FI100112B - Menetelmä bakteerien vastaisen tiomarinolin valmistamiseksi - Google Patents
Menetelmä bakteerien vastaisen tiomarinolin valmistamiseksi Download PDFInfo
- Publication number
- FI100112B FI100112B FI922058A FI922058A FI100112B FI 100112 B FI100112 B FI 100112B FI 922058 A FI922058 A FI 922058A FI 922058 A FI922058 A FI 922058A FI 100112 B FI100112 B FI 100112B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- doublet
- singlet
- triplet
- thiomarinol
- methanol
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D495/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms
- C07D495/02—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms in which the condensed system contains two hetero rings
- C07D495/04—Ortho-condensed systems
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
- C12P17/185—Heterocyclic compounds containing sulfur atoms as ring hetero atoms in the condensed system
- C12P17/187—Heterocyclic compounds containing sulfur atoms as ring hetero atoms in the condensed system containing two or more directly linked sulfur atoms, e.g. epithiopiperazines
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Food Preservation Except Freezing, Refrigeration, And Drying (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Tires In General (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Description
100112
Menetelmä bakteerien vastaisen tiomarinolin valmistamiseksi Förfarande för framställning av bakteriemotverkande tiomarinol 5 Keksinnön tausta
Esillä oleva keksintö liittyy menetelmään uuden yhdisteen valmistamiseksi. Olemme nimenneet tämän yhdisteen Tiomarinoliksi ja sen kaava on esitetty myöhemmin. Keksinnön mukaisissa menetelmissä tiomarinolia valmistetaan käymisen avulla käyttä-10 mällä suvun Alteromonas mikro-organismia ja varsinkin uuden lajin Alteromonas rava kantaa, merkitty SANK 73390, joka itsessään on uusi ja muodostaa osan tätä keksintöä. Tiomarinolilla on erilaisia terapeuttisia, varsinkin bakteerin vastaisia vaikutuksia ja siten keksinnön avulla saadaan myös aikaan koostumuksia ja menetelmiä hoitoon tai ennalta ehkäisyyn käyttämällä tätä yhdistettä.
15
Alteromonas suvun organismit voidaan eristää merivedestä ja jotkut ovat osoittautuneet .': : tuottavan yhdisteitä, joista on mahdollista terapeuttista käyttöä. Esimerkiksi yhdiste, joka on tunnettu nimellä Viscabelin, on saatu eräästä Alteromonas lajista ja sillä on osoittautunut olevan kasvaimenvastaista vaikutusta (Japanilainen patenttihakemus Kokai n:o Sho 20 63-27484).
Mitä tulee tiomarinolin rakenteeseen, tunnetaan useita antibioottiaineita, joilla on samantapaisia rakenteita ja nämä voidaan jakaa kolmeen ryhmään.
• · • · · * « · \ 25 Ensimmäinen ryhmä käsittää pseudoemoniinihapot, jotka ensin eristettiin lajista Pseudo- • · : -: monas spp. Näihin kuuluu pseudomoniinihappo A [joka tuottaa Peudomonas fluorescens.
• V · • * '·· joka on esitetty artikkelissa J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 294 (1977)], pseudo- moniinihappo B [ibid, 318 (1977)], pseudomoniinihappo C [ibid, 2827 (1982)] ja pseudomoniinihappo D [ibid, 2655 (1983)]. Pseudomoniinihappoa A myydään nimellä 30 "Bactroban" (Beecham, rekisteröity tavaramerkki) 2 %:sen dermatologisen salvan (ihon-hoitovoiteen) muodossa bakteerinvastaiseen käyttöön.
100112 2
Muita pseudomoniinihappojohdannaisia on saatu meren bakteereista [Am. Chem. Soc. Abstr. Pap., 200 (2), (1990)], mutta tämä julkaisu ei esitä, että sillä olisi mitään bakteerinvastaista vaikutusta.
5 Toinen ryhmä aineita, joilla on samantapainen rakenne kuin keksinnön mukaisella yhdisteellä, käsittää ryhmän, johon kuuluu antibiootit holomycin [Helv. Chim. Acta, 42, 563 (1959)], pyrrothine [J. Am. Chem. Soc., 77, 2861 (1955)], thiolutin [Angew. Chem., 66, 745 (1954)], aureothricin [J. Am. Chem. Soc., 74, 6304 (1952)] ja muut. Näitä antibiootteja tyypillisesti tuottaa aktinomyseetit ja niille on tunnusomaista rikkiä 10 sisältävä kromofoori. Xenorhabdiinit I-V ovat holomysiiniin liittyviä yhdisteitä ja niitä on myös eristetty bakteereista (esitetty julkaisussa WO 84/01775).
On suoritettu erilaisia tutkimuksia liittyen näiden kahden ryhmien johdannaisiin, mutta emme ole tietoisia mistään aikaisemmasta yhdisteestä, jolla olisi tiomarinolin mole-15 kyylirakenne tai jolle olisi tunnusomaista sen ominaisuudet.
Kolmas ryhmä yhdisteitä on esitetty julkaisuissa, kuten japanilaiset patenttihakemukset Kokai 52-102279, 54-12375, 54-90179, 54-103871 ja 54-125672, jotka esittävät pseudomoniinihapon johdannaisia ja joilla on samantapainen rakenne kuin tiomarinolilla, 20 mutta jossa päätykarboksyylihapon tilalla on amidiryhmä. Näillä yhdisteillä ei ole
I I
'. . verrattavissa olevaa bakteerinvastaista vaikutusta eikä niillä ole laajaa bakteerinvastaista ··*· i vaikutusta. Tosiasiassa näillä yhdisteillä on tyypillisesti heikompi antibioottinen • · · *;··* vaikutus kuin alkuperäisellä pseudomoniinihapolla.
• · · • · · t · · * 25 Keksinnön Ivhvt kuvaus i · k ♦ *
Mitään yhdisteistä, jotka on kuvattu edellä, ei ole eristetty lajista Alteromonas spp. ja • * · mikään ei ole identtinen tiomarinolin kanssa. Eräs tiomarinolin rakenneominaisuuksista on esimerkiksi OH-ryhmän läsnäolo 6-jäsenisen renkaan ja α,/3-tyydyttämättömän 30 karbonyyliryhmän välillä. Siksi tiomarinoli selvästi eroaa tekniikan tasosta.
3 100112 Tämän keksinnön kohteena on saada aikaan uusi yhdiste, jolla on parempi vaikutus ja laajempi bakteerinvastainen vaikutus verrattuna antibioottiryhmiin, jotka on kuvattu edellä. Siten esillä olevassa keksinnössä saadaan aikaan kaavan (I) mukainen yhdiste: 5
HO f” ?H ° O
10 ch, o Hl OH 0 15 Keksinnössä saadaan myös aikaan menetelmä tiomarinolin valmistamiseksi, jossa menetelmässä viljellään tiomarinolia tuottavaa suvun Alteromonas mikro-organismia ja eristetään tiomarinoli tästä viljelystä.
Keksinnön avulla saadaan myös aikaan farmaseuttinen koostumus, joka käsittää 20 tiomarinolia sekoitettuna farmaseuttisesti hyväksyttävään kantajaan tai laimentimeen.
: Keksinnöllä saadaan vielä aikaan tiomarinolin käyttö, varsinkin bakteeri-infektioiden # « · '···1 hoitoon tai ennalta ehkäisyyn.
