DE69322235T2

DE69322235T2 - Thiomarinol-Derivate und Verfahren zu ihrer Herstellung

Info

Publication number: DE69322235T2
Application number: DE69322235T
Authority: DE
Inventors: Katsumi C/O Sankyo Company Ltd. Shinagawa-Ku Tokyo 140 Fujimoto; Shiozawa C/O Sankyo Company Ltd. Shinagawa-Ku Tokyo 140 Hideyuki; Koichi C/O Sankyo Company Ltd. Shinagawa-Ku Itokyo 140 Hirai; Akira C/O Sankyo Company Ltd. Tsukuba-Shi Ibaraki-Ken Ishii; Yuji C/O Sankyo Company Ltd. Shinagawa-Ku Tokyo 140 Iwano; Takeshi C/O Sankyo Company Ltd. Iwaki-Shi Fukushima-Ken Kagasaki; Kentaro C/O Sankyo Company Ltd. Ibaraki-Ken Kodama; Kaneo C/O Sankyo Company Ltd. Iwaki-Shi Fukushima-Ken Ogawa; Yoshiharu C/O Sankyo Cy. Ltd. Fukishima-Ken Sakaida; Takahashi C/O Sankyo Company Ltd. Shinagawa-Ku Tokyo 140 Shuji; Akio C/O Sankyo Company Ltd. Shinagawa-Ku Tokyo 140 Torikata
Original assignee: Sankyo Co Ltd
Current assignee: Sankyo Co Ltd
Priority date: 1992-09-18
Filing date: 1993-09-17
Publication date: 1999-07-29
Anticipated expiration: 2013-09-18
Also published as: FI103055B1; MX9305720A; DK0595458T3; US5399711A; DE69322235D1; CA2106443A1; CN1092811A; FI103055B; TW255893B; HK1006935A1; FI981359A0; NO933328D0; NZ248696A; KR940007039A; AU665860B2; FI105814B; HU9302629D0; PH30111A; HU211907A9; FI981359A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft bestimmte neue Derivate von Thiomarinol und stellt Verfahren zu ihrer Herstellung sowie Verfahren und Zusammensetzungen, bei denen sie als antibakterielle Mittel verwendet werden, bereit.
Thiomarinol wird z. B. in der vor dem Anmeldedatum der vorliegenden Anmeldung, jedoch nach deren Prioritätsdaten veröffentlichten EP-A- 512 824 beschrieben. Es wird durch die folgende Formel (A) wiedergegeben:
Es wird durch Fermentation von Mikroorganismen der Gattung Alteromonas und insbesondere Alteromonas rava Stamm SANK 73390 hergestellt. Wir haben nun zwei Derivate von Thiomarinol aufgefunden, die ähnliche Arten von antibiotischer Aktivität wie das ursprüngliche Thiomarinol aufweisen.
Organismen der Gattung Alteromonas können aus Meerwasser isoliert werden, und von einigen ist gezeigt worden, daß sie Verbindungen mit einer möglichen therapeutischen Anwendung bilden. Zum Beispiel wurde eine Verbindung, die als Bisucaberin bekannt ist, aus einer Spezies von Alteromonas erhalten, und es wurde gezeigt, daß sie Antitumoraktivität aufweist (japanische Offenlegungsschrift Sho 63-27484).
Im Zusammenhang mit der Struktur von Thiomarinol sind mehrere antibiotische Substanzen mit ähnlichen Strukturen bekannt, und diese können in vier Gruppen eingeteilt werden.
Die erste Gruppe umfaßt die Pseudomonas-Säuren, die zuerst aus Pseudomonas spp. isoliert wurden. Diese umfassen Pseudomonas-Säure A [gebildet von Pseudomonas fluorescens, offenbart in J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 294 (1977)], Pseudomonas-Säure B [ebenda, 318 (1977)], Pseudomonas-Säure C [ebenda, 2827 (1982)] und Pseudomonas-Säure D [ebenda, 2655 (1983)]. Pseudomonas-Säure A wird unter der Bezeichnung "Bactroban" (Beecham, eingetragene Marke) in Form einer 2%igen dermatologischen Salbe für die antibakterielle Anwendung vermarktet. Alle diese Verbindungen aus dem Stand der Technik weisen jedoch schwächere antibakterielle Aktivitäten als die erfindungsgemäßen Thiomarinolderivate auf.
Die zweite Gruppe von Substanzen, die eine strukturelle Ähnlichkeit mit den erfindungsgemäßen Verbindungen aufweisen, umfassen die Antibiotika Holomycin [Helv. Chim. Acta, 42, 563 (1959)], Pyrrothin [J. Am. Chem. Soc., 77, 2861 (1955)], Thiolutin [Angew. Chem., 66, 745 (1954)], Aureothricin [J. Am. Chem. Soc., 74, 6304 (1952)] und andere. Diese Antibiotika werden typischerweise von Actinomyceten gebildet, und sie sind durch ein schwefelhaltiges Chromophor gekennzeichnet. Die Xenorhabdine I - V sind Substanzen, die verwandt mit Holomycin sind und die ebenfalls aus Bakterien isoliert worden sind (offenbart in WO 84/01775).
Es sind verschiedene Studien mit Derivaten dieser beiden Gruppen durchgeführt worden; uns ist jedoch keine Offenbarung einer Substanz, die eine Molekülstruktur aufweist, die ähnlich der der Thiomarinole ist, oder die durch ähnliche Eigenschaften charakterisiert ist, bekannt.
Die dritte Gruppe von Verbindungen ist in den japanischen Offenlegungsschriften 52-102279, 54-12375, 54-90179, 54-103871 und 54-125672 offenbart, die Pseudomonas-Säure-Derivate beschreiben, bei denen die endständige Carboxylgruppe durch eine Amidgruppe ersetzt ist. Diese Verbindungen zeigen keine vergleichbare antibakterielle Aktivität und zeigen kein breites Spektrum der antibakteriellen Aktivität. In der Tat besteht bei diesen Verbindungen eine Tendenz, daß sie schwächere antibiotische Aktivität als die ursprüngliche Pseudomonas-Säure aufweisen.
Die vierte Gruppe umfaßt eine Verbindung, die dahingehend ähnlich zu Thiomarinol ist, daß es sich um eine physiologische Substanz mit Ursprung in marinen Bakterien handelt [Abstracts of Papers from the 200 Year Conference of the Am. Chem. Soc. (26. bis 31. August 1990), Teil 2, ORGN. Nr. 139]. Bei der heterocyclischen Gruppe, die an die endständige Carbonylgruppe in dieser Verbindung gebunden ist, handelt es sich jedoch um eine 2-Oxo-3-piperidylgruppe. Es wurde kürzlich gezeigt, daß sie antimikrobielle Aktivität aufweist [Experimentia, Bd. 48, S. 1165-1169 (1992)].
Es wird jedoch angenommen, daß der nächstliegende Stand der Technik Pseudomonas-Säure A ist, und alle Thiomarinole, d. h. das ursprüngliche Thiomarinol, Thiomarinol B und Thiomarinol C, weisen eine erheblich stärkere antimikrobielle Aktivität als Pseudomonas-Säure A auf.
Allgemein gesagt stellt die vorliegende Erfindung zwei neue Derivate von Thiomarinol bereit, wobei es sich bei dem einen um ein S,S-Dioxo-Derivat handelt, das hier als "Thiomarinol B" bezeichnet wird, und es sich bei dem anderen um ein Desoxyderivat handelt, das hier als "Thiomarinol C" bezeichnet wird.
Die Struktur von Thiomarinol B ist bis jetzt noch nicht endgültig bestimmt worden, und aus der Formel von Thiomarinol selbst [Formel (A)] ist ersichtlich, daß es zwei mögliche Positionen für die S-Oxidation gibt. Thiomarinol B wird also hier durch seine physikochemischen Eigenschaften gekennzeichnet, die wie folgt lauten:

1) Beschaffenheit und Aussehen: Gelbes Pulver.

2) Molekularformel: C&sub3;&sub0;H&sub4;&sub4;N&sub2;O&sub1;&sub1;S&sub2;.

3) Molekulargewicht: 672 (bestimmt durch FAB-MS).

"FAB-MS" bedeutet Massenspektometrie durch Beschuß mit hochbeschleunigten Atomen ("Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry").

4) Hochauflösungs-Massenspektrometrie:

C&sub3;&sub0;H&sub4;&sub5;N&sub2;O&sub1;&sub1;S&sub2; [(M+H)&spplus;; bestimmt durch FAB-MS]
Gefunden: 673,2468
Berechnet: 673,2465

5) Elementaranalyse:

Berechnet für C&sub3;&sub0;H&sub4;&sub4;N&sub2;O&sub1;&sub1;S&sub2; + H&sub2;O:
C: 52,16%; H: 6,71%; N: 4,06%; S: 9,28%
Gefunden: C: 52,34%; H: 6,79%; N: 3,92%; S: 9,02%

6) Infrarotabsorptionsspektrum: νmax cm&supmin;¹

Das mit Hilfe der Kaliumbromid (KBr)-Scheiben-Methode gemessene Infrarotabsorptionsspektrum ist wie folgt:
3660, 3503, 3318, 3075, 2966, 2928, 2870, 1704, 1653, 1509, 1467, 1381, 1349, 1299, 1217, 1199, 1152, 1112, 1063, 1047, 1019, 975, 949, 884, 839, 764, 730, 660, 609, 553.

7) Ultraviolettabsorptionsspektrum: λmax nm(&epsi;)

Das in 1-Propanol gemessene Ultraviolettabsorptionsspektrum ist wie folgt:
377 (2900), 301 (13 000), 215 (21 000).
Das in 1-Propanol + Chlorwasserstoffsäure gemessene Ultraviolettabsorptionsspektrum ist wie folgt:
377 (2900), 301 (13 000), 223 (17 000).
Das in 1-Propanol + Natriumhydroxid gemessene Ultraviolettabsorptionsspektrum ist wie folgt:
377 (2900), 301 (13 000), 221 (19 000).

8) Spezifische Drehung: [α]D²&sup5; = +7,7º (c = 1,0, 1-Propanol).

9) Hochleistungsflüssigkeitschromatographie:

Trennsäule: Senshu-Pak ODS H-2151 (Säulendurchmesser 6 mm, Länge 150 mm, Marke für ein Produkt der Senshu Scientific Co., Ltd.)
Lösungsmittel: 40%iges (Vol./Vol.) wäßriges Acetonitril
Fließrate: 1,5 ml/min
Verweilzeit: 8,4 Minuten.

10) ¹H-NMR-Spektrum: (δ: ppm)

Das NMR-Spektrum (360 MHz), gemessen in hexadeuteriertem Dimethylsulfoxid unter Verwendung von Tetramethylsilan als innerem Standard, ist wie folgt:
11,28 (1H, breites Singulett);
10,47 (1H, Singulett);
7,23 (1H, Singulett);
5,97 (1H, Singulett);
5,37 (2H, Multiplett);
4,88 (1H, Dublett, J = 7,5 Hz);
4,61 (1H, breites Singulett);
4,43 (1H, Dublett, J = 7,25 Hz);
4,28 (1H, Dublett, J = 3,6 Hz);
4,18 (1H, Dublett, J = 7,2 Hz);
4,02 (2H, Triplett, J = 6,6 Hz);
3,74 (1H, breites Singulett);
3,64 (1H), 3,61 (1H), 3,54 (1H), 3,51 (1H);
3,35 (1H, Dublett, J = 10,9 Hz);
2,43 (2H, Triplett, J = 7,3 Hz);
2,12 (1H), 2,09 (1H), 2,03 (1H);
2,02 (3H, Singulett);
1,61 (1H), 1,58 (2H), 1,50 (2H), 1,32 (2H) 1,30 (2H), 1,25 (2H);
0,96 (3H, Dublett, J = 6,3 Hz);
0,92 (3H, Dublett, J = 6,9 Hz).

