CZ281324B6 - Thiomarinolové deriváty, způsob jejich výroby a farmaceutický prostředek s jejich obsahem - Google Patents

Abstract

Thiomarinolové deriváty obecného vzorce I, v němž jednotlivé symboly mají specifický význam. Způsob výroby těchto látek pěstováním mikroorganismu rodu Alteromonas a následnou izolací thiomarinolových derivátů z živného prostředí a také způsob výroby thiomarinolu B oxidací thiomarinolu. Farmaceutický prostředek s antibakteriálním účinkem s obsahem uvedených látek. ŕ

Description

Thiomarinolové deriváty, způsob jejich výroby a farmaceutický prostředek s jejich obsahem

Oblast techniky

Vynález se týká nových thiomarinolových derivátů, způsobu výroby těchto látek a farmaceutických prostředků s antibakteriálním účinkem, které je obsahují.

Dosavadní stav techniky

Thiomarinol je popsán například ve zveřejněné evropské patentové přihlášce č. 512 824, zveřejněné před podáním této přihlášky,avšak po datu jejího práva přednosti. Thiomarinol je možno vyjádřit vzorcem A

Tato látka je produkována při fermentaci mikroorganismů rodu Alteromonas, zvláště Alteromonas rava, kmen SANK 73390. Nyní byly objeveny dva deriváty této látky, které mají podobný typ antibiotického účinku jako původní thiomarinol.

Organismy rodu Alteromonas je možno izolovat z mořské vody a některé z těchto organismů produkují sloučeniny, potenciálně využitelné k léčebným účelům. Například z jedné čeledi Alteromonas byla získána sloučenina, která byla nazvána bisucaberin a bylo prokázáno, že tato látka má protinádorový účinek podle zveřejněné japonské patentové přihlášky Kokai č. Sho 63-27 484.

Pokud jde o strukturu thiomarinolu, je známo několik antibiotických látek s podobnou strukturou. Tyto látky je možno rozdělit do čtyř skupin. Do první skupiny je možno zařadit pseudomonové kyseliny, které byly poprvé izolovány z čeledí Pseudomonas. Jde o pseudomonovou kyselinu A (produkovanou Pseudomonas fluorescens, podle publikace J. Chem. Soc., Perkin Trans, I, 294, 1977), kyselinu pseudomonovou B (tamtéž, 318, 1977), kyselinu pseudomonovou C (tamtéž, 2827, 1982) a kyselinu pseudomonovou D (tamtéž, 2655, 1983). Pseudomonová kyselina A se dodává pod názvem Bactroban (Beecham) ve formě 2% mazání s.antibakteriálním účinkem pro kožní lékařství. Avšak tyto látky mají poměrné slabou bakteriální účinnost.

Druhou skupinou sloučenin s podobnou strukturou je skupina, zahrnující antibiotikum holomycin, popsané v Helv. Chim. Acta, 42, 563, 1959, pyrrothin, popsaný v J. Am. Chem. Soc., 77, 2861, 1955, thiolutin, popsaný v Angew. Chem., 66, 745, 1954, aureo

-1CZ 281324 B6 thricin, popsaný v J. Am. Chem. Soc., 74, 6304, 1952 a další látky. Tato antibiotika jsou typicky produkována čeledí Actinomycetes a jejich charakteristickým znakem je chromofor, který obsahuje síru. Xenorhabdiny I až V jsou látky, příbuzné holomycinu, které byly také izolovány z bakterií a byly popsányv mezinárodní patentové přihlášce WO 84/01775.

Deriváty uvedených dvou skupin byly podrobněji studovány, avšak nebyla nalezena žádná látka s molekulovou strukturou thiomarinolů podle vynálezu.

Třetí skupinou sloučenin jsou látky, které byly popsány například ve zveřejněných japonských patentových přihláškách Kokai č. 52-102279, 54-12375, 54-90179, 54-103871 a 54-125672. V těchto přihláškách se popisují deriváty pseudomonových kyselin, v nichž je koncová karboxylové skupina nahrazena amidovou skupinou. Tyto látky nemají srovnatelnou antibakteriální účinnost ani široké spektrum antibakteriální účinnosti a mají spíše slabší účinek než původní pseudomonová kyselina.

Čtvrtou skupinu tvoří sloučenina, která je podobná thiomarinolu v tom smyslu, že jde o fyziologickou látku, jejíž původ je v mořských bakteriích, látka byla popsána v Abstracts of Páper from the 200 Year Conference of the Am. Chem. Soc., srpen 26. až

31. 1990, část 2, ORGN. č. 139. Avšak heterocyklickou skupinou, která je vázána na koncovou karbonylovou skupinu této látky, je

2-oxo-3-piperidylová skupina. Antimikrobiální účinnost této látkybyla popsána v Experientia, sv. 48, str. 1165 až 1169, 1992.

Základní známou látkou je tedy patrně pseudomonová kyselina A. Všechny další thiomarinoly, to znamená původní thiomarinol, thiomarinol B a thiomarinol C mají podstatně vyšší antibakteriální účinnost než pseudomonová kyselina A.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří thiomarinolové deriváty obecného vzorce I

OH (I) kde

R¹ znamená atom vodíku nebo hydroxyskupinu a n znamená celé číslo 0 nebo 1.

-2CZ 281324 B6

je možno vyjádřit následujícím vzora deoxythiomarinol C, který cem C

Thiomarinol B je možno charakterizovat následujícími fyzikálně-chemickými vlastnostmi.

1) povaha a vzhled: žlutý prášek,

2) molekulový vzorec: ^C30^H44^N2° 11^S2'

3) molekulová hmotnost: 672 při stanovení FAB-MS (hmot.spektrometrie při bombardování rychlými atomy),

4) hmotová spektrometrie s vysokou rozlišovací schopností: ^C30^H45^N2°ll^S2 /(^M+H)⁺ při stanovení FAB-MS/, vypočteno 673,2465 nalezeno 673,2468.

5) Elementární analýza pro ^C30^H44^N2° 11^S2 ^{+ H}2° vypočteno C 52,16, H 6,71, N 4,06, S 9,28 % nalezeno C 52,34, H 6,79, N 3,92, S 9,02 %.

6) IR-spektrum: v_max cm“¹.

IR-spektrum se měří pomocí kotouče bromidu draselného a jeho hodnoty jsou dále uvedeny: 3 660, 3 503, 3 318, 3 975, 2 966,

-3CZ 281324 B6

928, 2 870, 1 704, 1 653, 1 509, 1 467, 1 381, 1 349, 1 299, 1 217, 1 199, 1 152, 1 112, 1 063, 1 047, 1 019, 975, 949, 884, 839, 764, 730, 660, 609, 553.

7) UV-spektrum: A_max (extinkce).

UV-spektrum bylo měřeno v 1-propanolu a má následující maxima: 377 (2,900), 301 (13,000), 215 (21,000).

UV-spektrum, měřené v 1-propanolu s kyselinou chlorovodíkovou má následující hodnoty: 377 (2,900), 301 (13,000), 223 (17,000).

UV-spektrum, měřené v 1-propanolu s hydroxidem sodným má následující maxima: 377 (2,900), 301 (13,000), 221 (19,000).

8) Specifická otáčivost: /alfa/²⁵ _D = +7,7° (c=l,0, 1-propanol).

9) Vysokotlaká kapalinová chromatografie byla provedena na sloupci s průměrem 6 mm a délkou 150 mm s náplní Senshu-Pak ODS H-2151 (Senshu Scientific Co., Ltd.) rozpouštědlo: vodný acetonitril, 40 % objemových rychlost průtoku: 1,5 ml/min doba retence: 8,4 minut.

10) ¹H-NMR-spektrum (ppm):

NMT-spektrum při 360 MHz bylo měřeno v hexadeuterovaném dimethylsulfoxidu při použití tetramethylsilanu jako vnitřního standardu:

11,28

10,47

7,23

5,97

5,37

4,88

4.61

4.43

4,28

4,18

4,02

3,74

3,64

3,35

2.43

2,12

2,02

1.61

1,25

0,96

0,92 široký singlet), singlet), singlet), singlet), multiplet), dublet, J = 7,5 : široký singlet), dublet, J = 7,2 : dublet, J = 3,6 : dublet, J = 7,2 : triplet, J = 6,6 široký singlet),

54 dublet, J = 10,9 triplet, J 2,09 (1H), singlet), (1H, (1H, (1H, (1H, (2H, (1H, (1H, (1H, (1H, (1H, (2H, (1H, (1H), 3,61 (1H) (1H, (2H, (1H, (3H, (1H),1,58 (2H), (2H) , (3H, dublet, (3H, dublet, = 7,3

2,03 (1H) ,

Hz) ,

Hz) , (1H) ,

3,51 (1H),

1,50 (2H) ,

1,32 (2H), 1,30 (2H),

11) ¹³C-NMR-spektrum:

J = 6,3

J = 6,9 (ppm):

HZ) , Hz) .