# i « • - · I 1 ’ : 25 Keksintö taijoaa vielä tiomarinolin käytön lääkkeen valmistamiseen bakteeri-infektioi- i i · t » ' * den käsittelyyn tai ennalta ehkäisyyn.
* · « «
* M
' ' Keksinnöllä saadaan vielä aikaan menetelmä bakteeri-infektioiden hoitoon tai ennalta ehkäisyyn, jossa menetelmässä annostellaan tiomarinolin tehokas määrä nisäkkäälle,
I I
‘ ; 30 joka voi olla ihminen, jolla on tai jolle voi tarttua tällainen infektio.
I · 100112 4
Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus
Edellä olevasta kaavasta on selvää, että tiomarinoli sisältää asymmetrisiä hiiliatomeja ja useita kaksoissidoksia. Isomerisointi on erityisen mahdollinen tiomarinolin α,β-5 tyydyttämättömässä karbonyyliosuudessa. Tiomarinoli voi siksi muodostaa erilaisia optisia ja geometrisia isomeerejä. Vaikka näitä kaikkia tässä kuvataan yhdellä ainoalla molekyylikaavalla, esillä olevaan keksintöön kuuluu sekä yksittäiset eristetyt isomeerit että niiden seokset, mukaanlukien rasemaatit. Kun käytetään stereospesifisiä syn-teesitekniikoita tai käytetään optisesti aktiivisia aineita lähtöaineina, yksittäiset 10 isomeerit voidaan valmistaa suoraan; toisaalta jos valmistetaan isomeerien seos, yksittäiset isomeerit voidaan saada tavanomaisilla erotustekniikoilla.
Luonnossa esiintyvä tiomarinoli pyrkii ottamaan itselleen optisen standardi-konfiguroin-nin. Siksi, vaikkakin muut konfiguroinnit ovat mahdollisia, luonnollinen konfigurointi 15 on edullinen.
Tiomarinolia voidaan valmistaa viljelemällä tiomarinolia tuottavaa lajin Alteromonas mikro-organismia ja sitten keräämällä tiomarinoli viljely väliaineesta. Tiomarinolin eri muotoja, joilla on haluttu bakteerinvastainen vaikutus, voidaan saada samalla tavalla 20 muista Alteromonas lajeista tai kannoista, jotka tuottavat halutun yhdisteen tai ne . ·. ·. voidaan saada modifioimalla sopivasti fermentoimalla saatu yhdiste, kuten on kuvattu tai : ne voidaan syntetisoida kemiallisesti suoraan.
« · « · • · · • · • · ·
Erityisesti pidämme edullisena käyttää mikro-organismina uutta Alteromonas rava lajia 25 ja varsinkin äskettäin eristettyä Alteromonas rava kantaa, jolle on annettu kannanmer- « · :T: kintänumero SANK 73390. Kanta SANK 73390 on meren mikro-organismi, joka on eristetty merivedestä keräämällä Koinan meripuolella, osoitteena Minami-Izu-Machi, Shizuoka Prefecture, Japani, ja tämä kanta on tallennettu laitoksessa Deposition v : Institute, Research Institute of Microbiological Technology, Agency of Industrial :' ·. 30 Science & Technology, Japani, 30. huhtikuuta 1991, talletusnumerolla FERM BP-3381, •: · ·: Budapestin sopimuksen mukaisesti. 1 ti · 100112 5
Alteromonas rava kannan SANK 73390 taksonomiset ominaisuudet on esitetty seuraavas-sa.
1. Morfologiset ominaisuudet 5
Alteromonas rava kantaa SANK 73390 viljeltiin lämpötilassa 23°C 24 tuntia Merivesi-agarissa (Difco). Samalla havaittiin mikroskoopilla, että solut olivat sauvanmuotoisia ja jokaisen halkaisija oli 0,8 - 1,0 μτη ja pituus 2,0 - 3,6 μπι. Tämä kanta on gram-negatiivinen ja liikkuu polaarisen yksittäisen siiman avulla.
10 2. Kasvu merivesi Agarilla
Kantaa SANK 73390 viljeltiin 24 tuntia lämpötilassa 23°C merivesi Agarilla (Difco). Tuloksena saadut viljelmät havaittiin olevan harmahtavan vaaleankeltaisia väriltään, 15 läpinäkyviä, pyöreitä, litteitä ja kokonaisia. Veteen liukenevaa pigmenttiä ei muodostunut.
3. Fysiologiset ominaisuudet 20 (1) Merivesivaatimukset: SANK 73390 vaatii merivettä kasvua varten.
.y, (2) Hapetus-käymis-testi (Hugh-Leifson menetelmä [J. Bact., 66, 24-26 j (1953)], väliaineessa, joka on valmistettu keinotekoisesta merivedestä): ei • M · vaikutusta hiilihydraattiin.
M t :*·,* (3) Oksidaasi: + • · :]·.? 25 (4) Katalaasi: + i.i . (5) Happivaatimus: aeorobinen (6) Nitraatin pelkistys - : (7) Tärkkelyksen hydrolyysi: + (8) Agarin hajoaminen: - 30 (9) Gelatiinin nesteyttäminen: + (10) DNaasin tuotto: + 100112 6 (11) Lipaasin tuotto: + (12) Kasvulämpötila: Huono kasvu lämpötilassa 4°C, hyvä kasvu lämpötila-alueella 17°C - 26°C, ei kasvua lämpötilassa 35°C.
(13) Kasvuntekijävaatimus: Perusväliaineella, joka on kuvattu Journal of 5 Bacteriology 107, 268-294 (1971), SANK 73390 vaatii vitamiinittoman
Casamino-hapon.
(14) Hiililähteiden assimilointi: Perusväliaineella, joka on kuvattu Journal of Bacteriology 107. 268-294 (1971), käsittäen lisäksi 0,1 % p/t vita-miinitonta Casamino-happoa, ravistusviljelmässä: 10
TAULUKKO
L-Arabinoosi: - D-Riboosi: 15 D-Ksy loosi: - D-Glukoosi: + D-Galaktoosi: - D-Fruktoosi:
Maltoosi: + Sakkaroosi:
Trehaloosi: + Sellobioosi:
Melibioosi: - Mannitoli: 20 Sorbitoli: - Glyseriini:
Natriumasetaatti: + Natriumpropionaatti: + • · · • · · ' ' " ' ' I ' — ' ' * — • · · · • · • · 4, Kemiallistaksonominen laatu :V 25 (1) DNA:n guaniini-ja sytosini-mooli-% (G + C sisältö): 43,4 % (HPLC menetelmä) (2) Kinoni-jäijestelmä: Ubikinoni Q-8 • ·
Ottamalla huomioon edellä olevat taksonomiset ominaisuudet, Alteromonas rava kantaa 30 SANK 73390 verrattiin kantoihin, joita on kuvattu julkaisussa Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, Voi. 1 (1984), kuten myös niihin kantoihin, joita on kuvattu
II
100112 7 äskettäin lehdessä International Journal of Systematic Bacteriology. Havaitsimme, että Alteromonas rava kanta SANK 73390 useassa suhteessa muistutti Alteromonas citrea kantaa, joka on toinen merivesiperäinen mikro-organismi. Kantoja SANK 73390 ja Alteromonas citrea. ATCC 29719 (standardi kanta) viljeltiin verrattavalla tavalla ja 5 verrattiin toisiinsa.