11) ¹³C-NMR-Spektrum: (δ: ppm)

Das NMR-Spektrum (90 MHz), gemessen in hexadeuteriertem Dimethylsulfoxid unter Verwendung von Tetramethylsilan als innerem Standard, ist wie folgt:
173,5 (Singulett), 166,1 (Singulett), 165,7 (Singulett),
160,8 (Singulett), 143,2 (Singulett), 134,2 (Dublett),
127,8 (Dublett), 123,3 (Singulett), 115,2 (Singulett),
114,4 (Dublett), 109,4 (Dublett), 76,2 (Dublett),
72,4 (Dublett), 69,6 (Dublett), 69,3 (Dublett),
64,3 (Triplett), 63,9 (Dublett), 63,0 (Triplett),
43,2 (Dublett), 42,2 (Dublett), 34,7 (Triplett),
31,9 (Triplett), 28,3 (Triplett), 28,2 (Triplett),
28,1 (Triplett), 25,3 (Triplett), 24,5 (Triplett),
20,0 (Quartett), 15,7 (Quartett), 15,6 (Quartett).

12) Löslichkeit:

Löslich in Alkoholen, wie Methanol, Ethanol, Propanol und Butanol, sowie in Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, Chloroform, Ethylacetat, Aceton und Diethylether. Unlöslich in Hexan und Wasser.
13) Dünnschichtchromatographie:
Rf-Wert: 0,52
Adsorptionsmittel: Silicagel (Merck & Co., Inc., Art. 5715)
Entwicklungslösungsmittel: Methylenchlorid : Methanol = 85 : 15 Volumenteile.
Eine weitere erfindungsgemäße Verbindung ist Thiomarinol C, das durch die folgende Formel (C) dargestellt werden kann:
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung von Thiomarinol B oder C bereit, das das Züchten eines Thiomarinol-produzierenden Stamms der Spezies Alteromonas rava und das Isolieren von Thiomarinol B oder C aus dem Kulturmedium umfaßt.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung von Thiomarinol B durch die Oxidation von Thiomarinol bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt auch eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die ein antibakterielles Mittel oder ein Mittel gegen Mycoplasmen im Gemisch mit einem pharmazeutisch geeigneten Träger oder Verdünnungsmittel umfaßt, wobei es sich bei dem antibakteriellen Mittel oder dem Mittel gegen Mycoplasmen um Thiomarinol B und/oder C handelt.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht ferner die Verwendung von Thiomarinol B und/oder C bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Prophylaxe von bakteriellen Infektionen oder Infektionen durch Mycoplasmen bei einem Säuger, insbesondere einem Menschen.
Wir stellen also neue Derivate von Thiomarinol bereit. Wir stellen auch Thiomarinolderivate bereit, die eine hervorragende antibakterielle Aktivität und Aktivität gegen Mycoplasmen aufweisen.
Die Struktur von Thiomarinol B ist zwar unsicher; es wird jedoch angenommen, daß es sich um eine Verbindung handelt, die die Formel (B1) oder (B2) aufweist:
Es kann sich um eine dieser Verbindungen handeln, oder es kann sich um ein Gemisch der beiden Verbindungen handeln. Im Falle eines Gemisches können die relativen Anteile festgelegt sein, oder sie können variieren, und zwar abhängig von der Art der Herstellung.
Aus der vorstehenden Formel ist klar, daß die Thiomarinole B und C eine Anzahl von asymmetrischen Kohlenstoffatomen und mehrere Doppelbindungen aufweisen. Eine Iosmerisierung ist insbesondere an der α,β-ungesättigten Carbonylgruppe der Thiomarinole möglich. Die Thiomarinole können daher verschiedene Stereoisomere und geometrische Isomere bilden.
Diese sind hier zwar alle durch eine einzige Molekularformel dargestellt; die vorliegende Erfindung umfaßt jedoch sowohl einzelne, isolierte Isomere als auch Gemische unter Einschluß von Razematen. Wenn stereospezifische Synthesetechniken angewandt werden oder optisch aktive Verbindungen als Ausgangsmaterialien eingesetzt werden, dann können einzelne Isomere direkt hergestellt werden; wenn andererseits ein Gemisch von Isomeren hergestellt wird, dann können die einzelnen Isomere durch herkömmliche Spaltungstechniken erhalten werden.
Da die Thiomarinole jedoch normalerweise durch Fermentation oder durch chemische Manipulation eines Fermentationsprodukts erhalten werden, besteht die Tendenz, daß sie eine optische Standardkonfiguration annehmen. Somit werden zwar andere Konfigurationen bereitgestellt; die natürliche Konfiguration ist jedoch bevorzugt.
Thiomarinol C ist durch die folgenden physikochemischen Eigenschaften gekennzeichnet:

1) Beschaffenheit und Aussehen: Gelbes Pulver.

2) Molekularformel: C&sub3;&sub0;H&sub4;&sub4;N&sub2;O&sub8;S&sub2;.

3) Molekulargewicht: 624 (bestimmt durch FAB-MS).

4) Elementaranalyse:

Berechnet für C&sub3;&sub0;H&sub4;&sub4;N&sub2;O&sub8;S&sub2; + H&sub2;O:
C: 56,05%; H: 7,21%; N: 4,36%; S: 9,97%
Gefunden: C: 56,48%; H: 7,23%; N: 4,30%; S: 9,11%

5) Infrarotabsorptionsspektrum: νmax cm&supmin;¹

Das mit Hilfe der Kaliumbromid (KBr)-Scheiben-Methode gemessene Infrarotabsorptionsspektrum ist wie folgt:
3256, 3068, 2928, 2858, 1645, 1596, 1530, 1455, 1384, 1287, 1225, 1151, 1104, 1052, 974, 820, 712.

6) Ultraviolettabsorptionsspektrum: λmax nm (&epsi;)

Das in Methanol oder Methanol + Chlorwasserstoffsäure gemessene Ultraviolettabsorptionsspektrum ist wie folgt:
388 (9600), 300 (2700), 215 (17 000).
Das in Methanol + Natriumhydroxid gemessene Ultraviolettabsorptionsspektrum ist wie folgt:
386 (8600), 205 (49 000).

7) Spezifische Drehung: [α]D²&sup5; = 1,4º (c = 1,0, Methanol).

8) Hochleistungsflüssigkeitschromatographie:

Trennsäule: Senshu-Pak ODS H-2151 (Säulendurchmesser 6 mm, Länge 150 mm, Senshu Scientific Co., Ltd.)
Lösungsmittel: 40%iges (Vol./Vol.) wäßriges Acetonitril
Fließrate: 1,5 ml/min
Verweilzeit: 11,3 Minuten.

9) ¹H-NMR-Spektrum: (δ: ppm)

Das NMR-Spektrum (360 MHz), gemessen in hexadeuteriertem Dimethylsulfoxid unter Verwendung von Tetramethylsilan als innerem Standard, ist wie folgt:
10,70 (1H, Singulett);
9,81 (1H, Singulett);
7,05 (1H, Singulett);
5,68 (1H, Singulett);
5,37 (1H, Multiplett);
5,33 (1H, Multiplett);
4,64 (1H, breites Singulett);
4,55 (1H, breites Multiplett);
4,32 (1H, Dublett, J = 4,3 Hz);
4,01 (2H, Triplett, J = 6,6 Hz);
3,67 (1H), 3,62 (1H), 3,58 (1H), 3,49 (1H), 3,35 (1H);
3,18 (1H, breites Multiplett);
2,56 (1H, breites Dublett, J = 14,2 Hz);
2,34 (2H, Triplett, J = 7,3 Hz);
2,15 (1H);
2,11 (3M, Singulett);
2,08 (1H), 2,06 (2H);
1,63 (1H, Multiplett);
1,56 (2H, Multiplett);
1,51 (2H, Multiplett);
1,30 (2H), 1,29 (2H), 1,26 (2H);
0,95 (3H, Dublett, J = 6,3 Hz);
0,91 (3H, Dublett, J = 6,9 Hz).

10) ¹³C-NMR-Spektrum: (δ: ppm)

Das NMR-Spektrum (90 MHz), gemessen in hexadeuteriertem Dimethylsulfoxid unter Verwendung von Tetramethylsilan als innerem Standard, ist wie folgt:
171,8 (Singulett), 167,9 (Singulett), 165,7 (Singulett),
157,9 (Singulett), 134,2 (Dublett), 133,9 (Singulett),
133,6 (Singulett), 127,6 (Dublett), 116,5 (Dublett),
115,3 (Singulett), 110,4 (Dublett), 74,4 (Dublett),
69,3 (Dublett), 69,2 (Dublett), 68,1 (Dublett),
64,0 (Triplett), 63,0 (Triplett), 43,1 (Dublett),
42,5 (Triplett), 42,0 (Dublett), 34,6 (Triplett),
32,1 (Triplett), 28,4 (Triplett), 28,3 (Triplett),
28,1 (Triplett), 25,2 (Triplett), 24,9 (Triplett),
20,0 (Quartett), 18,6 (Quartett), 15,7 (Quartett).

11) Löslichkeit:

Löslich in Alkoholen, wie Methanol, Ethanol, Propanol und Butanol, sowie in Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, Chloroform, Ethylacetat, Aceton und Diethylether. Unlöslich in Hexan und Wasser.

12) Dünnschichtchromatographie:

Rf-Wert: 0,66
Adsorptionsmittel: Silicagel (Merck & Co., Inc., Art. 5719)
Entwicklungslösungsmittel: Methylenchlorid : Methanol = 85 : 15 Volumenteile.
Thiomarinol B und C können durch Züchten eines Thiomarinol-produzierenden Mikroorganismus der Gattung Alteromonas und anschließende Gewinnung des gewünschten Thiomarinol B und/oder C aus dem Kulturmedium hergestellt werden. Varianten von Thiomarinol B und/oder C, die die gewünschte antibakterielle Aktivität aufweisen, können auf ähnliche Weise aus anderen Stämmen oder Spezies von Alteromonas, die die gewünschte Verbindung bilden, erhalten werden, oder sie können durch geeignete Modifikation einer Verbindung, die durch Fermentation, wie es vorstehend beschrieben wurde, erhalten wurde, erhalten werden, oder sie können direkt chemisch synthetisiert werden.
Wir bevorzugen es insbesondere, als Mikroorganismus die Spezies Alteromonas rava und ganz besonders einen kürzlich isolierten Stamm von Alteromonas rava, dem wir die Stammbezeichnung SANK 73390 gegeben haben, einzusetzen. Der Stamm SANK 73390 ist ein mariner Mikroorganismus, der aus Meerwasser, das an der Meeresküste von Koina, Minami-Izu Machi, Präfektur Shizuoka, Japan, erhalten wurde, isoliert wurde, und dieser Stamm wurde beim Deposition Institute, Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science & Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan, am 30. April 1991 unter der Zugangsnummer FERM BP-3381 gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags hinterlegt.
Die taxonomischen Charakteristika des Alteromonas rava-Stamms SANK 73390 sind nachstehend angegeben.

