FI103055B

FI103055B - Menetelmä tiomarinolijohdannaisten valmistamiseksi

Info

Publication number: FI103055B
Application number: FI934076A
Authority: FI
Inventors: Akio Torikata; Koichi Hirai; Takeshi Kagasaki; Yuji Iwano; Shuji Takahashi; Hideyuki Shiozawa; Kaneo Ogawa; Kentaro Kodama; Akira Ishii; Masahiko Fujimoto; Yoshiharu Sakaida
Original assignee: Sankyo Co
Priority date: 1992-09-18
Filing date: 1993-09-17
Publication date: 1999-04-15
Also published as: FI103055B1; MX9305720A; DK0595458T3; US5399711A; DE69322235D1; CA2106443A1; CN1092811A; TW255893B; HK1006935A1; FI981359A0; NO933328D0; NZ248696A; KR940007039A; AU665860B2; FI105814B; DE69322235T2; HU9302629D0; PH30111A; HU211907A9; FI981359A

Description

5 103055

Menetelmä tiomarinolijohdannaisten valmistamiseksi Förfarande för framställning av tiomarinolderivat

Keksinnön tausta

Esillä oleva keksintö liittyy tiettyihin uusiin tiomarinolin johdannaisiin ja menetelmiin niiden valmistamiseksi ja koostumuksiin, joissa käytetään niitä bakteerien vastaisina 10 aineina.

Tiomarinoli kuvataan esimerkiksi Euroopan patenttijulkaisussa 512 824, joka on julkaistu tämän hakemuksen päivämäärää ennen, mutta prioriteettipäivämäärien jälkeen. Se voidaan esittää kaavalla (A): 15 °H OH Λ S\ ^ ch3 o 'il I h o 20 0H (A)

Sitä tuotetaan suvun Alteromonas mikro-organismien fermentoinnilla, esimerkiksi ♦ · ·

Alteromonas rava kannalla SANK 73390. Olemme nyt löytäneet kaksi tiomarinolin johdannaista, joilla on samantapaista antibioottista vaikutusta kun alkuperäisellä tioma-25 rinolilla.

Suvun Alteromonas organismeja voidaan eristää merivedestä, ja jotkut on osoittautunut ·' tuottavan yhdisteitä, joilla on mahdollista terapeuttista käyttöä. Esimerkiksi yhdiste, joka tunnetaan nimellä bisucaberin on saatu eräästä Alteromonas lajista ja sillä on osoittautu-30 nut olevan kasvaimenvastaista vaikutusta (Japanin patenttihakemus Kokai Numero Sho 63-27484).

2 103055

Tiomarinolirakennetta ajatellen, tunnetaan useita antibioottisia aineita, joilla on samantapaisia rakenteita ja nämä voidaan jakaa neljään ryhmään.

Ensimmäinen ryhmä käsittää pseudomonihapot, jotka ensin eristettiin mikro-organismista 5 Pseudomonas spp. Näihin kuuluvat pseudomonihappo A [jota tuottaa Pseudomonas fluorescens. joka on esitetty J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 294 (1977)], pseudomonihappo B [ibid, 318 (1977)], pseudomonihappo C [ibid, 2827 (1982)] ja pseudomonihappo D [ibid, 2655 (1983)]. Pseudomonihappoa A myydään nimellä "Bactroban" (Beecham, rekisteröity tavaramerkki) 2 %:sen ihoa hoitavan voiteen muodossa bakteeri-10 envastaiseen käyttöön. Kaikilla näillä tekniikan tason yhdisteillä on kuitenkin heikompia bakteerinvastaisia vaikutuksia kun esillä olevan keksinnön mukaisilla tiomarinolin johdannaisilla.

Toinen ryhmä aineita, joilla on samantapainen rakenne kun keksinnön mukaisilla 15 yhdisteillä on ryhmä, johon kuuluu antibiootit holomycin [Helv. Chim. Acta, 42, 563 (1959)], pyrrothine [J. Am. Chem. Soc., 77, 2861 (1955)], thiolutin [Angew. Chem., 66, 745 (1954)], aureothricin [J. Am. Chem. Soc., 74, 6304 (1952)], ja muut. Näitä antibiootteja tuottaa tyypillisesti actinomycetes, ja niille on tunnusomaista rikkiä sisältävä kromofoori. Xenorhabdinit I-V ovat aineita, jotka liittyvät holomysiiniin, ja ne on myös 20 eristetty bakteereista (esitetty WO-hakemuksessa 84/01775).

« 4

Erilaisia tutkimuksia näiden kahden ryhmien johdannaisista on suoritettu, mutta emme ole tietoisia mistään sellaisen aineen esittämisestä, jolla on samantapainen molekyylirakenne kun tiomarinoleilla tai jolle on tunnusomaista samanlaiset ominaisuudet.

25

Kolmas ryhmä yhdisteitä on esitetty japanilaisissa hakemusjulkaisuissa numerot Kokai " 52-102279, 54-12375, 54-90179, 54-103871 ja 54-125672, jotka esittävät pseudo- monihapon johdannaisia, joissa päätekarboksyylihappo on korvattu amidiryhmällä. Näillä yhdisteillä ei ole verrattavaa bakteerienvastaista vaikutusta eikä niillä ole laajaa baktee-30 rienvastaista vaikutusta. Tosiasiassa näillä yhdisteillä yleensä on heikompi antibioottivai-kutus kun alkuperäisellä pseudomonihapolla.

3 103055

Neljäs ryhmä käsittää yhdisteen, joka muistuttaa tiomarinolia siinä, että se on fysiologinen aine, joka on peräisin meren bakteereista [Abstracts of Papers from the 200 Year Conference of the Am. Chem. Soc. (August 26-31, 1990), Part 2, ORGN. No. 139]. Heterosyklinen ryhmä, joka on sidottu päätekarbonyyliryhmään, tässä yhdisteessä, on 5 kuitenkin 2-okso-3-piperidyyliryhmä. Sillä on viimeaikoina osoitettu olevan mikrobinvas-taista vaikutusta [Experimentia, Col. 48, pages 1165 - 1169 (1992)].

Tärkeimmän tekniikan tason uskotaan kuitenkin olevan pseudomonihappo A ja kaikilla tiomarinoleilla, toisin sanoen alkuperäinen tiomarinoli, tiomarinoli B ja tiomarinoli C, 10 on merkittävästi vahvempi bakteerinvastainen vaikutus kun pseudomonihapolla A.

Keksinnön lvhvt yhteenveto Tämän keksinnön kohteena on saada aikaan uusia tiomarinolin johdannaisia.

15

Vielä eräänä ja erityisempänä kohteena on saada aikaan sellaisia yhdisteitä, joilla on erinomainen bakteerinvastainen ja bakteereita pienemmän mutta virusta isomman pieneliönvastainen vaikutus. (Tämän jälkeen näitä pieneliöitä kutsutaan yksinkertaisesti vain "pieneliöiksi").

20

Muut kohteet ja edut selvenevät selityksen edetessä.

Yleisesti ottaen, tämä keksintö tarjoaa kahta uutta tiomarinolin johdannaista, joista toinen on S,S-dioksojohdannainen ja siihen viitataan tässä nimellä "tiomarinoli B" ja 25 toinen on deoksijohdannainen ja siihen viitataan tässä nimellä "tiomarinoli C".

” Ensinmainittu esillä olevan keksinnön mukainen yhdiste on tiomarinoli B, joka voidaan esittää seuraavalla kaavalla (B) 30 a · v 103055 4 5 f ?H O Ö ch3 xl

ch3 o ff H

°H (B) 10

Esillä olevan keksinnön toinen yhdiste on tiomarinoli C, joka voidaan esittää seuraavalla kaavalla (C): r__ti f. "ΤΤΤΥ·^λΛϊΎ'" CH3vA^A/° CHj O ho 20 OH (c) • *

Keksinnöllä saadaan myös menetelmä tiomarinolin B tai C valmistamiseksi, joka käsittää sen, että viljellään tiomarinolia tuottavaa suvun Alteromonas mikro-organismia ja 25 eristetään tiomarinoli B tai C viljelmästä.

