-77802，生物活性比paulomycin A、paulomycin B弱两个数量级。N-乙酰L-半胱氨酸对保罗酸部分进行修饰得到的保罗霉素类似物paldimycinA、paldimycin B在稳定性水平上要优于paulomycin A、paulomycin B，但二者的抗菌活性要比paulomycin A、paulomycin B低一个数量级。此外，2017年，在同时缺失邻氨基苯甲酸合酶及异分支酸酶的突变株内分离得到273a2α、273a2β的分子内环化产物即含有五元杂环的化合物1-4，化合物1-4的结构比保罗霉素A、B更稳定，但抗革兰氏阳性细菌的活性降低。因此对保罗霉素进行结构改造获得结构稳定、抗菌活性高的保罗霉素类似物，将大大促进此类天然产物在临床医药方面的运用。
发明内容
本发明的一个目的是提供一类保罗霉素衍生物—palsimycins。
本发明所提供的保罗霉素衍生物—palsimycins的结构式如式I所示：
Figure BDA0001710244310000011
其中，R1选自下述任意一种基团：
Figure BDA0001710244310000021
R2选自下述任意一种基团：
Figure BDA0001710244310000022
R3选自下述任意一种基团：
Figure BDA0001710244310000031
当R1为a1，R3为a3或b3。
当R1为b1-f1中的任意一种，R3为a3。
优选的，所述保罗霉素衍生物—palsimycins为palsimycin A、palsimycin B、palsimycin C或palsimycin D，其结构式如下所示：
Figure BDA0001710244310000032
上述式I所示的保罗霉素衍生物—palsimycins药学上可接受的盐、酯及前药也属于本发明的保护范围。
本文所用术语“医药上可接受的盐”指在合理的医学判断范围内适于接触人类及低级动物的组织而不会产生过度毒性、刺激、过敏反应及类似反应且具有合理效益/风险比的盐。
本文所用术语“医药上可接受的酯”是指在体内水解的酯且包括那些在人体内易于分解获得母体化合物或其盐的酯。
本文所用术语“医药上可接受的前药”指本发明化合物的那些在合理的医学判断范围内适合用于接触人类及低等动物的组织而不具有过度毒性、刺激、过敏反应等、效益/风险比合理且对其预期用途有效的前药及本发明化合物可能的两性离子形式。术语“前药”指可(例如)通过在血液中水解在体内迅速转化产生上式母体化合物的化合物。
本发明的另一个目的是提供上述式I所示的保罗霉素衍生物—palsimycins的制备方法。
本发明所提供的式I所示的保罗霉素衍生物—palsimycins的制备方法，包括下述步骤：1)将Streptomyces paulus NRRL8115(即文献中的“Streptomyces paulusNRRL8115CIM3007”，记载于如下文献：Identification and Analysis of the PaulomycinBiosynthetic Gene Cluster and Titer Improvement of the Paulomycins inStreptomyces paulus NRRL 8115.)菌株在含N-乙酰半胱胺(SNAC)的液体培养基中进行发酵培养，收集发酵液；
2)将所述发酵液离心，收集上清液，将所述上清液用乙酸乙酯进行萃取，收集乙酸乙酯相进行干燥后浓缩，得粗提物；将所述粗提物用硅胶柱色谱进行分离纯化，其中所述硅胶柱色谱的洗脱液依次为：1倍柱体积的石油醚、1～1.5倍柱体积的石油醚和乙酸乙酯体积比1:1混合液、1～1.5倍柱体积的乙酸乙酯、1.5～2倍柱体积的乙酸乙酯和甲醇体积比1:1混合液、1倍柱体积的甲醇，收集用乙酸乙酯和甲醇体积比1:1混合液洗脱的洗脱组分并浓缩，得浓缩物；
将所述浓缩物通过C18反相填料柱色谱进行分离，其洗脱相依次为：水、1倍柱体积的体积分数为10％的乙腈-水溶液、1.5～2倍柱体积的体积分数为30％的乙腈-水溶液、1～1.5倍柱体积的体积分数为50％乙腈-水溶液、1～1.5倍柱体积的乙腈、2～2.5倍柱体积的甲醇，收集用体积分数为50％乙腈-水溶液洗脱的洗脱组分，除去有机相、干燥，得粗分离制品；
3)将所述粗分离制品以乙腈为溶剂，配制成溶液；然后利用反相高效液相色谱进行分离，以乙腈、含质量分数0.06％乙酸的水为流动相，所述乙腈、含质量分数0.06％乙酸的水按照体积比4:6进行等浓度洗脱，依次收集保留时间为12.5～13.0min洗脱组分记为组分1，收集保留时间13.4～14.0min的洗脱组分记为组分2，收集保留时间17.2～17.9min的洗脱组分记为组分3，收集保留时间18.2～19.3min的洗脱组分记为组分4，收集保留时间21.0～21.8min的洗脱组分记为组分5，收集保留时间19.4～19.8min的洗脱组分记为组分6，收集保留时间20.2～20.8min的洗脱组分记为组分7，收集保留时间24.0～26.0min的洗脱组分记为组分8；
4)将所述组分3、组分4合并，利用反相高效液相色谱进行二次精制，以乙腈、含质量分数0.06％乙酸的水为流动相，以所述乙腈、含质量分数0.06％乙酸的水按照体积比43:57进行等浓度梯度洗脱，收集保留时间为12.0～13.0min的洗脱液；经浓缩、干燥得到所述palsimycin A；
将所述组分1、组分2合并，利用反相高效液相色谱进行二次精制，以乙腈、含质量分数0.06％乙酸的水为流动相，以所述乙腈、含质量分数0.06％乙酸的水按照如下时间程序中乙腈百分比进行梯度洗脱：0～3min,35％；3～8min,35％～40％；8～13min，40％～43％；13～20min，43％～50％；20～22min，50％～100％；22～24min，100％；24～26min,100％～50％；26～30min,50％～35％。收集保留时间为18.0～19.0min时的洗脱液；经浓缩、干燥得到所述palsimycin B；