Verrattuna kannan SANK 73390 vaalean harmahtavaan keltaiseen väriin, kannan ATCC 29719 viljelmät olivat vihertävän keltaisia väriltään. SANK 73390 erosi myös lämpötilassa 4°C tapahtuvalta kasvultaan Alteromonas citrea: sta ja kyvyltään käyttää 10 hyväksi trehaloosia ja natriumpropionaattia hiililähteinä.
Sen mukaisesti, Alteromonas rava kanta SANK 73390 on uuden lajin Alteromonas rava: n uusi kantaja eroaa olennaisilta ominaisuuksiltaan lähimmistä tunnetusta lajista, joka on tallennettu talletusnumerolla ATCC 29719.
15
Edellä kuvatut ominaisuudet ovat tyypillisiä SANK 73390:lle. On kuitenkin hyvin tunnettua, että Alteromonas spp:n ominaisuudet ovat muutettavissa sekä luonnollisesti että keinotekoisesti. Ne ominaisuudet, jotka edellä kuvattiin, määrittävät tallennettua
Alteromonas rava:n kantaa, mutta eivät välttämättä ole tyypillisiä muille Altero- 20 monas:n lajeille tai Alteromonas rava:n kannoille, jotka kykenevät tuottamaan tioma- . . rinolia tai sen luonnollisesti esiintyvää muunnelmaa. Tällaiset muut lajit sisältyvät : keksinnön piiriin.
• · · · • · · • « ·» ·
On ymmärrettävä, että SANK 73390, tai mikä vain muu kanta, joka kykenee tuotta-25 maan tiomarinolia tai jotain sen muunnelmaa, voidaan ali-viljellä tai bioteknologisesti :T: muuttaa tai modifioida organismin tuottamiseksi, jolla on erilaiset ominaisuudet. Ainoa vaatimus on se, että tuloksena saatu organismi kykenee tuottamaan haluttua yhdistettä.
• · Tällaiset muutokset ja muunnelmat voivat olla missä vain halutussa muodossa tai ne 30 voivat olla johdonmukaisia sellaisessa mielessä, kuten esimerkiksi viljelyolosuhteet.
100112 8
Kantoja voi muuntaa viljelemällä ja sillä tavalla valita halutaanko sellaisia ominaisuuksia kuten parempaa kasvua tai kasvua alemmissa/korkeammissa lämpötiloissa.
Biotekniset muunnelmat on yleensä tarkoituksenmukaisia ja niillä voi saada aikaan 5 valittavia ominaisuuksia, kuten bakteerien kasvua ehkäisevä vastus tai herkkyys, tai sekä että, puhtauden ylläpitämiseksi tai viljelmien, varsinkin siemenviljelmien, puhdistuksen sallimiseksi eri ajankohdilla.
Muita ominaisuuksia, joita voidaan saada aikaan geenimanipuloinnilla, ovat mitkä vain, 10 jotka Alteromonas spp. sallii. Esimerkiksi plasmideja, jotka koodittavat vastustuskykyisiä organismeja, voidaan sisällyttää tai mitä vain luonnollisesti esiintyviä plasmideja voidaan poistaa. Edullisiin plasmideihin kuuluu ne, jotka vaikuttavat kasvuun. Plasmideja voidaan saada mistä vain sopivasta lähteestä tai niitä voidaan saada aikaan eristämällä luonnollisesti esiintyvä Alteromonas plasmidi ja sisällyttämällä haluttu geeni tai 15 halutut geenit toisesta lähteestä. Luonnollisia plasmideja voidaan myös modifioida millä vaan muulla tavalla, joka todetaan toivottavaksi.
Tiomarinolin saamiseksi sopivan mikro-organismin viljelmästä, mikro-organismi pitäisi fermentoida sopivassa väliaineessa. Sellaiset väliaineet tunnetaan yleensä hyvin alalla 20 ja usein niitä käytetään muiden käymistuotteiden tuottamiseen.
: Tyypillisesti on välttämätöntä, että väliaine käsittää hiililähteen, typpilähteen tai • « · · yhden tai useamman epäorgaanisen suolan yhdistelmän, jotka asianmukainen mikro-organismi pystyy käyttämään hyväksi. Väliaineen minimivaatimus on, että se sisältää V . 25 niitä ainesosia, jotka ovat olennaisia mikro-organismin kasvulla.
• · «
Sopivia hiililähteitä ovat glukoosi, fruktoosi, maltoosi, sakkaroosi, mannitoli, glyseroli, • · ' dekstriini, ohrajauho, ruis, maissi tärkkelys, peruna, maissipulveri, soijapapupulveri, pumpulisiemenöljy, siirappi, sitruunahappo ja viinihappo, joita voidaan käyttää 30 yksinään tai yhdistelmänä yhden tai useamman muun kanssa. Tyypilliset määrät ovat « 100112 9 alueella 1 - 10 % p/t väliaineen määrästä, vaikkakin määrää voidaan vaihdella halutulla tavalla tai halutun tuloksen saamiseksi.
Sopiviin typpilähteisiin kuuluu mikä vain aine, joka esimerkiksi sisältää proteiinia. 5 Edustuskelpoisia esimerkkejä typpilähteistä ovat orgaaniset typpilähteet eläimistä ja kasveista ja voivat olla uutteita sellaisista luonnollisesti lähteistä, kun soijapapupulveri, kaura, maapähkinäpulveri, pumpulisiemenpulveri, kaseiinihydrolysaatti, fermamiini, kalapulveri, maissineste, peptoni, lihauute, hiiva, hiivauute, mallasuute; ja sellaisista epäorgaanisista typpilähteistä, kun natriumnitraatti, ammoniumnitraatti ja ammonium-10 sulfaatti. Kuten hiililähteen tapauksessa, näitä voidaan käyttää yksinään tai yhdistelmänä. Sopivat määrät ovat tyypillisesti alueella 0,1 - 6 % p/t väliaineen määrästä.
Sopivat epäorgaaniset ravintosuolat ovat ne, joissa on hivenaineita, kuten myös suolan pääainesosa. Edullisten suolojen pitäisi tuottaa sellaisia ioneja, kuten natrium, kalium, 15 ammonium, kalsium, magnesium, rauta, fosfaatti, sulfaatti, kloridi ja karbonaatti. Sellaisia hivenainemetalleja, kuten koboltti, mangaani ja strontium tai suoloja, jotka kykenevät saamaan aikaan sellaisia ioneja, ovat bromidi, fluoridi, boraatti tai silikaatti-ionit voi myös olla läsnä.
20 On huomattava, että Alteromonas rava:a esiintyy luonnollisesti merivedessä niin, että . jos ei muuta sanota, parhaat olosuhteet sen viljelemiseksi vastaavat meriveden ympäris- j töä. Siten meressä olevia hiven-ioneja sisällytetään edullisesti mihin vain väliainee- * · · · >*“· seen, jota käytetään Alteromonaksen viljelemiseksi.
»•I
9 t t m · * · :** # 25 Jos mikro-organismi fermentoidaan nesteviljelmänä, on edullista, että käytetään vaahtoa vastustavaa ainetta, kuten silikoniöljyä tai kasviöljyä tai muuta sopivaa pinta-aktiivista ainetta.