Keksinnöllä saadaan myös farmaseuttinen koostumus, joka käsittää bakteerienvastaista tai pieneliönvastaista ainetta sekoitettuna farmaseuttisesti hyväksyttävään kantajaan tai laimentuneen, jossa bakteerienvastainen tai pieneliönvastainen aine on valittu ryhmästä, 30 johon kuuluu tiomarinoli B ja C.

« · 5 103055

Keksinnöllä saadaan vielä menetelmä bakteerien tai pieneliöiden aiheuttamien tartuntojen käsittelyyn tai ehkäisyyn, mikä menetelmä käsittää bakteerienvastaisen tai bakteeria pienemmän mutta virusta isomman pieneliönvastaisen aineen tehokkaan määrän annoste-lemisen nisäkkäälle, joka voi olla ihminen, joka kärsii tällaisesta tai joka on herkkä 5 tällaiselle tartunnalle.

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus

On selvää edellä olevasta kaavasta, että tiomarinolit B ja C sisältävät joukon asym-10 metrisiä hiiliatomeja ja useita kaksoissidoksia. Isomerisointi on erityisen mahdollista tiomarinolien α,/3-tyydyttämättömässä karbonyyliosuudessa. Tiomarinolit voivat siksi muodostaa erilaisia stereo- ja geometrisia isomeerejä. Vaikkakin näitä kaikkia esitetään tässä yhdellä ainoalla molekyylikaavalla, esillä olevaan keksintöön kuuluvat sekä yksittäiset, eristetyt isomeerit että niiden seokset, mukaanlukien rasemaatit. Kun 15 stereospesifisiä synteesitekniikoita käytetään tai optisesti aktiivisia yhdisteitä käytetään lähtöaineena, yksittäiset isomeerit voidaan valmistaa suoraan; toisaalta jos valmistetaan isomeerien seos, yksittäiset isomeerit voidaan saada tavanomaisilla erottelutekniikoilla.

Koska kuitenkin tiomarinolit normaalisti tuotetaan fermentoimalla tai fermentointi- tai 20 käymistuotteen kemiallisella muuttamisella, niillä yleensä on standardi optinen konfiguraatio. Siten, vaikkakin muita konfiguraatioita on olemassa, luonnollinen konfiguraatio on edullinen.

Tiomarinoli B voidaan tunnistaa seuraavien lysikaaliskemiallisten ominaisuuksien avulla 25 seuraavalla tavalla: ' 1) Olomuoto ja ulkonäkö: Keltainen pulveri.

2) Molekyylikaava: C30H44N2OHS2.

30 6 103055 3) Molekyylipaino: 672 (määriteltynä FAB-MS:llä) "FAB-MS" on Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry.

4) Korkean erotuskyvyn massaspektrometria: 5 ^30^45^^11¾ [(M+H) + ; määriteltynä FAB-MS:llä] Löydetty 673.2468

Laskettu 673.2465.

5) Alkuaineanalyysi: 10 Laskettu kaavasta C^qH^I^Oj ^2 + H2O: C, 52.16 %; H, 6,71 %; N, 4,06 %; S, 9,28 %.

Löydetty C, 52,34 %; H, 6,79 %; N, 3,92 %; S, 9,02 %.

6) Infrapuna-absorptiospektri: i»max cm" * 15

Infrapuna-absorptiospektri mitattiin kaliumbromidi- (KBr) levymenetelmällä, kuten on osoitettu myöhemmin.

3660, 3503, 3318, 3075, 2966, 2928, 2870, 1704, 20 1653, 1509, 1467, 1381, 1349, 1299, 1217, 1199, 1152, 1112, 1063, 1047, 1019, 975, 949, 884, 839, 764, 730, 660, 609, 553.

7) Ultraviolettiabsorptiospektri: \max nm (ε) 25 , Ultraviolettiabsorptiospektri on mitattu 1-propanolissa ja on osoitettu seuraavassa: - 377 (2,900), 301 (13,000), 215 (21,000).

Ultraviolettiabsorptiospektri on mitattu 1-propanolissa + kloorivetyhapossa ja on 30 osoitettu seuraavassa: 377 (2,900), 301 (13,000), 223 (17,000).

7 103055

Ultraviolettiabsorptiospektri on mitattu 1-propanolissa + natriumhydroksidissajaon osoitettu seuraavassa: 377 (2,900), 301 (13,000), 221 (19,000).

5 8) Ominaiskierto: [or]j^ = + 7,7° (c = 1,0, 1-propanoli).

9) Korkean erotuskyvyn nestekromatografia:

Erotuskolonni: Senshu-Pak ODS H-2151 (kolonnin halkaisija 6 mm, pituus 150 mm, yhtiön Senshu Scientific Co., Ltd:n tuotteen tavaramerkki) 10 Liuotin: 40 % t/t vesipitoinen asetnitrili

Virtausnopeus: 1,5 ml/minuutti Viipymäaika: 8,4 minuuttia.

10) ^H-ydinmagneettinen resonanssispektri: (6:ppm) 15 Ydinmagneettinen resonanssispektri (360 MHz) on mitattu heksadeuteroidussa dime-tyylisulfoksidissa käyttämällä tetrametyylisilaania sisäisenä standardina, kuten on osoitettu seuraavassa.

11.28 (1H, leveä singletti); 10,47 (1H, singletti); 20 7,23 (1H, singletti); -t - 5,97 (1H, singletti); 5,37 (2H, multipletti); 4,88 (1H, dupletti, J = 7,5 Hz); 4,61 (1H, leveä singletti); 25 4,43 (1H, dupletti, J = 7,2 Hz); 4.28 (1H, dupletti, J = 3,6 Hz); 4,18 (1H, dupletti, J = 7,2 Hz); 4,02 (2H, tripletti, J = 6,6 Hz); 3,74 (1H, leveä singletti); 30 3,64 (1H), 3,61 (1H), 3,54 (1H), 3,51 (1H); 3,35 (1H, dupletti, J = 10,9 Hz); 8 103055 2,43 (2H, tripletti, J = 7,3 Hz); 2,12 (1H), 2,09 (1H), 2,03 (1H); 2.02 (3H, singletti); 1,61 (1H), 1,58 (2H), 1,50 (2H), 1,32 (2fl), 1,30 (2H), 1,25 (2H); 5 0,96 (3H, dupletti, J = 6,3 Hz); 0,92 (3H, dupletti, J = 6,9 Hz).

11) ^C-ydinmagneettinen resonanssispektri: (Δ.-ppm)

Ydinmagneettinen resonanssispektri (360 MHz) on mitattu heksadeuteroidussa dime-10 tyylisulfoksidissa käyttämällä tetrametyylisilaania sisäisenä standardina, kuten on osoitettu seuraavassa.

173,5 (singletti), 166,1 (singletti), 165,7 (singletti), 160.8 (singletti), 143,2 (singletti), 134,2 (dupletti), 127.8 (dupletti), 123,3 (singletti), 115,2 (singletti), 15 114,4 (dupletti), 109,4 (dupletti), 76,2 (dupletti), 72,4 (dupletti), 69,6 (dupletti), 69,3 (dupletti), 64,3 (tripletti), 63,9 (dupletti), 63,0 (tripletti), 43.2 (dupletti), 42,2 (dupletti), 34,7 (tripletti), 31,9 (tripletti), 28,3 (tripletti), 28,2 (tripletti), 20 28,1 (tripletti), 25,3 (tripletti), 24,5 (tripletti), 20,0 (kvartetti), 15,7 (kvartetti), 15,6 (kvartetti).

(I · 12) Liukoisuus:

Liukenee alkoholeihin, kuten metanoliin, etanoliin, propanoliin ja butanoliin, kuten 25 myös dimetyylisulfoksidiin, dimetyyliformamidiin, kloroformiin, etyyliasetaatiin, . . asetoniin ja dietyylieetteriin. Liukenematon heksaaniin ja veteen.