将所述组分6、组分7合并，利用反相高效液相色谱进行二次精制，以乙腈、含质量分数0.06％乙酸的水为流动相，以所述乙腈、含质量分数0.06％乙酸的水按照体积比46:54进行等浓度梯度洗脱，收集保留时间为11.5～13.0min时的洗脱液；经浓缩、干燥得到所述palsimycin C；
将所述组分5利用反相高效液相色谱进行二次精制，以乙腈、含质量分数0.06％乙酸的水为流动相，以所述乙腈、含质量分数0.06％乙酸的水按照体积比57:43进行等浓度梯度洗脱，收集保留时间为7.3～7.9min时的洗脱液；经浓缩、干燥得到所述palsimycin D。
上述方法步骤1)中，所述含N-乙酰半胱胺(SNAC)的液体培养基中N-乙酰半胱胺的体积分数为0.1％～0.2％。
所述发酵培养的条件为：在28℃培养36～48h。
上述方法步骤1)中，所述液体培养基为R5α发酵培养基。每升所述R5α发酵培养基的组成为：蔗糖100g，葡萄糖10g，六水合氯化镁10.2g，3-N-吗啉代丙磺酸21g，酵母提取物5g，硫酸钾0.25g，酸水解酪蛋白0.1g，微量元素液2mL，氢氧化钠调pH至6.85；其中，微量元素液/升：氯化锌40mg，六水合氯化铁200mg，二水合氯化铜10mg，四水合氯化锰10mg，十水合四硼酸钠10mg，四水合钼酸铵10mg。
所述Streptomyces paulus NRRL8115的接种量为2％～4％。
所述Streptomyces paulus NRRL8115菌株在接种前，还包括制备Streptomycespaulus NRRL8115种子液的步骤，具体如下：将Streptomyces paulus NRRL8115菌株孢子接种于GS-7种子液培养基，在28℃培养48h；
其中，GS-7种子培养基成分/L：pharmamedia培养基20g,葡萄糖20g，氨水将pH调节至7.2。
上述方法步骤3)中，所述反相高效液相色谱的色谱条件为：色谱柱为AglientZorbax SB-C18，规格为9.4×250mm,5μm；流速为2mL/min。
本发明的再一个目的是保护式I所示的保罗霉素衍生物—palsimycins在医药方面的用途。
本发明所提供的式I所示保罗霉素衍生物—palsimycins在医药方面的用途包括下述方面：1)在制备抗菌药物中的应用；2)在制备抗肿瘤(如白血病)药物中的应用。
所述抗菌药物为抗细菌药物。
所述细菌为革兰氏阳性细菌，具体为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、耐甲氧西林-金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA))、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、粪链球菌(Enterococcus faecalis)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenens)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)以及非球菌等，此处所述革兰氏阳性细菌不限于上述具体菌种。
所述抗菌药物用于预防和/或治疗由球菌如金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林-金黄色葡萄球菌及非球菌引起的炎症如尿道炎以及感染如衣原体感染。
本发明还保护一类抗菌药物。
所述抗菌药物，其活性成分包括本发明式I所示的保罗霉素衍生物—palsimycins。
所述抗菌药物，其活性成分还可包括其他抗菌药物。
式I所示的保罗霉素衍生物可单独或者与其他抗菌剂组合用于预防或治疗由对青霉素、链霉素、新霉素、大环内酯等具有抗性的革兰氏阳性菌引起的炎症、感染。
所述药物还可包括药学上允许的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、增效剂、添加剂和溶剂等。制备所述抗菌药物时，可将有效剂量的所述化合物与药学上允许的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、增效剂、添加剂和溶剂等混合，制成各种药用制剂。所述药物的形态可为片剂、胶囊、软胶囊、散剂、颗粒剂、细粒剂、液剂、丸剂、乳剂或悬浊剂等口服制剂，亦可为针剂(如粉剂、水剂、油剂)栓剂、软膏、硬膏、贴剂、喷雾剂、酊剂或滴眼剂等非口服制剂。这些制剂都可采用本领域技术人员熟知常用的制备方法而获得。其给药途径可为口服、经皮，静脉或肌肉注射。
保罗霉素由A环(ring A)、乙酰化的阿洛糖(acetylated D-allose moiety)、保罗酸(paulic acid)和保罗糖(paulomycose)四部分组成，其中保罗酸部位的碳碳双键和异硫氰基N＝C＝S部分可与亲核基团如-SH、-NH发生加成反应，生成保罗霉素衍生物。如图2所示，当paulomycin B与一分子SNAC发生加成反应时，SNAC既可以加成到保罗酸部位的碳碳双键，也可以加成到异硫氰基N＝C＝S部位；当保罗霉素B与两分子SNAC反应时，SNAC可以同时加成到保罗酸部位的碳碳双键位置以及N＝C＝S基团。此外，当SNAC加成到保罗酸部位的碳碳双键时，使得C2"、C3"成为手性中心，会产生手性不同的保罗霉素B类似物。