Toto NMR-spektrum bylo měřeno při 90 MHz v hexadeuterovaném dimethylsulfoxidu při použití tetramethylsilanu jako vnitřního standardu:

-4CZ 281324 B6

173,5	(singlet),	166,1	(singlet),	165,7	(singlet)
160,8	(singlet),	143,2	(singlet),	134,2	(dublet),
127,8	(dublet),	123,3	(singlet),	115,2	(singlet)
114,4	(dublet),	109,4	(dublet),	76,2	(dublet),
72,4	(dublet),	69,6	(dublet),	69,3	(dublet),
64,3	(triplet),	63,9	(dublet),	63,0	(triplet)
43,2	(dublet),	42,2	(dublet),	34,7	(triplet)

Podstatu vynálezu tvoří také způsob výroby thiomarinolu B nebo C, který spočívá v tom, že se pěstuje mikroorganismus, produkující thiomarinol z rodu Alteromonas a thiomarinol B nebo C se z kultury izoluje.

Podstatu vynálezu tvoří také způsob výroby thiomarinolu B oxidací thiomarinolu.

Podstatu vynálezu tvoří také farmaceutický prostředek, obsahující antibakteriální nebo antimykoplasmatickou látku spolu s farmaceutickým nosičem nebo ředidlem, přičemž antibakteriální nebo antimykoplasmatickou látkou je thiomarinol B nebo C.

Tyto farmaceutické prostředky je možno využít k léčení nebo profylaxi bakteriálních nebo mykoplasmatických infekci tak, že se savcům yčetně člověka, kteří trpí takovou infekci nebo jsou jí ohroženi podá účinné množství antibakteriální nebo antimykoplasmatické látky.

Ze shora uvedených vzorců je zřejmé, že thiomarinoly B a C obsahují celou řadu asymetrických atomů uhlíku a kolikdvojných vazeb. Ke tvorbě isomerů může zvláště snadno docházet v místě alfa,beta-nenasycené karbonylové skupiny thiomarinolu.Thiomarinoly tedy mohou vytvářet různé prostorové a geometrické isomery. Přestože všechny tyto isomery jsou vyjádřeny jediným molekulovým vzorcem, spadají do rozsahu vynálezu jak jednotlivé, izolované isomery, tak jejich směsi včetně racemátů. V případě,že se použije stereospecifických způsobů výroby nebo v případě,že se jako výchozí materiály užijí opticky aktivní sloučeniny, jemožno přímo připravit jednotlivé isomery. Na druhé straně v případě, že se získá směs isomerů, je možno jednotlivé isomery připravit běžnými dělicími postupy.

Avšak vzhledem k tomu, že jsou thiomarinoly obvykle získávány fermentací nebo chemickým zpracováním fermentačního produktu, mají tyto látky obvykle tendenci uchovat si standardní optickou konfiguraci. To znamená, že i když dochází k získání látek s jinou konfigurací, výhodná je obvykle přírodní konfigurace.

Thiomarinol C je možno charakterizovat následujícími fyzikálně-chemickými vlastnostmi:

1) povaha a vzhled: žlutý prášek,

2) molekulový vzorec: ^C30^H44^N2°8^S2'

3) molekulová hmotnost: 624 (při stanovení FAB-MS).

4) Elementární analýza pro ^C30^H44^N2°8^S2 ^{+ H}2°

-5CZ 281324 B6 vypočteno C 56,48, H 7,23, N 4,30, S 9,11 % nalezeno C 56,06, H 7,21, N 4,36, S 9,97 %.

5) IR-spektrum: v_may cm^-1

IR-spektrum bylo měřeno metodou s použitím bromidu draselného a má následující hodnoty:

256, 3 068, 2 928, 2 858, 1 645, 1 596, 1 530, 1 455, 1 384, 1 287, 1 225, 1 151, 1 104, 1 052, 974, 820, 712«

6) UV-spektrum: ^_max nm (extinkce):

UV-absorpční spektrum, měřené v methanolu nebo ve směsi methanolu a kyseliny chlorovodíkové má následující maxima:

388 (9,600), 300 (2,700), 215 (17,000).

UV-absorpční spektrum, měřené ve směsi methanolu a hydroxidu sodného má následující maxima:

386 (8,600), 205 (49,000).

7) Specifická otáčivost: /alfa/²⁵ _D = -1,4° (c = 1,0, methanol).

8) Vysokotlaká kapalinová chromatografie:

dělicí sloupec: průměr 6 mm, délka 150 mm, náplň Senshu-Pak ODS H-2151 (Senshu Scientific Co., Ltd.).

rozpouštědlo: vodný acetonitril, 40 % objemových rychlost průtoku: 1,5 ml/min doba retence: 11,3 minuty.

9) ¹H-NMR-spektrum: (ppm)

NMR-spektrum bylo měřeno při 360 MHz při použití hexadeuterovaného dimethylsulfoxidu a tetramethylsilanu jako vnitřního standardu:

10,70

9,81

7,05

5,68

5,37

5.33

4,64

4.55

4,32

4,01

3,67

3,18

2.56

2.34

2,15

2,11

2,08

1,63

1.56 (1H, singlet), (1H, singlet), (1H, singlet), (1H, singlet), (1H, multiplet), (1H, multiplet), (1H, široký singlet), (1H, široký multiplet), (1H, dublet, J = 4,3 Hz), (2H, triplet, J = 6,6 Hz), (1H), 3,62 (1H), 3,58 (1H), 3,49 (1H), 3,35 (1H) (1H, široký multiplet), (1H, široký dublet, J = 14,2 Hz), (2H, triplet, J = 7,3 Hz), (1H) , (3H, singlet), (1H), 2,06 (2H), (1H, multiplet), (2H, multiplet),

-6CZ 281324 B6

1,51 (2H, multiplet),

1,30 (2H), 1,29 (2H), 1,26 (2H),

0,95 (3H, dublet, J = 6,3 Hz),

0,91 (3H, dublet, J = 6,9 Hz).

10)¹³C-NMR-spektrum (ppm):

Toto NMR-spektrum bylo prováděno při 90 MHz při použití hexa· deuterovaného dimethylsulfoxidu a tetramethylsilanu jako vnitřního standardu:

171,8	(singlet),	167,9	(singlet),	165,7	(singlet)
157,9	(singlet),	134,2	(dublet),	133,9	(singlet)
133,6	(singlet),	127,6	(dublet),	116,5	(dublet),
115,3	(singlet),	110,4	(dublet),	74,4	(dublet),
69,3	(dublet), (triplet),	69,2	(dublet),	68,1	(dublet),
64,0	63,0	(triplet),	43,1	(dublet),
42,5	(triplet),	42,0	(dublet),	34,6	(triplet)
32,1	(triplet),	28,4	(triplet),	28,3	(triplet)
28,1	(triplet),	25,2	(triplet),	24,9	(triplet)
20,0	(kvartet),	18,6	(kvartet),	15,7	(kvartet)

11) Rozpustnost:

Sloučenina je rozpustná v alkoholech například methanolu, ethanolu, propanolu a butanolu a také v dimethylsulfoxidu, dimethylformamidu, chloroformu, ethylacetátu, acetonu a diethyletheru. Nerozpustná je v hexanu a ve vodě.

12) Chromátografie na tenké vrstvě:

Rf: 0,66

Adsorpční činidlo: silikagel (Měrek a Co., Inc., výrobek 5719), vyvíjecí rozpouštědlo: methylenchlorid a methanol, objemový poměr 85 : 15.

Thiomarinol B a C je možno připravit tak, že se pěstuje mikroorganismus rodu Alteromonas, který thiomarinol produkuje a požadovaný thiomarinol B a/nebo C se z živného prostředí oddělí. Varianty thiomarinolu B a/nebo C s požadovanou antibakteriální účinností je možno získat podobným způsobem z jiných kmenů čeledi Alteromonas, produkujících požadovanou látku nebo je možno je připravit příslušnou modifikací látek, získaných shora popsanou fermentací nebo je možno je přímo vyrobit chemicky.

Zvláště výhodným mikroorganismem pro uvedené použití je čeleď Alteromonas rava a zvláště v poslední době izolovaný kmen Alteromonas rava, který byl označen SANK 73390. Kmen SANK 73390 je mořský mikroorganismus, který byl izolován z mořské vody, odebrané na pobřeží u Koina, Minami-Izu Machi, prefektura Shizuoka, Japonsko, kmen byl uložen ve veřejné sbírce kultur v Deposition Institute, Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japonsko, 30. dubna 1991 pod číslem FERM BP-3381 podle Budapešťské úmluvy. Dále budou uvedeny taxonomické vlastnosti Alteromonas rava, kmeneSANK 73390.

-7CZ 281324 B6

1. Morfologické vlastnosti

Alteromonas rava kmen SANK 73390 byl pěstován 24 hodin při teplotě 23 ’C na mořském agaru (Difco). Při následujícím mikroskopickém sledování byly prokázány buňky tyčinkovítého tvaru s průměrem 0,8 až 1,0 a délkou 2,0 až 3,6 mikrometrů. Kmen je gram-negativní a pohybuje se pomocí polárního jednoduchého bičíku.

2. Růst na mořském agaru

SANK 73390 byl pěstován 24 hodin při teplotě 23 ’C na mořském agaru (Difco). Vzniklé kolonie měly bleděšedožlutou barvu, byly opakní, ploché, celistvého kruhového tvaru. Nevytvářely ve voděrozpustný pigment.

3. Fyziologické vlastnosti

1) Požadavky na mořskou vodu: SANK 73390 pro svůj růst požaduje mořskou vodu.

2) Oxidativné fermentativní zkouška (Hugh-Leifsonova metoda podle J. Bact., 66, 24 až 26, 1953) v prostředí připraveném z umělé mořské vody: nebylo prokázáno žádné působeni na uhlohydrát.