13) Ohutkerroskromatografia:

Rf arvo: 0,52 30 Adsorbointiaine: Silikageeli (Merck & Co., Inc., Art 5715)

Kehitysliuotin: Metyleenikloridi : metanoli = 85 : 15 tilavuusseos.

9 103055

Tiomarinol C voidaan tunnistaa seuraavilla fysikaaliskemiallisilla ominaisuuksilla: 1) Olomuoto ja ulkonäkö: Keltainen pulveri.

5 2) Molekyylikaava: 3) Molekyylipaino: 624 (määriteltynä FAB-MS:llä).

4) Alkuaineanalyysi: 10 Laskettu kaavasta c30H44n2°8S2 + H20: C, 56,05 %; H, 7,21 %; N, 4,36 %; S, 9,97 %.

Löydetty C, 56,48 %; H, 7,23 %; N, 4,30 %; S, 9,11 %.

5) Infrapuna-absorptiospektri: Pmax cm-1 15

Infrapuna-absorptiospektri mitattiin kaliumbromidi (KBr) Ievymenetelmällä, kuten on osoitettu myöhemmin.

3256, 3068, 2928, 2858, 1645, 1596, 1530, 1455, 1384, 1287, 1225, 1151, 1104, 1052, 974, 820, 712.

20 6) Ultraviolettiabsorptiospektri: Xmax nm (e)

Ultraviolettiabsorptiospektri on mitattu metanolissa tai metanoli + kloorivetyha-possa ja on osoitettu seuraavassa: 25 388 (9,600), 300 (2,700), 215 (17,000).

Ultraviolettiabsorptiospektri on mitattu metanolissa + natriumhydroksidissa ja on osoitettu seuraavassa: 386 (8,600), 205 (49,000).

30 7) Ominaiskierto: [a]pj = - 1,4° (c = 1,0, metanoli).

10 103055 8) Korkean erotuskyvyn nestekromatografia:

Erotuskolonni: Senshu-Pak ODS H-2151 (kolonnin paikka, halkaisija 6 mm, pituus 150 mm, yhtiön Senshu Scientific Co., Ltd.)

Liuotin: 40 % t/t vesipitoinen asetnitriili 5 Virtausnopeus: 1,5 ml/minuutti

Viipymäaika: 8,4 minuuttia.

9) *H-Ydinmagneettinen resonanssispektri: (ö:ppm)

Ydinmagneettinen resonanssispektri (360 MHz) on mitattu heksadeuteroidussa 10 dimetyylisulfoksidissa käyttämällä tetrametyylisilaania sisäisenä standardina, kuten on osoitettu seuraavassa.

10,70 (1H, leveä singletti); 9,81 (1H, singletti); 7,05 (1H, singletti); 15 5,68 (1H, singletti); 5,37 (1H, multipletti); 5,33 (1H, multipletti); 4,64 (1H, leveä singletti); 4.55 (1H, leveä multipletti); 20 4,32 (1H, dupletti, J = 4,3 Hz); . 4,01 (2H, tripletti, J = 6,6 Hz); * f 3,67 (1H), 3,62 (1H), 3,58 (1H), 3,49 (1H), 3,35 (1H); 3,18 (1H, leveä multipletti); 2.56 (1H, leveä dupletti, J = 14,2 Hz); 25 2,34 (2H, tripletti, J = 7,3 Hz); 2,15 (1H); : 2,11 (3H, singletti); 2,08 (1H), 2,06 (2H); 1,63 (1H, multipletti); 30 1,56 (2H, multipletti); 1,51 (2H, multipletti); 11 103055 1,30 (2H), 1,29 (2H), 1,26 (2H); 0,95 (3H, dupletti, J = 6,3 Hz); 0,91 (3H, dupletti, J = 6,9 Hz).

5 10) ^C-ydinmagneettinen resonanssispektri: (6:ppm)

Ydinmagneettinen resonanssispektri (90 MHz) on mitattu heksadeuteroidussa dimetyylisulfoksidissa käyttämällä tetrametyylisilaania sisäisenä standardina, kuten on osoitettu seuraavassa.

171,8 (singletti), 167,9 (singletti), 165,7 (singletti), 10 157,9 (singletti), 134,2( singletti), 133,9 (singletti), 133,6 (singletti), 127,6 (dupletti), 116,5 (dupletti), 115.3 (singletti), 110,4 (dupletti), 74,4 (dupletti), 69.3 (dupletti), 69,2 (dupletti), 68,1 (dupletti), 64.0 (tripletti), 63,0 (tripletti), 43,1 (dupletti), 15 42,5 (tripletti), 42,0 (dupletti), 34,6 (tripletti), 32.1 (tripletti), 28,4 (tripletti), 28,3 (tripletti), 28.1 (tripletti), 25,2 (tripletti), 24,9 (tripletti), 20,0 (kvartetti), 18,6 (kvartetti), 15,7 (kvartetti).

20 12) Liukoisuus: . Liukenee alkoholeihin, kuten metanoliin, etanoliin, propanoliin ja butanoliin, kuten myös dimetyylisulfoksidiin, dimetyyliformamidiin, kloroformiin, etyyliasetaatiin, asetoniin ja dietyylieetteriin. Liukenematon heksaaniin ja veteen.

25 13) Ohutkerroskromatografia:

Rf arvo: 0,52 ' Adsorbointiaine: Silikageeli (Merck & Co., Inc., Art 5715)

Kehitysliuotin: Metyleenikloridi : metanoli = 85 : 15 tilavuusseos.

30 Tiomarinol B ja C voidaan valmistaa viljelemällä tiomarinolia tuottavaa suvun Altero-monas mikro-organismia ja sitten keräämällä haluttu tiomarinol B ja/tai C viljelyväliai- 12 103055 neesta. Tiomarinolin B ja/tai C muunnelmia, joilla on vaadittu bakteerinvastainen vaikutus voidaan saada samalla tavalla Alteromonas :ksen muista kannoista tai lajeista, jotka tuottavat haluttuja yhdisteitä, tai niitä voidaan saada sopivalla sellaisen yhdisteen modifioinnilla, joka on saatu fermentoinnilla kuten on kuvattu tai ne voidaan suoraan 5 kemiallisesti syntetisoida.

Erityisesti pidämme erityisen edullisena käyttää mikro-organismina lajia Alteromonas rava ja varsinkin äskettäin eristettyä Alteromonas ravarn kantaa, jolle on annettu kantamerkintä SANK 73390. Kanta SANK 73390 on meren mikro-organismi, joka on 10 eristetty merivedestä, joka on kerätty seuraavan paikan: Koina, Minami-Izu Machi, Shizuoka Prefecture, Japani, meripuolelta ja tämä kanta on tallennettu tallennuslaitok-seen: Deposition Institute, Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science & Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan, 30. huhtikuuta 1991 talletusnumerolla FERM BP-3381, Budapest-sopimuksen mukaisesti.

15

Alteromonas rava kannan SANK 73390 taksonomiset (ryhmäjaottelu) -ominaisuudet on esitetty seuraavassa.

1. Morfologiset ominaisuudet 20 ; Alteromonas rava kantaa SANK 73390 viljeltiin lämpötilassa 23 °C 24 tuntia meri- vesiagarilla (Difco). Sen jälkeen mikroskooppinen tutkimus osoitti, että solut olivat muodoltaan sauvamaisia ja kunkin halkaisija oli 0,8 - 1,0 jiim ja pituus 2,0 - 3,6 μτη. Tämä kanta on gram-negatiivinen ja liikkuu polaarisen monotriflagellin avulla.

25 > 2. Kasvu meren agarilla

Kantaa SANK 73390 viljeltiin 24 tuntia lämpötilassa 23 °C meren agarilla (Difco). Tuloksena saatujen viljelmien havaittiin olevan vaalean harmahtavan keltaisia väriltään, 30 läpinäkyviä, pyöreitä, litteitä ja kokonaisia. Veteen liukenevaa pigmenttiä ei muodostunut.

13 103055 3. Fysiologiset ominaiset (1) Merivesivaatimus: SANK 73390 vaatii merivettä kasvuun.