本发明通过将小分子硫醇类化合物N-乙酰半胱胺(SNAC)添加到保罗霉素的产生菌链霉菌NRRL8115高产菌株的发酵液中，经发酵分离纯化及结构解析，获得新结构化合物palsimycin A、palsimycin B、palsimycin C、palsimycin D(如图3)。抗菌活性实验表明，palsimycin A、palsimycin B对金黄色葡萄球菌等测试菌株的最小抑菌浓度(MIC)与paulomycin A、paulomycin B的MIC值处于同一水平。酸碱稳定性实验揭示，相同条件下，palsimycin A、B、C、D均比paulomycin A、paulomycin B更加稳定。因此，在不改变生物活性的前提下，本发明获得了更加稳定的保罗霉素衍生物。
本发明旨在对保罗霉素的结构进行改造修饰，在保持其生物活性的同时提高稳定性。本发明的优点在于：在不改变保罗霉素的生物活性的同时提高了其稳定性。
本发明采用直接向保罗霉素的产生菌链霉菌NRRL8115高产菌株中添加小分子硫醇类化合物N-乙酰基半胱胺(SNAC)，获得四个新结构保罗霉素衍生物。抗菌活性实验表明，palsimycin A、palsimycin B对测试菌株的最小抑菌浓度(MIC)与paulomycin A、paulomycin B的MIC值处于同一水平。酸碱稳定性实验揭示，相同条件下，palsimycin A、B、C、D均比paulomycin A、paulomycin B更加稳定。本方法避免了从发酵液中直接分离纯化不稳定的保罗霉素，而且添加的小分子化合物SNAC易获得、对细胞无毒性，不影响菌体的生长。
附图说明
图1为paulomycins及其类似物的结构式。
图2为paulomycin B与SNAC反应式。
图3为实施例1制备的palsimycin A的COSY、HMBC图及UV光谱(112μM，乙腈)。
图4为实施例1制备的palsimycin A的高分辨质谱图谱。
图5为实施例1制备的palsimycin A的1H NMR图谱。
图6为实施例1制备的palsimycin A的13C NMR图谱。
图7为实施例1制备的palsimycin A的COSY图谱。
图8为实施例1制备的palsimycin A的HSQC图谱。
图9为实施例1制备的palsimycin A的HMBC图谱。
图10为实施例2制备的palsimycin B的COSY、HMBC图及UV光谱(86μM，乙腈)。
图11为实施例2制备的palsimycin B的高分辨质谱图谱。
图12为实施例2制备的palsimycin B的1H NMR图谱。
图13为实施例2制备的palsimycin B的13C NMR图谱。
图14为实施例2制备的palsimycin B的COSY图谱。
图15为实施例2制备的palsimycin B的HSQC图谱。
图16为实施例2制备的palsimycin B的HMBC图谱。
图17为实施例3制备的palsimycin C的COSY、HMBC图及UV光谱(53μM，乙腈)。
图18为实施例3制备的palsimycin C的高分辨质谱图谱。
图19为实施例3制备的palsimycin C的1H NMR图谱。
图20为实施例4制备的palsimycin D的COSY、HMBC图及UV光谱(56μM，乙腈)。
图21为实施例4制备的palsimycin D的高分辨质谱图谱。
图22为实施例4制备的palsimycin D的1H NMR图谱。
图23为实施例4制备的palsimycin D的13C NMR图谱。
图24为实施例4制备的palsimycin D的COSY图谱。
图25为实施例4制备的palsimycin D的HSQC图谱。
图26为实施例4制备的palsimycin D的HMBC图谱。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中使用的Streptomyces paulus NRRL8115(即文献中的“Streptomyces paulus NRRL 8115CIM3007”)，记载于如下文献：Identification andAnalysis of the Paulomycin Biosynthetic Gene Cluster and Titer Improvement ofthe Paulomycins in Streptomyces paulus NRRL 8115。
实施例1 palsimycin A的分离纯化及生物活性、稳定性评价
Figure BDA0001710244310000081
1)发酵
S.paulus NRRL8115高产菌株孢子接种于GS-7种子液培养基，28℃摇床培养48h，以4％的量接种于装有100mL的R5α发酵培养基的500mL锥形瓶，添加0.1％～0.2％(V/V)的SNAC，28℃摇床培养培养4d，共发酵50L。
其中，GS-7种子培养基成分/L：pharmamedia培养基20g,葡萄糖20g,氨水将pH调节至7.2。R5α培养基成分/L：蔗糖100g，葡萄糖10g，六水合氯化镁10.2g，3-N-吗啉代丙磺酸21g，酵母提取物5g，硫酸钾0.25g，酸水解酪蛋白0.1g，微量元素液2mL，氢氧化钠调pH至6.85；其中，微量元素液/升：氯化锌40mg，六水合氯化铁200mg，二水合氯化铜10mg，四水合氯化锰10mg，十水合四硼酸钠10mg，四水合钼酸铵10mg。
N-乙酰半胱胺(SNAC)制备方法：半胱胺盐酸盐(3.05g)，氢氧化钾(1.5g)，碳酸氢钠(6.75g)，加入50mL水。加毕慢慢滴加醋酸酐(2.28mL)，5min内滴加完毕，反应0.5至1h。薄层色谱层析(TLC)检测，1mol/L的盐酸调节pH至中性，两倍体积的乙酸乙酯萃取，硅胶柱分离获得SNAC。
2)分离