3) Oxidáza: +

4) Kataláza: +

5) Požadavky na kyslík: organismus je aerobní.

6) Redukce nitrátu: -

7) Hydrolýza škrobu: +

8) Rozklad agaru: -

9) Zkapalnění želatiny: +

10) Produkce DN-ázy: +

11) Produkce lipásy: +

12) Růstová teplota: špatný růst při 4 °C, dobře rostev teplotním rozmezí 17 až 26 C, při teplotě 35 °C již neroste.

13) Požadavky na růstový faktor: na základním živném prostředí podle Journal of Bacteriology, 107, 268 až 294, 1971, vyžaduje SANK 73390 přítomnost aminokyselin z kaseinu bez přítomnosti vitamínů.

14) Využití uhlíkových zdrojů: Využiti bylo sledováno na základním prostředí podle Journal of Bacteriology, 107, 268 až 294, 1971, doplněném 0,1 % hmot, aminokyselin kaseinu bez vitamínů v třepací kultuře.

-8CZ 281324 B6

Tabulka

L-arabinosa n-xylosa

D-galaktosa maltosa+ trehalosa+ melibiosa sorbitoloctan sodný+

D-ribosa

D-glukosa+

D-fruktosa sacharosa cellobiosa mannitol glycerol propionát sodný +

4. Chemotaxonomické vlastnosti

1) mol % guaninu a cytosinu (obsah G + C) v DNA: 43,4 % (podle HPLC)

2) Chinonový systém: ubichinon Q-8.

S ohledem na shora uvedené taxonomické vlastnosti byl srovnáván Alteromonas rava kmen SANK 73390 s kmeny, popsanými v Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, sv. 1, 1984, a také s kmeny které byly popsány v poslední době v International Journal of Systematic Bacteriology. Bylo zjištěno, že Alteromonas rava, kmen SANK 73390 má některé vlastnosti, obdobné Alteromonas citrea, dalšímu mořskému mikroorganismu. Kmeny SANK 73390 a Alteromonas citrea, standardní kmen ATCC 29719 byly pěstovány a potom srovnávány.

Ve srovnání s bleděžlutou barvou kolonií kmene SANK 73390 měly kolonie ATCC 29719 zelenožlutou barvu. SANK 73390 se také lišil od Alteromonas citrea svým růstem při teplotě 4 °C a svou schopností využívat trehalosu a propionát sodný jako zdroje uhlíku. Alteromonas rava, kmen SANK 73390 je tedy novým kmenem nové čeledi Alteromonas rava a liší se podstatnými vlastnostmi od nejpříbuznější známé čeledi, jejíž kmen byl uložen pod číslem ATCC 29719.

Shora popsané vlastnosti jsou pro kmen SANK 73390 typické. Je však dobře známo, že se vlastnosti mikroorganismů čeledi Alteromonas mohou měnit, a to jak přirozeně, tak uměle. Vlastnosti, které byly shora uvedeny, definují kmen Alteromonas rava tak, jak byl uložen, avšak nejsou nutně typické pro jiné čeledi Alteromonas nebo pro některé kmeny Alteromonas rava, které jsou schopné produkovat thiomarinol nebo pro některé jejich přirozeně se vyskytující varianty. Tyto další kmeny také spadají do rozsahu vynálezu.

73390 nebo jakýkoliv další kmen, nebo některá z jeho variant může modifikován požadavkem požadovanou

Je zřejmé, že kmen SANK schopný produkovat thiomarinol být dále pěstován nebo biotechnologicky pozměněn nebo za vzniku organismu s odlišnými vlastnostmi. Jediným je, aby výsledný organismus byl schopen produkovat látku.

Takové změny a modifikace mohou mít jakoukoliv požadovanou formu nebo mohou být například důsledkem podmínek pěstování. Kmeny je možno modifikovat způsobem pěstování a potom podrobit se

-9CZ 281324 B6 lekci tak, aby bylo dosaženo požadovaných vlastností, například lepšího růstu nebo růstu při nižších nebo vyšších teplotách.

Biotechnologické modifikace budou obvykle záměrné a jejich cílem může být zavedení vlastností, umožňujících selekci, jako jsou odolnost nebo naopak citlivost k bakteriostatickým látkám nebo kombinace těchto vlastností tak, aby bylo možno udržet čistotu nebo usnadnit čištění kultury, zvláště očkovací kultury čas od času.

Dalšími vlastnostmi, které je možno zavést genetickou manipulací, jsou jakékoliv vlastnosti, přípustné pro čeled Alteromonas. Je například možno uložit plasmidy, obsahující kódový řetězec pro odolnost nebo odstranit jakýkoliv přírodně se vyskytující plasmid. Výhodné plasmidy zahrnují ty, které jsou příčinou auxotrofie. Plasmidy je možno získat z jakéhokoliv vhodného zdroje nebo je možno je zkonstruovat izolací přírodně se vyskytujícího plasmidu Alteromonas a uložením požadovaného genu nebo genů z jiného zdroje. Přírodní plasmidy je také možno modifikovat jakýmkoliv dalším požadovaným způsobem.

Aby bylo možno získat thiomarinol B a/nebo C z kultury příslušného mikroorganismu, je nutno tento mikroorganismus pěstovat ve vhodném živném prostředí. Tato prostředí jsou obvykle v oboru dobře známa a jsou přesto užívána k získání jiných fermentačních produktů.

Obvykle bude zapotřebí, aby živné prostředí obsahovalo jakoukoliv kombinaci zdroje uhlíku, zdroje dusíku a jedné nebo většího počtu anorganických solí, které je pěstovaný mikroorganismus schopen asimilovat. Minimálním požadavkem na prostředí bude obsah všech složek, které jsou pro růst pěstovaného mikroorganismu nezbytné.

Vhodné zdroje uhlíku zahrnují glukosu, fruktosu, maltosu, sacharosu, mannitol, glycerol, dextrin, ovesnou mouku, žito, kukuřičný škrob, brambor, kukuřičný prášek, sojovou mouku, olej z bavlníkových semen, sirup, kyselinu citrónovou a kyselinu vinnou, tyto zdroje mohou být užity jako takové nebo v kombinaci s jedním nebo větším počtem dalších látek. Budou užity typicky v množství 1 až 10 g na 100 ml živného prostředí, přesto že se množství může změnit podle požadovaného výsledku.

Vhodnými zdroji dusíku mohou být také nej různější látky, například bílkoviny. Jako příklady zdrojů dusíku je možno uvést organické zdroje dusíku z živočichů i rostlin. Může jít o extrakty z přírodních zdrojů, jako jsou sojová mouka, otruby, mouka z burských oříšků, mouka z bavlníkových semen, hydrolyzát kaseinu, fermamin, rybí mouka, kukuřičný výluh, pepton, extrakt z masa, kvasnice, extrakt z kvasnic nebo ze sladu, jako zdroje anorganického dusíku je možno uvést například dusičnan sodný, dusičnan amonný a síran amonný. Stejně jako v případě zdrojů uhlíku je možno zdroje dusíku použít jako takové nebo v jakékoliv kombinaci. Vhodné množství těchto zdrojů se typicky pohybuje v rozmezí 0,1 až 6 g na 100 ml živného prostředí.

Vhodnými živnými anorganickými solemi jsou takové soli, které mohou zajistit přítomnost stopových prvků i hlavních složek

-10CZ 281324 B6 soli. Soli by s výhodou měly zajistit ionty sodíku, draslíku, amonné ionty, ionty vápenaté, horečnaté, ionty železa, a také fosfátové, sulfátové, chloridové a uhličitanové ionty. Přítomny mohou být také stopové prvky jako kobalt, mangan a stroncium a soli, schopné přivádět bromidové, fluoridové, boritanové nebo křemičitanové ionty.

Je zřejmé, že Alteromonas rava se přirozené vyskytuje v mořské vodě a z tohoto důvodu, není-li výslovně uvedeno jinak, jsou vhodnými podmínkami pro pěstování podmínky, které ideálně odpovídají prostředí v moři. To znamená, že do jakéhokoliv prostředí pro pěstování Altoromonas se s výhodou přidávají stopové prvky, obvykle přítomné v mořské vodě. Zvláště výhodné je pěstování mikroorganismu v přítomnosti mořské vody nebo uměle připravené mořské vody ze složek, odpovídajících složení mořské vody.

V případě, že je s výhodou možno konový olej nebo aktivní činidlo.

je mikroorganismus pěstován v kapalné kultuře, přidávat protipěnivé činidlo, například sílírostlinný olej nebo jakékoliv jiné povrchově

V případě, že je kmen Alteromonas rava SANK 73390 užit pro výrobu thiomarinolu B a/nebo C, je výhodné udržovat pH živného prostředí v rozmezí 5,0 až 8,0, i když jediným požadavkem je, aby hodnota pH nebránila růstu mikroorganismu nebo irreversibilně nepříznivé neovlivnila kvalitu výsledného produktu. Může být vhodné přidat přebytek kyseliny nebo zásoby k ukončení fermentace.

Alteromonas rava kmen SANK 73390 obecně roste při teplotách v rozmezí 4 až 32 °C, dobrého růstu je možno dosáhnout při teplotě 17 až 26 °C. Jinou teplotu mimo uvedené rozmezí může být možné použít v případě, že se vyvine kmen, který je schopen růst při nižší nebo vyšší teplotě. Pro produkci thiomarinolu B a/nebo C je výhodná teplota v rozmezí 20 až 26 °C.