1. Morphologische Eigenschaften

Der Alteromonas rava-Stamm SANK 73390 wurde bei 23ºC für 24 Stunden auf "Marine Agar" (Difco) gezüchtet. Die anschließende mikroskopische Untersuchung zeigte, daß die Zellen eine stäbchenartige Form aufwiesen und jeweils einen Durchmesser von 0,8 bis 1,0 um und eine Länge von 2,0 bis 3,6 um hatten. Dieser Stamm ist gram-negativ und bewegt sich mittels einer polaren monotrikosen Geißel.

2. Wachstum auf "Marine Agar"

SANK 73390 wurde für 24 Stunden bei 23ºC auf "Marine Agar" (Difco) gezüchtet. Es wurde beobachtet, daß die resultierenden Kolonien eine blaße gräulich-gelbe Farbe aufwiesen, opak, kreisförmig, flach und vollständig waren. Wasserlösliches Pigment wurde nicht gebildet.

3. Physiologische Eigenschaften

(1) Meerwassererfordernis: SANK 73390 erfordert für das Wachstum Meerwasser.
(2) Oxidativ-fermentativer Test (Hugh-Leifson-Methode [J. Bact., 66, 24-26 (1953)] in einem Medium, das aus künstlichem Meerwasser hergestellt wurde): keine Einwirkung auf Kohlenhydrate.
(3) Oxidase: +
(4) Katalase: +
(5) Sauerstofferfordernis: aerob
(6) Reduktion von Nitrat: -
(7) Hydrolyse von Stärke: +
(8) Zersetzung von Agar: -
(9) Verflüssigung von Gelatine: +
(10) DNase-Bildung: +
(11) Lipase-Bildung: +
(12) Temperatur für das Wachstum: Schlechtes Wachstum bei 4ºC, gutes Wachstum zwischen 17ºC und 26ºC, kein Wachstum bei 35ºC.
(13) Wachstumsfaktorerfordernis: Auf dem in Journal of Bacteriology 107, 268-294 (1971) beschriebenen Basismedium erfordert SANK 73390 Vitamin-freie Casaminsäure ("Casamino Acid").
(14) Assimilation von Kohlenstoffquellen: Auf dem in Journal of Bacteriology 107, 268-294 (1971) beschriebenen Basismedium, das zusätzlich 0,1% (Gew./Vol.) Vitamin-freie Casaminsäure umfaßt, in Schüttelkultur:

Tabelle

L-Arabinose: - D-Ribose: -
D-Xylose: - D-Glucose: +
D-Galactose: - D-Fructose: -
Maltose: + Saccharose: -
Trehalose: + Cellobiose: -
Melibiose: - Mannit: -
Sorbit: - Glycerin: -
Natriumacetat: + Natriumpropionat: +

4. Chemotaxonomischer Charakter

(1) Mol-% an Guanin und Cytosin (G + C-Gehalt) der DNA: 43,4% (HPLC)