将上述发酵液(50L)4000r/min离心30min，取上清，等体积乙酸乙酯萃取两遍(100L)，将乙酸乙酯相进行干燥后旋蒸浓缩，浓缩之后粗提物10.5g。采用硅胶柱色谱除去浓缩提取液中的部分杂质，其中硅胶柱色谱(3cm×110cm)的洗脱液依次为：石油醚(2.5L)、石油醚:乙酸乙酯(1:1,v/v)(2.5L)、乙酸乙酯(5L)、乙酸乙酯:甲醇(1:1,v/v)(5L)、甲醇(2.5L)，palsimycin A主要集中在乙酸乙酯:甲醇(1:1,v/v)相，将其浓缩称量5.2g。浓缩干燥后通过C18反相填料柱色谱(3cm×90cm)，其洗脱相依次为水(1L)、10％乙腈(1.5L)、30％乙腈(1.5L)、50％乙腈(2L)、乙腈(1.5L)、甲醇(2L)，palsimycin A主要集中在50％的乙腈相中。将上述50％乙腈相经旋蒸除有机相、冷冻真空干燥除水，获得粗分离制品2.5g。
3)纯化
粗分离制品溶于15mL乙腈、0.22μm膜过滤，经Aglient Zorbax SB-C18(9.4×250mm,5μm,Aglient,Santa Clara,CA,USA)、Shimadzu高效液相(Shimadzu,Kyoto,Japan)进行首次纯化，采用乙腈、水(0.06％甲酸)为流动相，流速为2mL/min，采用40％的乙腈等浓度制备，进样体积为50μL,依次收集保留时间为12.5～13.0min洗脱组分记为组分1，收集保留时间13.4～14.0min的洗脱组分记为组分2，收集保留时间17.2～17.9min的洗脱组分记为组分3，收集保留时间18.2～19.3min的洗脱组分记为组分4，收集保留时间21.0～21.8min的洗脱组分记为组分5，收集保留时间19.4～19.8min的洗脱组分记为组分6，收集保留时间20.2～20.8min的洗脱组分记为组分7，收集保留时间24.0～26.0min的洗脱组分记为组分8。获得各组分及其质量(mg)如下：
Figure BDA0001710244310000091
Figure BDA0001710244310000101
其中，palsimycin A主要集中在组分3、组分4。
采用Aglient Zorbax SB-C18(9.4×250mm,5μm,Aglient,Santa Clara,CA,USA)、Shimadzu高效液相(Shimadzu,Kyoto,Japan)进行二次精制，以水(0.06％甲酸)、乙腈分别为A、B流动相，流速为2mL/min,60μL的进样体积，以体积分数43％的乙腈等浓度梯度纯化，收集保留时间为12.0～13.0min的洗脱液；经旋蒸浓缩、冷冻真空干燥获得纯化后的palsimycin A 11.7mg。
palsimycin A的结构确证数据：
HRMS/ESI给出的化学组成为C42H64N4O19S3(m/z:[M+Na]+为1047.3259，[M+Na]+计算值1047.3327，相对误差为3.9ppm)，UV光谱中特征吸收峰λmax分别在246nm、277nm、321nm，推测在保罗霉素A的保罗酸部分加成了两分子的SNAC。
通过与保罗霉素A的1H-NMR谱进行比对，发现palsimycin A与保罗霉素A的信号非常相似，只是缺少了保罗霉素A的碳碳双键的信号，同时多出了两分子SNAC的信号。相比于保罗霉素A，palsimycin A中H-2″(δ5.08)信号的出现以及H-3″信号位移的降低(δ6.83到δ3.53)，表明其中一分子的SNAC与保罗霉素A中保罗酸的双键进行了Michael加成，并且H-3″与C-1″″的HMBC相关进一步确证了以上推断。同时通过H-1″″″与C-5″的HMBC相关，确认了另一分子的SNAC通过亲核加成与保罗酸的异硫氰酸基团相连。详细的2D NMR相关分析(包括HSQC、HMBC、1H-1H COSY谱)确证了palsimycin A的结构(如图3所示)。
Palsimycin A:1H NMR(500MHz,acetone-d6)δ:5.36(q,J＝6.8Hz,1H,H-7'),5.13(m,1H,H-1'),5.08(d,J＝6.6Hz 1H,H-2"),4.77(dd,J＝2Hz,10Hz,1H,H-11),4.49(q,J＝6.8Hz,1H,H-5'),4.23(m,1H,H-10),4.10(m,1H,H-12),3.94,3.88(m,2H,H-13),3.82(d,J＝10Hz,1H,H-8),3.68(m,1H,H-9),3.64(m,1H,H-3'),3.53(m,1H,H-3"),3.40(m,2H,H-2"""),3.35(s,3H,H-3'-OMe),3.31(t,J＝7Hz,2H,H-1"""),3.26,3.50(m,2H,H-2""'),3.16(m,2H,H-5),2.64,2.77(m,2H,H-1""'),2.45(m,1H,H-2"'),2.00(s,3H,H-2""),1.96,2.24(m,2H,H-2'),1.94(s,3H,H-4"""),1.88(s,3H,H-4""),1.72,1.53(m,2H,H-3"'),1.35(d,J＝6.8Hz,3H,H-4"),1.29(d,J＝6.8Hz,3H,H-8'),1.24(d,J＝6.8Hz,3H,H-6'),1.18(d,J＝7.0Hz,3H,H-4"'),0.96(t,J＝7.0Hz,3H,H-5"').13C NMR(125MHz,acetone-d6)δ:199.6,199.2,188.8,175.6,175.6,171.1,170.6,170.2,168.4,159.8,99.5,99.5,78.6,76.9,76.9,74.9,74.1,72.6,70.4,69.8,68.2,68.2,64.6,63.2,57.1,48.4,41.9,40.4,39.2,38.5,34.6,31.4,31.1,27.1,22.8,22.6,20.5,18.9,17.2,15.8,15.7,11.8.
