FI105814B - Menetelmä lääkeaineena käyttökelpoisen tiomarinoli B:n valmistamiseksi - Google Patents

Description

105814

Menetelmä lääkeaineena käyttökelpoisen tiomarinoli B:n valmistamiseksi Förfarande för framställning av 5 som läkemedel användbar tiomarinol B

Keksinnön tausta 10

Esillä oleva keksintö liittyy tiettyihin uusiin tiomarinolin johdannaisiin ja menetelmiin niiden valmistamiseksi ja koostumuksiin, joissa käytetään niitä bakteerienvastai-sina aineina.

15 Tiomarinoli kuvataan esimerkiksi Euroopan patenttijulkaisussa 512 824, joka on julkaistu tämän hakemuksen päivämäärää ennen, mutta prioriteettipäivämäärien jälkeen. Se voidaan esittää kaavalla (A): .Y: OH OH O S\ | j:··; CH, hovVVy0'-'~^^A^h :Y: OH ... (A) • · · • · · • · · / t · · - • · *“;* Sitä tuotetaan suvun Alteromonas mikro-organismien fermentoinnilla, esimerkiksi • · ____.......

Alteromonas rava kannalla SANK 73390. Olemme nyt löytäneet tiomarinolin « « : 30 johdannaisen, jolla on samantapaista antibioottista vaikutusta kun alkuperäisellä

III

tiomarinolilla.

9 « · « « « « • ( « f · I I I · 105814 2

Kemialliselta rakenteeltaan läheisiä, samanlaisia bakteerienvastaisia ominaisuuksia omaavia yhdisteitä on kuvattu myös WO-patenttijulkaisussa 84/01775.

Suvun Alteromonas organismeja voidaan eristää merivedestä, ja jotkut on osoittautu-5 nut tuottavan yhdisteitä, joilla on mahdollista terapeuttista käyttöä. Esimerkiksi yhdiste, joka tunnetaan nimellä bisucaberin on saatu eräästä Alteromonas lajista ja sillä on osoittautunut olevan kasvaimenvastaista vaikutusta (Japanin patenttihakemus Kokai Numero Sho 63-27484).

10 Tiomarinolirakennetta ajatellen, tunnetaan useita antibioottisia aineita, joilla on samantapaisia rakenteita ja nämä voidaan jakaa neljään ryhmään.

Ensimmäinen ryhmä käsittää pseudomonihapot, jotka ensin eristettiin mikro-organismista Pseudomonas spp. Näihin kuuluvat pseudomonihappo A [jota tuottaa Pseudo-15 monas fluorescens. joka on esitetty J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 294 (1977)], pseudomonihappo B [ibid, 318 (1977)], pseudomonihappo C [ibid, 2827 (1982)] ja pseudomonihappo D [ibid, 2655 (1983)]. Pseudomonihappoa A myydään nimellä "Bactroban" (Beecham, rekisteröity tavaramerkki) 2 %:sen ihoa hoitavan voiteen muodossa bakteerienvastaiseen käyttöön. Kaikilla näillä tekniikan tason yhdisteillä ·.·* ·' 20 on kuitenkin heikompia bakteerinvastaisia vaikutuksia kun esillä olevan keksinnön • · : mukaisilla tiomarinolin johdannaisilla.

• · · • · •

Mf M

Toinen ryhmä aineita, joilla on samantapainen rakenne kun keksinnön mukaisilla · · yhdisteillä on ryhmä, johon kuuluu antibiootit holomycin [Helv. Chim. Acta, 42,563 • V · 25 (1959)], pyrrothine [J. Am. Chem. Soc., 77, 2861 (1955)], thiolutin [Angew. Chem., ... 66, 745 (1954)], aureothricin [J. Am. Chem. Soc., 74, 6304 (1952)], ja muut. Näitä V · • · antibiootteja tuottaa tyypillisesti actinomycetes, ja niille on tunnusomaista rikkiä m *!’ sisältävä kromofoori. Xenorhabdinit I-V ovat aineita, jotka liittyvät holomysiiniin, ja « « « · · '·· ’· ne on myös eristetty bakteereista (esitetty WO-hakemuksessa 84/01775).

• * 30 « · • * · 105814 3

Erilaisia tutkimuksia näiden kahden ryhmien johdannaisista on suoritettu, mutta emme ole tietoisia mistään sellaisen aineen esittämisestä, jolla on samantapainen molekyylirakenne kun tiomarinoleilla tai jolle on tunnusomaista samanlaiset ominaisuudet.

5

Kolmas ryhmä yhdisteitä on esitetty japanilaisissa hakemusjulkaisuissa numerot Kokai 52-102279, 54-12375, 54-90179, 54-103871 ja 54-125672, jotka esittävät pseudomonihapon johdannaisia, joissa päätekarboksyylihappo on korvattu amidiryh-mällä. Näillä yhdisteillä ei ole verrattavaa bakteerienvastaista vaikutusta eikä niillä 10 ole laajaa bakteerienvastaista vaikutusta. Tosiasiassa näillä yhdisteillä yleensä on heikompi antibioottivaikutus kun alkuperäisellä pseudomonihapolla.

Neljäs ryhmä käsittää yhdisteen, joka muistuttaa tiomarinolia siinä, että se on fysiologinen aine, joka on peräisin meren bakteereista [Abstracts of Papers from the 15 200 Year Conference of the Am. Chem. Soc. (August 26-31,1990), Part 2, ORGN.

No. 139]. Heterosyklinen ryhmä, joka on sidottu päätekarbonyyliryhmään, tässä yhdisteessä, on kuitenkin 2-okso-3-piperidyyliryhmä. Sillä on viimeaikoina osoitettu olevan mikrobinvastaista vaikutusta [Experimentia, Col. 48, pages 1165 - 1169 (1992)].

• · i ·.: : 20 • · : Tärkeimmän tekniikan tason uskotaan kuitenkin olevan pseudomonihappo A ja •« · : kaikilla tiomarinoleilla, toisin sanoen alkuperäinen tiomarinoli, tiomarinoli B ja ' 1 tiomarinoli C, on merkittävästi vahvempi bakteerinvastainen vaikutus kun pseudo- • · 9 monihapolla A.