(2) Chinonsystem: Ubichinon Q-8

Unter Berücksichtigung der vorstehend angegebenen taxonomischen Charakteristika wurde der Stamm Alteromonas rava SANK 73390 mit den Stämmen verglichen, die in Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Bd. 1 (1984) beschrieben sind, sowie mit den Stämmen, die in neueren Ausgaben des International Journal of Systematic Bacteriology beschrieben sind. Wir haben festgestellt, daß der Stamm Alteromonas rava SANK 73390 bestimmte Gemeinsamkeiten mit Alteromonas citrea, einem anderen marinen Mikroorganismus, aufweist. SANK 73390 und Alteromonas citrea ATCC 29719 (ein Standard-Stamm) wurden vergleichbar gezüchtet und verglichen.
Im Vergleich mit der blassen gräulich-gelben Farbe von SANK 73390 wiesen die Kolonien von ATCC 29719 eine grünlich-gelbe Farbe auf. SANK 73390 unterschied sich von Alteromonas citrea auch im Wachstum bei 4ºC und in der Fähigkeit, Trehalose und Natriumpropionat als Kohlenstoffquellen zu nutzen. Dementsprechend ist der Stamm Alteromonas rava SANK 73390 ein neuer Stamm der neuen Spezies Alteromonas rava und unterscheidet sich in wesentlichen Merkmalen von der nächsten bekannten Spezies, die unter der Zugangsnummer ATCC 29719 hinterlegt ist.
Die vorstehend beschriebenen Eigenschaften sind typisch für SANK 73390. Es ist jedoch bekannt, daß die Eigenschaften von Alteromonas spp. sowohl auf natürliche als auch auf künstliche Weise veränderlich sind. Die vorstehend definierten Merkmale definieren den Stamm von Alteromonas rava, wie er hinterlegt wurde, sind jedoch nicht notwendigerweise typisch für andere Spezies von Alteromonas oder Stämme von Alteromonas rava, die zur Bildung von Thiomarinol oder einer natürlich auftretenden Variante imstande sind. Derartige weitere Stämme gehören zum Umfang der vorliegenden Erfindung.
Es ist darauf hinzuweisen, daß SANK 73390 oder ein beliebiger anderer Stamm, der zur Bildung von Thiomarinol oder von dessen Varianten imstande ist, subkultiviert oder biotechnologisch verändert oder modifiziert werden kann, um einen Organismus mit anderen Merkmalen herzustellen. Die einzige Anforderung an den resultierenden Organismus besteht darin, daß er zur Bildung der gewünschten Verbindung imstande ist.
Derartige Änderungen und Modifikationen können eine beliebige Form haben und sich z. B. aus Überlegungen hinsichtlich der Kulturbedingungen ergeben. Stämme können durch Kultur modifiziert und auf solche Weise selektiert werden, daß sie Eigenschaften, wie verstärktes Wachstum oder Wachstum bei niedrigeren/höheren Temperaturen, aufweisen.
Biotechnologische Modifikationen erfolgen im allgemeinen mit einer bestimmten Absicht und können selektierbare Merkmale, wie Resistenz oder Empfindlichkeit für ein bestimmtes Bakteriostatikum oder Kombinationen davon, einführen, um die Reinheit von Kulturen zu erhalten oder von Zeit zu Zeit die Reinigung von Kulturen, insbesondere Impfkulturen, zu erlauben.
Weitere Merkmale, die durch genetische Manipulation eingeführt werden können, sind beliebige Merkmale, die für Alteromonas spp. zulässig sind. Zum Beispiel können Plasmide, die Resistenzen kodieren, eingeführt werden, oder beliebige natürlich vorkommende Plasmide können entfernt werden. Vorteilhafte Plasmide umfassen die, die Auxotrophie verleihen. Plasmide können aus beliebigen geeigneten Quellen erhalten werden, oder sie können durch Isolierung eines natürlich auftretenden Alteromonas- Plasmids und Einführen eines gewünschten Gens oder gewünschter Gene aus anderen Quellen konstruiert werden. Natürliche Plasmide können auch auf beliebige andere Weise, die für günstig erachtet wird, modifiziert werden.
Um Thiomarinol B und/oder C aus einer Kultur eines geeigneten Mikroorganismus zu erhalten, sollte der Mikroorganismus in einem geeigneten Medium gezüchtet werden. Derartige Medien sind auf diesem Gebiet allgemein bekannt und werden häufig für die Herstellung von anderen Fermentationsprodukten verwendet.
Typischerweise ist es erforderlich, daß das Medium eine Kombination aus einer Kohlenstoffquelle, einer Stickstoffquelle und einem oder mehreren anorganischen Salzen, die von dem entsprechenden Mikroorganismus as similierbar sind, umfaßt. Die Minimalanforderungen an das Medium bestehen darin, daß es die Bestandteile enthält, die für das Wachstum des Mikroorganismus essentiell sind.
Geeignete Kohlenstoffquellen umfassen Glucose, Fructose, Maltose, Saccharose, Mannit, Glycerin, Dextrin, Hafermehl, Roggen, Maisstärke, Kartoffel, Maispulver, Sojabohnenpulver, Baumwollsamenöl, Sirup, Citronensäure und Weinsäure, wobei beliebige dieser Quellen allein oder in Kombination mit einer oder mehreren weiteren Quellen eingesetzt werden können. Typische Mengen liegen im Bereich von 1 bis 10% (Gew./Vol.) der Menge des Mediums, wobei die Menge jedoch nach Wunsch und entsprechend dem gewünschten Ergebnis variiert werden kann.
Geeignete Stickstoffquellen umfassen beliebige Substanzen, die z. B. ein Protein enthalten. Repräsentative Beispiele für Stickstoffquellen sind organische Stickstoffquellen aus Tieren und Pflanzen, und es kann sich um Extrakte aus natürlichen Quellen, wie Sojabohnenmehl, Kleie, Erdnußmehl, Baumwollsamenmehl, Caseinhydrolysat, Fermamin, Fischpulver, Maiseinweichflüssigkeit, Pepton, Fleischextrakt, Hefe, Hefeextrakt und Malzextrakt handeln; sowie anorganische Stickstoffquellen, wie Natriumnitrat, Ammoniumnitrat und Ammoniumsulfat. Wie bei den Kohlenstoffquellen können diese allein oder in Kombination eingesetzt werden.
Geeignete Mengen liegen typischerweise im Bereich von etwa 0,1 bis 6% (Gew./Vol.) der Menge des Mediums. Geeignete anorganische Nährstoffsalze sind die, die Spurenelemente sowie den Hauptbestandteil des Salzes bereitstellen. Vorzugsweise sollten die Salze Ionen, wie Natrium, Kalium, Ammonium, Calcium, Magnesium, Eisen, Phosphat, Sulfat, Chlorid und Carbonat, bereitstellen. Solche Spurenmetalle, wie Kobalt, Mangan und Strontium, oder Salze, die Ionen, wie Bromid-, Fluorid-, Borat- oder Silicationen, bereitstellen können, können ebenfalls vorliegen.
Es ist darauf hinzuweisen, daß Alteromonas rava natürlicherweise in Meerwasser auftritt, so daß, bei Fehlen von Anzeichen des Gegenteils, die Bedingungen für dessen Kultur idealerweise einer Meeresumgebung entsprechen. Spurenionen, die sich im Meer finden, sind also vorteilhafterweise in jedes Medium, das für die Kultur von Alteromonas verwendet wird, eingeschlossen. Insbesondere ist es bevorzugt, wenn der Mikroorganismus in Gegenwart von Meerwasser, künstlichem Meerwasser oder Komponenten, die der Zusammensetzung von Meerwasser entsprechen, gezüchtet wird.
Bei Züchten des Mikroorganismus als flüssige Kultur ist es bevorzugt, ein schaumhemmendes Mittel, wie ein Siliconöl oder ein pflanzliches Öl, oder einen anderen geeigneten oberflächenaktiven Stoff einzusetzen.
Es ist bevorzugt, wenn der pH-Wert des Kulturmediums für den Stamm Alteromonas rava SANK 73390 bei Verwendung für die Herstellung von Thiomarinol B und/oder C im Bereich von 5,0 bis 8,0 gehalten wird, wobei jedoch die einzige Anforderung darin besteht, daß der pH-Wert das Wachstum des Mikroorganismus nicht verhindern und nicht irreversibel die Qualität des Endprodukts beeinträchtigen sollte. Es mag bevorzugt sein, einen Überschuß an Säure oder Alkali zuzugeben, um die Fermentation zu beenden.
Der Stamm Alteromonas rava SANK 73390 wächst im allgemeinen bei Temperaturen im Bereich von 4ºC bis 32ºC, und er wächst gut bei 17ºC bis 26ºC. Andere Temperaturen, die nicht in diese Bereiche fallen, können anwendbar sein, wenn ein Stamm entwickelt worden ist, der bei niedrigeren oder höheren Temperaturen wachsen kann. Für die Herstellung von Thiomarinol B und/oder C liegt die bevorzugte Temperatur zwischen 20ºC und 26ºC.
Thiomarinol B und/oder C wird idealerweise durch aerobe Kultur erhalten, und beliebige aerobe Kulturtechniken, wie z. B. Festphasenkultur, Schüttelkultur und Belüftungs-Rührkultur, können angewandt werden.
Wenn die Kultur im kleinen Maßstab durchgeführt wird, dann ist im allgemeinen eine Schüttelkultur, die für mehrere Tage bei 20ºC bis 26ºC gezüchtet wird, bevorzugt.
Um eine Fermentationskultur zu beginnen, wird entsprechend einer bevorzugten Technik ein anfängliches Inokulum in einer oder in zwei Stufen, z. B. in einem Erlenmeyer-Kolben, hergestellt. Eine Kohlenstoffquelle und eine Stickstoffquelle können in Kombination für das Kulturmedium verwendet werden. Der Kolben für die Impfkultur wird in einem thermostatischen Inkubator bei 23ºC für 1 bis 3 Tage oder bis ein ausreichendes Wachstum beobachtet wird, geschüttelt. Die resultierende Impfkultur kann dann verwendet werden, um eine zweite Impfkultur oder eine Produktionskultur anzuimpfen. Wenn eine zweite Impfkultur durchgeführt wird, dann kann dies auf ähnliche Weise geschehen, und sie kann dann teilweise zum Animpfen des Produktionsmediums verwendet werden. Der Kolben, der mit der Impfkultur angeimpft wird, wird für eine geeignete Zeitspanne, z. B. 1 bis 3 Tage, oder bis eine maximale Produktion erzielt wird, bei einer geeigneten Temperatur, wie sie z. B. vorstehend beschrieben wurde, geschüttelt. Wenn die Inkubation abgeschlossen ist, wird der Inhalt des Kolbens durch Zentrifugation oder Filtration aufgefangen.
Wenn eine Kultur in großem Maßstab durchgeführt wird, dann kann eine Kultur in einem geeigneten Belüftungs-Rührfermenter bevorzugt sein. Bei diesem Verfahren wird das Nährmedium in einem Fermenter hergestellt. Nach Sterilisation bei 125ºC wird das Medium abgekühlt und mit einem Inokulum, das zuvor in einem sterilisierten Medium gezüchtet worden ist, angeimpft. Die Kultur wird bei 20ºC bis 26ºC unter Rühren und Belüftung durchgeführt. Dieses Verfahren eignet sich, um große Mengen der Verbindung zu erhalten.
Die Menge an Thiomarinol B und/oder C, die von der Kultur im Verlauf der Zeit gebildet wird, kann z. B. durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie überwacht werden. Im allgemeinen erreicht die gebildete Menge an Thiomarinol B ein Maximum nach einer Zeitspanne zwischen 19 Stunden und 200 Stunden, und die gebildete Menge an Thiomarinol C erreicht ein Maximum nach einer Zeitspanne zwischen 19 Stunden und 200 Stunden; im Gegensatz dazu erreicht die gebildete Menge an Thiomarinol ein Maximum nach einer Zeitspanne zwischen 19 Stunden und 96 Stunden.
Nach einer geeigneten Zeit der Kultur können Thiomarinol B und/oder C isoliert und durch beliebige bekannte Maßnahmen gereinigt werden. Zum Beispiel können in der Kulturbrühe verbliebenes Thiomarinol B und/oder C durch Abfiltrieren der Feststoffe, z. B. unter Verwendung von Kieselgur als Filtrationshilfe, oder durch Zentrifugation und anschließende Extraktion aus dem Überstand durch Reinigung entsprechend der physikochemischen Eigenschaften von Thiomarinol B oder C erhalten werden. Zum Beispiel können im Filtrat oder im Überstand vorliegendes Thiomarinol B und/oder C mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, wie Ethylacetat, Chloroform, Ethylenchlorid, Methylenchlorid oder beliebigen Gemischen davon, unter neutralen oder sauren Bedingungen extrahiert und gereinigt werden.
Alternativ dazu können ein Adsorbens, Aktivkohle oder ein adsorbierendes Harz, wie Amberlite (Marke) XAD-2, XAD-4 (Rohur & Haas) oder Diaion (Marke) HP-10, HP-20, CHP-20, HP-50 (Mitsubishi Kasei Corporation) eingesetzt werden. Verunreinigungen können nach Adsorption durch Durchleiten der Flüssigkeit, die Thiomarinol B und/oder C enthält, durch eine Schicht des Adsorptionsmittels entfernt werden; oder Thiomarinol B und/oder C können nach Adsorption durch Elution mit einem geeigneten Elutionsmittel, wie wäßrigem Methanol, wäßrigem Aceton oder Butanol/Wasser, gereinigt werden.
Intrazelluläres Thiomarinol B und/oder C kann durch Extraktion mit einem geeigneten Lösungsmittel, wie wäßrigem Aceton oder wäßrigem Methanol, vorzugsweise mit einer Konzentration von 50 bis 90%, bezogen auf das Volumen, anschließende Entfernung des organischen Lösungsmittels, gefolgt von Extraktion, wie es vorstehend für das Filtrat oder den Überstand beschrieben wurde, gereinigt werden.
Das resultierende Thiomarinol B und/oder C kann weiter nach bekannten Techniken gereinigt werden, z. B.: Adsorptionssäulenchromatographie unter Verwendung eines Trägers, wie Silicagel oder Magnesium-Silicagel, z. B. das Material, das unter der Marke "Florisil" vertrieben wird; Verteilungssäulenchromatographie unter Verwendung eines Adsorbens, wie Sephadex LH-20 (Marke für ein Produkt von Pharmacia); oder Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unter Verwendung einer Normalphasen- oder Umkehrphasensäule. Wie auf diesem Gebiet bekannt ist, können diese Isolierungs- und Reinigungsverfahren allein oder in einer beliebigen Kombination und gegebenenfalls wiederholt durchgeführt werden, um das gewünschte Endprodukt zu isolieren und zu reinigen.
Alternativ dazu kann Thiomarinol B durch Oxidation von Thiomarinol hergestellt werden, und dieses Verfahren wird als vorteilhaft angesehen, da Thiomarinol B nur in relativ geringen Mengen durch Fermentation erhalten wird.
Die Oxidation wird vorzugsweise durchgeführt, indem man ein Oxidationsmittel auf Thiomarinol in Gegenwart eines Lösungsmittels und in Gegenwart oder Abwesenheit einer Base einwirken läßt.
Die Beschaffenheit des verwendeten Oxidationsmittels ist für das erfindungsgemäße Verfahren nicht kritisch, und ein beliebiges Oxidationsmittel, das üblicherweise bei Oxidationsreaktionen verwendet wird, kann auch hier eingesetzt werden. Beispiele für derartige Oxidationsmittel umfassen: Kaliumpermanganat; Chromate, wie Kaliumdichromat (Kaliumbichromat), Natriumdichromat (Natriumbichromat), Chrom(VI)-oxid, Chromylchlorid und tert.-Butylchromat; Rutheniumtetroxid; Halogene, wie Chlor, Brom und Iod; Ozon; Sauerstoff; Wasserperoxid; organische Peroxide, wie Bis-(trimethylsilyl)peroxid, Cumylhydroperoxid und tert.-Butylhydroperoxid; Dioxirane, wie Dioxiran, Methyldioxiran, Dimethyldioxiran, Diethyldioxiran, Ethylmethyldioxiran, Methylpropyldioxiran, Butylmethyldioxiran, Fluordioxiran, Methylfluordioxiran, Difluordioxiran, Bis-(trifluormethyl)-dioxiran, Methyltrifluormethyldioxiran und Trifluormethylchlordifluormethyldioxiran; organische Persäuren und deren Salze, wie Peressigsäure, Perameisensäure und m-Chlorperbenzoesäure; und Peroxyschwefelsäuren und deren Salze, wie Peroxymonoschwefelsäure, Kaliumperoxydisulfat und Kaliumperoxymonosulfat (insbesondere das, das unter der Marke "Oxone", Produkt von Aldrich Chemical Co., vertrieben wird). Bevorzugte Beispiele für Oxidationsmittel umfassen Wasserstoffperoxid, organische Persäuren und deren Salze, organische Peroxide, Dioxirane sowie Perschwefelsäuren und deren Salze, und besonders bevorzugte Beispiele umfassen Wasserstoffperoxid, Dimethyldioxiran und Perschwefelsäuren und deren Salze.
Es gibt gleichfalls keine spezielle Beschränkung hinsichtlich der Beschaffenheit der bei dieser Reaktion eingesetzten Base, sofern sie keine ungünstige Wirkung auf die Reaktion oder die Reagenzien ausübt. Bevorzugte Beispiele für derartige Basen umfassen: anorganische Salze, z. B. Carbonate von Alkalimetallen (wie Natriumcarbonat, Kaliumcarbonat oder Lithiumcarbonat), Hydrogencarbonate von Alkalimetallen (wie Natriumhydrogencarbonat, Kaliumhydrogencarbonat oder Lithiumhydrogencarbonat), Hydride von Alkalimetallen (wie Lithiumhydrid, Natriumhydrid oder Kaliumhydrid), Hydroxide von Alkalimetallen (wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Bariumhydroxid oder Lithiumhydroxid) und Fluoride von Alkalimetallen (wie Natriumfluorid, Kaliumfluorid oder Cäsiumfluorid); organische Salze, z. B. Alkoxide von Alkalimetallen (wie Natriummethoxid, Natriumethoxid, Kalium-tert.-butoxid oder Lithiummethoxid), Alkalimetallalkylsulfide (wie Natriummethylsulfid oder Natriumethylsulfid); und Stickstoffverbindungen (wie Triethylamin, Tributylamin, Diisopropylethylamin, N-Methylmorpholin, Pyridin, 4-(N,N-Dimethylamino)pyridin, N,N-Dimethylanilin, N,N-Diethylanilin, 1,5-Diazabicyclo[4.3.0]non-5-en (DBN), 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octan (DABCO) und 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en (DBU). Besonders bevorzugte Beispiele umfassen Carbonate von Alkalimetallen und Hydrogencarbonate von Alkalimetallen.
Die Reaktion wird normalerweise und vorzugsweise in Gegenwart eines Lösungsmittels durchgeführt, dessen Beschaffenheit nicht kritisch ist, sofern es keine ungünstige Wirkung auf die Reaktion ausübt und die Reagenzien mindestens in einem gewissen Maß lösen kann. Beispiele für geeignete Lösungsmittel umfassen: Wasser; Alkohole, wie Methanol, Ethanol oder Propanol; Ketone, wie Aceton oder Methylethylketon; organische Säuren, wie Essigsäure oder Ameisensäure; Ester, wie Ethylacetat; Ether, wie Diethylether oder Tetrahyrofuran; Amide, wie Dimethylformamid oder Dimethylacetamid; und Gemische von zwei oder mehr dieser Lösungsmittel. Bevorzugte Beispiele umfassen Alkohole und Gemische aus Wasser und Ketonen, wobei ein besonders bevorzugtes Beispiel ein Gemisch aus Wasser und Aceton ist.
Gegebenenfalls kann die Reaktion in Gegenwart eines anorganischen Katalysators, wie Platinoxid oder Vanadinoxid, durchgeführt werden, um die Reaktion zu erleichtern, wobei die Reaktion jedoch auch ohne derartige Katalysatoren abläuft.
Die Reaktion läuft über einen weiten Bereich von Temperaturen ab, und die Wahl der genauen Reaktionstemperatur ist für die Erfindung nicht kritisch. Im allgemeinen halten wir es für zweckmäßig, die Reaktion bei einer Temperatur im Bereich von -78ºC bis 100ºC und insbesondere von -10ºC bis Raumtemperatur durchzuführen. Die für die Reaktion erforderliche Zeit variiert ebenfalls stark, und zwar abhängig von vielen Faktoren, insbesondere der Reaktionstemperatur und der Beschaffenheit der Reagenzien, speziell des eingesetzten Oxidationsmittels und der eingesetzten Base. In den meisten Fällen ist jedoch eine Zeitspanne von 15 Minuten bis 30 Stunden und insbesondere von 15 Minuten bis 2 Stunden ausreichend.
Nach Abschluß der Reaktion kann die gewünschte Verbindung aus dem Reaktionsgemisch durch herkömmliche Maßnahmen gewonnen werden. Zum Beispiel umfaßt eine geeignete Technik zum Gewinnen der Substanz: Eingießen des Reaktionsgemisches in Wasser; Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, wie einem aromatischen Kohlenwasserstoff (z. B. Benzol), einem Ether (z. B. Diethylether), einem Ester einer organischen Säure (z. B. Ethylacetat) oder einem halogenierten Kohlenwasserstoff (z. B. Methylenchlorid); und anschließendes Abdestillieren des Lösungsmittels aus dem Extrakt. Die auf diese Weise erhaltene gewünschte Verbindung kann gegebenenfalls durch herkömmliche Methoden, z. B. unter Anwendung der verschiedenen chromatographischen Techniken, insbesondere der Säulenchromatographie und der präparativen Dünnschichtchromatographie, gereinigt werden.
Thiomarinol, wobei es sich um das Ausgangsmaterial für diese Oxidationsreaktion handelt, kann durch Verwendung eines Mikroorganismus der Gattung Alteromonas, insbesondere des Stamms Alteromonas rava SANK 73390, wie es vorstehend im Zusammenhang mit der Herstellung von Thiomarinol B und C beschrieben wurde, hergestellt werden.
Da die Thiomarinole B und C eine antibakterielle Wirkung gegenüber gram-positiven und gram-negativen Bakterien und Mycoplasmen in Tieren, (z. B. Mensch, Hund, Katze und Kaninchen) zeigen, können sie für die Behandlung oder Prophylaxe von bakteriellen Infektionen oder Infektionen durch Mycoplasmen auf verschiedenen Wegen, abhängig von der Art der Infektion, verwendet werden.
Wenn die erfindungsgemäßen Verbindungen therapeutisch verwendet werden sollen, dann können sie allein oder in einer geeigneten pharmazeutischen Formulierung, die, zusätzlich zu der aktiven Verbindung, ein oder mehrere herkömmliche Verdünnungsmittel, Träger, Exzipienten oder Adjuvantien enthält, verabreicht werden. Die Beschaffenheit der Formulierung hängt selbstverständlich vom beabsichtigten Weg der Verabreichung ab. Für den oralen Weg wird die Verbindung vorzugsweise als Pulver, Körner, Tabletten, Kapseln oder Sirupe formuliert. Für die parenterale Verabreichung wird sie als eine Injektion (die intravenös, intramuskulär oder subkutan erfolgen kann), als Tropfen, Zäpfchen, Salben oder Einreibemittel formuliert.
Diese Formulierungen können durch herkömmliche Maßnahmen hergestellt werden, idem zu der aktiven Verbindung Additive, wie Träger, Bindemittel, Desintegratoren, Gleitmittel, Stabilisatoren, Korrigentien, Solubilisierungsmittel, Aromastoffe, Parfums, Suspensionsmittel oder Beschichtungsmittel, gegeben werden. Die Dosierung kann zwar von den Symptomen und dem Alter des Patienten, der Beschaffenheit und Schwere der Infektion und dem Weg und der Art der Verabreichung variieren; im Fall der oralen Verabreichung an einen erwachsenen menschlichen Patienten werden die erfindungsgemäßen Verbindungen jedoch normalerweise in einer täglichen Dosis von 20 mg bis 2000 mg verabreicht. Die Verbindungen können als einzelne Dosis oder in geteilten Dosen, z. B. 2 bis 3 mal am Tag, verabreicht werden.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen wird weiter durch die folgenden Beispiele erläutert, und die biologischen Aktivitäten dieser Verbindungen werden durch die anschließenden Testbeispiele erläutert. Beispiel 6 erläutert die Herstellung von Thiomarinol, das als Ausgangsmaterial für die oxidative Herstellung von Thiomarinol B verwendet wird.