Thiomarinol B a/nebo C se ideálně získají z aerobní kultury, přičemž je možno použit jakýkoliv vhodný způsob pěstování aerobní kultury, například pevnou kulturu, třepací kulturu nebo pěstování za současného míchání a provzdušnění kultury.

V případě, že se pěstování provádí v malém měřítku, dává se obvykle přednost třepací kultuře, pěstované několik dnů při teplotě 20 až 26 °C.

Aby bylo možno zahájit fermentativní kulturu, připraví se nejprve s výhodou v jednom nebo ve dvou stupních počáteční očkovací materiál, například v Erlenmaeyrové baňce. V živném prostředí je možno v kombinaci použít zdroj uhlíku a zdroj dusíku. Potom se baňka s očkovacím materiálem protřepává v termostatickém inkubátoru 1 až 3 dny při teplotě 23 °C nebo tak dlouho, až se dosáhne dostatečného růstu. Výslednou očkovací kulturu je potom možno použít k naočkování druhé očkovací kultury nebo produkční kultury. V případě, že je nutno použít druhou očkovací kulturu,je možno postupovat podobným způsobem a částečně ji využit pro naočkování produkčního prostředí. Baňka, do níž se očkovací materiál naočkuje, se protřepává po vhodnou dobu, například 1 až 3 dny nebo do dosažení maximální produkce při vhodné teplotě, například

-11CZ 281324 B6 při shora uvedeném teplotním rozmezí. Po ukončení inkubace je možno obsah baňky oddělit odstředěním nebo filtrací.

V případě, že se kultura pěstuje ve velkém měřítku, užije se s výhodou fermentoru za současného míchání a provzdušnění kultury. Při tomto postupu je možno živné prostředí připravit přímo ve fermentoru. Po sterilizaci při teplotě 125 ’C se prostředí zchladí a naočkuje očkovacím materiálem, předem vypěstovaným na sterilizovaném prostředí. Organismus se pěstuje při teplotě 20 až 26 ’C za míchání a provzdušňování. Tento postup je vhodný v případě, že má být získáno velké množství produktu.

Množství thiomarinolu B a/nebo C, produkovaného kulturou v průběhu času je možno sledovat například pomocí vysokotlaké kapalinové chromatografie. Obecně dosáhne množství produkovaného thiomarinolu B svého maxima po době 19 až 200 hodin a množství produkovaného thiomarinolu C dosáhne svého maxima také v době v rozmezí 19 až 200 hodin, na rozdíl od toho dosáhne množství produkovaného thiomarinolu svého maxima po době 19 až 96 hodin.

Po příslušné době pěstování je možno thiomarinol B a/nebo c izolovat a čistit jakýmkoliv známým způsobem. Například jakýkoliv thiomarinol B a/nebo C, obsažený v živném prostředí je možno získat odfiltrováním pevného podílu, například při použití diatomitu jako pomocného prostředku pro filtraci nebo odstředění ma následnou extrakcí ze supernatantu čištěním na základě fyzikálné-chemických vlastností obou uvedených látek. Například thiomarinol B a/nebo C ve filtrátu nebo v supernatantu je možno extrahovat organickým rozpouštědlem, nemísitelným s vodou, jako je ethylacetát, chloroform, ethylenchlorid, methylenchlorid nebo jakákoliv směs těchto rozpouštědel za neutrálních nebo kyselých podmínek a potom čistit.

V jiném provedení je možno jako adsorpční látku použit aktivní uhlí nebo adsorpční pryskyřici, jako Amberlit XAD-2, XAD-4 (Rohma Haas) nebo Diaion HP-10, HP-20, CHP-20 nebo HP-50 (Mitsubishi Kasei Corporation). Po adsorpcí je možno odstranit nečistoty tak, že se kapalina s obsahem thiomarinolu B a/nebo C nechá projít vrstvou adsorpčního prostředku nebo je tyto látky možno po adsorpcí čistit elucí pomocí vhodného elučního činidla, jako je vodný methanol, vodný aceton nebo směs butanolu a vody.

Intracelulární thiomarinol B a/nebo C je možno čistit extrakcí vhodným rozpouštědlem, například vodným acetonem nebo vodným methanolem, s výhodou s koncentrací 50 až 90 % objemových s následným odstraněním organického rozpouštědla a potom s extrakcí tak, jak byla shora popsána pro filtrát nebo prosupernatant.

Výsledný thiomarinol B a/nebo C je možno dále čistit známými postupy, například adsorpční chromatografii na sloupci při použití nosiče, například silikagelu nebo silikagelu s obsahem hořčíku, dodávaného například pod názvem Florisil, dále je možno užít dělicí chromatografii na sloupci při použití adsorpčního prostředku, například Sephadexu LH-20 (Pharmacia) nebo vysokotlaké kapalinové chromatografie v běžné formě nebo v reversní fázi. Jak je v oboru dobře známo, je možno tyto izolační a čisticí postupy provádět jako takové nebo v jakékoliv vhodné kombinaci a v případě potřeby

-12CZ 281324 B6 opakovaně tak, aby bylo dosaženo izolace a čištění požadovaného výsledného produktu.

Thiomarinol B je možno připravit také oxidací thiomarinolu, tento postup je považován za výhodný vzhledem k tomu, že fermentací je možno získat thiomarinol B pouze v malých množstvích.

Oxidace se s výhodou provádí tak, že se na thiomarinol působí oxidačním činidlem v přítomnosti rozpouštědla a v přítomnosti nebo nepřítomnosti báze.

Povaha oxidačního činidla není při provádění tohoto postupu kritická a je možno užít jakékoliv oxidační činidlo, běžně užívané v oxidačních reakcích. Jako příklady takových oxidačních činidel je možno uvést manganistan draselný, chromany, například dichroman draselný nebo sodný, oxid chromový, chromylchlorid a terc.butylchroman, oxid ruteničelý, halogeny, například atom chloru, bromu nebo jodu, ozon, kyslík, peroxid vodíku, organické peroxidy, například bis(trimethylsilyl)peroxid, kumylhydroperoxid a terč.butylhydroperoxid, dioxirany, jako dioxiran, methyldioxiran, dimethyldioxiran, diethyldioxiran, ethylmethyldioxiran, methylpropyldioxiran, butylmethyldioxiran, fluordioxiran, methylfluordioxiran, difluordioxiran, bis(trifluormethyl)dioxiran, methyltrifluormethyldioxiran a trifluormethylchlordifluormethyldioxiran, organické perkyseliny a jejich soli, například kyselina peroctová, permravenčí a m-chlorperbenzoová a kyseliny peroxysírové a jejich soli, jako je kyselina peroxymonosírová, peroxydisulfát draselný a peroxymonosulfát draselný, dodávaný pod obchodním názvem Oxon, (Aldrich Chemical Co.). Výhodnými příklady oxidačních činidel mohou být peroxid vodíku, organické perkyseliny a jejich soli, organické peroxidy, dioxirany a kyseliny peroxysírové a jejich soli, zvláště výhodnými příklady jsou peroxid vodíku, dimethyldioxiran a kyseliny peroxysírové a jejich soli.

Neexistuje žádné zvláštní omezení, týkající se povahy báze, použité v průběhu této reakce za předpokladu, že báze nemá žádný nepříznivý vliv na průběh reakce nebo na jednotlivé reakční složky. Jako výhodné příklady těchto bází je možno uvést anorganické soli, například uhličitany alkalických kovů, jako jsou uhličitan sodný, uhličitan draselný nebo uhličitan lithný, dále hydrogenuhličitany alkalických kovů, jako hydrogenuhličitan sodný, hydrogenuhličitan draselný nebo hydrogenuhličitan lithný, hydridy alkalických kovů, například hydrid lithia, hydrid sodíku nebo hydrid draslíku, hydroxidy alkalických kovů, například hydroxid sodný, hydroxid draselný, hydroxid barnatý nebo hydroxid lithný, a také fluoridy alkalických kovů, například fluorid sodný, fluorid draselný nebo fluorid česný, dále je možno použít organické soli, jako jsou například alkoxidy alkalických kovů, jako methoxid sodíku, ethoxid sodíku, terc.butoxid draslíku nebo methoxid lithia, alkylsulfidy alkalických kovů, jako methylsulfid sodný nebo ethylsulfid sodný a sloučeniny dusíku, jako jsou triethylamin, tributylamin, diisopropyl ethylamin, N-methylmorfolin, pyridin, 4-(Ν,Ν-dimethylamino)pyridin, Ν,Ν-dimethylanilin, N,N,-diethylanilin, 1,5-azabicyklo/4.3.0/non-5-en (DBN), 1,4-diazabicyklo/2.2.2/oktan (DABCO) a 1,8-diazabicyklo/5.4.0/undec-7-en (DBU). Zvláště výhodné příklady zahrnují uhličitany alkalických kovů a hydrogenuhličitany alkalických kovů.