(2) Oksidatiivinen fermentointitesti (Hugh-Leifson method [J. Bact., 66, 24-26 5 (1953)], väliaineessa, joka on valmistettu keinotekoisesta merivedestä): ei vaikutusta hiilihydraattiin.

(3) Oksidaasi: + (4) Katalaasi: + (5) Happivaatimus: aerobinen 10 (6) Nitraatinpelkistys: - (7) Tärkkelyksen hydrolyysi: + (8) Agaarin hajoaminen: - (9) Gelatiinin nesteyttäminen: + (10) DNase-tuotto: + 15 (11) Lipaasintuotto: + (12) Kasvulämpötila: Huono kasvu lämpötilassa 4 °C, hyvä kasvu lämpötilassa 17 °C - 26 °C, ei kasvua lämpötilassa 35 °C.

(13) Kasvuntekijävaatimus: Perusväliaineessa, joka on kuvattu Journal of Bacteriology 107. 268-294 (1971), SANK 73390, vaatii vitamiinivapaata 20 Casamino-happoa.

(14) Hiililähteiden assimilointi: Perusväliaineessa, joka on kuvattu Journal of Bacteriology 107. 268-294 (1971), lisäksi käsittäen 0,1 % p/t vitamiinivapaata Casamino-happoa, ravistusviljelmässä: 25 i i 14 103055

TAULUKKO

L-Arabinoosi: - D-Riboosi: 5 D-Ksyloosi: - D-GIukoosi: + D-Galaktoosi: - D-Fruktoosi:

Maltoosi: + Sakkaroosi:

Trehaloosi: + Sellobioosi:

Melibioosi: - Mannitoli: 10 Sorbitoli: - Glyseriini:

Natriumasetaatti: -f Natriumpropionaatti: + 4. Jaottelu kemiallisten ominaisuuksien mukaan 15 (1) Mooli-% guaniinia ja sytosiinia (G + C sisältö) DNA:ssa 43,4 % (HPLC-menetel-mä) (2) Kinonijärjestelmä: Ubikinoni Q-8 20 Ottamalla huomioon taksonomiset ominaisuudet, jotka on esitetty edellä, Alteromonas rava kantaa SANK 73390 vertailtiin kantoihin, jotka on kuvattu julkaisussa Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, Voi. 1 (1984), kuten myös niihin kantoihin, jotka on kuvattu International Journal of Systematic Bacteriology, nyttemmin. Havaitsimme, että Alteromonas rava kannalla SANK 73390 oli tiettyjä yhtäläisyyksiä Alteromonas 25 citrea:n kanssa, joka on toinen meren mikro-organismi. SANK 73390 -kantaa ja . Alteromonas citrea ATCC 29719 -kantaa (standardikanta) viljeltiin yhtä aikaa ja niitä verrattiin.

Verrattuna kannan SANK 73390 vaalean harmahtavan keltaiseen väriin, ATCC 29719:n 30 viljelmät olivat väriltään vihertävän keltaisia. SANK 73390 erosi myös Alteromonas citrea:sta kasvustaan lämpötilassa 4 °C ja kyvystään käyttää hyväksi trehaloosia ja 103055 15 natriumpropionaattia hiililähteinä. Alteromonas rava kanta SANK 73390 on siis uuden lajin Alteromonas rayain uusi kanta ja se eroaa olennaisilta ominaisuuksiltaan lähimmästä tunnetusta lajista, joka on tallennettu talletusnumerolla ATCC 29719.

5 Edellä kuvatut ominaisuudet ovat tyypillisiä kannalle SANK 73390. Tiedetään kuitenkin hyvin, että Alteromonas spp.n ominaisuudet vaihtelevat, sekä luonnonmukaisesti että keinotekoisesti. Edellä määritellyt ominaisuudet määrittelevät tallennettua Alteromonas rava kantaa, mutta eivät välttämättä ole tyypillisiä muille Alteromonas lajeille tai muille Alteromonas rava kannoille, jotka kykenevät tuottamaan tiomarinolia tai sen luonnolli-10 sesti esiintyvää muunnelmaa. Sellaiset muut kannat kuuluvat keksinnön piiriin.

Huomataan, että SANK 73390 tai joku muu kanta, joka kykenee tuottamaan tiomarinolia tai jotakin sen muunnelmista voidaan aliviljellä tai bioteknologisesti muuttaa tai modifioida tuottamaan organismi, jolla on erilaiset ominaisuudet. Ainoa vaatimus on se, että 15 tuloksena saadun organismin on kyettävä tuottamaan vaadittua yhdistettä.

Sellaiset muutokset ja vaihtelut voivat olla minkä vain halutun muotoisia tai voivat esimerkiksi olla johdonmukaisia sellaisilta näkökannoilta kuin viljelyolosuhteet. Kantoja voidaan muuttaa viljelyllä ja valita sellaisia ominaisuuksia, kuten parempi kasvu, tai 20 kasvu alemmissa/korkeammissa lämpötiloissa.

Bioteknologiset muutokset ovat yleensä tarkoituksenmukaisia ja niihin voivat kuulua valittavat ominaisuudet, kuten vastustuskyky tai herkkyys bakteereita vastaan, tai niiden yhdistelmiä puhtauden ylläpitämiseksi tai viljelmien, varsinkin siemenviljelmien, 25 puhdistuksen sallimiseksi eri ajankohtina.

· Muita ominaisuuksia, joita voidaan saada aikaan geenimanipuloinnilla, ovat mitkä vaan, jotka ovat sallittavissa Alteromonas spp:ssä. Voidaan esimerkiksi sisällyttää plasmideja, jotka koodaavat vastuskykyisiä muotoja tai voidaan poistaa mitä vain luonnollisesti 30 esiintyviä plasmideja. Edullisiin plasmideihin kuuluvat ne, jotka saavat aikaan auksotro-fian. Plasmideja voidaan saada mistä vain sopivasta lähteestä tai niitä voidaan käsitellä 16 103055 eristämällä luonnollisesti esiintyvä Alteromonas plasmidi ja sisällyttämällä haluttu geeni tai halutut geenit jostain muusta lähteestä. Luonnollisia plasmideja voidaan myös modifioida jollain muulla tavalla, jota pidetään toivottavana.

5 Tiomarinolin B ja/tai C saamiseksi sopivan mikro-organismin viljelmästä, mikro-organismit tulee fermentoida sopivassa väliaineessa. Sellaiset väliaineet ovat yleisesti tunnettuja alalla ja niitä käytetään paljon muiden fermentointituotteiden tuotannossa.

Tyypillisesti on välttämätöntä, että väliaine käsittää jonkin yhdistelmän, jossa on 10 hiililähde, typpilähde ja yksi tai useampi epäorgaaninen suola, jonka kyseinen mikro-organismi kykenee käyttämään hyväkseen. Minimivaatimus väliaineelle on, että se sisältää näitä ainesosia, jotka ovat välttämättömiä mikro-organismin kasvulle.

Sopivia hiililähteitä ovat glukoosi, fruktoosi, maltoosi, sakkaroosi, mannitoli, glyseroli, 15 dekstriini, kaurajauho, ruis, maissitärkkelys, peruna, maissipulveri, soijapapupulveri, pumpulisiemenöljy, siirappi, sitruunahappoja viinihappo, joita voidaan käyttää yksinään tai yhdessä yhden tai useamman muun kanssa. Tyypilliset määrät ovat alueella noin 1-10 % p/t väliaineen määrästä, vaikkakin määrä voi vaihdella halutun lopputuloksen mukaisesti.

20

Sopivia typpilähteitä ovat mitkä vain aineet, jotka sisältävät esimerkiksi proteiinia. Edustuskelpoisia esimerkkejä typpilähteistä ovat orgaaniset typpilähteet eläimistä ja kasveista ja voivat olla uutteita sellaisista luonnollisista lähteistä, kuten soijapapujauho, lese, maapähkinäjauho, pumpulisiemenjauho, kaseinhydrolysaatti, fermamiini, kalapul-25 veri, maissin liuotusneste, peptoni, lihauute, hiiva, hiivauute, mallasuute; ja sellaisista epäorgaanisista typpilähteistä, kuten natriumnitraatti, ammoniumnitraatti, ammonium-sulfaatti. Kuten hiililähteen tapauksessa, näitä voidaan käyttää yksinään tai yhdistelmänä. Sopivat määrät ovat tyypillisesti alueella noin 0,1-6 p/t väliaineen määrästä.