• * • · ·
On edullista, että viljely väliaineen pH Alteromonas rava:n kantaa SANK 73390 varten, 30 kun sitä käytetään tiomarinolin tuottamiseen, pH ylläpidetään alueella 5,0 - pH 8,0, vaikka ainoa vaatimus on se, että pH ei saisi estää mikro-organismin kasvua, tai » · 100112 10 haitallisesti ja peruuntumattomasti pilata lopullisen tuotteen laatua. Saattaa olla edullista lisätä hapon tai allcalin ylimäärä käymisen lopettamiseksi.
Alteromonas rava kanta SANK 73390, yleensä kasvaa lämpötila-alueella 4°C- 32°C, ja 5 kasvaa hyvin lämpötila-alueella 17°C - 26°C. Muita lämpötiloja, jotka eivät osu näiden lämpötila-alueiden sisäpuolelle, voidaan käyttää kun sellainen kanta on kehitetty, joka voi kasvaa alemmissa tai korkeammissa lämpötiloissa. Tiomarinolin tuotantoa varten edullinen lämpötila on alueella 20°C - 26°C.
10 Tiomarinolia saadaan ihanteellisesti aerobisesti viljelemällä, ja mitä vain sopivaa aerobista viljelytekniikkaa, jotka ovat esimerkiksi kiinteä viljely, ravistusviljely tai ilmastointi-sekoitus-viljelmä voidaan käyttää.
Jos viljelmä suoritetaan pienessä mittakaavassa, silloin ravistusviljely, joka saa käydä 15 useita päiviä lämpötilassa 20°C - 26°C on yleensä edullinen.
Käymisviljelmän aloittamiseksi edullisessa tekniikassa käytetään aikuistutusta, joka on valmistettu yhdessä tai kahdessa vaiheessa, Erlenmeyer-pullossa, esimerkiksi. Hiililäh-dettä ja typpilähdettä voidaan käyttää yhdessä viljelyväliaineen kanssa. Siemenpulloa 20 ravistetaan termostaattisessa inkubaattorissa lämpötilassa 23°C 1-3 päivää, kunnes havaitaan riittävä kasvu. Tuloksena saatua siemenviljelyä voidaan sitten käyttää istutta- • :‘j maan toista siemenviljelmää tai tuottamalla viljely. Jos suoritetaan toinen siemennys, »t1\1 tämä voidaan suorittaa samalla tavalla ja osittain käyttää tuotantoväliaineen istuttami- seen. Pulloa, johon siemen viedään, ravistetaan 1-3 päivää tai kunnes saadaan * · V'1 25 maksimituotanto sopivassa lämpötilassa. Kun inkubointi on täydellinen, pullot sisällöt
« »I
V : voidaan kerätä sentrifugoimalla tai suodattamalla.
• · « f · ’> ’! Jos viljely suoritetaan suorassa mittakaavassa, viljely sopivassa ilmastointi-sekoitus- ‘ käymisastiassa voi olla edullinen. Tässä menetelmässä ravintoväliaine voidaan • 4 :/·; 30 valmistaa käymisastiassa. Steriloinnin jälkeen lämpötilassa 125°C väliaine jäähdyte- ':": tään ja siemennetään istuttamalla, joka istutusaine aikaisemmin on kasvanut steriloidus-
II
| • · 100112 11 sa väliaineessa. Viljely suoritetaan lämpötilassa 20°C - 26°C sekoittaen ja ilmastamalla. Tämä menetelmä on sopiva yhdisteen suuren määrän saamiseksi.
Tuotetun tiomarinolin määrä viljelemällä ajan mittaan voidaan suorittaa korkean 5 suorituskyvyn nestekromatografialla, esimerkiksi. Yleensä tuotetun tiomarinolin määrä saavuttaa maksimin 19-96 tunnin jälkeen.
Sopivan viljelyajan jälkeen tiomarinoli voidaan eristää ja puhdistaa millä vain tunnetulla tavalla. Esimerkiksi tiomarinolia, jota on jäänyt viljelyliemeen, voidaan saada 10 suodattamalla kiinteät aineet pois esimerkiksi käyttämällä diatomiittia suodatusapuai-neena tai sentrifugoimalla ja sen jälkeen uuttamalla kelluvasta kaasusta puhdistamalla tiomarinolin fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien mukaisesti. Esimerkiksi tiomarinolia, jota on suodoksessa tai kelluvassa faasissa voidaan uuttaa veteen sekoittumattomalla orgaanisella liuottimella, kuten etyyliasetaatilla, kloroformilla, etyleenikloridilla, 15 metyleenikloridilla tai millä vaan sen seoksella neutraaleissa tai happamissa olosuhteissa ja puhdistaa.
Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää adsorbenttia, aktiivista hiiltä tai adsorboivaa hartsia, kuten Amberlite XAD-2, XAD-4 (Rohm & Haas) tai Diaion HP-10, HP-20, CHP-20, 20 HP-50 (Mitsubishi Kasei Corporation). Epäpuhtauksia voidaan poistaa adsorption jälkeen antamalla nesteen, joka sisältää tiomarinolia, mennä adsorbenttikerroksen läpi; : tai tiomarinolia voidaan puhdistaa adsorption jälkeen eluoimalla sopivalla eluentilla, • « *···' kuten vesipitoisella metanolilla, vesipitoisella asetonilla tai butanoli/vedellä.
• · • · · • t· • < « « .
*·./ 25 Solunsisäistä tiomarinolia voidaan puhdistaa uuttamalla sopivalla liuottimella, kuten I · • f 50-90 % :11a vesipitoisella asetonilla tai vesipitoisella metanolilla, sen jälkeen poistamalla . . orgaaninen liuotin, jonka jälkeen seuraa uutto, kuten on edellä kuvattu suodosta tai • « · • · · kelluvaa faasia varten.
' 30 Tuloksena saatua tiomarinolia voidaan edelleen puhdistaa hyvin tunnetuilla tekniikoilla esimerkiksi: adsorptiokolonnikromatografialla käyttämällä kantajaa, kuten silikageeliä 100112 12 tai magnesiumsilikageeliä, esimerkiksi sitä jota myydään kauppanimellä "Florisil"; jakokolonnikromatografialla käyttämällä adsorbenttia, kuten Sephadex LH-20 (tavaramerkki Pharmacian tuotteelle); tai korkean suorituskyvyn nestekromatografiaa käyttämällä normaalifaasi- tai käänteisfaasikolonnia. Kuten hyvin tiedetään alalla, näitä 5 erityisiä puhdistusmenetelmiä voidaan suorittaa yksinään tai minä vain sopivana yhdistelmänä ja haluttaessa toistuvasti halutun lopputuotteen eristämiseksi ja puhdistamiseksi.
Kun keksinnön mukaiset yhdisteet on tarkoitettu terapeuttiseen käyttöön, ne voidaan 10 annostella yksinään tai sopivassa farmaseuttisessa formuloinnissa, joka sisältää aktiivisen yhdisteen lisäksi yhtä tai useampaa tavanomaista laimenninta, kantaja-ainetta, täyteainetta tai apuainetta. Formuloinnin laatu riippuu tietenkin tarkoitetusta annostelu-reitistä. Suun kautta tapahtuvaa reittiä varten yhdiste edullisesti formuloidaan pulvereiksi, rakeiksi, tableteiksi, kapseleiksi tai siirapeiksi. Ruuansulatuskanavan ulkopuolelle 15 tapahtuvaa annostelua varten on edullista formuloida se ruiskun muotoon (joka voi olla suonensisäinen, lihaksensisäsinen tai ihonalainen) pisaroiksi tai puikoiksi.