Beispiel 1

Herstellung von Thiomarinol B durch Züchtung in einem Tank

A) Kultur

Der Stamm Alteromonas rava SANK 73390 wurde für 3 Tage bei 22ºC auf einer Schräge aus "Marine Agar" (Produkt von Difco) gezüchtet. Die resultierende Kultur wurde in 3 ml sterilisiertem künstlichem Meerwasser suspendiert. 0,1 ml der resultierenden Suspension wurden in jeden von zwei 500 ml-Erlenmeyer-Kolben mit jeweils 100 ml eines sterilisierten Mediums der folgenden Zusammensetzung überimpft:
"Marine Broth" (Difco) 37,4 g
Entionisiertes Wasser 1000 ml
pH-Wert nicht eingestellt.
Die Kultur wurde dann für 24 Stunden bei 23ºC unter Schütteln bei 210 U/min mit einem Rotationsschüttler inkubiert. Die Gesamtmenge der resultierenden Kultur wurde dann in einen belüfteten 600 l-Rührkulturtank, der 200 l eines Mediums mit der gleichen Zusammensetzung, wie sie vorstehend angegeben wurde, enthielt, das getrennt sterilisiert worden war, überimpft. Es erfolgte dann eine Kultur bei 23ºC für 26 Stunden unter Belüftung der Kultur mit einer Luftströmungsgeschwindigkeit von 0,5 vvm (d. h. "Volumen pro Volumen pro Minute": 1 vvm bedeutet, daß die Menge an zugeführter Luft in 1 Minute gleich dem Volumen der Luft im Tank ist) und Einstellung der Geschwindigkeit der Rotation im Bereich von 82,5 bis 170 U/min. um die Konzentration an gelöstem Sauerstoff bei 5,0 ppm zu halten.

B) Isolierung

Ausreichend wäßrige Chlorwasserstoffsäure wurde zu 230 l der resultierenden Kulturlösung gegeben, um deren pH-Wert auf 2,5 einzustellen. 200 l Aceton wurden dann zu dem resultierenden Gemisch gegeben, und das Gemisch wurde unter Rühren für 0,5 Stunden extrahiert. 4,0 kg Celite 545- Filterhilfe (Marke für ein Produkt von Jones Manvill Project Corporation, USA) wurden dann zu dem Gemisch gegeben, und das Gemisch wurde filtriert. Das Filtrat (430 l) wurde 1 mal mit 200 l Ethylacetat und dann 2 mal mit 100 l Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten Ethylacetatextrakte wurde mit 200 l 5%iger (Gew./Vol.) wäßriger Lösung von Natriumhydrogencarbonat und dann mit 100 l einer gesättigten wäßrigen Lösung von Natriumchlorid gewaschen. Danach wurden sie über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und dann unter verringertem Druck zur Trockene eingeengt, wobei man ungefähr 80 g eines Öls erhielt.
Die Gesamtmenge des auf diese Weise erhaltenen Öls wurde in Methylenchlorid gelöst, und die resultierende Lösung wurde in einer Säule, die mit 1,1 kg Silicagel gepackt war, das mit Methylenchlorid gesättigt worden war, adsorbiert. Die Lösung wurde dann mit einem Gemisch aus Methylenchlorid und Ethylacetat im Volumenverhältnis 1 : 1, mit Ethylacetat allein und mit einem Gemisch aus Ethylacetat und Methanol im Volumenverhältnis 9 : 1 in dieser Reihenfolge (wobei die Polarität der Elutionsmittel in dieser Reihenfolge zunimmt) eluiert. Nach Fraktionierung des Eluats in Anteile von jeweils 500 ml wurde die Fraktion, die Thiomarinol B enthielt und mit einem Gemisch aus Ethylacetat und Methanol eluiert wurde, aufgefangen und unter verringertem Druck zur Trockene eingeengt, wobei man 60 g eines Öls erhielt.
Die Gesamtmenge des resultierenden Öls wurde in 6 l 50%igem (Vol./Vol.) wäßrigem Methanol gelöst, und die resultierende Lösung wurde in einer 2,3 l-Säule, die mit Diaion HP-20 (Marke), das mit Wasser gesättigt worden war, gepackt war, adsorbiert. Danach wurde die Lösung des Öls einer stufenweisen Gradientenelution unter Verwendung von wäßrigem Methanol, wobei die Konzentration an Methanol allmählich von 30 aus 90 Vol.-% erhöht wurde, unterzogen. Genauer gesagt wurde die Säule, nachdem jeweils 4 l an 30%igem wäßrigem Methanol, 50%igem wäßrigem Methanol, 60%igem wäßrigem Methanol, 70%igem wäßrigem Methanol und 80%igem wäßrigem Methanol auf die Säule aufgebracht worden waren, mit 90%igem wäßrigem Methanol eluiert. Die Elution wurde durchgeführt, bis keine weitere Elution der Verbindung mehr beobachtet wurde, was durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie überwacht wurde. Die für die Elution verwendete Menge an 90%igem wäßrigem Methanol betrug ungefähr 10 l. Die Fraktion, die mit 90%igem wäßrigem Methanol eluiert wurde, wurde aufgefangen und unter verringertem Druck zur Trockene eingedampft, wobei man 3,8 g eines gelben Pulvers erhielt. Das gelbe Pulver wurde einer Chromatographie unter Verwendung einer Säule, die mit 320 g Sephadex LH-20, das mit einem Gemisch aus Methylenchlorid, Ethylacetat und Methanol im Volumenverhältnis 19 : 19 : 2 gesättigt worden war, gepackt war, unterzogen. Anschließend erfolgte eine Elution mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch, um eine Reinigung zu bewirken.
Das resultierende Produkt wurde weiter durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unter Verwendung einer Umkehrphasensäule [Senshu-Pak ODS H-5251 (Säulengröße: 20 mm Durchmesser, 250 mm Länge), Marke für ein Produkt von Senshu Scientific Co., Ltd.] und unter Verwendung von 40%igem (Vol./Vol.) wäßrigem Acetonitril als Elutionsmittel bei einer Fließrate von 15 ml/min gereinigt, um das Produkt zu reinigen, wobei die Reinigung durch Beobachtung der Extinktion bei 220 nm überwacht wurde. Da Thiomarinol B als ein Peak mit einer Verweilzeit von 13 bis 14 Minuten erhalten wurde, wurde diese Fraktion aufgefangen und unter verringertem Druck zur Trockene eingedampft, wobei 130 mg der Titelverbindung mit den zuvor angegebenen physikochemischen Eigenschaften erhalten wurden.