-13CZ 281324 B6

Reakce se obvykle a s výhodou provádí v přítomnosti rozpouštědla, jehož povaha není kritická za předpokladu, že rozpouštědlo nemá žádný nepříznivý účinek na průběh reakce a že může rozpouštět alespoň do určité míry reakční složky. Příkladem takových rozpouštědel mohou být voda, alkohol, například methanol, ethanol nebo propanol, ketony, například aceton nebo methylethylketon, organické kyseliny, například kyselina octová nebo kyselina mravenčí, estery, například ethylacetát, ethery, například diethylether nebo tetrahydrofuran, amidy, například dimethylformamid nebo dimethylacetamid a směsi jakýchkoliv dvou nebo většího počtu těchto rozpouštědel. Jako výhodné příklady je možno uvést alkoholy a také směsi vody a ketonů, zvláště výhodným příkladem může být směs vody a acetonu.

V případě potřeby je možno reakci provádět v přítomnosti anorganického katalyzátoru, například oxidu platiny nebo oxidu vanadu k urychlení průběhu reakce, přestože reakce dobře probíhá i bez těchto katalyzátorů.

Reakce může probíhat ve velmi širokém teplotním rozmezí a přesná reakční teplota není pro způsob podle vynálezu kritická. Obecně je možno uvést, že reakce dobře probíhá při teplotách v rozmezí-78 až 100, s výhodou -10 ’C až teplotě místnosti. Doba, jíž je zapotřebí k dovršení reakce se také může široce měnit v závislosti na celé řadě faktorů, zejména na reakční teplotě a na povaze reakčních složek, zejména použitého oxidačního činidla a použité báze. Avšak ve většině případů bude k dovršení reakce stačit doba v rozmezí 15 minut až 30 hodin, s výhodou 15 minut až 2 hodiny.

Po ukončení reakce je možno požadovaný výsledný produkt z reakční směsi izolovat běžným způsobem. Je například možno postupovat tak, že se reakční směs vlije do vody, vzniklá směs se extrahuje pomocí rozpouštědla, nemísitelného s vodou, například aromatického uhlovodíku, jako benzenu, etheru, například diethyletheru, esteru organické kyseliny, například ethylacetátu nebo také halogenovaného uhlovodíku, například methylenchloridu a potom se rozpouštědlo z extraktu oddestiluje. Požadovaný výsledný produkt, získaný uvedeným způsobem je v případě potřeby možno dále čistit některým z běžných postupů, například při použití různých chromatografických metod, zejména chromatografie na sloupci nebo preparativní chromatografie na tenké vrstvě.

Tiomarinol, který je výchozím materiálem pro tuto oxidační reakci je možno připravit fermentací při použití mikroorganismu z rodu Alteromonas, zejména Alteromonas rava, kmen SANK 73390 tak, jak byl shora popsán v souvislosti s přípravou thiomarinolu B a C.

Vzhledem k tomu, že thiomarinoly B a C mají antibakteriální účinek proti gram-positivnim i gram-negativním bakteriím a mykoplasmatům u živočichů, například u člověka, psa, kočky a králíka, je možno tyto látky užít k léčení nebo profylaxi bakteriální nebo mykoplasmatické infekce různým způsobem v závislosti na povaze infekce.

V případě, že jsou sloučeniny podle vynálezu určeny k léčebnému použití, je možno je podávat jako takové nebo ve formě vhod

-14CZ 281324 B6 něho farmaceutického prostředku, který kromě účinné látky obsahuje jedno nebo větší počet běžných ředidel, nosičů nebo pomocných látek. Povaha prostředku bude samozřejmě záviset na předpokládaném způsobu podání. Pro perorální podání se sloučenina s výhodou zpracovává na farmaceutické prostředky ve formě prášku, granulátu, tablet, kapslí nebo sirupů. Pro parenterálni podání jsou výhodné injekční prostředky, například pro nitrožilní, nitrosvalové nebo podkožní podání, mimoto je možno užít také kapky, čípky nebo mazání.

Farmaceutické prostředky uvedených typů je možno připravit známým způsobem tak, že se účinná látka smísí s dalšími přísadami, například s nosičem, pojivém, desintegrační látkou, kluznými látkami, stabilizátory, látkami pro úpravu chuti, solubilizačními činidly, chuťovými látkami, parfémy, činidly pro tvorbu suspenze nebo povlaky. Přestože dávka závisí na věku nemocného, na povaze a závažnosti infekce a na způsobu podání, je možno uvést, že v případě perorálního podání dospělému člověku je možno sloučeninu podle vynálezu podávat v denní dávce 20 až 2 000 mg. Tuto dávku je možno podat najednou nebo rozděleně, například ve dvou nebo třech denních dávkách.

Způsob výroby sloučenin podle vynálezu bude dále osvětlen příklady, které však nemají sloužit k omezení rozsahu vynálezu, dále bude popsána také biologická účinnost těchto látek. V přikladu 6 se popisuje příprava thiomarinolu, který se užívá jako výchozí látka pro oxidativní výrobu thiomarinolu B.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Příprava thiomarinolu B fermentací v tanku

A) Kultura

Alteromonas rava kmen SANK 73390 byl pěstován tři dny při teplotě 22 ’C na šikmém mořském agaru (Difco). Výsledná kultura byla uvedena do suspenze ve 3 ml sterilizované umělé mořské vodě. Potom bylo 0,1 ml výsledné suspenze použita k naočkování každé ze dvou Erlenmeyerových baněk s objemem 500 ml, z nichž každá obsahovala 100 ml sterilizovaného živného prostředí s následujícím složením:

mořský bujón (Difco) 37,4 g deionizované voda 1 000,0 ml pH nebylo upravováno.

Kultura potom byla inkubována 24 hodin při teplotě 23 °C za protřepávání 210 ot/min při použití rotačního třepacího zařízeni. Potom bylo celé množství výsledné kultury užito k naočkování provzdušňovaného fermentačního tanku, opatřeného míchadlem, s objemem 600 litrů a obsahem 200 litrů stejného živného prostředí jako svrchu, prostředí bylo sterilizováno. Kultura potom byla pěstována 26 hodin při teplotě 23 ’C při provzdušňování rychlostí 0,5 wm (1 wm znamená 1 objem vzduchu na objem prostředí za mi

-15CZ 281324 B6 nutu, což znamená, že množství vzduchu, dodané v průběhu 1 minuty je rovno objemu vzduchu v tanku). Rychlost rotace se upravuje na hodnotu v rozmezí 82,5 až 170 ot/min tak, aby koncentrace rozpuštěného kyslíku byla udržovánana hodnotě 5,0 ppm.

B) Izolace

Ke 230 litrům výsledného živného prostředí se přidá vodný roztok kyseliny chlorovodíkové tak, aby došlo k úpravě pH na hodnotu 2,5. Potom se ke směsi přidá ještě 200 litrů acetonu a výsledná směs se extrahuje půl hodiny za stálého míchání. Potom se ke směsi přidá 4,0 kg Celitu 545 (Jones Manvill Project Corporation, USA) jako pomocného prostředku pro filtraci a směs se zfiltruje. 430 litrů filtrátu se extrahuje 200 litry ethylacetátu a potom ještě 2 x 100 1 ethylacetátu. Ethylacetátové extrakty se spojí, promyjí se 200 1 roztoku hydrogenuhličitanu sodného ve vodě o koncentraci 5 % hmot, a potom 100 1 nasyceného vodného roztoku chloridu sodného, potom se roztok vysuší bezvodým síranem sodným a odpaří do sucha za sníženého tlaku, čímž se získá přibližné 80 g oleje.

Veškeré množství takto získaného oleje se rozpustí v methylenchloridu a výsledný roztok se nanese na sloupec s náplní 1,1 kg silikagelu, nasyceného methylenchloridem. Jako eluční činidlo se užije nejprve směs methylenchloridu a ethylacetátu v objemovém poměru 1 : 1, potom samotný ethylacetát a nakonec směs ethylacetátu a methanolu v objemovém poměru 9:1, v tomto pořadí se polarita elučních činidel postupně zvyšuje. Eluát se odebírá po podílech 500 ml, frakce, obsahující thiomarinol, získaná při použití směsi ethylacetátu a methanolu se odpaří do sucha za sníženého tlaku, čímž se získá 60 g oleje.

Veškeré množství tohoto oleje se rozpustí v 6 litrech 50% vodného methanolu (% objemová) a výsledný roztok se nanese na sloupec, který obsahuje 2,3 litru pryskyřice Diaion HP-20 ve vodě, potom se užívá gradientově eluce tak, že se užije směs vody a methanolu, v níž se koncentrace methanolu postupně zvyšuje ze 30 na 90 % objemových. Postupuje se tak, že se nejprve sloupec promyje 4 litry 30% vodného methanolu, 4 litry 50% vodného methanolu, 4 litry 60% vodného methanolu, 4 litry 70% vodného methanolu a 4 litry 80% vodného methanolu a potom se jako eluční činidlo užije 90% vodný methanol. Eluce se provádí tak dlouho, až již nedochází k eluci požadované sloučeniny, což je možno sledovat pomocí vysokotlaké kapalinové chromatografie. Celkové množství 90% vodného methanolu, užitého k eluci je přibližně 10 litrů. Frakce, která se získá při eluci 90% vodným methanolem se odpaří do sucha za sníženého tlaku, čímž se získá 3,8 g žlutého prášku. Tento žlutý prášek se podrobí chromatografii na sloupci, který obsahuje 320 g prostředku Sephadex LH-20 ve směsi methylenchloridu, ethylacetátu a methanolu v objemovém poměru 19: 19 : 2, jako eluční činidlo se užije tatáž směs rozpouštědel, čímž se získá částečně čištěný produkt.