Valmisteet voidaan valmistaa tunnetuilla tavoilla lisäämällä sellaisia lisäaineita, kuten kuljetusaineita, sideaineita, hajotusaineita, voiteluaineita, stabilointiaineita, koijausainei- 20 ta, solubilisointiaineita, suspensioaineita tai päällystysaineita. Vaikka annos saattaa vaihdella potilaan oireiden ja iän mukaan, tartunnan laadusta ja vakavuudesta ja :.*· : annostelureitistä riippuen, kun on kyseessä suun kautta tapahtuva annostelu aikuiselle *;··* ihmispotilaalle, esillä olevan keksinnön mukaiset yhdisteet voidaan normaalisti annostel- *; * la päivittäisenä annoksena 20 mg - 2000 mg. Yhdisteet voidaan annostella yhtenä • · *;_*· 25 ainoana annoksena tai jaettuina annoksina, esimerkiksi 2-3 kertaa päivässä.
• · o • · l . . Koska tiomarinolilla on bakteerin vastainen vaikutus gram-positiivisia ja gram-bakteereja • · · vastaan eläimissä (esim. ihminen, koira, kissa ja kani), on usein toivottavaa levittää sitä ihon yli tapahtuvana annosteluna, yleensä voiteen, salvan tai geelin muodossa.
’ · ’; 30 Samanlaisia huomioita tämän annostelumuodon ainesosista ja valmistuksesta pätee kuin edellä olevien muotojen yhteydessä.
100112 13
Seuraavat esimerkit kuvaavat tiomarinolin valmistusta ja sen bakteerinvastaista vaikutusta, mutta ne ei ole tehty rajoittamaan esillä olevaa keksintöä millään tavalla.
ESIMERKKI 1 5
Tiomarinolin astiafermentointi A) Viljely 10 Alteromonas rava kantaa SANK 73390 viljeltiin 3 päivää lämpötilassa 20°C meri-vesiperäisen Agarin tasolla (Difcon tuote). Tuloksena saatu viljely suspensoitiin 3 ml:aan keinotekoista merivettä. 0,1 ml suspensiota otettiin aseptisesti ja istutettiin 500 ml Erienmeyer-pulloon, joka sisälsi 100 ml steriloitua väliainetta [37,4 g meri-vesilientä (Difcon tuote) 1 litrassa deionisoitua vettä, pH ei säädetty).
15
Pulloa haudottiin 24 tuntia lämpötilassa 23°C ravistamalla nopeudella 200 rpm (70 mm kiertosäde) käyttämällä pyörivää ravistinta. Tämän jälkeen kaikki neljä 30 litran käymisastiaa, jokaisen sisältäessä 15 ml steriiliä edellä kuvattua väliainetta, istutettiin 15 ml:lla viljelyä, joka aseptisesti oli otettu Erlenmeyer-pullosta. Käymisastioita 20 haudottiin 23 tuntia lämpötilassa 23°C, ilmastointinopeudella 7,5 litraa/minuutti samalla sekoittaen (100 rpm).
• · » · • · · *;··* B) Eristys « · · « • · 25 23 tunnin jälkeen käymisastioiden sisällöt yhdistettiin, jolloin saatiin 60 litraa vilje- lynestettä. Nesteen pH säädettiin sitten arvoon 3 lisäämällä kloorivetyhappoa, jonka ; jälkeen seurasi 60 litran asetonilisäys ja seosta uutettiin 30 minuuttia, samalla sekoitta- • ·« en. Käyttämällä 1,2 kg Celite 545 -suodatusapuainetta (yhtiöstä Johns Manville Co. saatavilla olevan t iotteen tavaramerkki), liuos suodatettiin. 110 litraa tuloksena saatua 30 suodosta uutettiin sitten kerran 60 litralla etyyliasetaattia ja kaksi kertaa etyyliasetaatilla, kummallakin kerralla määrällä 30 litraa. Orgaaninen kerros pestiin 30 litralla 5 % p/t 100112 14 vesipitoista natriumvetykarbonaattiliuosta ja sen jälkeen 30 litralla tyydytettyä natrium-kloridin vesiliuosta, kuivattiin vedettömän natriumsulfaatin avulla ja kondensoitiin kuivaksi haihduttamalla alennetussa paineessa, jolloin saatiin 14 g öljymäistä ainetta.
5 Öljymäinen aine, joka saatiin, liuotettiin metyleenikloridiin ja liuotin adsorboitiin kolonniin, joka on pakattu 200 g:lla silikageeliä metyleenikloridissa. Kohdeyhdiste eluoitiin korottamalla kehitysliuottimen polaarisuus seuraavassa jäijestyksessä: metylee-nikloridi/etyyliasetaatti; etyyliasetaatti; etyyliasetaatti/metanoli. Eluointi kerättiin 18 ml:n fraktioina ja fraktiot, jotka eluoitiin etyyliasetaatilla-metanolilla, ja jotka 10 sisälsivät tiomarinolia säästettiin.
Säästetyt fraktiot kondensoitiin kuivaksi haihduttamalla, jolloin saatiin 7 g öljymäistä ainetta, joka liuotettiin 400 ml:aan 50 tilavuus-% vesipitoista metanolia ja adsorboitiin 600 mklle kolonnia, joka oli pakattu Diaion HP-20:lla (yhtiön Mitsubishi Chem. Ind. 15 tuotteen tavaramerkki) vedessä. Kun oli pesty 50 %: sella t/t vesipitoisella metanolilla, kohdeaine eluoitiin 90 % t/t vesipitoisella metanolilla ja kondensoinnin jälkeen kuivaksi alennetussa paineessa, saatiin 1 g keltaista pulveria. Keltaista pulveria eluoitiin edelleen kolonnikromatogrammiin käyttämällä Sephadex LH-20 ja kehitettiin metyleenikloridil-la: etyyliasetaatilla: metanolilla (19 : 19 : 2 tilavuusseoksella) aktiivisten fraktioiden 20 keräämiseksi. 750 mg tiomarinolia saatiin keltaisena pulverina.
; Tuloksena saadulla tiomarinolilla oli seuraavassa esitetyt ominaisuudet.
• · • « • · · • « • · k • · · * . 1) Ulkonäkö ja ilmentymismuoto: Keltainen pulveri.
• « * 25 • ♦ · 2) Sulamispiste: 84-89°C.
• · • · · • · · 3) Molekyylikaava: C30H44N2O9S2.
30 4) Molekyylipaino: 640, määriteltynä FAB-MS-menetelmällä ("FAB-MS" on Fast
Atom Bombardment Mass Spectrometry).
II
100112 15 5) Korkean erotuskyvyn massaspektri: C3oH45N209S2 [ (M+H)+ FAB-MS-menetelmällä]:
Laskettu: 641.2567 Löydetty: 641.2585 5 6) Alkuaineanalyysi:
Laskettu: C, 56,23 %; H, 6,92 %; N, 4,37 %; S, 10,01 % Löydetty: C, 55,92 %; H, 6,82 %; N, 4,23 %; S, 9,90% 10 7) Infrapuna-absorptiospektri: infrapunaspektrissä oli seuraavat absorptiomaksimit (KBr-levymenetelmä, v,^ cm'1): 3394, 2930, 1649, 1598, 1526, 1288, 1216, 1154, 1102, 1052.