* 1 · • · 1 __ 25 ... Keksinnön lvhvt yhteenveto • « • $ • · » • · · • · ’·’ Tämän keksinnön kohteena on saada aikaan uusia tiomarinolin johdannaisia.

• · · • · · IM · · · « · 30 Vielä eräänä ja erityisempänä kohteena on saada aikaan sellaisia yhdisteitä, joilla on • · :’1· erinomainen bakteerinvastainen ja bakteereita pienemmän mutta virusta isomman • · 105814 4 pieneliönvastainen vaikutus. (Tämän jälkeen näitä pieneliöitä kutsutaan yksinkertaisesti vain "pieneliöiksi").

Muut kohteet ja edut selvenevät selityksen edetessä.

5

Yleisesti ottaen, tämä keksintö tarjoaa menetelmän uuden tiomarinolin johdannaisen valmistamiseksi, joka on S,S-dioksojohdannainen ja siihen viitataan tässä nimellä "tiomarinoli B".

10 Esillä olevan keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetaan yhdiste tiomarinoli B, joka voidaan esittää seuraavalla kaavalla (B)

V

OH OH s' N

CH3V—fHj I ' r yn'h

OH H O

<W

• ·

I » I

• t • · · • · · • · m : Keksinnöllä saadaan menetelmä tiomarinolin B valmistamiseksi tiomarinolin * hapettamisella.

• · * * * • · a • · • · · t f i 25 Keksinnöllä saadaan myös farmaseuttinen koostumus, joka käsittää bakteerienvas-taista tai pieneliönvastaista ainetta sekoitettuna farmaseuttisesti hyväksyttävään • * • · *·* kantajaan tai laimentuneen, jossa bakteerienvastainen tai pieneliönvastainen aine on a · ’!* tiomarinoli B.

• · a a a a a a a a a a a a » a '·;·* 30 Keksinnöllä saadaan vielä menetelmä bakteerien tai pieneliöiden aiheuttamien a · • '·· tartuntojen käsittelyyn tai ehkäisyyn, mikä menetelmä käsittää bakteerienvastaisen a • a 5 105814 tai bakteeria pienemmän mutta virusta isomman pieneliönvastaisen aineen tehokkaan määrän annostelemisen nisäkkäälle, joka voi olla ihminen, joka kärsii tällaisesta tai joka on herkkä tällaiselle tartunnalle.

5 Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus

On selvää edellä olevasta kaavasta, että tiomarinoli B sisältää joukon asymmetrisia hiiliatomeja ja useita kaksoissidoksia. Isomerisointi on erityisen mahdollista tioma-rinolien α,β-tyydyttämättömässä karbonyyliosuudessa. Tiomarinoli voi siksi muodos-10 taa erilaisia stereo- ja geometrisia isomeerejä. Vaikkakin näitä kaikkia esitetään tässä yhdellä ainoalla molekyylikaavalla, esillä olevaan keksintöön kuuluvat sekä yksittäiset, eristetyt isomeerit että niiden seokset, mukaanlukien rasemaatit. Kun stereospesifisiä synteesitekniikoita käytetään tai optisesti aktiivisia yhdisteitä käytetään lähtöaineena, yksittäiset isomeerit voidaan valmistaa suoraan; toisaalta jos 15 valmistetaan isomeerien seos, yksittäiset isomeerit voidaan saada tavanomaisilla erottelutekniikoilla.

Koska kuitenkin tiomarinolit normaalisti tuotetaan fermentoimalla tai fermentointi-tai käymistuotteen kemiallisella muuttamisella, niillä yleensä on optinen standardi-20 konfiguraatio. Siten, vaikkakin muita konfiguraatioita on olemassa, luonnollinen i ;': konfiguraatio on edullinen.

• · · • · • ·

Tiomarinoli B voidaan tunnistaa seuraavien fysikaaliskemiallisten ominaisuuksien • · avulla seuraavalla tavalla: • · · 25 1) Olomuoto ja ulkonäkö: Keltainen pulveri.

• · · ...

· • · · • · • · ·;·' 2) Molekyylikaava: 03^44^0,jS2.

• · » · · • · · • t · • · · 30 3) Molekyylipaino: 672(määriteltynä FAB-MS:llä) "FAB-MS"on Fast Atom Bom- * bardment Mass Spectrometry.

• · 105814 6 4) Korkean erotuskyvyn massaspektrometria: C30H45N2OnS2 [(M+H)+; määriteltynä FAB-MS:llä] Löydetty 673.2468

Laskettu 673.2465.

5 5) Alkuaineanalyysi:

Laskettu kaavasta CjqH^NjOuSj + H20: C, 52.16 %; H, 6,71 %; N, 4,06 %; S, 9,28 %.

Löydetty C, 52,34 %; H, 6,79 %; N, 3,92 %; S, 9,02 %.

10 6) Infrapuna-absorptiospektri: vmax cm'1

Infrapuna-absorptiospektri mitattiin kaliumbromidi- (KBr) levymenetelmällä, kuten on osoitettu myöhemmin.

15 3660, 3503, 3318, 3075, 2966, 2928, 2870, 1704, 1653, 1509, 1467, 1381, 1349, 1299, 1217,1199, 1152, 1112, 1063, 1047, 1019, 975, 949, 884, 839, 764, 730, 660, 609, 553.

20 [il 7) Ultraviolettiabsorptiospektri: nm (ε) a · a • · · • • · *·**· Ultraviolettiabsorptiospektri on mitattu 1-propanolissa ja on osoitettu seuraavas- • • · · ·.·.· sa: • · · : 25 377 (2,900), 301 (13,000), 215 (21,000).

7 105814

Ultraviolettiabsorptiospektri on mitattu 1-propanolissa + natriumhydroksidissa ja on osoitettu seuraavassa: 377 (2,900), 301 (13,000), 221 (19,000).

5 8) Ominaiskierto: [α]£5 = + 7,7°(c = 1,0,1-propanoli).

9) Korkean erotuskyvyn nestekromatografia:

Erotuskolonni: Senshu-Pak ODS H-2151 (kolonnin halkaisija 6 mm, pituus 150 mm, yhtiön Senshu Scientific Co.,Ltd:n tuotteen tavaramerkki) 10 Liuotin; 40 % t/t vesipitoinen asetnitrili

Virtausnopeus: 1,5 ml/minuutti Viipymäaika: 8,4 minuuttia.