Beispiel 2

Herstellung von Thiomarinol B durch Oxidation von Thiomarinol

100,9 mg Thiomarinol (hergestellt, wie es in Beispiel 6 beschrieben wird) wurden in einem Gemisch aus 5 ml Aceton und 5 ml Wasser gelöst, und anschließend wurde die resultierende Lösung eisgekühlt. 112,2 mg OXONE (Handelsbezeichnung für ein Produkt von Aldrich Chemical Co., Inc.) wurden zu der resultierenden Lösung gegeben, und anschließend wurde das Gemisch unter Eiskühlung für 40 Minuten gerührt. Am Ende dieser Zeit wurden 1,2 ml einer gesättigten wäßrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat zu diesem Gemisch gegeben, und das Gemisch wurde erneut unter Eiskühlung für 30 Minuten gerührt. 5 ml Wasser wurden dann zu dem Reaktionsgemisch gegeben, das anschließend mit einem Gemisch aus Methylenchlorid und Tetrahydrofuran im Volumenverhältnis 10 : 1 extrahiert wurde. Der Extrakt wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel wurde dann durch Destillation unter verringertem Druck entfernt. Der resultierende Rückstand wurde anschließend isoliert und durch Umkehrphasen- Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (unter Verwendung einer Senshu Pak ODS-5251-N-Säule und von 40%igem (Vol./Vol.) wäßrigem Acetonitril als Elutionsmittel) gereinigt, wobei man 79,5 mg (Ausbeute: 75%) Thiomarinol B mit einer hellgelben Farbe und den vorstehend angegebenen physikochemischen Eigenschaften erhielt.

Beispiel 3

Herstellung von Thiomarinol B durch Oxidation von Thiomarinol

100 mg Thiomarinol (hergestellt, wie es in Beispiel 6 beschrieben wird) wurden in einem Gemisch aus 15 ml Aceton und 7,5 ml Wasser gelöst, und anschließend wurden 0,074 ml 35%iges wäßriges Wasserstoffperoxid und 2 Tropfen einer verdünnten wäßrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat zu dem Gemisch gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde für 5 Minuten gerührt. Danach wurde das Aceton durch Destillation unter verringertem Druck entfernt. Acetonitril wurde dann zu dem Rückstand gegeben, und die Bildung von Thiomarinol B wurde durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (unter Verwendung einer Senshu Pak ODS-H-2151-Säule und von 40%igem (Vol./Vol.) wäßrigem Acetonitril als Elutionsmittel) bestätigt. Das Lösungsmittel wurde aus dem Reaktionsgemisch durch Destillation unter verringertem Druck entfernt, und der resultierende Rückstand wurde in 40%igem (Vol./Vol.) wäßrigem Acetonitril gelöst. Es erfolgte dann eine Isolierung und Reinigung durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (unter Verwendung einer Senshu Pak ODS-4251-N-Säule und von 40%igem (Vol./Vol.) wäßrigem Acetonitril als Elutionsmittel), wobei man 43,2 mg (Ausbeute: 41%) Thiomarinol B mit einer hellgelben Farbe und mit den vorstehend angegebenen physikochemischen Eigenschaften erhielt.

Beispiel 4

Herstellung von Thiomarinol B durch Oxidation von Thiomarinol

100 mg Thiomarinol (hergestellt, wie es in Beispiel 6 beschrieben wird) wurden in 40 ml Aceton gelöst, und anschließend wurden 134 mg m- Chlorperbenzoesäure unter Eiskühlung und Rühren zu der resultierenden Lösung gegeben. Das Gemisch wurde dann für 1,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Am Ende dieser Zeit wurde das Reaktionsgemisch mit Methylenchlorid extrahiert, und der Extrakt wurde 3 mal mit Wasser und dann 1 mal mit gesättigter wäßriger Lösung von Natriumhydrogensulfat gewaschen. Der Extrakt wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Danach wurde das Lösungsmittel durch Destillation unter verringertem Druck entfernt. Der resultierende Rückstand wurde durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (unter Verwendung einer Senshu Pak ODS-4251-N-Säule und von 40%igem (Vol./Vol.) wäßrigem Acetonitril als Elutionsmittel) isoliert und gereinigt, wobei man 8,5 mg (Ausbeute: 8%) Thiomarinol B mit einer hellgelben Farbe und mit den vorstehend angegebenen physikochemischen Eigenschaften erhielt.

Beispiel 5

Herstellung von Thiomarinol C durch Kultivieren in einem Tank

A) Kultur

Eine Schräge aus "Marine Agar" (Difco), auf die der Stamm Alteromonas rava SANK 73390 aufgetragen worden war und auf der er gezüchtet worden war, wurde zu 10 ml sterilisierter "Marine Broth" (Difco) gegeben, um eine Bakteriensuspension herzustellen.
Ein 30 l-Fermenter, der 15 l des gleichen "Marine Broth"-Mediums enthielt, wurde durch Erhitzen sterilisiert, und anschließend wurde die Gesamtmenge der Bakteriensuspension in den Fermenter überimpft und bei einer Temperatur von 23ºC und einer Luftströmungsrate von 7,5 l/min für 24 Stunden kultiviert. Die anfängliche Rührgeschwindigkeit betrug 100 U/min. und dann wurde die Rührgeschwindigkeit entsprechend eingestellt, um die Konzentration an gelöstem Sauerstoff bei 5,0 ppm zu halten.
300 l eines Kulturmediums mit der folgenden Zusammensetzung wurden dann in jeden von zwei 600 l-Tanks gegeben:
Glucose 1,5%
Bactopeptone (Difco) 1,5%
Bacto-Hefeextrakt (Difco) 0,2%
NaCl 3,89%
MgCl&sub2;·6H&sub2;O 2,52%
Na&sub2;SO&sub4; 0,648%
CaCl&sub2;·2H&sub2;O 0,4767%
KCl 0,11%
Na&sub2;CO&sub3; 0,038%
Eisen(III)-citrat 0,02%
pH-Wert: 7,6 vor der Sterilisation
Die Tanks wurden dann durch Erhitzen sterilisiert. Danach wurden 3 l der Impfkultur in jeden der Tanks überimpft, und es erfolgte eine Kultur bei einer Temperatur von 23ºC und einer Luftströmungsrate von 150 l/min für 29 Stunden. Die Anfangsrührgeschwindigkeit betrug 82 U/min. und die Rührgeschwindigkeit wurde dann entsprechend eingestellt, um die Konzentration an gelöstem Sauerstoff bei 5,0 ppm zu halten.

B) Isolierung

Ausreichend wäßrige Chlorwasserstoffsäure wurde zu 700 l der resultierenden Kulturlösung gegeben, um deren pH-Wert auf 3 einzustellen, und dann wurden 700 l Aceton zu dem resultierenden Gemisch gegeben, und eine Extraktion wurde unter Rühren für 1 Stunde durchgeführt. Der resultierende Extrakt wurde dann 1 mal mit 700 l Ethylacetat und dann 1 mal mit 300 l Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten Ethylacetatextrakte wurde mit 300 l 5%iger (Gew./Vol.) wäßriger Lösung von Natriumhydrogencarbonat und mit 300 l einer gesättigten wäßrigen Lösung von Natriumchlorid in dieser Reihenfolge gewaschen. Danach wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde dann durch Verdampfen unter verringertem Druck entfernt. Im Verlauf des Eindampfens wurden 540 g Silicagel zugegeben, und dann wurde das Eindampfen zur Trockene fortgesetzt.
Der auf diese Weise erhaltene Rückstand wurde in Methylenchlorid suspendiert, und die resultierende Lösung wurde auf eine Säule, die mit 4 kg Silicagel, das mit Methylenchlorid gesättigt worden war, gepackt war, aufgetragen. Es erfolgte dann eine Elution mit Methylenchlorid, einem Gemisch aus Methylenchlorid und Ethylacetat im Volumenverhältnis 1 : 1, mit Ethylacetat allein und mit einem Gemisch aus Ethylacetat und Methanol im Volumenverhältnis 9 : 1 in dieser Reihenfolge; die Polarität der Elutionsmittel nimmt in dieser Reihenfolge zu. Das Eluat wurde in Anteile von jeweils 2 l fraktioniert, und die Fraktion, die Thiomarinol C enthielt und die mit dem Gemisch aus Ethylacetat und Methanol extrahiert wurde, wurde aufgefangen und unter verringertem Druck zur Trockene eingedampft. Im Verlauf des Eindampfens wurden 50 g Silicagel zugegeben, und das Eindampfen zur Trockene wurde dann fortgesetzt.
Der resultierende Rückstand wurde in einem Gemisch aus Hexan und Aceton suspendiert, und die resultierende Suspension wurde auf eine Säule, die mit 200 g Silicagel, das mit Hexan gesättigt worden war, gepackt war, aufgetragen, und es erfolgte dann eine Elution mit einem Gemisch aus Hexan und Aceton im Volumenverhältnis 1 : 1. Das Eluat wurde in Anteile von jeweils 500 ml fraktioniert, wobei man Fraktionen 1 und 2, die Thiomarinol C enthielten, erhielt. Fraktion 1 wurde durch Verdampfen unter verringertem Druck eingeengt. Im Verlauf des Einengens wurden 25 g Silicagel zugegeben, und das Eindampfen zur Trockene wurde dann fortgesetzt.
Der resultierende Rückstand wurde in einem Gemisch aus Hexan, Aceton und Ethylacetat im Volumenverhältnis 1 : 1 : 2 suspendiert, und die resultierende Suspension wurde auf eine Säule, die mit 200 g Silicagel, das mit Hexan gesättigt worden war, gepackt war, aufgetragen. Es erfolgte dann eine Elution mit einem Gemisch aus Hexan, Aceton und Ethylacetat im Volumenverhältnis 1 : 1 : 2. Das Eluat wurde in Anteile von jeweils 500 ml fraktioniert, und die Fraktion, die Thiomarinol C enthielt, wurde aufbewahrt. Diese Fraktion wurde mit der vorstehend erhaltenen Fraktion 2 vereinigt, und die vereinigten Fraktionen wurden durch Verdampfen unter verringertem Druck eingeengt. Im Verlauf des Einengens wurden 20 g Silicagel zugegeben, und das Einengen zur Trockene wurde dann fortgesetzt.
Der resultierende Rückstand wurde in einem Gemisch aus Hexan, Aceton und Ethylacetat im Volumenverhältnis 1 : 1 : 1 suspendiert, und die resultierende Suspension wurde auf eine Säule, die mit 200 g Silicagel, das mit Hexan gesättigt worden war, gepackt war, aufgetragen. Es erfolgte dann eine Elution mit einem Gemisch aus Hexan, Aceton und Ethylacetat im Volumenverhältnis 1 : 1 : 1. Das Eluat wurde in Anteile von jeweils 500 ml fraktioniert, und die Fraktionen, die Thiomarinol C enthielten, wurden aufgefangen und durch Eindampfen unter verringertem Druck eingeengt, wobei man eine ölige Substanz erhielt.
Die Gesamtmenge dieser öligen Substanz wurde weiter einer Chromatographie unter Verwendung einer 200 ml-Säule, die mit Sephadex LH-20, das mit einem Gemisch aus Methylenchlorid, Ethylacetat und Methanol im Volumenverhältnis 19 : 19 : 2 gesättigt worden war, gepackt war, unterzogen und durch Elution mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch gereinigt. Die Frak tionen, die Thiomarinol C enthielten, wurden aufgefangen und durch Verdampfen unter verringertem Druck eingeengt. Im Verlauf des Einengens wurden 25 g Silicagel zugegeben, und das Eindampfen zur Trockene wurde dann fortgesetzt.
Der resultierende Rückstand wurde in Methylenchlorid suspendiert, und die Suspension wurde auf eine Säule, die mit 250 g Silicagel, das mit Methylenchlorid gesättigt worden war, gepackt war, aufgetragen. Es erfolgte dann eine Elution mit Gemischen aus Methylenchlorid und Aceton mit Anteilen, die von 9 : 1 bis 1 : 9, bezogen auf das Volumen, variierten, so daß die Polarität des Elutionsmittels allmählich anstieg. Das Eluat wurde in Anteile von jeweils 1 l fraktioniert, und die Fraktionen, die Thiomarinol C enthielten, wurden aufgefangen und unter verringertem Druck zur Trockene eingedampft, wobei 150 mg Thiomarinol C mit den vorstehend angegebenen physikochemischen Eigenschaften isoliert wurden.