4)生物活性评价
选取革兰氏阳性菌：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus CGMCC 1.89)、抗甲氧西林葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis ATCC 35984)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis1.14)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)作为测试菌株，采用纸片法进行抗菌活性的初筛，palsimycin A以及paulomycin A、paulomycin B溶于DMSO，二倍稀释法进行系列稀释，取5μL滴加到6mm的无菌滤纸片上，以DMSO为负对照，比较palsimycin A、paulomycin A、paulomycin B抑菌圈的直径大小。
测试菌株在Mueller-Hinton(MH)肉汤培养基中培养12h，37℃,220rpm，并稀释至1×105CFU/mL。palsimycin A及paulomycin A、paulomycin B溶解于一定浓度的DMSO中，取5μL加入到195μL的无菌MH肉汤中，采用96孔板法进行系列稀释，最后一个稀释度弃100μL，取100μL稀释后的菌悬液加入少上述孔中，并设置正负对照。DMSO终浓度不超过5％。37℃培养24h，读出MIC值。每组实验重复三次。结果见表1。
5)稳定性评价
主要评价在酸性(pH＝2)以及碱性条件下(pH＝9),温度控制在25℃，放置12h、36h后，palsimycin A的保留百分比，并与paulomycin A、paulomycin B相比较，每组实验重复三次。结果见表2。
实施例2 Palsimycin B的分离纯化及生物活性、稳定性评价
1)发酵
同实施例1。
2)分离
同实施例1。palsimycin B主要集中在50％的乙腈相中。将上述50％乙腈相经旋蒸除有机相、冷冻真空干燥除水，获得粗分离制品2.5g。
3)纯化
粗分离制品溶于15mL乙腈、0.22μm膜过滤，经Aglient Zorbax SB-C18(9.4×250mm,5μm,Aglient,Santa Clara,CA,USA)、Shimadzu高效液相(Shimadzu,Kyoto,Japan)进行首次纯化，采用乙腈、水(0.06％甲酸)为流动相，流速为2mL/min，采用40％的乙腈等浓度梯度制备，进样体积为50μL,依次收集保留时间为12.5～13.0min洗脱组分记为组分1，收集保留时间13.4～14.0min的洗脱组分记为组分2，收集保留时间17.2～17.9min的洗脱组分记为组分3，收集保留时间18.2～19.3min的洗脱组分记为组分4，收集保留时间21.0～21.8min的洗脱组分记为组分5，收集保留时间19.4～19.8min的洗脱组分记为组分6，收集保留时间20.2～20.8min的洗脱组分记为组分7，收集保留时间240～260min的洗脱组分记为组分8。获得各组分及其质量(mg)如下：
Figure BDA0001710244310000121
其中，palsimycin B主要集中在组分1、组分2。
采用Aglient Zorbax SB-C18(9.4×250mm,5μm,Aglient,Santa Clara,CA,USA)、Shimadzu高效液相(Shimadzu,Kyoto,Japan)进行二次精制，以水(0.06％甲酸)、乙腈分别为A、B流动相，流速为2mL/min,60μL的进样体积，按照如下时间程序中乙腈百分比进行梯度洗脱：0～3min,35％；3～8min,35％～40％；8～13min，40％～43％；13～20min,43％～50％；20～22min，50％～100％；22～24min,100％；24～26min,100％～50％；26～30min,50％～35％。收集保留时间为18.0～19.0min时的洗脱液；经旋蒸浓缩、冷冻真空干燥获得纯化后的palsimycin B 12mg。
Palsimycin B的结构确证数据：
HRMS/ESI给出的化学组成为C41H62N4O19S3(m/z:[M+Na]+为1033.3068,[M+Na]+计算值1033.3170，相对误差为0.54ppm)，UV光谱中特征吸收峰λmax分别在246nm、277nm、322nm，与保罗霉素B的区别在于保罗酸部分的吸收，推测在保罗霉素B的保罗酸部分加成了两分子的SNAC。
通过与保罗霉素B的1H-NMR谱进行比对，发现palsimycin B与保罗霉素B的信号非常相似，只是缺少了保罗霉素B的碳碳双键的信号，同时多出了两分子SNAC的信号。相比于保罗霉素B，palsimycin B中H-2″(δ5.08)信号的出现以及H-3″信号位移的降低(δ6.82到δ3.52)，表明其中一分子的SNAC与保罗霉素B中保罗酸的双键进行了Michael加成，并且H-3″与C-1″″的HMBC相关进一步确证了以上推断。同时通过H-1″″″与C-5″的HMBC相关，确认了另一分子的SNAC通过亲核加成与保罗酸的异硫氰酸基团相连。详细的2D NMR相关分析(包括HSQC、HMBC、1H-1H COSY谱)确证了palsimycin B的结构，如图8所示。
Palsimycin B:1H NMR(500MHz,acetone-d6)δ:5.35(q,J＝6.0Hz,1H,H-7'),5.13(d,J＝2Hz,1H,H-1'),5.08(m,1H,H-2"),4.78(dd,J＝2Hz,8Hz,1H,H-11),4.51(q,J＝6.0Hz,1H,H-5'),4.23(m,1H,H-10),4.13(m,1H,H-12),3.95-3.86(m,2H,H-13),3.83(d,J＝10Hz,1H,H-8),3.70(m,1H,H-9),3.65(dd,J＝4.85Hz,11.0Hz,1H,H-3'),3.52(m,1H,H-3"),3.41(m,2H,H-2""”),3.34(s,3H,H-3'-OMe),3.32(m,2H,H-1""”),3.29(m,2H,H-2""'),3.16(m,2H,H-5),2.78(m,2H,H-1”'"),2.65(m,1H,H-2"'),2.00(s,3H,H-2""),1.98,2.24(m,2H,H-2'),1.94(s,3H,H-4"""),1.88(s,3H,H-4""'),1.35(d,J＝6.85Hz,3H,H-4"),1.28(d,J＝6.85Hz,3H,H-8'),1.24(d,J＝6.0Hz,3H,H-6'),1.20(d,J＝7.0Hz,3H,H-4"'),1.18(d,J＝7.0Hz,3H,H-3"').13C NMR(125MHz,acetone-d6)δ:199,198,188.1,175.5,175.5,169.9,169.7,169.2,167.8,159.2,99.8,98.8,78,77.9,76.1,74.2,73.5,71.9,70,69.8,69.2,67.4,63.9,62.4,56.4,47.7,39.7,39.7,38.7,33.9,30.4,30.4,22.1,21.9,19.8,18.7,18.6,15.2,15.