10) 'H-ydinmagneettinen resonanssispektri; (5:ppm) 15 Ydinmagneettinen resonanssispektri (360 MHz) on mitattu heksadeuteroidussa dimetyylisulfoksidissa käyttämällä tetrametyylisilaania sisäisenä standardina, kuten on osoitettu seuraavassa.

11.28 (1H, leveä singletti); 10,47 (1H, singletti); 20 7,23 (1H, singletti); : 5,97(1H, singletti); • « « « 5,37 (2H, multipletti); 4,88 (1H, dupletti, J = 7,5 Hz); 4,61 (1H, leveä singletti); 0 : 25 4,43 (1H, dupletti, J = 7,2 Hz); 4.28 (1H, dupletti, J = 3,6 Hz); • · · 4,18 (1H, dupletti, J = 7,2 Hz); • · · 4,02 (2H, tripletti, J = 6,6 Hz); i.i 3,74 (1H, leveä singletti); C: 30 3,64 (1H), 3,61 (1H), 3,54 (1H), 3,51 (1H); 9 3,35 (1H, dupletti, J = 10,9 Hz); • * δ 105814 2,43 (2Η, tripletti, J = 7,3 Hz); 2,12 (1H), 2,09 (1H), 2,03 (1H); 2.02 (3H, singletti); 1,61 (1H), 1,58 (2H), 1,50 (2H), 1,32 (2H), 1,30 (2H), 1,25 (2H); 5 0,96 (3H, dupletti, J = 6,3 Hz); 0,92 (3H, dupletti, J = 6,9 Hz).

11) 13C-ydinmagneettinen resonanssispektri: (A:ppm)

Ydinmagneettinen resonanssispektri (360 MHz) on mitattu heksadeuteroidussa 10 dimetyylisulfoksidissa käyttämällä tetrametyylisilaania sisäisenä standardina, kuten on osoitettu seuraavassa.

173,5 (singletti), 166,1 (singletti), 165,7 (singletti), 160.8 (singletti), 143,2 (singletti), 134,2 (dupletti), 127.8 (dupletti), 123,3 (singletti), 115,2 (singletti), 15 114,4 (dupletti), 109,4 (dupletti), 76,2 (dupletti), 72,4 (dupletti), 69,6 (dupletti), 69,3 (dupletti), 64,3 (tripletti), 63,9 (dupletti), 63,0 (tripletti), 43.2 (dupletti), 42,2 (dupletti), 34,7 (tripletti), 31,9 (tripletti), 28,3 (tripletti), 28,2 (tripletti), .'!': 20 28,1 (tripletti), 25,3 (tripletti), 24,5 (tripletti), : 20,0 (kvartetti), 15,7 (kvartetti), 15,6 (kvartetti).

tr ( • · • · • · 12) Liukoisuus: • ·

Liukenee alkoholeihin, kuten metanoliin, etanoliin, propanoliin ja butanoliin, ·«· *·' * 25 kuten myös dimetyylisulfoksidiin, dimetyyliformamidiin, kloroformiin, etyy- liasetaatiin, asetoniin ja dietyylieetteriin. Liukenematon heksaaniin ja veteen.

• · · • · * • · · « · ” 13) Ohutkerroskromatografia: • · i Rf arvo: 0,52 « t *··' 30 Adsorbointiaine: Silikageeli (Merck & Co., Inc., Art 5715) j Kehitysliuotin: Metyleenikloridi : metanoli = 85 : 15 tilavuusseos.

• · 9 105814

Tiomarinolia B voidaan valmistaa tiomarinolin hapettamisella ja tätä menetelmää pidetään edullisena, koska tiomarinolia B saadaan ainoastaan suhteellisen pieninä määrinä fermentoinnilla.

5 Hapetus suoritetaan edullisesti antamalla hapetusaineen vaikuttaa tiomarinoliin liuottimen läsnäollessa ja emäksen läsnäollessa tai poissaollessa.

Käytetyn hapetusaineen laatu ei ole kriittinen esillä olevalle keksinnölle ja mitä vain hapetusreaktioissa tavallisesti käytettyä hapetusainetta voidaan yhtä hyvin käyttää 10 tässä. Esimerkkejä sellaisista hapetusaineista ovat: kaliumpermanganaatti; kromaatit, kuten kaliumdikromaatti (kaliumbikromaatti), natriumdikromaatti (natriumbikro- maatti), kromioksidi (VI), kromyylikloridi ja t-butyylikromaatti; ruteenitetroksidi; halogeenit, kuten kloori, bromi ja jodi; otsoni; happi; vetyperoksidi; orgaaniset peroksidit, kuten bis(trimetyylisilyyli)peroksidi, kumyylivetyperoksidi ja t-butyylivety- 15 peroksidi; dioksiraanit, kuten dioksiraani, metyylidioksiraani, dimetyylidioksiraani, dietyylidioksiraani, etyylimetyylidioksiraani, metyylipropyylidioksiraani, butyylimetyy- lidioksiraani, fluorodioksiraani, metyylifluorodioksiraani, difluorodioksiraani, bis(tri- fluorometyyli)dioksiraani, metyylitrifluorometyylidioksiraani ja trifluorimetyylikloro- difluorometyylidioksiraani; orgaaniset perhapot ja niiden suolat, kuten peretikkahap- 20 po, permuurahaishappo ja m-klooriperbentsoehappo; ja peroksirikkihapot ja niiden : : : suolat, kuten peroksimonorikkihappo, kaliumperoksidisulfaatti ja kaliumperoksi- • · « • V monosulfaatti (varsinkin se, jota myydään tavaramerkillä "Oxone" yhtiön Aldrich

Chemical Co. tuote). Edullisia esimerkkejä hapetusaineista ovat vetyperoksidi, • · orgaaniset perhapot ja niiden suolat, orgaaniset peroksidit, dioksiraanit ja peroksirik- • · · *.* * 25 kihapot ja niiden suolat, ja erityisen edullisia esimerkkejä ovat vetyperoksidi, dimetyylidioksiraani ja peroksirikkihapot ja niiden suolat.