Beispiel 6

Fermentation von Thiomarinol

A) Kultur

Der Stamm Alteromonas rava SANK 73390 wurde für 3 Tage bei 22ºC auf einer Schräge von "Marine Agar" (Produkt von Difco) gezüchtet. Die resultierende Kultur wurde in 3 ml künstlichem Meerwasser suspendiert. 0,1 ml der Suspension wurden aseptisch entnommen und in einen 500 ml-Erlenmeyer- Kolben, der 100 ml sterilisiertes Medium [37,4 g "Marine Broth" (Produkt von Difco) in 1 l entionisiertem Wasser, pH-Wert nicht eingestellt] enthielt, überimpft.
Der Kolben wurde für 24 Stunden bei 23ºC unter Schütteln bei 200 U/min (Rotationsradius von 70 mm) unter Verwendung eines Rotationsschüttlers inkubiert. Nach dieser Zeit wurde jeder von vier 30 l-Fermentern, die jeweils 15 l steriles Medium, das vorstehend beschrieben wurde, enthielten, mit 15 ml Kultur, die aseptisch aus dem Erlenmeyer-Kolben entnommen wurde, angeimpft. Die Fermenter wurden für 23 Stunden bei 23ºC bei einer Belüftungsrate von 7,5 l/min unter Rühren (100 U/min) inkubiert.

B) Isolierung

Nach 23 Stunden wurde der Inhalt der Fermenter vereinigt, wobei man 60 l Kulturflüssigkeit erhielt. Der pH-Wert der Flüssigkeit wurde dann auf einen Wert von 3 durch Zugabe von Chlorwasserstoffsäure eingestellt. Danach wurden 60 l Aceton zugegeben, und das Gemisch wurde für 30 Minuten unter Rühren extrahiert. Unter Verwendung von 1,2 kg Celite 545-Filterhilfe (Marke eines Produkts, das von Johns Manville Co. erhältlich ist) wurde die Lösung filtriert. 110 l des resultierenden Filtrats wurden 1 mal mit 60 l Ethylacetat und 2 mal mit jeweils 30 l Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurde mit 30 l einer 5%igen (Gew./Vol.) wäßrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat und sodann mit 30 1 einer gesättigten wäßrigen Lösung von Natriumchlorid gewaschen. Das Gemisch wurde anschließend über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter verringerten Druck zur Trockene eingedampft, wobei man 14 g einer öligen Substanz erhielt.
Die Gesamtmenge der erhaltenen öligen Substanz wurde in Methylenchlorid gelöst, und die Lösung wurde in einer Säule, die mit 200 g Silicagel, das mit Methylenchlorid gesättigt worden war, gepackt war, adsorbiert. Die Lösung wurde dann mit einem Gemisch aus Methylenchlorid und Ethylacetat im Volumenverhältnis 1 : 1, mit Ethylacetat allein und mit einem Gemisch aus Ethylacetat und Methanol im Volumenverhältnis 9 : 1 in dieser Reihenfolge eluiert (die Polarität der Elutionsmittel steigt in dieser Reihenfolge an). Das eluierte Medium wurde in Fraktionen von 18 ml aufgefangen, und die mit einem Gemisch aus Ethylacetat und Methanol eluierten Fraktionen, die Thiomarinol enthielten, wurden aufbewahrt.
Die aufbewahrten Fraktionen wurden zur Trockene eingedampft, wobei man 7 g einer öligen Substanz erhielt, die in 400 ml 50%igem (Vol./Vol.) wäßrigem Methanol gelöst und in einer 600 ml-Säule, die mit Diaion HP-20 (Marke für ein Produkt, das von Mitsubishi Chem. Ind. erhältlich ist), das mit Wasser gesättigt worden war, gepackt war, adsorbiert. Die Säule wurde mit 50%igem (Vol./Vol.) wäßrigem Methanol gewaschen, und dann wurde die Zielsubstanz mit 90%igem (Vol./Vol.) wäßrigem Methanol eluiert. 1 g eines gelben Pulvers wurden aus der resultierenden Fraktion durch Eindampfen unter verringertem Druck erhalten. Dieses gelbe Pulver wurde weiter durch Säulenchromatographie unter Verwendung von Sephadex LH-20 eluiert und mit einem Gemisch aus Methylenchlorid, Ethylacetat und Methanol im Volumenverhältnis 19 : 19 : 2 entwickelt. 750 mg Thiomarinol wurden als gelbes Pulver aus den aktiven Fraktionen erhalten.
Das resultierende Thiomarinol wies die folgenden Eigenschaften auf:

1) Beschaffenheit und Aussehen: Gelbes Pulver.

2) Schmelzpunkt: 84-89ºC.

3) Molekularformel C&sub3;&sub0;H&sub4;&sub4;N&sub2;O&sub9;S&sub2;.

4) Molekulargewicht: 640, bestimmt durch FAB-MS ("FAB-MS" bedeutet Massenspektrometrie durch Beschuß mit hochbeschleunigten Atomen).

5) Hochauflösungs-Massenspektrometrie:

C&sub3;&sub0;H&sub4;&sub5;N&sub2;O&sub9;S&sub2; [(M+H)&spplus; nach FAB-MS]:
Berechnet: 641,2567
Gefunden: 641,2585.

6) Elementaranalyse:

Berechnet: C: 56,23%; H: 6,92%; N: 4,37%; S: 10,01%
Gefunden: C: 55,92%; H: 6,82%; N: 4,23%; S: 9,90%

7) Infrarotabsorptionsspektrum: Das Infrarotspektrum zeigte die folgenden Absorptionsmaxima (KBr-Scheiben-Methode, νmax cm&supmin;¹):

3394, 2930, 1649, 1598, 1526, 1288, 1216, 1154, 1102, 1052.

8) Ultraviolettabsorptionsspektrum:

In Methanol oder Methanol + HCl weist Thiomarinol das nachstehend angegebene Ultraviolettabsorptionsspektrum auf [angegeben als λmax nm (&epsi;)]:
387 (12 000), 300 (3 500), 214 (26 000)
In Methanol + NaOH weist es das nachstehend angegebene Ultraviolettspektrum auf [angegeben als λmax nm (&epsi;)]:
386 (9 600), 306 (3 200), 206 (25 000).

9) Spezifische Drehung: [α]D²&sup5; = +4,3º (C = 1,0, Methanol).

10) Hochleistungsflüssigkeitschromatographie:

Trennsäule: Senshu-Pak ODS H-2151 (Säulengröße: 6 · 150 mm, Produkt von Senshu Scientific Co., Ltd.)
Lösungsmittel: 40%iges (Vol./Vol.) wäßriges Acetonitril
Fließrate: 1,5 ml/min
Wellenlänge: 220-350 nm (Nachweis durch Photodiodenarray)
Verweilzeit: 5,9 min.

11) ¹H-NMR-Spektrum: (δ ppm)

Das NMR-Spektrum (270 MHz) in hexadeuteriertem Dimethylsulfoxid unter Verwendung von Tetramethylsilan als innerem Standard ist wie folgt:
0,91 (3H, Dublett, J = 6,8 Hz);
0,95 (3H, Dublett, J = 5,9 Hz);
1,30 (6H, breites Multiplett);
1,55 (5H, breites Multiplett);
2,03 (3H, Singulett);
2,09 (3H, Multiplett);
2,34 (2H, Triplett, J = 7,3 Hz);
3,33 (1H, Dublett, J = 10,7 Hz);
3,52 (2H, Multiplett);
3,64 (2H, Multiplett);
3,73 (1H, Dublett von Dubletts);
4,02 (2H, Triplett, J = 6,6 Hz);
4,18 (1H, breites Dublett, J = 7,3 Hz);
4,30 (1H, Dublett, J = 4,4 Hz);
4,44 (1H, Dublett, J = 7,8 Hz);
4,63 (1H, Dublett, J = 3,4 Hz);
4,89 (1H, Dublett, J = 7,3 Hz);
5,37 (2H, Multiplett);
5,97 (1H, breites Singulett);
7,04 (1H, Singulett);
9,80 (1H, breites Singulett);
10,68 (1H, breites Singulett).

12) ¹³C-NMR-Spektrum: (δ ppm)

Das NMR-Spektrum (68 MHz) in tetradeuteriertem Methanol unter Verwendung von Trimethylsilan als innerem Standard ist wie folgt:
174,3 (Singulett), 170,4 (Singulett), 168,6 (Singulett),
161,1 (Singulett), 137,9 (Singulett), 135,7 (Dublett),
135,1 (Singulett), 129,8 (Dublett), 116,3 (Dublett),
115,8 (Singulett), 113,7 (Dublett), 77,6 (Dublett),
74,4 (Dublett), 72,1 (Dublett), 71,8 (Dublett),
66,0 (Triplett), 65,7 (Dublett), 64,9 (Triplett),
45,3 (Dublett), 43,9 (Dublett), 36,6 (Triplett),
33,4 (Triplett), 30,1 (Triplett), 30,0 (Triplett),
29,7 (Triplett), 27,0 (Triplett), 26,7 (Triplett),
20,3 (Quartett), 16,6 (Quartett), 16,3 (Quartett).

13) Löslichkeit:

Löslich in Alkoholen, wie Methanol, Ethanol, Propanol und Butanol; und löslich in Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, Chloroform, Ethylacetat, Aceton und Diethylether. Unlöslich in Hexan und Wasser.

14) Farbreaktionen:

Positiv bei Schwefelsäure, Iod und Kaliumpermanganat.

15) Dünnschichtchromatographie:

Rf-Wert: 0,57
Adsorptionsmittel: Silicagel (Merck & Co., Inc., Art. 5715)
Entwicklungslösungsmittel: Methylenchlorid : Methanol = 85 : 15 Volumenteile.

Biologische Aktivität

Die biologische Aktivität der Thiomarinole B und C wird durch die folgenden Testbeispiele belegt, in denen sie mit Pseudomonas-Säure A und Thiomarinol verglichen werden.