30 Sopivia epäorgaanisia ravinnesuoloja ovat sellaiset, jotka tarjoavat hivenaineita, kuten myös suolan pääainesosa. Edullisesti suolojen pitäisi antaa sellaisia ioneja, kuten 103055 17 natrium, kalium, ammonium, kalsium, magnesium, rauta, fosfaatti, sulfaatti, kloridi ja karbonaatti. Sellaisia hivenmetalleja, kuten koboltti, mangaani ja strontium, tai suoloja, jotka kykenevät antamaan sellaisia ioneja, kuten bromidi, fluoridi, boraatti tai silikaatti-ionit, voi myös olla läsnä.

5

On huomattava, että Alteromonas rava:a esiintyy luonnollisesti merivedessä niin, että jos ei muuta sanota, olosuhteet sen viljelyyn ideaalitapauksessa vastaavat meriympäristöä. Siten hivenioneja, joita on löydetty meressä, sisällytetään edullisesti väliaineeseen, jota käytetään Alteromonas:ksen viljelemiseen. Erityisesti on edullista, että mikro-organismia 10 viljellään meriveden läsnäollessa tai keinotekoisen meriveden läsnäollessa tai komponenttien läsnäollessa, jotka vastaavat meriveden koostumusta.

Jos mikro-organismi fermentoidaan nesteviljelmänä, on edullista, että vaahtoa vastustavaa ainetta, kuten silikoniöljyä tai kasviöljyä tai muuta sopivaa pinta-aktiivista ainetta 15 käytetään.

On edullista, että viljelyaineen pH Alteromonas rava:n kannalle SANK 73390, kun sitä käytetään tiomarinolin B ja/tai C tuottamiseen, ylläpidetään alueella pH 5,0 - 8,0, vaikkakin ainoa vaatimus on se, että pH ei saisi estää mikro-organismin kasvua tai 20 haitallisen korjaamattomasti vaikuttaa lopputuotteen laatuun. Saattaa olla edullista lisätä hapen tai alkaalin ylimäärä fermentoinnin pysäyttämiseksi.

Alteromonas rava kanta SANK 73390 yleensä kasvaa lämpötilassa 4 °C - 32 °C ja kasvaa hyvin lämpötilassa 17 °C - 26 °C. Muut lämpötilat, jotka eivät ole näillä 25 alueilla, saattavat olla käyttökelpoisia kun on kehitetty kanta, joka kykenee kasvamaan . alemmissa tai korkeammissa lämpötiloissa. Tiomarinolin B ja/tai C tuottamiseen, edullinen lämpötila on 20 °C ja 26 °C.

Tiomarinolia B ja/tai C saadaan ihanteellisesti aerobisella viljelyllä, ja mitä vain sopivaa 30 aerobista viljelytekniikkaa, kuten esimerkiksi kiinteätä viljelmää, ravistusviljelmää tai ilmastus-ravistus-viljelmää voidaan käyttää.

18 103055

Jos viljely suoritetaan pienessä mittakaavassa, silloin ravistusviljely, jota fermentoidaan useita päiviä lämpötilassa 20 °C - 26 °C, on yleensä edullinen.

Fermentoivan viljelmän aloittamiseksi, edullisessa tekniikassa käytetään alkuistutetta, 5 joka on valmistettu yhdessä tai kahdessa vaiheessa Erlenmeyer-pullossa esimerkiksi. Voidaan käyttää hiililähdettä ja typpilähdettä yhdessä viljelyväliaineen kanssa. Siemen-pulloa ravistetaan termostaattisessa inkubaattorissa lämpötilassa 23 °C 1-3 päivää, kunnes havaitaan riittävä kasvu. Tuloksena saatua siemenviljelyä voidaan sitten käyttää sisällyttämään toinen siemenviljely tai tuottoviljely. Jos suoritetaan toinen siementämi-10 nen, tämä voidaan suorittaa samalla tavalla ja osittain käyttää tuottoväliaineen sisällyttämiseksi. Pulloa, johon siemen sisällytetään, ravistetaan sopivan ajan, esim. 1-3 päivää, tai kunnes maksimaalinen tuotto saadaan sopivassa lämpötilassa, esimerkiksi kuten on kuvattu vedellä. Kun hautominen on täydellistä, pullon sisällöt voidaan kerätä sentrifu-goimalla tai suodattamalla.

15

Jos viljely suoritetaan suuremmassa mittakaavassa, viljely sopivassa ilmastus-ravistus-käymisastiassa saattaa olla edullista. Tässä menetelmässä ravintoväliaine voidaan valmistaa käymisastiaan. Steriloinnin jälkeen lämpötilassa 125 °C väliaine jäähdytetään ja siemennetään istutteella, joka on aikaisemmin kasvanut steriloidussa väliaineessa. 20 Viljely suoritetaan lämpötilassa 20 °C - 26 °C sekoittamalla ja ilmaistamalla. Tämä menetelmä on sopiva yhdisteen suuren määrän saamiseksi.

Tiomarinolin B ja/tai C määrä, jonka viljely on tuottanut ajan kuluessa, voidaan käsitellä korkean suorituskyvyn nestekromatografialla, esimerkiksi. Yleensä tuotetun tiomarinolin 25 B määrä saavuttaa maksimin 19 tunnin - 200 tunnin jälkeen ja tuotetun tiomarinolin C . määrä saavuttaa maksimin 19 tunnin - 200 tunnin jälkeen. Sitä vastoin tuotetun tioma rinolin määrä saavuttaa maksimin 19 - 96 tunnin jälkeen.

Sopivan viljelyajan jälkeen tiomarinol B ja/tai C voidaan eristää ja puhdistaa millä vain 30 tunnetulla tavalla. Esimerkiksi mahdollista tiomarinolia B ja/tai C, jota on jäljellä viljelyliemessä, voidaan saada suodattamalla kiinteät aineet pois esimerkiksi käyttämällä 103055 19 diatomiittia suodatusapuaineena tai sentrifugoimalla ja sen jälkeen uuttamalla kelluvasta osasta puhdistamalla tiomarinolin B tai C fysikaaliskemiallisten ominaisuuksien mukaisesti. Esimerkiksi suodoksessa esiintyvä tai kelluvassa osuudessa oleva tiomarinol B ja/tai C voidaan uuttaa veteen sekoittamattomalla orgaanisella liuottimella, kuten 5 etyyliasetaatit, kloroformi, etyleenikloridi, metyleenikloridi tai jonkin näiden seos, neutraaleissa tai happamissa olosuhteissa ja puhdistaa.

Vaihtoehtoisesti, adsorbenttina, aktiivihiiltä tai adsorboivaa hartsia, kuten Amberlite (tavaramerkki) XAD-2, XAD-4 (Rohm & Haas) tai Diaion (tavaramerkki) HP-10, 10 HP-20, CHP-20, HP-50 (Mitsubishi Kasei Corporation) voidaan käyttää. Epäpuhtaudet voidaan poistaa adsorptiolla antamalla nesteen, joka sisältää tiomarinolia B ja/tai C, kulkea adsorbenttikerroksen läpi; tai tiomarinol B ja/tai C voidaan puhdistaa adsorption jälkeen eluoimalla sopivalla eluentilla, kuten vesipitoisella metanolilla, vesiasetonilla tai butanoli/vedellä.

15

Solunsisäistä tiomarinolia B ja/tai C voidaan puhdistaa uuttamalla sopivalla liuottimella, kuten vesipitoisella asetonilla tai vesipitoisella metanolilla, edullisesti sellaisella, jonka konsentraatio on 50-90 t-% ja sen jälkeen poistamalla orgaaninen liuotin ja sen jälkeen uuttamalla, kuten on kuvattu edellä suodokselle tai kelluvalle osuudelle.