* · « « ··· M» • · ·;* Tässä reaktiossa käytetyn emäksen laatua eri myöskään erityisemmin rajoiteta, sillä : edellytyksellä, että sillä ei ole haitallista vaikutusta reaktioon tai reagensseihin.

30 Edullisia esimerkkejä sellaisista emäksistä ovat: epäorgaaniset suolat, esimerkiksi « alkalimetallien karbonaatit (kuten natriumkarbonaatti, kaliumkarbonaatti tai • · 105814 10 litiumkarbonaatti), aikaiimetallien vetykarbonaatit (kuten natriumvetykarbonaatti, kaliumvetykarbonaatti tai litiumvetykarbonaatti), alkalimetallin hydridit (kuten litiumhydridi, natriumhydridi tai kaliumhydridi), alkalimetallien hydroksidit (kuten natriumhydroksidi, kaliumhydroksidi, bariumhydroksidi tai litiumhydroksidi) ja 5 alkalimetallien fluoridit (kuten natriumfluoridi, kaliumfluoridi tai kesiumfluoridi); orgaaniset suolat, esimerkiksi alkalimetallin alkoksidit (kuten natriummetoksidi, natriumetoksidi, kalium-t-butoksidi tai litiummetoksidi); alkalimetallialkyylisulfidit (kuten natriummetyylisulfidi tai natriumetyylisulfidi); ja typpiyhdisteet (kuten trietyyliamiini, tributyyliamiini, di-isopropyylietyyliamiini, N-metyylimorfoliini, 10 pyridiini,4-(N,N-dimetyyliamino)pyridiini, N, N-dimetyy Handiini, N,N-dietyy Handiini, l,5-diatsabisyklo[4.3.0]non-5-eeni (DBN), l,4-diatsabisyklo[2.2.2]oktaani (DABCO) ja l,8-diatsabisyklo[5.4.0]undek-7-eeni (DBU). Erityisen edullisia esimerkkejä ovat alkalimetallien karbonaatit ja alkalimetallien vetykarbonaatit.

15 Reaktio suoritetaan normaalisti ja edullisesti liuottimen läsnäollessa, jonka laatu ei ole kriittinen, sillä edellytyksellä, että sillä ei ole haitallista vaikutusta reaktioon ja että se kykenee liuottamaan reagenssit ainakin jossain määrin. Esimerkkejä sopivista liuottimista ovat: vesi; alkoholit, kuten metanoli, etanoli tai propanoli; ketonit, kuten asetoni tai metyylietyyliketoni; orgaaniset hapot, kuten etikkahappo tai muurahais-: 20 happo; esterit, kuten etyyliasetaatti; eetterit, kuten dietyy 1 ieetteri tai tetrahydrofuraa- : : ni; amidit, kuten dimetyyliformamidi tai dimetyyliasetamidi; ja kahden tai useamman • ',· näiden liuottimien seokset. Edullisia esimerkkejä ovat alkoholit ja veden ja ketonien *·**· seokset, kun erityisen edullisia esimerkkejä ovat veden ja asetonin seokset.

• · * · « • · · • · • · · *.’ * 25 Haluttaessa reaktio voidaan suorittaa epäorgaanisen katalysaattorin läsnäollessa, kuten platinaoksidin tai vanadiinioksidin reaktion helpottamiseksi, vaikkakin reaktio • · *;·;* etenee ilman tällaisia katalysaattoreita.

• · • · · « « : Reaktio tapahtuu laajalla lämpötila-alueella ja täsmällinen reaktiolämpötila, ei ole ···* 30 kriittinen keksinnölle. Yleensä pidämme sopivana suorittaa reaktio lämpötilassa • · • · · 105814 11 -78 °C- 100 °C, edullisemmin -10 °C - huoneenlämpötila. Reaktioon vaadittu aika voi myös vaihdella laajasti riippuen monesta tekijästä, joista huomattakoon reaktion lämpötila ja reagenssien laatu, erityisesti hapetusaine ja käytetty emäs. Useimmissa tapauksissa 15 minuuttia - 30 tuntia, edullisemmin 15 minuuttia - 2 tuntia, kuitenkin 5 normaalisti riittää.

Reaktion mentyä loppuun haluttu yhdiste voidaan ottaa talteen reaktioseoksesta tavanomaisin keinoin. Eräs sopiva talteenottotekniikka käsittää esimerkiksi sen, että kaadetaan reaktioseos veteen; uutetaan se liuottimella, joka on sekoittumaton 10 veteen, kuten aromaattinen hiilivety (esimerkiksi bentseeni), eetteri (esimerkiksi dietyylieetteri), orgaanisen hapon esteri (esimerkiksi etyyliasetaatti) tai halogenisoitu hiilivety (esimerkiksi metyleenikloridi); ja sitten tislaamalla liuotin pois uutteesta. Tällä tavalla saatu haluttu tuote voidaan haluttaessa edelleen puhdistaa tavanomaisilla menetelmillä esimerkiksi käyttämällä erilaisia kromatografiatekniikoita, joista 15 huomattakoon kolonnikromatografia tai preparatiivinen ohutkerroskromatografia.

Tiomarinoli, joka on lähtöaine tässä hapetusreaktiossa, voidaan valmistaa fermen-toinnilla käyttämällä suvun Alteromonas mikro-organismeja, varsinkin Alteromonas rava kantaa SANK 73390.

20 « ...

j(j | Koska tiomarinolilla B on bakteerinvastainen vaikutus gram-positiivisia ja gram- « « t I V negatiivisia bakteereita ja pieneliöitä vastaan eläimissä (esim. ihminen, koira, kissa ja kani), sitä voidaan käyttää bakteeri- tai pieneliötartuntojen käsittelyyn tai eh- • · käisyyn erilaisilla reiteillä, riippuen tartunnan laadusta.

• * · « · · *.· * 25

Kun keksinnön mukainen yhdiste on tarkoitettu terapeuttiseen käyttöön, sitä voidaan · annostella yksinomaan tai sopivassa farmaseuttisessa formuloinnissa, joka sisältää • · aktiivisen yhdisteen lisäksi yhtä tai useampaa tavanomaista laimenninta, kantajaa, • · i täyteainetta tai apuainetta. Formuloinnin laatu riippuu tietenkin tarkoitetusta 9 9 · « · ........