4)生物活性评价
同实施例1。结果见表1。
5)稳定性评价
主要评价在酸性(pH＝2)以及碱性条件下(pH＝9),温度控制在25℃，放置12h、36h后，palsimycin B的保留百分比，并与paulomycin A、paulomycin B相比较，每组实验重复三次。结果见表2。
实施例3 palsimycin C的分离纯化及生物活性、稳定性评价
1)发酵
同实施例1。
2)分离
同实施例1。palsimycin C主要集中在50％的乙腈相中。将上述50％乙腈相经旋蒸除有机相、冷冻真空干燥除水，获得粗分离制品2.5g。
3)纯化
粗分离制品溶于15mL乙腈、0.22μm膜过滤，经Aglient Zorbax SB-C18(9.4×250mm,5μm,Aglient,Santa Clara,CA,USA)、Shimadzu高效液相(Shimadzu,Kyoto,Japan)进行首次纯化，采用乙腈、水(0.06％甲酸)为流动相，流速为2mL/min，采用40％的乙腈等浓度梯度制备，进样体积为50μL,依次收集保留时间为12.5～13.0min洗脱组分记为组分1，收集保留时间13.4～14.0min的洗脱组分记为组分2，收集保留时间17.2～17.9min的洗脱组分记为组分3，收集保留时间18.2～19.3min的洗脱组分记为组分4，收集保留时间21.0～21.8min的洗脱组分记为组分5，收集保留时间19.4～19.8min的洗脱组分记为组分6，收集保留时间20.2～20.8min的洗脱组分记为组分7，收集保留时间24.0～26.0min的洗脱组分记为组分8。获得各组分及其质量(mg)如下：
Figure BDA0001710244310000131
Figure BDA0001710244310000141
其中，palsimycin C主要集中在组分6、组分7。
采用Aglient Zorbax SB-C18(9.4×250mm,5μm,Aglient,Santa Clara,CA,USA)、Shimadzu高效液相(Shimadzu,Kyoto,Japan)进行二次精制，以水(0.06％甲酸)、乙腈分别为A、B流动相，流速为2mL/min，60μL的进样体积，以体积分数46％的乙腈等浓度梯度纯化palsimycin C，收集11.5～13.0min时候的洗脱液，经旋蒸浓缩、冷冻真空干燥获得纯化后的palsimycin C 4.2mg。
palsimycin C的结构确证数据：
HRMS/ESI给出的化学组成为C37H53N3O18S2(m/z:[M+Na]+为892.2840，[M+Na]+计算值892.2766，相对误差为0.19ppm)，UV光谱中特征吸收峰λmax分别在239nm、321nm，与保罗霉素B区别在于保罗酸部分的吸收，同时根据分子量，推测palsimycin C在保罗霉素B的保罗酸部分加成了一分子的SNAC。
通过与保罗霉素B的1H NMR谱进行比对，发现palsimycin C与保罗霉素B的信号非常相似，只是缺少了保罗霉素B的碳碳双键的信号，同时多出了一分子SNAC的信号。相比于保罗霉素B，palsimycin B中H-2″(δ5.10)信号的出现以及H-3″信号位移的降低(δ6.82到δ3.51)，表明其中一分子的SNAC与保罗霉素B中保罗酸的双键进行了Michael加成，如图17所示。
Palsimycin C:1H NMR(500MHz,acetone-d6)δ:5.36(q,J＝6.8Hz,1H,H-7'),5.10(d,J＝5Hz 1H,H-2"),5.04(m,1H,H-1'),4.77(dd,J＝2Hz,9Hz,1H,H-11),4.56(q,J＝6.3Hz,1H,H-5'),4.24(m,1H,H-10),4.15(m,1H,H-12),3.94,3.85(m,2H,H-13),3.84(d,J＝10Hz,1H,H-8),3.70(m,1H,H-9),3.65(m,1H,H-3'),3.51(m,1H,H-3"),3.50(m,2H,H-2""'),3.34(s,3H,H-3'-OMe),3.31,3.23(m,2H,H-1""'),3.17(m,2H,H-5),2.64(m,1H,H-2"'),2.00(s,3H,H-2""),1.94,2.22(m,2H,H-2'),1.88(s,3H,H-4""'),1.35(d,J＝6.8Hz,3H,H-4"),1.29(d,J＝6.8Hz,3H,H-8'),1.24(d,J＝6.3Hz,3H,H-6'),1.21(d,J＝7.0Hz,3H,H-3"'),1.18(d,J＝7.0Hz,3H,H-4"').