20

Tuloksena saatu tiomarinol B ja/tai C voidaan edelleen puhdistaa hyvin tunnetuilla tekniikoilla, esimerkiksi: adsorptiokolonnikromatografialla käyttämällä kantajaa, kuten silikageeliä tai magnesiumsilikageeliä, esimerkiksi sitä, jota myydään kauppanimellä "Florisil"; osituskolonnikromatografialla käyttämällä adsorbenttia, kuten Sephadex LH-25 20 (Pharmacia tuotteen tavaramerkki); tai korkean suodatuskyvyn nestekromatografialla , käyttämällä normaalifaasi- tai käänteisfaasikolonnia. Kuten alalla hyvin tiedetään, nämä * · eristämis- ja puhdistusmenetelmät voidaan suorittaa yksinomaan tai minkälaisena vain sopivana yhdistelmänä ja haluttaessa toistaa halutun lopputuotteen eristämiseksi ja puhdistamiseksi.

30 20 103055

Koska tiomarinoleilla B ja C on bakteerinvastainen vaikutus gram-positiivisia ja gram-negatiivisia bakteereita ja pieneliöitä vastaan eläimissä (esim. ihminen, koira, kissa ja kani), niitä voidaan käyttää bakteeri- tai pieneliötartuntojen käsittelyyn tai ehkäisyyn erilaisilla reiteillä, riippuen tartunnan laadusta.

5

Kun keksinnön mukaiset yhdisteet on tarkoitettu terapeuttiseen käyttöön, niitä voidaan annostella yksinomaan tai sopivassa farmaseuttisessa formuloinnissa, joka sisältää aktiivisen yhdisteen lisäksi yhtä tai useampaa tavanomaista laimenninta, kantajaa, täyteainetta tai apuainetta. Formuloinnin laatu riippuu tietenkin tarkoitetusta annostelu-10 reitistä. Suun kautta tapahtuvaa reittiä varten yhdiste edullisesti kuitenkin formuloidaan pulvereiksi, rakeiksi, tableteiksi, kapseleiksi tai siirapeiksi. Ruoansulatuskanavan ulkopuoliseen annosteluun se on edullista formuloida ruiskuksi (joka voi olla suonensisäinen, lihaksensisäinen tai ihonalainen), tipoiksi, puikoiksi, voiteiksi tai linimenteiksi.

15 Nämä formuloidit voidaan valmistaa tunnetulla tavalla lisäämällä aktiiviseen yhdisteeseen sellaisia lisäaineita, kuten kuljetusaineita, sideaineita, hajoitusaineita, voiteluaineita, stabilointiaineita, korjausaineita, solubilisointiaineita, makuaineita, parfyymeja, suspen-sointiaineita tai päällystysaineita. Vaikkakin annos saattaa vaihdella riippuen potilaan oireista ja iästä, tartunnan laadusta ja vakavuudesta ja annostelureitin tavasta, kun 20 kyseenä on suun kautta tapahtuva annostelu aikuiselle ihmispotilaalle, esillä olevan keksinnön yhdisteitä voidaan normaalisti annostella päivittäisinä annoksina • · *.

20 mg - 2000 mg. Yhdisteitä voidaan annostaa yhtenä ainoana annoksena tai jaettuina annoksina esim. kaksi tai kolme kertaa päivässä.

25 Esillä olevan keksinnön yhdisteiden valmistusta kuvataan vielä seuraavien ei-rajoittavien esimerkkien avulla ja näiden yhdisteiden biologisia vaikutuksia kuvataan sen jälkeisillä *- testiesimerkeillä.

103055 21 ESIMERKKI 1

Tiomarinolin B valmistaminen viljelemällä säiliössä 5 A) Vilielv

Alteromonas rava kantaa SANK 73390 viljeltiin kolme päivää lämpötilassa 22 °C meren agarin viistopinnalla (Difco:n tuote). Tuloksena saatua viljelyä suspensoitiin 3 mlrssa steriloitua keinotekoista merivettä. 0,1 ml tuloksena saatua suspensiota 10 istutettiin kuhunkin kahteen 500 ml:n Erlenmeyer-pulloon kummankin sisältäessä 100 ml steriloitua väliainetta, jolla on seuraava koostumus:

Merivesilientä (Difco) 37,4 g 15 Deionisoitua vettä 1000 ml pH:ta ei säädetty

Viljelyä haudutettiin sitten 24 tuntia lämpötilassa 23 °C ravistamalla 210 rpm.ssä 20 käyttämällä pyörivää ravistinta. Koko tuloksena saatu viljely istutettiin sitten 600 litraan ilmastoituun sekoitusviljelysäiliöön, joka sisälsi 200 I väliainetta, jolla on sama koostumus kun on kuvattu edellä, joka oli steriloitu erikseen. Tätä viljeltiin sitten lämpötilassa 23 °C 26 tuntia samalla kun ilmaistettiin viljelyä 0,5 vvm:n ilmavirrassa (s.o. "tilavuus per tilavuus per minuutti ": 1 vvm tarkoittaa sitä, että yhdessä minuutissa syötetty 25 ilmamäärä on sama kun säiliössä olevan ilman tilavuus); ja säätämällä pyörintänopeus ; olemaan alueella 82,5 - 170 rpm liuotetun happikonsentraation ylläpitämiseksi 5,0 ppm.

B) Eristys 30 Riittävästi vesipitoista kloorivetyhappoa lisättiin 230 litraan tuloksena saatua viljelyli-uosta sen pH:n säätämiseksi arvoon 2,5. 200 litraa asetonia lisättiin sitten tuloksena 22 103055 saatuun seokseen ja seosta uutettiin, samalla sekoittaen 0,5 tuntia. 4,0 kg Celite 545 -suodatusapuainetta (yhtiön Jones Manvill Project Corporation, U.S.A. tuotteen tavaramerkki) lisättiin sitten seokseen ja seos suodatettiin. Suodos (430 litraa) uutettiin kerran 200 litralla etyyliasetaattia ja sitten kaksi kertaa 100 litralla etyyliasetaattia. Yhdistetyt 5 etyyliasetaattiuutteet pestiin 200 litralla natriumvetykarbonaatin 5 %:sta p/t vesiliuosta ja siten 100 litralla natriumkloridin kyllästettyä vesiliuosta, jonka jälkeen ne kuivattiin vedettömän natriumsulfaatin avulla ja sitten haihdutettiin kuivaksi alennetussa paineessa, jolloin saatiin noin 80 g öljyä.

10 Koko näin saatu öljy liuotettiin metyleenikloridiin ja tuloksena saatu liuos adsorboitiin kolonnille, joka oli pakattu 1,1 kg:lla silikageeliä, joka oli kyllästetty metyleenikloridil-la. Liuos eluoitiin sitten metyleenikloridin ja etyyliasetaatin 1 : 1 tilavuusseoksella, etyyliasetaatilla pelkästään ja etyyliasetaatti-metanolin 9 : 1 tilavuusseoksella mainitussa järjestyksessä (eluointiaineiden polarisuus suurenee tässä järjestyksessä). Kun eluaatti 15 oli fraktioitu 500 ml:n alimääriin, fraktio, joka sisälsi tiomarinolia B, joka oli eluoitu etyyliasetaatin ja metanolin seoksella, kerättiin ja haihdutettiin kuivaksi alennetussa paineessa, jolloin saatiin 60 g öljyä.