30 annostelureitistä. Suun kautta tapahtuvaa reittiä varten yhdiste edullisesti kuitenkin • 9 | ’·· formuloidaan pulvereiksi, rakeiksi, tableteiksi, kapseleiksi tai siirapeiksi. Ruoansula- 9 9 9 9 9 9 • · 12 105814 tuskanavan ulkopuoliseen annosteluun se on edullista formuloida ruiskuksi (joka voi olla suonensisäinen, lihaksensisäinen tai ihonalainen), tipoiksi, puikoiksi, voiteiksi tai linimenteiksi.

5 Nämä formuloidit voidaan valmistaa tunnetulla tavalla lisäämällä aktiiviseen yhdisteeseen sellaisia lisäaineita, kuten kuljetusaineita, sideaineita, hajoitusaineita, voiteluaineita, stabilointiaineita, korjausaineita, solubilisointiaineita, makuaineita, parfyymeja, suspensointiaineita tai päällystysaineita. Vaikkakin annos saattaa vaihdella riippuen potilaan oireista ja iästä, tartunnan laadusta ja vakavuudesta ja 10 annostelureitin tavasta, kun kyseenä on suun kautta tapahtuva annostelu aikuiselle ihmispotilaalle, esillä olevan keksinnön yhdisteitä voidaan normaalisti annostella päivittäisinä annoksina 20 mg - 2000 mg. Yhdisteitä voidaan annostaa yhtenä ainoana annoksena tai jaettuina annoksina esim. kaksi tai kolme kertaa päivässä.

15 Esillä olevan keksinnön yhdisteiden valmistusta kuvataan vielä seuraavien ei- rajoittavien esimerkkien avulla ja näiden yhdisteiden biologisia vaikutuksia kuvataan sen jälkeisillä testiesimerkeillä. Esimerkki 6 kuvaa tiomarinolin valmistamista, jota käytetään lähtöaineena tiomarinolin B hapettavaan valmistukseen.

20 ESIMERKKI 1 I · I • 11 • · « < « « « • Tiomarinolin B valmistus hapettamalla tiomarinolia m • · • · *.·.* 100,9 mg tiomarinolia (valmistettu kuten on kuvattu esimerkissä 4) liuotettiin • · · • · « *·’ ‘ 25 seokseen, joka sisälsi 5 ml asetonia ja 5 ml vettä ja sitten tuloksena saatua liuosta jäähdytettiin jäällä. 112,2mgOXONE (yhtiön Aldrich Chemical Co.,Inc., tuotteen • tavaramerkki) lisättiin tuloksena saatuun liuokseen ja sitten seosta sekoitettiin • · "* samalla kun jäähdytettiin jäällä 40 minuuttia. Tämän jälkeen 1,2 ml natriumvetykar- • · : bonaatin kyllästettyä vesiliuosta lisättiin tähän seokseen ja seosta sekoitettiin taas « « · • · '·;·* 30 samalla kun jäähdytettiin jäällä 30 minuuttia. 5 ml vettä lisättiin sitten reaktioseok- • · • *·· seen, joka sitten uutettiin metyleenikloridin ja tetrahydrofuraanin 10 : 1 tilavuusse- • · 105814 13 oksella. Uute kuivattiin vedettömän natriumsulfaatin avulla ja sitten liuotin poistettiin tislaamalla alennetussa paineessa. Tuloksena saatu jäännös eristettiin ja puhdistettiin korkean suodatuskyvyn käänteisfaasinestekromatografialla (käyttämällä Senshu Pak ODS-5251-N kolonnia ja 40 %:sta t/t vesipitoista asetnitriliä eluenttina), 5 jolloin saatiin 79,5 mg (saanti 75 %) tiomarinolia B, jolla on vaaleankeltainen väri ja jonka fysikaaliskemialliset ominaisuudet on lueteltu edellä.

ESIMERKKI 2 10 Tiomarinolin B valmistus hapettamalla tiomarinolia 100 mg tiomarinolia (valmistettu kuten on kuvattu esimerkissä 4) liuotettiin seokseen, joka sisälsi 15 ml asetonia ja 7,5 ml vettä ja sitten 0,074 ml 35 %:sta vesipitoista vetyperoksidia ja 2 pisaraa natriumvetykarbonaatin laimeata vesiliuosta lisättiin 15 seokseen. Reaktioseosta sekoitettiin 5 minuuttia, jonka jälkeen asetoni poistettiin tislaamalla alennetussa paineessa. Asetnitriliä lisättiin jäännökseen ja tiomarinolin B muodostuminen vahvistettiin korkean suorituskyvyn nestekromatografialla (käyttämällä Senshu Pak ODS-H-2151 kolonnia ja 40 %:sta t/t vesipitoista asetnitriliä eluenttina). Liuotin poistettiin reaktioseoksesta tislaamalla alennetussa paineessa : 20 ja tuloksena saatu liuos liuotettiin 40 %:seen t/t vesipitoiseen asetnitriliin. Se I <.

: eristettiin sitten ja puhdistettiin korkean suorituskyvyn käänteisfaasinestekromatogra- « r __ : V fialla (käyttämällä Senshu Pak ODS-4251-N kolonnia ja 40 %:sta t/t vesipitoista ** * asetnitriliä eluenttina), jolloin saatiin 43,2 mg (saanti 41 %) tiomarinolia, jolla on • · • · » ’·*·* vaaleankeltainen väri ja jonka fysikaaliskemialliset ominaisuudet on lueteltu edellä.

• · · *·· ’25 ESIMERKKI 3 • · « » • · • · · • ·

Tiomarinolin B valmistus hapettamalla tiomarinolia I ·

• I I

• · · • · · I · · • · 30 100 mg tiomarinolia (valmistettu kuten on kuvattu esimerkissä 4) liuotettiin 40 • • ’·· ml:aan asetonia ja sitten 134 mg m-klooriperbentsoehappoa lisättiin samalla kun * t · 14 105814 jäähdytettiin jäällä ja sekoitettiin, tuloksena saatuun liuokseen. Seosta sekoitettiin sitten 1,5 tuntia huoneenlämmössä. Tämän jälkeen reaktioseos uutettiin metyleenik-loridilla ja uute pestiin kolme kertaa vedellä ja sitten kerran natriumvetysulfaatin kyllästetyllä vesiliuoksella. Uute kuivattiin vedettömän natriumsulfaatin avulla, jonka 5 jälkeen liuotin poistettiin tislaamalla alennetussa paineessa. Tuloksena saatu jäännös eristettiin ja puhdistettiin korkean suorituskyvyn käänteisfaasinestekromatografialla (käyttämällä Senshu Pak ODS-4251-N kolonnia ja 40 %:sta t/t vesipitoista asetnitri-liä eluenttina), jolloin saatiin 8,5 mg (saanti 8 %) tiomarinolia B, jolla on vaaleankeltainen väri ja jonka fysikaaliskemialliset ominaisuudet on lueteltu edellä.