8) Ultraviolettiabsorptiospektri: 15 Metanolissa tai seoksessa metanoli + HC1, tiomarinolilla on seuraavassa esitetty ultraviolettiabsorptiospektri: [annettu yksikössä λ,^ nm (ε) ] 387 (12,000), 300 (3,500), 214 (26,000) ja seoksessa metanoli 4- NaOH sillä on seuraava ultraviolettispektri: [annettu yksikössä λ,^ nm (ε) ] 20 386 (9,600), 306 (3,200), 206 (25,000).
; 9) Ominaiskierto: [a]D25 = +4,3° (C = 1,0, metanoli).
« · • · « · · • · 'm\ 10) Korkean suorituskyvyn nestekromatografia: m 1 “ • » L 25 Erotuskolonni: Senshu-Pak ODS H-2151 (Kolonnin koko, yhtiön Senshu Scientific • · · • ·
Co., Ltd tuote) ^ . Liuotin: 40 % t/t vesipitoinen asetonitriili * · ·
Virtausnopeus: 1,5 ml/minuutti
Aallonpituus: 220-350 nm (määritelty fotodiodijäijestelmällä) 30 Viipymäaika: 5,9 minuuttia.
100112 16 11) ^-ydinmagneettinen resonanssispektri: (5 ppm)
Ydinmagneettinen resonanssispektri (270 MHz) heksadeuteroidussa dimetyylisulfok-sidissa, käyttämällä tetrametyylisilaania sisäisenä standardina, on esitetty seuraa-vassa: 5 0,91 (3H, dupletti, J = 6,8 Hz); 0,95 (3H, dupletti, J = 5,9 Hz); 1.30 (6H, leveä multipletti); 1,55 (5H, leveä multipletti); 2.03 (3H, singletti); 10 2,09 (3H, multipletti); 2,34 (2H, tripletti, J = 7,3 Hz); 3,33 (1H, dupletti, J = 10,7 Hz); 3,52 (2H, multipletti); 3,64 (2H, multipletti); 15 3,73 (1 H, duplettien dupletti); 4,02, (2H, tripletti, J = 6,6 Hz); 4,18 (1H, leveä dupletti, J = 7,3 Hz); 4.30 (1H, dupletti, J = 4,4 Hz); 4,44 (1H, dupletti, J = 7,8 Hz); 20 4,63 (1H, dupletti, J = 3,4 Hz); 4,89 (1H, dupletti, J = 7,3 Hz); ; 5,37 (2H, multipletti); ’··1' 5,97 (1H, leveä singletti); • · : \ 7,04 (1H, singletti); « · I, ' 25 9,80 (1H, leveä singletti); • · · • « · 10,68 (1H, leveä singletti); tl · • · · • ♦ · 12) 13C-ydinmagneettinen resonanssispektri: (6 ppm)
Ydinmagneettinen resonanssispektri (68 MHz) deuteroidussa metanolissa, käyttä-30 mällä tetrametyylisilaania sisäisenä standardina, on esitetty seuraavassa: 174.3 (singletti), 170,4 (singletti), 168,4 (singletti), 100112 17 161.1 (singletti), 137,9 (singletti), 135,7 (dupletti), 135.1 (singletti), 129,8 (dupletti), 116,3 (dupletti), 115,8 (singletti), 113,7 (dupletti), 77,6 (dupletti), 74,4 (dupletti;, , 72,1 (dupletti), , 71,8 (dupletti), 5 66,0 (tripletti), 65,7 (dupletti), 64,9 (tripletti), 45.3 (dupletti), 43,9 (dupletti), 36,6 (tripletti), 33.4 (tripletti), 30,1 (tripletti), 30,0 (tripletti), 29,7 (tripletti), 27,0 (tripletti), 26,7 (tripletti), 20,3 (kvartetti), 16,6 (kvartetti), 10 16,3 (kvartetti).
13) Liukoisuus:
Liukenee alkoholeihin, kuten metanoli, etanoli, propanoli ja butanoli; ja liukenee dimetyylisulfoksidiin, dimetyyliformamidiin, kloroformiin, etyyliasetaattiin, 15 asetoniin ja etyylieetteriin; liukenematon heksaaniin ja veteen.
14) Värireaktiot:
Positiivinen rikkihapolle, jodille ja kaliumpermanganaatille.
20 15) Ohutkerroskromatografia:
Rf-arvo: 0,57 :·· ; Adsorbointiaine: Silikageeli (Merck & Co. Inc., Art. 5715) ··· ’···] Kehitysliuotin: metyleenikloridi: metanoli = 85 : 15 tilavuusseos.
• · • · > « · 25 TESTIESIMERKKT 1 . . Tiomarinolin bakteeri n vastainen vaikutus • · · • · · • ·
Tiomarinolin pienin inhibointikonsentraatio (MIC), annettuna yksikössä Mg/ml, gram-30 positiivisia ja gram-negatiivisia bakteereita vastaan määriteltiin agari-väliaine-liuotin- 100112 18 menetelmällä käyttämällä ravinto-agari-väliainetta (yhtiön Eiken Chemical Co., Ltd tuote).
Tulokset on annettu seuraavassa taulukossa 1.
5
Taulukko 1 10 Testibakteerikanta MIC (Mg/ml)
Staphylococcus aureus 209P < 0,01
Staphylococcus aureus 56R < 0,01
Staphylococcus aureus 535 (MRSA) < 0,01 15 Enterococcus faecalis 681 0,02
Escherichia coli NHIJ 0,8
Escherichia coli 609 0,8
Salmonella enteritidis 0,4
Klebsiella pneumoniae 806 0,8 20 Klebsiella pneumoniae 846 (R) 0,2
Enterobacter cloacae 963 1,5 :.. . Serratia marcescens 1184 3,1 «·· ’···* Proteus vulgaris 1420 0,05 « « • · \ Morganella morganii 1510 6,2 « » · 25 Pseudomonas aeruginosa 1001 0,2 • « · • < * * Pseudomonas aeruginosa N07 0,4 « · • · · — — • · · • · 100112 19 TESTIESIMERKKI 2 Tiomarinolin sienenvastainen vaikutus 5 Suorittamalla sama menetelmä kuin testiesimerkissä 1, tiomarinolin vaikutus analysoitiin erilaisia sienilajeja vastaan. Tulokset on annettu seuraavassa taulukossa 2.
Taulukko 2 10 Kanta MIC (Mg/ml)
Mycoplasma bovis Donetta 0,0125
Mycoplasma pallisepticum PG-31 0,05
Mycoplasma pallisepticum S-6 0,10 15 Mycoplasma pallisepticum K-l 0,05
Mycoplasma synoviae WVU1853 <0,006
Mycoplasma hvosynoviae S-16 0,025 20 Istutettu: 0,005 ml 105 CFU/ml .; ' Analysointiväliaine: i M· bovis ja M· pallisepticum Chanock väliaine [valmistettu kuten on kuvattu * · · P.N.A.S., 48, 41-49 (1962) ja täydennetty • · · *; 20 %:11a hevosen seerumia] I i * * 25 M synoviae Frey väliaine [valmistettu kuten on kuvattu Am.