4)生物活性评价
同实施例1。结果见表1。
5)稳定性评价
主要评价在酸性(pH＝2)以及碱性条件下(pH＝9),温度控制在25℃，放置12h、36h后，palsimycin C的保留百分比，并与paulomycin A、paulomycin B相比较，每组实验重复三次。结果见表2。
实施例4 Palsimycin D的分离纯化及生物活性、稳定性评价
1)发酵
同实施例1。
2)分离
同实施例1。palsimycin D主要集中在50％的乙腈相中。将上述50％乙腈相经旋蒸除有机相、冷冻真空干燥除水，获得粗分离制品2.5g。
3)纯化
粗分离制品溶于15mL乙腈、0.22μm膜过滤，经Aglient Zorbax SB-C18(9.4×250mm,5μm,Aglient,Santa Clara,CA,USA)、Shimadzu高效液相(Shimadzu,Kyoto,Japan)进行首次纯化，采用乙腈、水(0.06％甲酸)为流动相，流速为2mL/min，采用40％的乙腈等浓度梯度制备，进样体积为50μL,依次收集保留时间为12.5～13.0min洗脱组分记为组分1，收集保留时间13.4～14.0min的洗脱组分记为组分2，收集保留时间17.2～17.9min的洗脱组分记为组分3，收集保留时间18.2～19.3min的洗脱组分记为组分4，收集保留时间21.0～21.8min的洗脱组分记为组分5，收集保留时间19.4～19.8min的洗脱组分记为组分6，收集保留时间20.2～20.8min的洗脱组分记为组分7，收集保留时间24.0～26.0min的洗脱组分记为组分8。获得各组分及其质量(mg)如下：
Figure BDA0001710244310000151
其中，palsimycin D主要集中在组分5。采用Aglient Zorbax SB-C18(9.4×250mm,5μm,Aglient,Santa Clara,CA,USA)、Shimadzu高效液相(Shimadzu,Kyoto,Japan)进行二次精制，以水(0.06％甲酸)、乙腈分别为A、B流动相，流速为2mL/min，60μL的进样体积，以45％的乙腈等浓度梯度纯化palsimycin D，经旋蒸浓缩、冷冻真空干燥获得纯化后的palsimycin D 4.1mg。
Palsimycin D的结构确证数据：
HRMS/ESI给出的化学组成为C37H53N3O18S2(m/z:[M+Na]+为892.2840，[M+Na]+计算值892.2766，相对误差为0.19ppm)，UV光谱中特征吸收峰λmax分别在237nm、321nm，与保罗霉素B区别在于保罗酸部分的吸收，同时根据分子量，推测palsimycin D在保罗霉素B的保罗酸部分加成了一分子的SNAC。
通过与palsimycin C的1H NMR谱进行比对，发现palsimycin D与palsimycin C的信号非常相似，分析palsimycin D的HMBC谱图，发现有H-3″与C-5″的相关信号，确认了一分子的SNAC先与异硫氰酸基团发生亲核加成，随后与碳碳双键进行Michael加成，在保罗酸部分形成了五元杂环的结构。详细的2D NMR相关分析(包括HSQC、HMBC、1H-1H COSY谱)确证了palsimycin D的结构，如图20所示。
Palsimycin D:1H NMR(500MHz,acetone-d6)δ:5.35(q,J＝6.0Hz,1H,H-7'),5.13(d,J＝2.0Hz,1H,H-1'),5.08(m,1H,H-2"),4.78(dd,J＝2Hz,8Hz,1H,H-11),4.51(q,J＝6.0Hz,1H,H-5'),4.23(m,1H,H-10),4.13(m,1H,H-12),3.95-3.86(m,2H,H-13),3.83(d,J＝10Hz,1H,H-8),3.70(m,1H,H-9),3.65(dd,J＝4.85Hz,11.0Hz,1H,H-3'),3.52(m,1H,H-3"),3.34(s,3H,H-3'-OMe),3.29(m,2H,H-2""'),3.18(m,2H,H-5),2.78(m,2H,H-1""'),2.65(m,1H,H-2”'),2.00(s,3H,H-2""),1.98,2.24(m,2H,H-2'),1.88(s,3H,H-4"'"),1.35(d,J＝6.85Hz,3H,H-4"),1.28(d,J＝6.85Hz,3H,H-8'),1.24(d,J＝6.0Hz,3H,H-6'),1.20(d,J＝7.0Hz,3H,H-4"'),1.18(d,J＝7.0Hz,3H,H-3"').
13C NMR(125MHz,acetone-d6)δ:197.5,187.4,175.1,169.3,168,167,158.5,97.7,79.1,77.3,77.1,74.6,73.5,72.8,71.2,69.1,69,68.5,66.6,61.4,55.6,48.5,47.1,38.4,33.2,31,29.6,21.2,19.1,18,17.1,15.9,14.5,14.3.