Koko tuloksena saatu öljy liuotettiin 6 litraan 50 %:sta t/t vesipitoista metanolia ja 20 tuloksena saatu liuos adsorboitiin 2,3 litralle kolonnia, joka oli pakattu Diaion HP-20:llä (tavaramerkki), joka oli kyllästetty vedellä, jonka jälkeen öljyliuokselle tehtiin vaiheittainen gradienttieluointi käyttämällä vesipitoista metanolia, jossa metanolin konsentraatio vähitellen suureni 30 %:sta 90 % tilavuusprosenttiin. Erityisemmin, kun 4 litraa 36 % vesipitoista metanolia, 50 % vesipitoista metanolia, 60 % vesipitoista metanolia, 25 70 % vesipitoista metanolia ja 80 % vesipitoista metanolia kutakin oli lisätty kolonniin, ; kolonni eluoitiin 90 %:sella vesipitoisella metanolilla. Eluointia jatkettiin kunnes ei havaittu enää yhdisteen eluointia, mitattuna korkean suorituskyvyn nestekromatografial-la, jolloin 90 %:sen vesipitoisen metanolin määrää, joka käytettiin eluointiin, oli noin 10 litraa. Fraktio, joka eluoitiin 90 %:sella vesipitoisella metanolilla, kerättiin ja haihdutet-30 tiin kuivaksi alennetussa paineessa, jolloin saatiin 3,8 g keltaista pulveria. Keltaiselle pulverille tehtiin kromatografia käyttämällä kolonnia, joka oli pakattu 103055 23 320 g: 11a Sephadex LH-20:lla, joka oli kyllästetty metyleenikloridin, etyyliasetaatin ja metanolin 19 : 19 : 2 tilavuusseoksella, jonka jälkeen se oli eluoitu samalla liuotinseok-sella puhdistamisen suorittamiseksi.

5 Tuloksena saatua tuotetta puhdistettiin lisää korkean suorituskyvyn nestekromatografialla käyttämällä käänteisfaasikolonnia [Senshu-Pak ODS H-5251 (kolonnin koko: 20 mm halkaisija, 250 mm pitkä) yhtiön Senshu Scientific Co., Ltd tuotteen tavaramerkki] ja käyttämällä 40 % t/t vesipitoista asetnitriliä eluenttina virtausnopeudella 15 ml/minuutti tuotteen puhdistamiseksi samalla kun suoritettiin puhdistus havaitsemalla absorbanssi 10 aallonpituudella 220 nm. Koska tiomarinoli B saatiin piikkinä, jonka viipymäaika oli 13-14 minuuttia, tämä fraktio kerättiin ja haihdutettiin kuivaksi alennetussa paineessa niin, että voitiin eristää 130 mg otsikkoyhdistettä, jonka fysikaaliskemialliset ominaisuudet on lueteltu aikaisemmin.

15 ESIMERKKI 2

Tiomarinolin C valmistus viljelemällä säiliössä A) Viljely 20

Merivesiagaarin yksi viistopinta (Difco), johon oli lisätty Alteromonas rava kantaa SANK 73390 ja kasvatettu, lisättiin 10 ml steriloitua merenlientä (Difco) bakteerisus-pension valmistamiseksi.

25 30 litran käymisastia, joka sisälsi 15 litraa samaa merivesiliemiväliainetta, steriloitiin kuumentamalla ja sitten koko bakteerisuspensio istutettiin fermentointiastiaan ja viljeltiin ’ lämpötilassa 23 °C ilmavirrassa 7,5 litraa/minuutti 24 tuntia. Alkusekoitusnopeus oli 100 rpm ja sitten sekoitusnopeutta säädettiin sopivasti liuenneen happikonsentraation ylläpitämiseksi arvossa 5,0 ppm.

30 24 103055 300 litraa viljely väliainetta, jolla on seuraava koostumus, lisättiin sitten molempiin 600 litran säiliöihin:

Glukoosi 1,5 % 5 Baktopeptoni (Difco) 1,5 %

Baktohiivauute (Difco) 0,2 %

NaCl 3,89 %

MgCl2.6H20 2,52 %

Na2S04 0,648 % 10 CaCl2.2H20 0,4767 % KC1 0,11 %

Na2C03 0,038 %

Rautasitraatti 0,02 % pH 7,6 ennen sterilointia 15 Säiliöt steriloitiin sitten kuumentamalla, jonka jälkeen 3 litraa siemenviljelyä istutettiin kuhunkin säiliöön ja viljeltiin lämpötilassa 23 °C ja ilmavirrassa 150 litraa/minuutti 29 tuntia. Alkusekoitusnopeus oli 82 rpm ja sitten sekoitusnopeutta säädettiin sopivasti liuenneen happikonsentraation ylläpitämiseksi arvossa 5,0 ppm.

20 » ; B) Eristäminen

Riittävästi vesipitoista kloorivetyhappoa lisättiin 700 litraan tuloksena saama viljelyli-25 uosta sen pH-arvon säätämiseksi arvoon 3 ja sitten 700 litraa asetonia lisättiin tuloksena saatuun seokseen ja uutos suoritettiin sekoittamalla 1 tunti. Tuloksena saatu uute uutettiin itse kerran 700 litralla etyyliasetaattia ja sitten kerran 300 litralla etyyliasetaattia.

Yhdistetyt etyyliasetaattiuutteet pestiin sitten 300 litralla natriumvetykarbonaatin 5 % :sta p/t vesiliuosta ja 300 litralla natriumkloridin kyllästettyä vesiliuosta mainitussa järjestyk-30 sessä, jonka jälkeen ne kuivattiin vedettömän natriumsulfaatin avulla. Liuotin poistettiin 103055 25 sitten haihduttamalla alennetussa paineessa. Haihduttamisproseduurin aikana 540 g silikageeliä lisättiin ja sitten haihduttamista kuivaksi jatkettiin.

Näin saatu jäännös suspensoitiin metyleenikloridiin ja tuloksena saatu liuos lisättiin 5 kolonniin, joka on pakattu 4 kg:lla silikageeliä, joka oli kyllästetty metyleenikloridilla. Se eluoitiin sitten metyleenikloridilla, metyleenikloridin ja etyyliasetaatin 1 : 1 tilavuus-seoksella, etyyliasetaatilla yksinomaan ja etyyliasetaatin ja metanolin 9 : 1 tilavuusseok-sella mainitussa järjestyksessä; eluenttien polarisuus lisääntyy tässä järjestyksessä. Eluentti jaettiin 2 litran alimääriin ja fraktio, joka sisälsi tiomarinolia C, joka eluoitiin 10 etyyliasetaatin ja metanolin seoksella, kerättiin ja haihdutettiin kuivaksi alennetussa paineessa. Haihdutuksen aikana lisättiin 50 g silikageeliä ja sitten haihduttamista kuivaksi jatkettiin.

Tuloksena saatu jäännös suspensoitiin heksaanin ja asetonin seokseen ja tuloksena saatu 15 suspensio lisättiin kolonniin, joka oli pakattu 200 g:Hä silikageeliä, joka oli kyllästetty heksaanilla, joka sitten eluoitiin heksaanin ja asetonin 1 : 1 tilavuusseoksella. Eluaatti jaettiin 500 ml:n alimääriin, jolloin saatiin fraktiot 1 ja 2, jotka sisälsivät tiomarinolia C. Fraktio 1 väkevöitiin haihduttamalla alennetussa paineessa. Väkevöimisen aikana lisättiin 25 g silikageeliä ja sitten haihduttamista kuivaksi jatkettiin.

20

Tuloksena saatu jäännös suspensoitiin heksaanin, asetonin ja etyyliasetaatin 1:1:2 tilavuusseokseen, ja tuloksena saatu suspensio lisättiin kolonniin, joka oli pakattu 200 g:lla silikageeliä, joka oli kyllästetty heksaanilla. Se eluoitiin sitten heksaanin, asetonin ja etyyliasetaatin 1:1:2 tilavuusseoksella. Eluaatti jaettiin 500 ml:n alimää-25 riin ja fraktio, joka sisälsi tiomarinolia C, säästettiin. Tämä fraktio yhdistettiin edellä saatuun fraktioon 2 ja yhdistetyt fraktiot väkevöitiin haihduttamalla alennetussa paineessa. Väkevöimisen aikana 20 g silikageeliä lisättiin ja haihduttamista kuivaksi jatkettiin.