Testbeispiel 1

Antibakterielle Aktivität der Thiomarinole B und C

Die minimale Hemmkonzentration (MIC) von Thiomarinol, Thiomarinol B, Thiomarinol C und Pseudomonas-Säure A (als "A", "B", "C" bzw. "P" identifiziert), angegeben in ug/ml, gegen gram-positive und gram-negative Bakterien wurde nach dem Agarmedium-Verdünnungsverfahren unter Verwendung eines Nähragarmediums (Produkt von Eiken Chemical Co., Ltd.) bestimmt.
Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 1 angegeben. Tabelle 1

Testbeispiel 2

Aktivität der Thiomarinole B und C gegen Mycoplasmen

Nach dem gleichen Verfahren wir für Testbeispiel 1 wurde die Aktivität von Thiomarinol, Thiomarinol B, Thiomarinol C und Pseudomonas-Säure A (als "A", "B", "C" bzw. "P" identifiziert) gegen verschiedene Spezies von Mycoplasmen bestimmt. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 2 angegeben. Tabelle 2
Inokulum: 0,005 ml mit 10&sup5; CFU/ml
Medium für den Assay:
Thiomarinol B, Thiomarinol C und Pseudomonas-Säure A wurden auf Chanock-Medium [hergestellt, wie es in P. N. A. S., 48, 41-49 (1962) beschrieben ist und angereichert mit 20% Pferdeserum] für alle Mikroorganismen untersucht.
Thiomarinol wurde auf den folgenden Medien untersucht:
M. bovis und M. gallisepticum: Chanock-Medium (hergestellt, wie es vorstehend beschrieben wurde)
M. hyosynoviae: Mucin-PPLO*-Agarmedium (15% Pferdeserum-angereichert)
*PPLO (PleuroPneumonia-artiger Organismus)
PPLO-Brühe ohne CV (Difco) 21 g
Bakteriologisches Mucin (Difco) 5 g
Destilliertes Wasser 800 ml
Altar Noble (Difco) 12 g
Pferdeserum 150 ml
25% frischer Hefeextrakt 50 ml
Kulturbedingungen: 37ºC, 5 Tage, leicht aerob (BBL-Gaspackmethode [Kultivierung in Einmal-CO&sub2;-Generator von Becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, MD 2103 USA])
Aus den vorstehenden Ergebnissen ist klar, daß die Thiomarinole B und C hervorragende antibakterielle Aktivitäten und Aktivitäten gegen Mycoplasmen zeigen, die mindestens so gut sind wie die von Thiomarinol und die im allgemeinen signifikant besser sind als die von Pseudomonas-Säure A.

Claims

1. Verbindung der Bezeichnung "Thiomarinol B", die durch folgende Eigenschaften gekennzeichnet ist:

1) Beschaffenheit und Aussehen: Gelbes Pulver,

2) Molekularformel: C&sub3;&sub0;H&sub4;&sub4;N&sub2;O&sub1;&sub1;S&sub2;,

3) Molekulargewicht: 672, bestimmt durch FAB-MS (FAB-MS bedeutet Massenspektrometrie durch Beschuß mit hochbeschleunigten Atomen),

4) Hochauflösungs-Massenspektrometrie:

C&sub3;&sub0;H&sub4;&sub5;N&sub2;O&sub1;&sub1;S&sub2;, (M+H)&spplus;, bestimmt durch FAB-MS

Gefunden 673,2468

Berechnet 673,2465,

5) Elementaranalyse:

berechnet für C&sub3;&sub0;H&sub4;&sub4;N&sub2;O&sub1;&sub1;S&sub2; + H&sub2;O:

C, 52,16%; H, 6,71%; N, 4,06%; S, 9,28%,

Gefunden: C, 52,34%, H, 6,79%; N, 3,92%; S, 9,02%,

6) Infrarotabsorptionsspektrum: νmax cm&supmin;¹

Das mit Hilfe der Kaliumbromid (KBr)-Scheiben-Methode gemessene Infrarotabsorptionsspektrum ist wie folgt:

3660, 3503, 3318, 3075, 2966, 2928, 2870, 1704, 1653, 1509, 1467, 1381, 1349, 1299, 1217, 1199, 1152, 1112, 1063, 1047, 1019, 975, 949, 884, 839, 764, 730, 660, 609, 553,

7) Ultraviolettabsorptionsspektrum: λmax nm (&epsi;)

das in 1-Propanol gemessene Ultraviolettabsorptionsspektrum ist wie folgt:

377 (2 900), 301 (13 000), 215 (21 000),

das in 1-Propanol + Chlorwasserstoffsäure gemessene Ultraviolettabsorptionsspektrum ist wie folgt: 377 (2 900), 301 (13 000), 223 (17 000),

das in 1-Propanol + Natriumhydroxid gemessene Ultraviolettabsorptionsspektrum ist wie folgt: 377 (2 900), 301 (13 000), 221 (19 000),

8) Spezifische Drehung: [α]D²&sup5; = +7,7º (c = 1,0, 1-Propanol),

9) Hochleistungsflüssigkeitschromatographie:

Trennsäule: Senshu-Pak ODS H-2151 (Säulendurchmesser 6 mm, Länge 150 mm, Warenzeichen für ein Produkt der Senshu Scientific Co., Ltd.),

Lösungsmittel: 40%iges (V/V) wäßriges Acetonitril,

Fließrate: 1,5 ml/Min.,

Verweilzeit: 8,4 Minuten,

10) ¹H-NMR-Spektrum: (δ ppm)

Das NMR-Spektrum (360 MHz), gemessen in hexadeuteriertem Dimethylsulfoxid unter Verwendung von Tetramethylsilan als innerer Standard ist wie folgt:

11,28 (1H, breites Singulett);

10,47 (1H, Singulett);

7,23 (1H, Singulett);

5,97 (1H, Singulett);

5,37 (2H, Multiplett);

4,88 (1H, Dublett, J = 7,5 Hz);

4,61 (1H, breites Singulett);

4,43 (1H, Dublett, J = 7,2 Hz);

4,28 (1H, Dublett, J = 3,6 Hz);

4,18 (1H, Dublett, J = 7,2 Hz);

4,02 (2H, Triplett, J = 6,6 Hz);

3,74 (1H, breites Singulett);

3,64 (1H, 3,61 (1H), 3,54 (1H), 3,51 (1H);

3,35 (1H, Dublett, J = 10,9 Hz);

2,43 (2H, Triplett, J = 7,3 Hz);

2,12 (1H), 2,09 (1H), 2,03 (1H);

2,02 (3H, Singulett);

1,61 (1H), 1,58 (2H), 1,50 (2H), 1,32 (2H), 1,30 (2H), 1,25 (2H);

0,96 (3H, Dublett, J = 6,3 Hz);

0,92 (3H, Dublett, J = 6,9 Hz),

11) ¹³C-NMR-Spektrum (δ ppm)

Das NMR-Spektrum (90 MHz), gemessen in hexadeuteriertem Dimethylsulfoxid unter Verwendung von Tetramethylsilan als innerer Standard ist wie folgt:

173,5 (Singulett), 166,1 (Singulett), 165,7 (Singulett),

160,8 (Singulett), 143,2 (Singulett), 134,2 (Dublett),

127,8 (Dublett), 123,3 (Singulett), 115,2 (Singulett),

114,4 (Dublett), 109,4 (Dublett), 76,2 (Dublett),

72,4 (Dublett), 69,6 (Dublett), 69,3 (Dublett),

64,3 (Triplett), 63,9 (Dublett), 63,0 (Triplett),

43,2 (Dublett), 42,2 (Dublett), 34,7 (Triplett),

31,9 (Triplett), 28,3 (Triplett), 28,2 (Triplett),

28,1 (Triplett), 25,3 (Triplett), 24,5 (Triplett),

20,0 (Quadruplett), 15,7 (Quadruplett), 15,6 (Quadruplett),

12) Löslichkeit:

Löslich in Alkoholen, wie Methanol, Ethanol, Propanol und Butanol, sowie in Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, Chloroform, Ethylacetat, Aceton und Diethylether. Unlöslich in Hexan und Wasser,

13) Dünnschichtchromatographie:

Rf-Wert: 0,52 Adsorptionsmittel: Silikagel (Merck & Co., Inc., Art. 5715),

Entwicklungslösungsmittel: Methylenchlorid. Methanol = 85 : 15 Volumteile.

2. Verbindung der Bezeichnung "Thiomarinol C" mit der Formel (C)

3. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 1, welches das Züchten eines Thiomarinol-produzierenden Stammes der Spezies Alteromonas rava und das Isolieren von Thiomarinol B aus dem Kulturmedium umfaßt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Mikroorganismus Alteromonas rava Stamm SANK 73390 ist, der durch die Hinterlegungsnummer FERM BP-3381 identifiziert ist.

5. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 2, welches das Züchten eines Thiomarinol-produzierenden Stammes der Spezies Alteromonas rava und das Isolieren von Thiomarinol C aus dem Kulturmedium umfaßt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Mikroorganismus Alteromonas rava Stamm SANK 73390 ist, der durch die Hinterlegungsnummer FERM BP-3381 identifiziert ist.

7. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 1, welches die Oxidation von Thiomarinol umfaßt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Oxidation unter Verwendung mindestens eines Oxidationsmittels durchgeführt wird, das ausgewählt ist unter Kaliumpermanganat, Chromatem Rutheniumtetroxid, Halogenen, Ozon, Sauerstoff, Wasserstoffperoxid, organischen Peroxiden, Dioxiranen, organischen Persäuren und deren Salzen und Peroxyschwefelsäuren und deren Salzen.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Oxidationsmittel mindestens eine unter Wasserstoffperoxid, organischen Persäuren und deren Salzen, organischen Peroxiden, Dioxiranen und Peroxyschwefelsäuren und deren Salzen ausgewählte Verbindung ist.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Oxidationsmittel mindestens eine unter Wasserstoffperoxid, Dimethyldioxiran und Peroxyschwefelsäuren und deren Salzen ausgewählte Verbindung ist.

11. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Oxidation unter Verwendung mindestens eines Oxidationsmittels durchgeführt wird, das ausgewählt ist unter Kaliumpermanganat, Kaliumdichromat, Natriumdichromat, Chrom(VI)-Oxid, Chromylchlorid, t-Butylchromat, Rutheniumtetroxid, Chlor, Brom, Iod, Ozon, Sauerstoff, Wasserstoffperoxid, Bis(trimethylsilyl)-peroxid, Cumylhydroperoxid, t-Butylhydroperoxid, Dioxiran, Methyldioxiran, Dimethyldioxiran, Diethyldioxiran, Ethylmethyldioxiran, Methylpropyldioxiran, Butylmethyldioxiran, Fluordioxiran, Methylfluordioxiran, Difluordioxiran, Bis(trifluormethyl)-dioxiran, Methyltrifluormethyldioxiran, Trifluormethylchlordifluormethyldioxiran, Peressigsäure, Perameisensäure, m-Chlorperbenzoesäure, Peroxymonoschwefelsäure, Kaliumperoxydisulfat und Kaliumperoxymonosulfat.

12. Zusammensetzung, die eine Verbindung nach Anspruch 1 und ein pharmazeutisch geeignetes Trägermaterial dafür umfaßt.

13. Zusammensetzung, die eine Verbindung nach Anspruch 2 und ein pharmazeutisch geeignetes Trägermaterial dafür umfaßt.

14. Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Prophylaxe von bakteriellen Infektionen.

15. Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 2 bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Prophylaxe von bakteriellen Infektionen.

16. Verwendung nach Anspruch 14 oder Anspruch 15, wobei das Arzneimittel zur Anwendung beim Menschen bestimmt ist.

17. Verbindung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 zur therapeutischen Verwendung.