4)生物活性评价同实施例1。结果见表1。
5)稳定性评价
主要评价在酸性(pH＝2)以及碱性条件下(pH＝9),温度控制在25℃，放置12h、36h后，palsimycin D的保留百分比，并与paulomycin A、paulomycin B相比较，每组实验重复三次。结果见表2。
表1 palsimycin A-D与paulomycin A、B的抗菌活性比较(μg/mL)
Figure BDA0001710244310000161
采用肉汤微量稀释法，以革兰氏阳性菌株金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus CGMCC 1.89)、抗甲氧西林葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcusaureus,MRSA)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis ATCC 35984)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis 1.14)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)为测试菌株，评价palsimycin A、B、C、D的抗菌活性，并与paulomycin A、paulomycin B相比较，同时以万古霉素为阳性对照。实验结果如表1所示，palsimycin A、paldimycin B对各测试菌株的抗菌活性与paulomycin A、paulomycin B处于同一水平，而经一分子SNAC修饰的保罗霉素衍生物palsimycin C、palsimycin D的抗菌活性均弱于paulomycin A、paulomycin B。此外，含有特殊五环结构的palsmycin D的抗菌活性要显著优于在保罗酸的碳碳双键部位加成一分子SNAC的palsimycin C。palsimycinA、paldimycin B及paulomycin A、paulomycin B对除了肺炎链球菌外的各测试菌株的最小抑菌浓度(MIC)与阳性对照万古霉素处于同一数量级。
表2 palsimycin A-D的稳定性评价
Figure BDA0001710244310000171
与保罗霉素性质类似，palsimycin A-D对热敏感、在酸性及碱性条件下不稳定。酸性条件下，A环羟基脱水，溶液由无色转变为淡黄色而失去生物活性。由表2可知，pH＝2时，palsimycin A-D降解的速度慢于paulomycin A及paulomycin B，36h后palsimycin A-D分别保留51％、60％、42％及32％，而paulomycin A、paulomycin B分别降解88％、77％。碱性(pH＝9)条件下，palsimycin A-D在25℃放置12h后，分别保留76％、83％、89％、84％，paulomycin A、paulomycin B分别保留49％及50％；而放置36h后，与paulomycin A、paulomycin B的保留量(33％、31％)相比，palsimycinA-D(48％、50％、54％、58％)的降解速度更慢。因此，palsimycin A-D在酸性及碱性条件下都要比paulomycin A、paulomycin B更稳定。

Claims (7)

1.结构式如式I所示的化合物或其药学上可接受的盐、酯：
Figure FDA0002646339170000011
所述式I所示的化合物具体为palsimycin A、palsimycin B、palsimycin C或palsimycin D，其结构式如下所示：
Figure FDA0002646339170000012
2.权利要求1所述化合物的制备方法，包括下述步骤：
1)将Streptomyces paulus NRRL8115菌株在含N-乙酰半胱胺的液体培养基中进行发酵培养，收集发酵液；
2)将所述发酵液离心，收集上清液，将所述上清液用乙酸乙酯进行萃取，收集乙酸乙酯相进行干燥后浓缩，得粗提物；将所述粗提物用硅胶柱色谱进行分离纯化，其中所述硅胶柱色谱的洗脱液依次为：1倍柱体积的石油醚、1～1.5倍柱体积的石油醚和乙酸乙酯体积比1:1混合液、1～1.5倍柱体积的乙酸乙酯、1.5～2倍柱体积的乙酸乙酯和甲醇体积比1:1混合液、1倍柱体积的甲醇，收集用乙酸乙酯和甲醇体积比1:1混合液洗脱的洗脱组分并浓缩，得浓缩物；
将所述浓缩物通过C18反相填料柱色谱进行分离，其洗脱相依次为：水、1倍柱体积的体积分数为10％的乙腈-水溶液、1.5～2倍柱体积的体积分数为30％的乙腈-水溶液、1～1.5倍柱体积的体积分数为50％乙腈-水溶液，收集用体积分数为50％乙腈-水溶液洗脱的洗脱组分，除去有机相、干燥，得粗分离制品；
3)将所述粗分离制品以乙腈为溶剂，配制成溶液；然后利用反相高效液相色谱进行分离，以乙腈、含质量分数0.06％乙酸的水为流动相，所述乙腈、含质量分数0.06％乙酸的水按照体积比4:6进行等浓度梯度洗脱，依次收集保留时间为12.5～13.0min洗脱组分记为组分1，收集保留时间13.4～14.0min的洗脱组分记为组分2，收集保留时间17.2～17.9min的洗脱组分记为组分3，收集保留时间18.2～19.3min的洗脱组分记为组分4，收集保留时间21.0～21.8min的洗脱组分记为组分5，收集保留时间19.4～19.8min的洗脱组分记为组分6，收集保留时间20.2～20.8min的洗脱组分记为组分7，收集保留时间24.0～26.0min的洗脱组分记为组分8；
4)将所述组分3、组分4合并，利用反相高效液相色谱进行二次精制，以乙腈、含质量分数0.06％乙酸的水为流动相，以所述乙腈、含质量分数0.06％乙酸的水按照体积比43:57进行等浓度梯度洗脱，收集保留时间为12.0～13.0min的洗脱液；经浓缩、干燥得到所述palsimycin A；
将所述组分1、组分2合并，利用反相高效液相色谱进行二次精制，以乙腈、含质量分数0.06％乙酸的水为流动相，以所述乙腈、含质量分数0.06％乙酸的水按照如下时间程序中乙腈百分比进行梯度洗脱：0～3min,35％；3～8min,35％～40％；8～13min,40％～43％；13～20min,43％～50％；20～22min,50％～100％；22～24min,100％；24～26min,100％～50％；26～30min,50％～35％。收集保留时间为18.0～19.0min时的洗脱液；经浓缩、干燥得到所述palsimycin B；
将所述组分6、组分7合并，利用反相高效液相色谱进行二次精制，以乙腈、含质量分数0.06％乙酸的水为流动相，以所述乙腈、含质量分数0.06％乙酸的水按照体积比46:54进行等浓度梯度洗脱，收集保留时间为11.5～13.0min时的洗脱液；经浓缩、干燥得到所述palsimycin C；
将所述组分5利用反相高效液相色谱进行二次精制，以乙腈、含质量分数0.06％乙酸的水为流动相，以所述乙腈、含质量分数0.06％乙酸的水按照体积比57:43进行等浓度梯度洗脱，收集保留时间为7.3～7.9min时的洗脱液；经浓缩、干燥得到所述palsimycin D。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述含N-乙酰半胱胺的液体培养基中N-乙酰半胱胺的体积分数为0.1％～0.2％；
所述发酵培养的条件为：在28℃培养36～48h；
所述Streptomyces paulus NRRL8115的接种量为2％～4％。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述反相高效液相色谱的色谱条件为：色谱柱为Aglient Zorbax SB-C18，规格为9.4×250mm,5μm；流速为2mL/min。
5.权利要求1所述化合物或其药学上可接受的盐、酯在制备抗革兰氏阳性细菌药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述革兰氏阳性细菌为下述至少一种：金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪链球菌、化脓性链球菌、肺炎链球菌。
7.一类抗革兰氏阳性细菌的药物，其活性成分包括权利要求1中所述的palsimycin A、palsimycin B或palsimycin D或其药学上可接受的盐、酯。
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