Výsledný produkt se dále čistí pomocí vysokotlaké kapalinové chromatografie s použitím sloupce v reverzní fázi s rozměrem 20 x 250 mm a s náplní Senshu-Pak ODS H-5251 (Senshu Scientific Co.,Ltd.), jako eluční činidlo se užije vodný acetonitril s koncentrací 40 % objemových při rychlosti průtoku 15 ml za minutu,

-16CZ 281324 B6 postup čištěni produktu je možno sledovat pomocí absorbance při 220 nm.

Vzhledem k tomu, že thiomarinol B je obsažen ve vrcholu s dobou retence 13 až 14 minut, odebere se frakce, vycházející ze sloupce v této době a tato frakce se odpaří do sucha za sníženého tlaku, čímž se získá 130 mg výsledného produktu, jehož fyzikálně-chemické vlastnosti odpovídají vlastnostem, které byly uvedeny shora.

Příklad 2

Příprava thiomarinolu B oxidací thiomarinolu

100,9 mg thiomarinolu, připraveného způsobem, popsaným v příkladu 6 se rozpustí ve směsi 5 ml acetonu a 5 ml vody a výsledný roztok se zchladí v ledu. K výslednému roztoku se přidá 112,2 mg prostředku OXONE (Aldrich Chemical Co., Inc.) a směs se míchá za chlazení ledem ještě 40 minut. Na konci této doby se ke směsi přidá ještě 1,2 ml nasyceného vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a směs se znovu míchá za chlazení ledem ještě 30 minut. Potom se k reakční směsi přidá 5 ml vody a potom se směs extrahuje směsí methylenchloridu a tetrahydrofuranu v objemovém poměru 10 : 1. Extrakt se suší bezvodým síranem sodným a rozpouštědlo se odpaří destilací za sníženého tlaku. Výsledný odparek se izoluje a čistí vysokotlakou kapalinovou chromatografií v reverzní fázi při použití sloupce s náplní Senshu Pak ODS-5251-N, jako eluční činidlo se užije vodný acetonitril s koncentrací 40 % objemových, čímž se ve výtěžku 75 % získá 79,5 mg thiomarinolu B, který má světležlutou barvu a fyzikálně-chemické vlastnosti, tak jak byly shora uvedeny.

Příklad 3

Příprava thiomerinolu B oxidací thiomarinolu

100 mg thiomarinolu, připraveného způsobem, popsaným v příkladu 6 se rozpustí ve směsi 15 ml acetonu a 7,5 ml vody a potom se ke směsi přidá 0,074 ml 35% vodného peroxidu vodíku spolu se dvěma kapkami zředěného vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného. Reakční směs se 5 minut míchá a potom se aceton odstraní destilací za sníženého tlaku. Potom se k odparku přidá acetonitril a tvorba thiomarinolu B se prokáže vysokotlakou kapalinovou chromatografií v reverzní fázi při použití sloupce s náplní Senshu Pak ODS-H-2151, jako eluční činidlo se užije vodný acetonitril s koncentrací 40 % objemových. Rozpouštědlo se z reakční směsi odstraní destilací za sníženého tlaku a výsledný odparek se rozpustí ve vodném acetonitrilu s koncentrací 40 % objemových. Produkt se potom oddělí a čistí vysokotlakou kapalinovou chromatografií v reverzní fázi při použití sloupce s náplní Senshu Pak ODS-4251-N, jako eluční činidlo se užije vodný acetonitril s koncentrací 40 % objemových, čímž se ve výtěžku 41 % získá 43,2 mg thiomarinolu B, který má světle žlutou barvu a fyzikálně-chemické vlastnosti tak, jak byly uvedeny shora.

-17CZ 281324 B6

Příklad 4

Příprava thiomarinolu B oxidací thiomarinolu

100 mg thiomarinolu, připraveného způsobem, popsaným v příkladu 6 se rozpustí ve 40 ml acetonu a potom se přidá k výslednému roztoku za chlazení ledem a za míchání 134 mg kyseliny m-chlorperbenzoové. Potom se směs míchá při teplotě místnosti ještě 1,5 hodiny. Na konci této doby se reakční směs extrahuje methylenchloridem a extrakt se třikrát promyje vodou a potom ještě nasyceným vodným roztokem hydrogensíranu sodného. Potom se směs vysuší bezvodým síranem sodným a rozpouštědlo se odpaří destilací za sníženého tlaku. Odparek se izoluje a čistí vysokotlakou kapalinovou chromatografií v reverzní fázi při použití sloupce Senshu Pak ODS-4251-N, jako eluční činidlo se užije vodný acetonitril s koncentraci 40 % objemových, čímž se ve výtěžku 8 % získá 8,5 mg thiomarinolu B, který má světle žlutou barvu a shora uvedené fyzikálně-chemické vlastnosti.

Příklad 5

Příprava thiomarinolu C fermentací v tanku

A) Kultura

Alteromonas rava kmen SANK 73390 se pěstuje na šikmém mořském agaru (Difco) a získaná kultura se potom uvede do suspenze v 10 ml sterilizovaného mořského bujónu (Difco) za vzniku suspenze bakterií.

litrů téhož mořsFermentor s objemem 30 litrů a obsahem 15 kého bujónu se sterilizuje zahřátím a potom se veškeré množství bakteriální suspenze naočkuje do fermentoru a kultura se pěstuje při teplotě 23 ’C a rychlosti průtoku vzduchu 7,5 litrů za minutu celkem 24 hodin. Počáteční rychlost míchání je 100 ot/min, potom se rychlost mícháni příslušně upraví tak, aby koncentrace rozpuštěného kyslíku byla udržována na hodnotě 5,0 ppm. Do každého ze dvou fermentačních tanků s objemem 600 litrů se pak uloží 300 litrů živného prostředí s následujícím

5,0 ppm. Do 600 litrů . složením:

glukosa

Bactopepton (Difco)

Bactoextrakt z kvasnic (Difco) NaCl

MgCl₂.6H₂0

Na 2 S0 ₄

CaCl₉.2H_?O

KC1

Na ₂CO₃ citronan železitý pH 7,6 před sterilizací.

1,5

1,5

0,2 % % %

3,89 %

2,52 %

0,648 % 0,4767 %

0,11 % 0,038 %

0,02 %

Tanky se sterilizují zahřátím, potom se do každého tanku přidají 3 litry očkovací kultury a kultura se pěstuje při teplotě 23 °C a rychlosti průtoku vzduchu 150 1/min celkem 29 hodin.

-18CZ 281324 B6

Počáteční rychlost míchání byla 82 ot/min a potom se rychlost míchání příslušně upraví tak, aby koncentrace rozpuštěného kyslíku byla udržována na 5,0 ppm.

B) Izolace

K 700 1 výsledného materiálu se přidá dostatečné množství kyseliny chlorovodíkové k úpravě pH na hodnotu 3 a potom se k výsledné směsi přidá 700 litrů acetonu a extrakt se za stálého míchání provádí 1 hodinu. Výsledný extrakt se potom extrahuje nejprve 700 litry ethylacetátu a potom ještě 300 litry ethylacetátu. Ethylacetátové extrakty se spojí, promyjí se nejprve 300 litry vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného s koncentraci 5 % hmot, a potom ještě 300 litry nasyceného vodného roztoku chloridu sodného, potom se extrakt suší bezvodým síranem sodným. Rozpouštědlo se odpaří za sníženého tlaku. V průběhu odpařování se přidá 540 g silikagelu a potom se směs odpaří dosucha.

Takto získaný odparek se uvede do suspenze v methylenchloridu a získaný materiál se nanese na sloupec s náplní 4 kg silikagelu v methylenchloridu. Potom se k eluci užije nejprve methylenchlorid, potom směs methylenchloridu a ethylacetátu v objemovém poměru 1:1, potom samotný ethylacetát a nakonec smés ethylacetátu a methanolu v objemovém poměru 9:1. Při tomto pořadí použitých elučních činidel jejich polarita postupně stoupá. Získaný eluát se odebírá po podílech 2 litry a frakce, která obsahuje thiomarinol C a získá se při použití směsi ethylacetátu a methanolu jako elučního činidla se odpaří do sucha za sníženého tlaku. V průběhu odpařování se k této frakci přidá 50 g silikagelu a potom se odpařování dokončí.

Takto získaný odparek se uvede do suspenze ve směsi hexanu a acetonu a získaná suspenze se nanese na vrchol sloupce s náplní 200 g silikagelu v hexanu a sloupec se potom vymývá směsí hexanu a acetonu v objemovém poměru 1:1. Eluát se odebírá po podílech s objemem 500 ml, čímž se získají frakce 1 a 2, obsahující thiomarinol C. Frakce 1 se odpaří do sucha za sníženého tlaku. V průběhu odpařováni se přidá 25 g silikagelu a potom se odpaření do sucha dokončí.

Získaný odparek se uvede do suspenze ve směsi hexanu, acetonu a ethylacetátu v objemovém poměru 1:1:2a výsledná suspenze se nanese na sloupec s obsahem 200 g silikagelu v hexanu. Jako eluční činidlo se potom užije směs hexanu, acetonu a ethylacetátu v objemovém poměru 1:1:2. Eluát se odebírá po podílech s objemem 500 ml, odebere se frakce s obsahem thiomarinolu C a tato frakce se spojí s frakcí 2, získanou v předchozím stupni a spojené frakce se odpaří za sníženého tlaku. V průběhu odpařování se přidá 20 g silikagelu a potom se odpařování dosucha dokončí.