10 ESIMERKKI 4

Tiomarinolin valmistus Tiomarinolin ravistusfermentointi astiassa 15 A) Viljely

Alteromonas rava kantaa SANK 73390 viljeltiin kolme päivää lämpötilassa 22 °C merivesiagarin viistopinnalla (Difco:n tuote). Tuloksena saatua viljelyä suspensoitiin .’l i 20 3 ml:ssa keinotekoista merivettä. 0,1 ml suspensiota otettiin aseptisesti ja istutettiin i < \tl \ 500 ml Erlenmeyer-pulloon, joka sisälsi 100 ml steriloitua väliainetta [37,4 g meri- c / ; V vesilientä (Difco:n tuote) 1 litrassa dejonisoitua vettä, pH:ta ei säädetty].

• · • · *.*.* Pulloa haudutettiin 24 tuntia lämpötilassa 23 °C ravistamalla nopeudella 200 rpm * « * • · · *·’ ’ 25 (pyörintäsäde 70 mm), käyttämällä pyörivää ravistajaa. Tämän jälkeen kukin neljästä 30 litran käymisastiasta, jokaisen sisältäessä 15 litraa steriiliä väliainetta, joka on • · "l\\ kuvattu edellä, istutettiin 50 ml:lla viljelyä, joka oli otettu aseptisesti Erlenmeyer- • · pullosta. Fermentointiastioita haudottiin 23 tuntia lämpötilassa 23 °C, ilmastus- < « : nopeudella 7,5 litraa/minuutti sekoittaen (100 rpm).

< « · :···: 30 « · t ·

• M

• • · 15 uä8«i4 B) Eristys 23 tunnin jälkeen käymisastioiden sisällöt yhdistettiin, jolloin saatiin 60 litraa vilje-lynestettä. Nesteen pH säädettiin arvoon 3 lisäämällä kloorivetyhappoa, jonka 5 jälkeen 60 litraa asetonia lisättiin ja seos uutettiin 30 minuuttia samalla kun sekoitettiin. Liuos suodatettiin käyttämällä 1,2 kg Celite 545 suodatusapuainetta (tuotteen tavaramerkki, joka saadaan yhtiöstä Johns Manville Co.). 110 litraa tuloksena saatua suodosta uutettiin kerran 60 litralla etyyliasetaattia ja kaksi kertaa etyyliasetaatilla ja kumpanakin kertana 30 litralla. Yhdistetyt orgaaniset uutteet pestiin 30 litralla 10 natriumvetykarbonaatin 5 % p/t vesiliuosta ja sen jälkeen 30 litralla kyllästettyä natriumkloridin vesiliuosta. Seos kuivattiin sitten vedettömän natriumsulfaatin avulla ja haihdutettiin kuivaksi alennetussa paineessa, jolloin saatiin 14 g öljyistä ainetta.

Koko öljyinen aine, joka saatiin, liuotettiin metyleenikloridiin ja liuos adsorboitiin 15 kolonniin, joka oli pakattu 200 g:IIa silikageeliä, joka oli kyllästetty metyleenikloridil-la. Liuos eluoitiin sitten metyleenikloridin ja etyyliasetaatin 1 : 1 tilavuusseoksella, etyyliasetaatilla yksinomaan ja etyyliasetaatti-metanolin 9 : 1 tilavuusseoksella mainitussa järjestyksessä (eluenttien polarisuus suurenee tässä järjestyksessä).

« 1 < v ' Eluentti kerättiin 18 ml:an fraktioihin ja fraktiot, jotka eluoitiin etyyliasetaatin ja i i I I · ·'! : 20 metanolin seoksella, jotka sisälsivät tiomarinolia, säästettiin.

C € t ·*

« I I « I

I ( . .

! . Säästetyt fraktiot haihdutettiin kuivaksi, jolloin saatiin 7 g öljyistä ainetta, joka • · · • · · L* liuotettiin 400 ml:aan 50 %:sta t/t vesipitoista metanolia ja adsorboitiin 600 ml:n • · · kolonniin, joka oli pakattu Diaion HP-20:llä (yhtiöstä Mitsubishi Chem. Ind. 25 saatavan tuotteen tavaramerkki), joka oli kyllästetty vedellä. Kolonni pestiin 50 • · .···, %:sella t/t vesipitoisella metanolilla ja sitten kohdeaine eluoitiin 90 % t/t vesime- ··· . ·, tanolilla. 1 g keltaista pulveria saatiin tuloksena saadusta fraktiosta haihduttamalla * · · • · · '!!.* alennetussa paineessa. Tämä keltainen pulveri eluoitiin lisää kolonnikromatogram- • · millä käyttämällä Sephadex LH-20 ja kehitettiin metyylikloridin ja etyyliasetaatin ja • · ; ” 30 metanolin 19 : 19 : 2 seoksella. Saatiin 750 mg tiomarinolia keltaisena pulverina aktiivisista fraktioista.

105814 16

Tuloksena saadulla tiomarinolilla oli seuraavassa esitetyt ominaisuudet.

1) Olomuoto ja ulkonäkö: Keltainen pulveri.

5 2) Sulamispiste: 84 - 89 °C.

3) Molekyylikaava: C30H44N2O9S2.

4) Molekyylipaino: 640, määriteltynä FAB-MS:llä ("FAB-MS" on Fast Atom Bom-10 bardment Mass Spectrometry).

5) Korkean erotuskyvyn massaspektrometria: C30H45N2O9S2 [(M+H)+; määriteltynä FAB-MS :llä]

Laskettu 641,2567 15 Löydetty 641.2585.