« · J. Vet. Res., 29, 2163-2171 (1968) ja täyden- >.t . netty 12 %:lla sian seerumia] • · · I I φ M hvosynoviae Mucin PPLO agariväliaine (täydennetty 15 % :11a hevosen seerumia) 30 1 i I « · 100112 20
Viljelyolosuhteet: 37°C, 5 päivää, kevyesti aerobiset (BBL kaasupakkausmenetelmä [viljely saatavissa olevassa C02 generaattorissa frpm Becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, MD 2103 USA]) 5 * - PPLO (PleuroPneumonia-Like Organism) PPLO liemi ilman CV:tä (Difco) 21 g
Bakteriologinen sieni (Difco) 5 g
Tislattua vettä 800 ml
Jaloagaria (Difco) 12 g 10 Equine-seerumia 150 ml 25 % tuoretta hiivauutetta 50 ml fr fr fr ' · f · ♦ fr fr fr · • · ·« 1 « fr · fr • *» fr < 1 • ·· r * • « « r ' 4 m · « » « t fr fr * · • · »
Claims (5)
1. Adsorbointiaine: Silikageeli (Merck & Co. Inc., Art. 5715) • · « • · · J..* Kehitysliuotin: metyleenikloridi: metanoli = 85 : 15 tilavuusseos; • · · ;·. 25 ja että menetelmässä viljellään suvun Alteromonas mikro-organismia, joka kykenee • i r tuottamaan mainittua yhdistettä ja eristetään mainittu yhdiste mainitusta viljelmästä. • · · • · ·
1 H-ydinmagneettinen resonanssispektri: (δ ppm) Ydinmagneettinen resonanssispektri (270 MHz) heksadeuteroidussa dimetyylisulfok-sidissa, käyttämällä tetrametyylisilaania sisäisenä standardina, on esitetty seuraavas-sa: 5 0,91 (3H, dupletti, J = 6,8 Hz); 0,95 (3H, dupletti, J = 5,9 Hz); 1.30 (6H, leveä multipletti); 1,55 (5H, leveä multipletti); 2.03 (3H, singletti); 10 2,09 (3H, multipletti); 2,34 (2H, tripletti, J = 7,3 Hz); 3,33 (1H, dupletti, J = 10,7 Hz); 3,52 (2H, multipletti); 3,64 (2H, multipletti); 15 3,73 (1H, duplettien dupletti); 4,02, (2H, tripletti, J = 6,6 Hz); 4,18 (1H, leveä dupletti, J = 7,3 Hz); 4.30 (1H, dupletti, J = 4,4 Hz); •.V 4,44 (1H, dupletti, J = 7,8 Hz); I : : 20 4,63 (1H, dupletti, J = 3,4 Hz); 4,89 (1H, dupletti, J = 7,3 Hz); ’· ” 5,37 (2H, multipletti); "♦ '· 5,97 (1H, leveä singletti); • · · 7.04 (1H, singletti); .. 25 9,80 (1H, leveä singletti); • · 10,68 (1H, leveä singletti); • · 1 • · · · · • · · 1Λ 1 -’C-ydinmagneettinen resonanssispektri: (δ ppm) Ydinmagneettinen resonanssispektri (68 MHz) deuteroidussa metanolissa, käyttä-i " 30 mällä tetrametyylisilaania sisäisenä standardina, on esitetty seuraavassa: “· 174,3 (singletti), 170,4 (singletti), 168,4 (singletti), 100112 161.1 (singletti), 137,9 (singletti), 135,7 (dupletti), 135.1 (singletti), 129,8 (dupletti), 116,3 (dupletti), 115,8 (singletti), 113,7 (dupletti), 77,6 (dupletti), 74,4 (dupletti), 72,1 (dupletti), 71,8 (dupletti), 5 66,0 (tripletti), 65,7 (dupletti), 64,9 (tripletti), 45.3 (dupletti), 43,9 (dupletti), 36,6 (tripletti), 33.4 (tripletti), 30,1 (tripletti), 30,0 (tripletti), 29,7 (tripletti), 27,0 (tripletti), 26,7 (tripletti), 20,3 (kvartetti), 16,6 (kvartetti), 10 16,3 (kvartetti); Liukoisuus: Liukenee alkoholeihin, kuten metanoli, etanoli, propanoli ja butanoli; ja liukenee dimetyylisulfoksidiin, dimetyyliformamidiin, kloroformiin, etyyliasetaattiin, 15 asetoniin ja etyylieetteriin; liukenematon heksaaniin ja veteen; Värireaktiot: Positiivinen rikkihapolle, jodille ja kaliumpermanganaatille; ja • « •;; * 20 Ohutkerroskromatografia: • · ; ·, Rf-arvo: 0,57 • · *
1. Menetelmä seuraavan kaavan mukaisen yhdisteen valmistamiseksi 5 OH OH o S\ / OH (I, 15 tunnettu siitä, että menetelmässä viljellään suvun Alteromonas mikro-organismia, joka kykenee tuottamaan mainittua yhdistettä ja eristetään mainittu yhdiste mainitusta viljelmästä. : : : 20
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitulla yhdisteellä on seuraavat ominaisuudet: • «· • · • · ♦ · · *·// Ilmentymismuoto ja ulkonäkö: Keltainen pulveri; * · · • · · .. 25 Sulamispiste: 84-89°C; • « • ♦ * « • · · • « · • ♦ ♦ Molekyylikaava: C3QH44N2O9S2; • · · Molekyylipaino: 640, määritetty FAB-MS-menetelmällä ("FAB-MS" on Fast Atom 30 Bombardment Mass Spectrometry); 100112 Korkean erotuskyvyn massaspektri: C30H45N2O9S2 [ (M+H)+ FAB-MS-menetelmällä]: Laskettu: 641.2567 Löydetty: 641.2585; 5 Alkuaineanalyysi: Laskettu: C, 56,23 %; H, 6,92 %; N, 4,37 %; S, 10,01 % Löydetty: C, 55,92 %; H, 6,82 %; N, 4,23 %; S, 9,90%
10 Infrapuna-absorptiospektri: infrapunaspektrillä oli seuraavat absorptiomaksimit (KBr-levymenetelmä, Pmax cm"*): 3394, 2930, 1649, 1598, 1526, 1288, 1216, 1154, 1102, 1052; Ultraviolettiabsorptiospektri:
15 Metanolissa tai seoksessa metanoli + HC1, tiomarinolilla on seuraavassa esitetty ultraviolettiabsorptiospektri: [annettu yksikössä Xmax nm (e) ] 387 (12,000), 300 (3,500), 214 (26,000) ja seoksessa metanoli + NaOH sillä on seuraava ultraviolettispektri: [annettu .:: yksikössä Xmax nm (e) ] : 20 386 (9,600), 306 (3,200), 206 (25,000); *; '· Ominaiskierto: [a]j)^ = +4,3° (C = 1,0, metanoli); • · ♦ • · · • · • · · • · · • « « * Korkean suorituskyvyn nestekromatografia: .. 25 Erotuskolonni: Senshu-Pak ODS H-2151 (Kolonnin koko, yhtiön Senshu Scientific • · * • 1 > *.;.φ Co., Ltd mote) • · · Liuotin: 40 % t/t vesipitoinen asetonitriili • « · Virtausnopeus: 1,5 ml/minuutti Aallonpituus: 220-350 nm (määritelty fotodiodijärjestelmällä)
30 Viipymäaika: 5,9 minuuttia; 11 100112
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu mikro-organismi on Alteromonas rava. 30 II 100112
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu mikro-organismi on Alteromonas rava kanta SANK 73390, ja tunnistetaan talletusnume-rolla FERM BP-3381.