Výsledný odparek se uvede do suspenze ve směsi hexanu, acetonu a ethylacetátu v objemovém poměru 1:1:1a výsledná suspenze se nanese na sloupec s náplni 200 g silikagelu v hexanu. Jako eluční činidlo se potom užije směs hexanu, acetonu a ethylacetátu v obj emovém poměru 1:1:1. Eluát se potom odebírá po jednotlivých podílech s objemem 500 ml a frakce, které obsahují

-19CZ 281324 B6 thiomarinol C se oddělí a odpaří za sníženého tlaku, čímž se získá olejovitý produkt.

Veškeré množství tohoto olejovitého produktu se podrobí chromatografii při použití sloupce s objemem 200 ml s náplní prostředku Sephadex LH-20 ve směsi methylenchloridu, ethylacetátu a methanolu v objemovém poměru 19 : 19 : 2, jako eluční činidlo se užije tatáž směs rozpouštědel. Frakce, které obsahuji thiomarinol C se oddělí a odpaří za sníženého tlaku. V průběhu odpařování se přidá 25 g silikagelu a potom se odpařování do sucha dokončí.

Takto získaný odparek se uvede do suspenze v methylenchloridu a vzniklá suspenze se nanese na vrchol sloupce, který obsahuje jako náplň 250 g silikagelu v methylenchloridu. Jako eluční činidlo se použije směs methylenchloridu a acetonu v objemových poměrech, které se mění v rozmezí 9 : 1 až 1:9, takže polarita elučního činidla se postupně zvyšuje. Eluát se odebírá po podílech s objemem 1 litr a frakce, které obsahují thiomarinol C se oddělí a potom se odpaří do sucha za sníženého tlaku, čímž se získá 150 mg thiomarinolu C, jehož fyzikálně-chemické vlastnosti byly uvedeny shora.

Příklad 6

Příprava thiomarinolu fermentací

A) Kultura

Alteromonas rava kmen SANK 73390 se pěstuje tři dny při teplotě 22 ’C na šikmém mořském agaru (Difco). Výsledná kultura se uvede do suspenze ve 3 ml umělé mořské vody. Potom se asepticky odebere 0,1 ml této suspenze a užije se k naočkování Erlenmeyerovy baňky s objemem 500 ml, obsahující 100 ml sterilizovaného živného prostředí, a to 37,4 g mořského bujónu (Difco) v 1 litru deionisované vody bez úpravy pH.

Baňka se inkubuje 24 hodin při teplotě 23 ’C při protřepávání rychlostí 200 ot/min, výkyv je 70 mm při použití rotační třepačky. Po této době se vždy 15 ml kultury, odebrané asepticky z Erlenmeyerovy baňky naočkují čtyři velké fermentační nádoby s objemem 30 litrů, z nichž každá obsahuje 15 litrů shora popsaného sterilního živného prostředí. Uvedené fermentační nádoby se potom inkubuji 23 hodin při teplotě 23 °C za míchání rychlostí 100 ot/min při rychlosti provzdušnění 7,5 litrů za minutu.

B) Izolace

Po 23 hodinách se obsah fermentačních nádob spojí, čímž se získá 60 litrů materiálu. Potom se pH tohoto materiálu upraví na hodnotu 3 přidáním kyseliny chlorovodíkové. Po této úpravě se přidá 60 litrů acetonu a směs se extrahuje za míchání celkem 30 minut. Potom se přidá ještě 1,2 kg Celitu 545 (Johns Manville Co.) jako pomocného prostředku pro filtraci a směs se zfiltruje. 110 litrů výsledného filtrátu se potom nejprve jednou extrahuje 60 litry ethylacetátu a 2 x 30 litry ethylacetátu. Organické extrakty se spojí, potom se promyjí nejprve 30 litry vodného roz-20CZ 281324 B6 toku hydrogenuhličitanu sodného s koncentrací 5 % hmot, a potom ještě 30 litry nasyceného vodného roztoku chloridu sodného. Potom se směs vysuší bezvodým síranem sodným a odpaří do sucha za sníženého tlaku, čímž se získá 14 g olejovité látky.

Veškeré množství této olejovité látky se rozpustí v methylenchloridu a roztok se nanese na sloupec s náplní 200 g silikagelu v methylenchloridu. Potom se jako eluční činidlo užije nejprve směs methylenchloridu a ethylacetátu v objemovém poměru 1:1, potom samotný ethylacetát a nakonec směs ethylacetátu a methanolu v objemovém poměru 9:1, tímto způsobem se polarita elučního činidla postupně zvyšuje. Eluční činidlo se odebírá ve frakcích po 18 ml a frakce, obsahující thiomarinol, získané v průběhu eluce směsí ethylacetátu a methanolu se oddělí.

Tyto frakce se odpaří do sucha, čímž se získá 7 g olejovité látky, která se potom rozpustí ve 40 ml vodného methanolu s koncentrací 50 % objemových a roztok se nanese na vrchol sloupce s obsahem 600 ml pryskyřice Diaion HP-20 (Mitsubishi Chem. Ind.) ve vodě. Sloupec se promyje vodným methanolem s koncentrací 50 % objemových a potom se jako eluční činidlo užije vodný methanol s koncentrací 90 % objemových. Příslušné frakce s obsahem výsledného produktu se odpaří za sníženého tlaku, čímž se získá 1 g žlutého prášku. Tento žlutý prášek se nanese na další sloupec s náplní Sephadex LH-20, jako eluční činidlo se užije směs methylenchloridu, ethylacetátu a methanolu v objemovém poměru 19 : 19 : 2. Z příslušných frakcí se odpařením získá 50 mg thiomarinolu ve formě žlutého prášku.

Takto získaný thiomarinol má následující vlastnosti:

1) povaha a vzhled : žlutý prášek

2) teplota táni: 84 až 89 °C

3) molekulový vzorec: ^c3o^H44^N2°9^s2*

4) Molekulová hmotnost: 640 při stanovení FAB-MS (hmotová spektrometrie při bombardování rychlými atomy)

5) Hmot, spektrometrie s vysokou rozlišovací schopností při stanovení metodou FAB-MS:

	C30H45N2°9S2	(M+H)+
	vypočteno C	641.2567
	nalezeno C	641.2585.
6)	Elementární	analýza:
	vypočteno C	56,23, H 6,92, N	4,37, S	10,01 %
	nalezeno C	55,92, H 6,82, N	4,23, S	9,90 %.
7)	IR-spektrum	má následující	absorpční maxima (KBr disc, vmAY
	cm1):
	3 394, 2 930, 1 649, 1 598,	1 526, 1	288, 1 216, 1 154, 1 102,
	1 052.

-21CZ 281324 B6

8) UV-spektrum v methanolu nebo v methanolu s kyselinou chlorovodíkovou, thiomarinol má následující hodnoty, uvedené jako nm (extinkce):

387 (12,000), 300 (3,500), 214 (26,000)

UV-spektrum v methanolu s hydroxidem sodným je vedeno také jako nm (extinkce):

386 (9,600), 306 (3,200), 206 (25,000).

9) Optická otáčivost: /alfa/²⁵ _D =+4,3° (c = 1,0, methanol).

10) Vysokotlaká kapalinová chromatografie:

sloupec: Senshu-Pak ODS H-2151 s rozměrem 6 x 150 mm (Senshu Scientific Co., Ltd.) rozpouštědlo: vodný acetonitril, 40 % objemových Rychlost průtoku: 1,5 ml/min vlnová délka: 220 až 350 nm (detekce fotodiodou) doba retence: 5,9 minut.

llj^H-NMR: ppm při 270 MHz v hexadeuterovaném dimethylsulfoxidu při použití tetramethylsilanu jako vnitřního standardu:

0,91	(3H,	dublet, J = 6,8 Hz),
0,95	(3H,	dublet, J = 5,9 Hz), široký multiplet),
1,30	(6H,
1,55	(5H,	široký multiplet),
2,03	(3H,	singlet),
2,09	(3H,	multiplet),
2,34	(2H,	triplet, J = 7,3 Hz),
3,33	(1H,	dublet, J = 10,7 Hz), multiplet),
3,52	(2H,
3,64	(2H,	multiplet),
3,73	(1H,	dublet dubletů),
4,02	(2H,	triplet, J = 6,6 Hz),
4,18	(1H,	široký dublet, J = 7,3 Hz),
4,30	(1H,	dublet, J = 4,4 Hz), dublet, J = 7,8 Hz),
4,44	(1H,
4,63	(1H,	dublet, J = 3,4 Hz),
4,89	(1H,	dublet, J = 7,3 Hz),
5,37	(2H,	multiplet),
5,97	(1H,	široký singlet),
7,04	(1H,	singlet),
9,80	(1H,	široký singlet)
10,68	(1H,	široký singlet).