6) Alkuaineanalyysi:

Laskettu C, 56,23 %; H, 6,92 %; N, 4,37 %; S, 10,01 %.

• I I

v : Löydetty C, 55,92 %; H, 6,82 %; N, 4,23 %; S, 9,90 %.

::v 20 1 7) Infrapuna-absorptiospektri: infrapunaspektri on esitetty seuraavalla absorp- I / tiomaksimilla (KBr levymenetelmä, cm'1 • · · 3394, 2930, 1649, 1598, 1526, 1288, 1216, 1154, 1102, 1052.

• · · • · · t 25 8) Ultraviolettiabsorptiospektri: • ·

Metanolissa, tai metanoli + HC1, tiomarinolilla on ultraviolettiabsorptiospektri, • · · joka on esitetty seuraavassa: [λ^ nm (ε)] · · 387(12,00),300(3,500),214(26,000) « t • · ja metanolissa + NaOH on ultraviolettispektri, joka on esitetty seuraavassa: • · : " 30 [λ^ nm (ε)] 386 (9,600), 306 (3,200), 206 (25,000).

105814 17 9) Ominaiskierto: [α]£5 = + 7,7°(c = l,0,metanoli).

10) Korkean erotuskyvyn nestekromatografia:

Erotuskolonni: Senshu-Pak ODS H-2151 (kolonnin koko, 6 x 150 mm, yhtiön 5 Senshu Scientific Co.,Ltd:n tuote)

Liuotin: 40 % t/t vesipitoinen asetonitriili

Virtausnopeus: 1,5 ml/minuutti

Aallon pituus: 220-350 nm (kirjattu fotodiodin avulla)

Viipymäaika: 5,9 minuuttia.

10 11) 1 H-Ydinmagneettinen resonanssispektri: (5:ppm)

Ydinmagneettinen resonanssispektri (270 MHz) heksadeuteroidussa dimetyy-lisulfoksidissa käyttämällä tetrametyylisilaania sisäisenä standardina, on seuraa-va: 15 0,91 (3H, dupletti, J = 6,8 Hz); 0,95 (3H, dupletti, J = 5,9 Hz); 1,30 (6H, leveä multipletti); 1,55 (5H, leveä multipletti); • · t j ' 2,03 (3H, singletti);

• « I

;;/ 20 2,09 (3H, multipletti); I i \ 2,34 (2H, tripletti, J = 7,3 Hz); • (•cc >v 3,33 (1H, dupletti, J = 10,7 Hz); • » · · r. · " 3,52 (2H, multipletti); · · 3,64 (2H, multipletti); ,···. 25 3,73 (1H, duplettien dupletti); .***. 4,02 (2H, tripletti, J = 6,6Hz); . 4,18 (1H, leveä dupletti, J = 7,3 Hz); . 4,30 (1 H, dupletti, J =4,4 Hz); • · 4,44 (1 H, dupletti, J =7,8 Hz); • · ' [ 30 4,63 (1H, dupletti, J =3,4 Hz); 4,89 (1H, dupletti, J = 7,3 Hz); 105814 18 5,37 (2H, multipletti); 5,97 (1H, leveä singletti); 7.04 (1H, singletti); 9,80 (1H, leveä singletti); 5 10,68 (1H, leveä singletti).

12) 13C-Ydinmagneettinen resonanssispektri: (δ:ppm)

Ydinmagneettinen resonanssispektri (68 MHz) tetradeuteroidussa metanolissa käyttämällä tetrametyylisilaania sisäisenä standardina, on seuraava.

10 174,3 (singletti), 170,4 (singletti), 168,6 (singletti), 161.1 (singletti), 137,9 (singletti), 135,7 (dupletti), 135.1 (singletti), 129,8 (dupletti), 116,3 (dupletti), 115,8 (singletti), 113,7 (dupletti), 77,6 (dupletti), 74.4 (dupletti), 72,1 (dupletti), 71,8 (dupletti), 15 66,0 (tripletti), 65,7 (dupletti), 64,9 (tripletti), 45.3 (dupletti), 43,9 (dupletti), 36,6 (tripletti), 33.4 (tripletti), 30,1 (tripletti), 30,0 (tripletti), 29,7 (tripletti), 27,0 (tripletti), 26,7 (tripletti), ' 20,3 (kvartetti), 16,6 (kvartetti), 16,3 (kvartetti).

;;«:j 20 1' 13) Liukoisuus: . . Liukenee alkoholeihin, kuten metanoliin, etanoliin, propanoliin ja butanoliin; ja • · · • « « *..1 liukenee dimetyylisulfoksidiin, dimetyyliformamidiin, kloroformiin, etyyli- * 1 1 asetaattiin, asetoniin ja dietyylieetteriin; liukenematon heksaaniin ja veteen.

25 ·

• M

.···. 14) Värireaktiot: • · · . ·. Positiivinen rikkihapolle, jodille ja kaliumpermanganaatille.

• · · • · · a a 105814 19 15) Ohutkerroskromatografia:

Rf arvo: 0,57

Adsorbointiaine: Silikageeli (Merck & Co., Inc., Art 5715) 5 Kehitysliuotin: Metyleenikloridi : metanoli = 85 : 15 tilavuusseos.

BIOLOGINEN VAIKUTUS

Tiomarinolin B biologinen vaikutus on esitetty seuraavilla testiesimerkeillä, joissa 10 sitä verrataan pseudomonihappoon A ja tiomarinoliin.

TESTIESIMERKKI 1

Tiomarinolin B bakteerinvastainen vaikutus 15

Tiomarinolin, tiomarinolin B ja pseudomonihapon A (tunnistetaan merkeillä "A","B" ja "P") inhiboiva minimikonsentraatio (MIC) annettuna μg/ml, gram-positiivisia ja gram-negatiivisia bakteereita vastaan määriteltiin agaariväliainelaimennusmenetel-' mällä käyttämällä ravintoagaariväliainetta (yhtiön Eiken Chemical Co.,Ltd. tuote).

;;y 20 ‘ Tulokset on annettu seuraavassa taulukossa 1.

• ♦ • · · • ♦ * • · • ♦ · • · · • » · 9 • 99 • · « · • 99 • 99 . _________ ..