Tuloksena saatu jäännös suspensoitiin heksaanin, asetonin ja etyyliasetaatin 1:1:1 30 tilavuusseokseen ja tuloksena saatu suspensio lisättiin kolonniin, joka oli pakattu 26 103055 200 g.ila silikageeliä, joka oli kyllästetty heksaanilla. Se eluoitiin sitten heksaanin, asetonin ja etyyliasetaatin 1:1:1 tilavuusseoksella. Eluaatti jaettiin 500 ml:n alimää-riin ja fraktiot, jotka sisälsivät tiomarinolia C, kerättiin ja väkevöitiin haihduttamalla alennetussa paineessa, jolloin saatiin Öljyinen aine.

5

Koko tälle öljyiselle aineelle tehtiin vielä kromatografia käyttämällä 200 ml kolonnia, joka oli pakattu Sephadex LH-20:lla, joka oli kyllästetty metyleenikloridin, etyyliasetaatin ja metanolin 19 : 19 : 2 tilavuusseoksella ja puhdistettiin eluoimalla samalla liuotin-seoksella. Fraktiot, jotka sisälsivät tiomarinolia C, kerättiin ja väkevöitiin haihduttamalla 10 alennetussa paineessa. Väkevöimisen aikana lisättiin 25 g silikageeliä ja haihduttamista kuivaksi jatkettiin.

Tuloksena saatu jäännös suspensoitiin metyleenikloridiin ja suspensio lisättiin kolonniin, joka on oli pakattu 250 g silikageelillä, joka oli kyllästetty metyleenikloridilla. Se 15 eluoitiin sitten metyleenikloridin ja asetonin seoksilla suhteissa, jotka vaihtelivat alueilla 9:1-1:9 tilavuusosaa niin, että eluentin polaarisuus vähitellen lisääntyi. Eluaatti jaettiin 1 litran alimääriin ja fraktiot, jotka sisälsivät tiomarinolia C, kerättiin ja haihdutettiin kuivaksi alennetussa paineessa 150 mg tiomarinolin C eristämiseksi, jolla on edellä luetellut fysikaaliskemialliset ominaisuudet.

20

BIOLOGINEN VAIKUTUS

Tiomarinolien B ja C biologinen vaikutus on esitetty seuraavilla testiesimerkeillä, joissa 25 niitä verrataan pseudomonihappoon A ja tiomarinoliin.

103055 27 TESTIESIMERKKI 1

Tiomarinolien B ia C bakteerinvastainen vaikutus 5 Tiomarinolin, tiomarinolin B, tiomarinolin C ja pseudomonihapon A (tunnistetaan merkeillä "A", "B", "C" ja "P") inhiboiva minimikonsentraatio (MIC) annettuna ^g/ml, gram-positiivisia ja gram-negatiivisia bakteereita vastaan määriteltiin agaariväliainelai-mennusmenetelmällä käyttämällä ravintoagaariväliainetta (yhtiön Eiken Chemical Co., Ltd. tuote).

10

Tulokset on annettu seuraavassa taulukossa 1.

28 103055

Taulukko 1

Testin bakteerikanta MIC* 0*g/ml)

5 A B C P

Staphylococcus aureus 209 P <0,01 <0,01 <0,01 0,05

Staphylococcus aureus 56RP <0,01 <0,01 <0,01 0,1

Staphylococcus aureus 535P (MRSA) <0,01 <0,01 <0,01 0,2 10 Enterococcus faecalis 681 0,02 0,05 0,8 25

Escherichia coli NIHJ 0,8 0,8 3,1 100

Escherichia coli 609 0,8 0,8 1,5 100

Salmonella enteritidis 0,4 0,4 1,5 50

Klebsiella pneumoniae 806 0,8 0,8 1,5 100 15 Klebsiella pneumoniae 846 (R) 0,2 0,2 0,8 100

Enterobacter cloacae 963 1,5 0,8 3,1 >100

Serratia marcescens 1184 3,1 3,1 6,2 >100

Proteus vulgaris 1420 0,05 0,05 0,2 0,4

Morganella morganii 1510 6,2 6,2 12,5 >100 20 Pseudomonas aeruginosa 1001 0,2 0,2 0,8 > 100

Pseudomonas aeruginosa No. 7 0,4 0,4 0,8 >100

Pseudomonas aeruginosa 3719 - 0,8 0,4 >100 25 MIC = inhiboiva minimikonsentraatio « 103055 29 TESTIESIMERKKI 2

Tiomarinolin B ia C pieneliönvastainen vaikutus 5 Suorittamalla sama menetelmä kuin testiesimerkissä 1, tiomarinolin, tiomarinolin B, tiomarinolin C ja pseudomonihapon A (tunnistetaan merkeillä "A", "B”, ”C" ja "P") vaikutus analysoitiin erilaisia pieneliön lajeja vastaan. Tulokset on annettu seuraavassa taulukossa 2.

10 Taulukko 2 sfc

Testattu pieneliökanta MIC ^g/ml)

A B C P

15 _

Mycoplasma bovis Donetta 0,0125 0,006 <0,006 <0,006

Mycoplasma gallisepticum PG-31 0,05 0,1 0,05 6,25

Mycoplasma gallisepticum K-l 0,05 0,1 0,05 6,25

Mycoplasma hvosvnoviae S-16 0,025 - 20 Mycoplasma hvorhinis BTS 7 - 0,78 1,56 0,39 MIC = inhiboiva minimikonsentraatio

Istute: 0,005 ml of 105 CFU/ml 25 Analyysiväliaine:

Tiomarinoli B, tiomarinoli C ja pseudomonihappo A analysoitiin kaikki Chanock-' väliaineella [valmistettu kuten on kuvattu P.N.A.S., 48, 41-49 (1962) ja täydennetty 20 % :11a hevosen seerumilla] kaikia mikro-organismeja vastaan.

30 Tiomarinoli analysoitiin seuraavilla väliaineilla: 30 103055 M. bovis ja M. gallisepticum: Chanock -väliaine (valmistettu kuten on esitetty edellä).

jj( M. hvosvnoviae: Mucin PPLO agar-väliaine (täydennetty 15 %:IIa hevosen 5 seerumilla).

- PPLO (PleuroPneumonia-Like Organism) PPLO liemi ilman CV (Difco) 21 g

Mucin bacteriological (Difco) 5 g 10 Tislattua vettä 800 ml

Agar Noble (Difco) 12 g

Hevosen seerumi 150 ml 25 % tuore hiivauute 50 ml 15 Viljelyolosuhteet: 37 °C, 5 päivää, hieman aerobinen (BBL kaasupakkausmenetelmä [viljely saatavassa olevassa C02'generaattorissa yhtiöstä Becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, MD 2103 USA]) 20 Edellä olevista tuloksista on selvää, että tiomarinoleilla B ja C on erinomaisia baktee-rinvastaisia ja pieneliönvastaisia vaikutuksia, jotka ovat ainakin yhtä hyvät kun tioma- t t rinolin ja yleensä merkittävästi paremmat kun pseudomonihapon A.

• j

Claims

103055

1. Menetelmä lääkeaineena käyttökelpoisen kaavan B mukaisen yhdisteen, jolle on annettu nimi "tiomarinoli B" valmistamiseksi, 5 °. .O v OH OH O \_! 10 cHj CHj O Ho oh (b; 15 tunnettu siitä, että viljellään suvun Alteromonas tiomarinolia B tuottavaa mikro-organismia ja eristetään tiomarinoli B viljelmästä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu mikro-organismi on Alteromonas rava.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu mikro-organismi on Alteromonas rava kanta SANK 73390, jonka tunnistaa talletusnume- 25 rolla FERM BP-3381.

4. Menetelmä lääkeaineena käyttökelpoisen kaavan C mukaisen yhdisteen, jolle on annettu nimi "tiomarinoli C" valmistamiseksi, 30 103055 /S OH

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu 15 mikro-organismi on Alteromonas rava.

5 HON^^l 9 )—\ OH H O (C) 10 tunnettu siitä, että viljellään suvun Alteromonas tiomarinolia C tuottavaa mikro-organismia ja eristetään tiomarinoli C viljelmästä.

6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu mikro-organismi on Alteromonas rava kanta SANK 73390, jonka tunnistaa talletusnume-rolla FERM BP-3381. 20 103055