12)^{12 13}C-NMR-spektrum, ppm: při 68 MHz v tetradeuterovaném methanolu při použití tetramethylsilanu jako vnitřního standardu:

174,3 (singlet),

161.1 (singlet),

135.1 (singlet),

115,8 (singlet),

74,4 (dublet),

66,0 (triplet),

45.3 (dublet),

33.4 (triplet),

170,4 (singlet),

137,9 (singlet),

129,8 (dublet),

113,7 (dublet),

72.1 (dublet),

65,7 (dublet),

43,9 (dublet),

30.1 (triplet),

168.6 (singlet)

135.7 (dublet),

116,3 (dublet),

77.6 (dublet),

71.8 (dublet),

64.9 (triplet),

36.6 (triplet),

30,0 (triplet),

-22CZ 281324 B6

29,7 (triplet),

20,3 (kvartet),

27,0 (triplet), 26,7( triplet),

16,6 (kvartet), 16,3 (kvartet).

13)Rozpustnost:

Sloučenina je rozpustná v alkoholech, například methanolu, ethanolu, propanolu a butanolu a také v dimethylsulfoxidu, dimethylformamidu, chloroformu, ethylacetátu, acetonu a diethyletheru. Nerozpustná je v hexanu a ve vodě.

14)Barevné reakce:

positivní reakce s kyselinou sirovou, jodem a draselným.

15)Chromátografie na tenké vrstvě:

Hodnota Rf = 0,57 adsorpční činidlo: silikagel (Měrek a Co., č. 5715).

Vyvíjecí rozpouštědlo: směs methylenchloridu objemovém poměru 85 : 15.· manganistanem

Inc., výrobek a methanolu v

Biologická účinnost

Biologická účinnost thiomarinolů B a C byla prokázána postupem podle následujících zkušebních příkladů, v nichž jsou tyto látky srovnány s účinností pseudomonové kyseliny A a thiomarinolu.

Zkušební příklad 1

Antibakteriální účinnost thiomarinolů B a C

Minimální inhibiční koncentrace MIC pro thiomarinol, thiomarinol B, thiomarinol C a pseudomonovou kyselinu A (odpovídající identifikace těchto látek v následující tabulce je v tomtéž pořadí A, B, C a P) v mikrogramech/ml proti gram-positivním a gram-negativním bakteriím byla stanovena metodou postupného ředění na agaru při použití živného agaru (Eiken Chemical Co.,Ltd.).

Získané výsledky jsou shrnuty v následující tabulce 1.

Tabulka 1

MIC (úg/ml)

bakteriální kmen	A	B	C	P
Staphylococcus aureus 209P	<0.01	<0.01	<0.01	0.05
Staphvlocuccus aureus 56R	<0.01	<0.01	<0.01	0.1
Staphylococcus aureus 535 (MRSA)	<0.01	<0.01	<0.01	0.2
Enterococcus faecalis 681	0.02	0.05	0.8	25
Escherichia coli NIHJ	0.8	0.8	3.1	100
Escherichia coli 609	0.8	0.8	1.5	100
Salmonella enteritidis	0.4	0.4	1.5	50
Klebsiella pneumoniae 806	0.8	0.8	1.5	100

-23CZ 281324 B6

Tabulka 1 - pokračování

bakteriální kmen	MIC (úg/ml)
A	B	C	P
Klebsiella pneumoniae
846 (R)	0.2	0.2	0.8	100
Enterobacter cloacae 963	1.5	0.8	3.1	>100
Serratia marcescens 1184	3.1	3.1	6.2	>100
Próteus vulqaris 1420	0.05	0.05	0.2	0.4
Moroanella moraanii 1510	6.2	6.2	12.5	>100
Pseudomonas aerucjinosa 1001	0.2	0.2	0.8	>100
Pseudomonas aeruoinosa No.7	0.4	0.4	0.8	>100
Pseudomonas aeruqinosa 3719	-	0.8	0.4	>100

Zkušební příklad 2

Účinnost thiomarinolů B a C proti mykoplasmatům

Obdobným způsobem jako ve zkušebním příkladu 1 byla stanovena účinnost thiomarinolu, thiomarinolu B, thiomarinolu C a pseudomonové kyseliny A proti různým čeledím mycoplasmat. Uvedené látky jsou v tabulce opét ve stejném pořadí označeny písmeny A, B, C a P. Získané výsledky jsou shrnuty v následující tabulce 2.

Tabulka 2 kmen mykoplasmat MIC (|ig/ml)

	A	B	C	P
Mycoplasma bovis Donetta	0,0125	0,006	<0,006	<0,006
Mycoplasma gallisepticum
PG-31	0,05	0,1	0,05	6,25
Mycoplasma gallisepticum
K-l	0,05	0,1	0,05	6,25
Mycoplasma hyosynoviae S-16	0,025	-	-	-
Mycoplasma hyorhinis BTS7		0,78	1,56	0,39

Očkovací materiál: 0,005 ml 105 CFU/ml

Prostředí, použité pro zkoušky:

pro thiomarinol B, thiomarinol C a pseudomonovou kyselinu A bylo užito Canockovo prostředí, připravené podle publikace

P.N.A.S., 48, 41 až 49, 1962, doplněné 20 % koňského séra pro všechny mikroorganismy.

Thiomarinol byl podroben zkouškám na následujících živných prostředích:

M. bovis a M. gallisepticum: Chanockovo prostředí, připravené shora uvedeným způsobem.

M. hyosynoviae: Agarové prostředí Mucin PPLOx (doplněné 15 % koňského séra):

-24CZ 281324 B6.

^x PPLO (organismy, podobné organismům pleuropneumonie):

bujón PPLO bez CV (Difco) 21g bakteriologický mucin (Difco) 5g destilovaná voda 800ml agar Noble (Difco) 12g koňské sérum 150ml

25% čerstvý extrakt z kvasnic 50ml

Podmínky pěstování:

“C, 5 dnů, mírně aerobní podmínky (metoda BBL, jde o pěstování v přítomnosti generátoru C0₂ pro jedno použití (Becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, MD 2103 USA)).

Z uvedených výsledků je zřejmé, že thiomarinoly B a C mají velmi dobrou účinnost proti bakteriím i proti mykoplasmatům, účinnost je alespoň rovna účinnosti thiomarinolu a obecně je podstatně vyšší než účinnost pseudomonové kyseliny A.

Claims (12)

1. PATENTOVÉ NÁROKY (I) kde

   R¹ znamená atom vodíku nebo hydroxyskupinu a n znamená celé číslo 0 nebo 1.

   -25CZ 281324 B6
2. 4. Způsob výroby thiomarinolu B podle nároku 2, vyznačující se tím, že se pěstuje mikroorganismus rodu

   Alteromonas, produkující thiomarinol B a tato z kultury izoluje. látka se potom 5. Způsob podle nároku 4, vyznačující že se pěstuje mikroorganismus Alteromonas rava. s e tím, 6. Způsob podle nároku 4, vyznačující s e tím,

   že se pěstuje mikroorganismus Alteromonas rava kmen SANK 73390, FERM BP-3381.
3. 7. Způsob výroby thiomarinolu C podle nároku 3., vyznačující se tím, že se pěstuje mikroorganismus rodu Alteromonas, produkující thiomarinol C a tato látka se potom z kultury izoluje.
4. 8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že se pěstuje mikroorganismus Alteromonas rava.
5. 9. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že se pěstuje mikroorganismus Alteromonas rava kmen SANK 73390, FERM BP-3381.
6. 10. Způsob výroby thiomarinolu B podle nároku 2, vyznačující se tím, že se oxiduje thiomarinol.
7. 11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že se thiomarinol oxiduje oxidačním činidlem ze skupiny manganistan draselný, chromany, oxid rutheničelý, halogeny, ozon, kyslík, peroxid vodíku, organické peroxidy, dioxirany, organické perkyseliny a jejich soli a kyselina peroxysírová a její soli.
8. 12. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že se thiomarinol oxiduje oxidačním činidlem ze skupiny peroxid vodíku, organické perkyseliny a jejich soli, organické peroxidy, dioxirany a kyselina peroxysírová a její soli.
9. 13. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že se thiomarinol oxiduje oxidačním činidlem ze skupiny peroxid vodíku, dimethyldioxiran a kyselina peroxysírová a její soli.

   26CZ 281324 B6
10. 14. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že se thiomarinol oxiduje oxidačním činidlem ze skupiny manganistan draselný, dichroman draselný, dichroman sodný, oxid chromový, chromylchlorid, terc.butylchroman, oxid rutheničelý, chlor, brom, jod, ozon, kyslík peroxid vodíku, bis(trimethylsilyl)peroxid, kumylhydroperoxid, terč.butylhydroperoxid, dioxiran, methyldioxiran, dimethyldioxiran, diethyldioxiran, ethylmethyldioxiran, methylpropyldioxiran, butylmethyldioxiran, fluordioxiran, methylfluordioxiran, difluordioxiran, bis(trifluormethyl)dioxiran, methyltrifluormethyldioxiran, trifluormethylchlordifluormethyldioxiran, kyselina peroctová, kyselina permravenčí, kyselina m-chlorperbenzoová, kyselina peroxymonosírová, peroxydisulfát draselný a peroxymonosulfát draselný.
11. 15. Farmaceutický prostředek s antibakteriálním účinkem, vyznačující se tím, že obsahuje thiomarinol B podle nároku 2 a farmaceuticky přijatelný nosič.
12. 16. Farmaceutický prostředek s antibakteriálním účinkem, vyznačující se tím, že obsahuje thiomarinol C podle nároku 3 a farmaceuticky přijatelný nosič.