• · _ ' • · · • ♦ • · · • · ♦ »f* ί tee te • e et· t 9 9 9 9 9 9 105814 20

Taulukko 1 5 Testin bakteerikanta MIC1 (jag/ml)

A B P

Staphylococcus aureus 209 P <0,01 <0,01 0,05

Staphylococcus aureus 56RP <0,01 <0,01 0,1 10 Staphylococcus aureus 535P (MRSA) <0,01 <0,01 0,2

Enterococcus faecalis 681 0,02 0,05 25

Escherichia coli NIHJ 0,8 0,8 100

Escherichia coli 609 0,8 0,8 100

Salmonella enteritidis 0,4 0,4 50 15 Klebsiella pneumoniae 806 0,8 0,8 100

Klebsiella pneumoniae 846 (R) 0,2 0,2 100

Enterobacter cloacae 963 1,5 0,8 >100

Serratia marcescens 1184 3,1 3,1 >100

Proteus vulgaris 1420 0,05 0,05 0,4 ; 20 Morganella morganii 1510 6,2 6,2 >100 : Pseudomonas aeruginosa 1001 0,2 0,2 > 100 . . Pseudomonas aeruginosa No. 7 0,4 0,4 > 100 • · ·

Pseudomonas aeruginosa 3719 - 0,8 >100 · · * .-. 25 • · · + .···. MIC = inhiboiva minimikonsentraatio • # · « · « · · • · · • · « «

• · O

105814 21 TESTIESIMERKK1 2 Tiomarinolin B pieneliönvastainen vaikutus 5 Suorittamalla sama menetelmä kuin testiesimerkissä 1, tiomarinolin, tiomarinolin B ja pseudomonihapon A (tunnistetaan merkeillä "A","B"ja "P")vaikutus analysoitiin erilaisia pieneliön lajeja vastaan. Tulokset on annettu seuraavassa taulukossa 2.

Taulukko 2 10

Testattu pieneliökanta MIC* (μξ/πύ)

A B P

15 Mycoplasma bovis Donetta 0,0125 0,006 <0,006

Mycoplasma gallisepticum PG-31 0,05 0,1 6,25

Mycoplasma gallisepticum K-l 0,05 0,1 6,25

Mycoplasma hvosvnoviae S-16 0,025 ' Mycoplasma hvorhinis BTS 7 - 0,78 0,39 ; 20 ( r — f ; . . MIC* = inhiboiva minimikonsentraatio • t « • · t • · • · · • * #

Istute: 0,005 ml of 105 CFU/ml .···. 25 Analyysiväline: * · ·«· .*·*. Tiomarinoli B ja pseudomonihappo A analysoitiin kaikki Chanock-väliaineella ··« . [valmistettu kuten on kuvattu P.N.A.S.,48,41-49 (1962) ja täydennetty 20 %:11a • · · *’*/ hevosen seerumilla] kaikia mikro-organismeja vastaan.

• · • ♦ ♦ ; 30 • · 105814 22

Tiomarinoli analysoitiin seuraavilla väliaineilla: M. bovis ja M· gallisepticum: Chanock -väliaine (valmistettu kuten on esitetty edellä).

5 M. hvosvnoviae: Mucin PPLO1 agar-väliaine (täydennetty 15 %:lla hevosen seerumilla).

* - PPLO (PleuroPneumonia-Like Organism) 10 PPLO liemi ilman CV (Difco) 21 g

Mucin bacteriological (Difco) 5 g

Tislattua vettä 800 ml

Agar Noble (Difco) 12 g

Hevosen seerumi 150 ml 15 25 % tuore hiivauute 50 ml

Viljelyolosuhteet: 37 °C,5 päivää, hieman aerobinen (BBL kaasupakkausmenetelmä [viljely saatavassa olevassa C02-generaattorissa yhtiöstä Becton Dickinson Microbiology ;; 20 Systems, Cockeysville, MD 2103 USA]) 1 M f . . Edellä olevista tuloksista on selvää, että tiomarinolilla B on erinomaisia baktee- • · • · · rinvastaisia ja pieneliönvastaisia vaikutuksia, jotka ovat ainakin yhtä hyvät kun • · 1 tiomarinolin ja yleensä merkittävästi paremmat kun pseudomonihapon A.

25 • · · • · · • · • · · • · • m · • · · • · · · • · « • « • · · * ·

Claims (5)

105814

1. Menetelmä lääkeaineena käyttökelpoisen kaavan B mukaisen yhdisteen, jolle on annettu nimi "tiomarinoli B",valmistamiseksi, 5 C> o |H |H o O ch I [TTT H3vX\tV° ch3 o ho 0H (B) 15 tunnettu siitä, että tiomarinoli B valmistetaan hapettamalla kaavan (A) /S f ?H o \J !.:·· ΓΗ 1 [TTT CH, O Ho 0H (A) • · • 4 « • 4 | · • · · • · · 4 4 4 mukaista tiomarinolia. 25 • · • · · .···. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hapetus φ 444 . *. suoritetaan käyttämällä hapetusainetta, joka on valittu ryhmästä, johon kuuluu: • · · • · · "λ* kaliumpermanganaatti; kromaatit; ruteniumtetraoksidi; halogeenit; otsoni; happi; • · *·* vetyperoksidi; orgaaniset peroksidit; dioksiraanit; orgaaniset perhapot ja niiden • · • " 30 suolat; ja peroksirikkihapot ja niiden suolat. • · 105814

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hapetus suoritetaan käyttämällä hapetusainetta, joka on valittu ryhmästä, johon kuuluu: vetyperoksidi, orgaaniset perhapot ja niiden suolat, orgaaniset peroksidit, dioksi-raanit ja peroksirikkihapot ja niiden suolat. 5

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hapetus suoritetaan käyttämällä hapetusainetta, joka on valittu ryhmästä, johon kuuluu: vetyperoksidi, dimetyylidioksiraani ja peroksirikkihapot ja niiden suolat.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hapetus suoritetaan käyttämällä hapetusainetta, joka on valittu ryhmästä, johon kuuluu: m-klooriperbentsoehappo, vetyperoksidi ja kaliumperoksimonosulfaatti. • t« « · · • · • < < • I « | • · • · · a a f m m m m m a a a • · · • · « • « m a • aa aa a a a a a a a a a a a a a a a a a « a aa * a a a « a a a « a aa a a a · 105814