5 • · · • · • · • « · • · · • · • · · • » 1 • · 1 • · « « • « ' » · t ♦ ♦ • · · · · • · » 100112
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10157591 | 1991-05-07 | ||
| JP10157591 | 1991-05-07 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI922058A0 FI922058A0 (fi) | 1992-05-06 |
| FI922058A FI922058A (fi) | 1992-11-08 |
| FI100112B true FI100112B (fi) | 1997-09-30 |
Family
ID=14304198
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI922058A FI100112B (fi) | 1991-05-07 | 1992-05-06 | Menetelmä bakteerien vastaisen tiomarinolin valmistamiseksi |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0512824B1 (fi) |
| JP (1) | JP2766421B2 (fi) |
| KR (1) | KR0139515B1 (fi) |
| CN (1) | CN1043786C (fi) |
| AT (1) | ATE127805T1 (fi) |
| AU (1) | AU646615B2 (fi) |
| CA (1) | CA2068083C (fi) |
| CZ (1) | CZ279780B6 (fi) |
| DE (1) | DE69204734T2 (fi) |
| DK (1) | DK0512824T3 (fi) |
| ES (1) | ES2079797T3 (fi) |
| FI (1) | FI100112B (fi) |
| GR (1) | GR3018161T3 (fi) |
| HK (1) | HK3896A (fi) |
| HU (2) | HU214738B (fi) |
| IE (1) | IE70452B1 (fi) |
| IL (1) | IL101786A (fi) |
| IS (1) | IS1606B (fi) |
| NO (1) | NO300736B1 (fi) |
| NZ (1) | NZ242648A (fi) |
| RU (1) | RU2077534C1 (fi) |
| TW (1) | TW224488B (fi) |
| ZA (1) | ZA923242B (fi) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3038064B2 (ja) * | 1991-10-07 | 2000-05-08 | 日清製粉株式会社 | インドール誘導体およびこれを有効成分とする抗潰瘍薬 |
| IL107017A (en) * | 1992-09-18 | 1998-01-04 | Sankyo Co | History of thiomarinol, processes for their preparation, and pharmaceutical preparations containing them |
| AU6927094A (en) * | 1993-05-13 | 1994-12-12 | Smithkline Beecham Plc | Deoxythiomarinol derivatives, process and intermediates for their preparation and their use as microbicides and herbicides |
| GB9310485D0 (en) * | 1993-05-21 | 1993-07-07 | Smithkline Beecham Plc | Novel compounds |
| WO1995005384A1 (en) * | 1993-08-13 | 1995-02-23 | Smithkline Beecham Plc | Derivatives of monic acids a and c having antibacterial, antimycoplasmatical, antifungal and herbicidal activity |
| AU4496996A (en) * | 1995-01-31 | 1996-08-21 | Sankyo Company Limited | Pseudomonic acid derivatives |
| CN1345377A (zh) * | 1999-02-03 | 2002-04-17 | 拜奥盖尔药厂有限公司 | 从含假单胞菌酸复合体的培养液中分离假单胞菌酸a的方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2173499A (en) * | 1985-02-04 | 1986-10-15 | Ici Plc | Fungicidal dithiolopyrrolones |
-
1992
- 1992-05-05 IL IL10178692A patent/IL101786A/en not_active IP Right Cessation
- 1992-05-05 ZA ZA923242A patent/ZA923242B/xx unknown
- 1992-05-05 AU AU16033/92A patent/AU646615B2/en not_active Ceased
- 1992-05-05 IS IS3855A patent/IS1606B/is unknown
- 1992-05-06 JP JP4112934A patent/JP2766421B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1992-05-06 RU SU5052114/04A patent/RU2077534C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1992-05-06 CA CA002068083A patent/CA2068083C/en not_active Expired - Fee Related
- 1992-05-06 FI FI922058A patent/FI100112B/fi not_active IP Right Cessation
- 1992-05-06 NO NO921783A patent/NO300736B1/no unknown
- 1992-05-07 NZ NZ242648A patent/NZ242648A/en unknown
- 1992-05-07 ES ES92304105T patent/ES2079797T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-05-07 KR KR1019920007740A patent/KR0139515B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1992-05-07 HU HU9201526A patent/HU214738B/hu not_active IP Right Cessation
- 1992-05-07 AT AT92304105T patent/ATE127805T1/de not_active IP Right Cessation
- 1992-05-07 CN CN92104386A patent/CN1043786C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1992-05-07 DE DE69204734T patent/DE69204734T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1992-05-07 CZ CS921392A patent/CZ279780B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1992-05-07 TW TW081103556A patent/TW224488B/zh active
- 1992-05-07 DK DK92304105.7T patent/DK0512824T3/da active
- 1992-05-07 EP EP92304105A patent/EP0512824B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-07-01 IE IE921460A patent/IE70452B1/en not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-06-29 HU HU95P/P00547P patent/HU211594A9/hu unknown
- 1995-11-22 GR GR950403279T patent/GR3018161T3/el unknown
-
1996
- 1996-01-11 HK HK3896A patent/HK3896A/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5444087A (en) | Manumycin compounds | |
| FI100112B (fi) | Menetelmä bakteerien vastaisen tiomarinolin valmistamiseksi | |
| FI103055B (fi) | Menetelmä tiomarinolijohdannaisten valmistamiseksi | |
| US5405762A (en) | Culture of alteromonas and process of using the same to produce an antibacterial compound | |
| US5081225A (en) | Gram-positive and gram-negative antibacterial compounds from the microorganism, janthinobacterium lividum | |
| KR20010022705A (ko) | 항종양 활성을 갖는 마크로리드 화합물 | |
| RU2089548C1 (ru) | Тиомаринол c и способ его получения | |
| US4895864A (en) | Antibiotic TAN-950A, its production and use | |
| JPS62294676A (ja) | パチュロリドおよびその製造法 | |
| JP3123864B2 (ja) | 新規化合物チオマリノールｃおよびその製造法 | |
| JPH05155888A (ja) | 新規な抗生物質およびそれらの製造 | |
| RU2101353C1 (ru) | Тиомаринол b и способ его получения (варианты) | |
| KR950005548B1 (ko) | 항생물질 gtx-01 및 그 제조방법 | |
| JPH07291992A (ja) | 新規化合物ｂ４３１７ | |
| JP2532199B2 (ja) | 新規化合物チオマリノ―ルｂ | |
| JPH10114778A (ja) | 新規化合物ｆ−１２５１７ | |
| JPH0687866A (ja) | 化合物３１６６８ｐおよび３１６６８ｕ、それらの製造方法およびそれらの使用 | |
| JPH08208658A (ja) | 新規化合物チオマリノールｄ、ｅおよびｆ | |
| JPH06206884A (ja) | 新規化合物チオマリノールｂの製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MA | Patent expired |