HU211907A9 - Thiomarinol compounds - Google Patents

Thiomarinol compounds Download PDF

Info

Publication number
HU211907A9
HU211907A9 HU95P/P00570P HU9500570P HU211907A9 HU 211907 A9 HU211907 A9 HU 211907A9 HU 9500570 P HU9500570 P HU 9500570P HU 211907 A9 HU211907 A9 HU 211907A9
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
thiomarinol
doublet
singlet
triplet
methanol
Prior art date
Application number
HU95P/P00570P
Other languages
English (en)
Inventor
Shuji Takahashi
Takeshi Kagasaki
Hideyuki Shiozawa
Yuji Iwano
Koichi Hirai
Katsui Fujimoto
Akio Torikata
Akira Ishii
Kaneo Ogawa
Yoshiharu Sakaida
Kentaro Kodama
Original Assignee
Sankyo Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sankyo Co filed Critical Sankyo Co
Publication of HU211907A9 publication Critical patent/HU211907A9/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D495/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D495/02—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms in which the condensed system contains two hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D495/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D495/02—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D495/04—Ortho-condensed systems

Landscapes

  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
  • Cephalosporin Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Manufacture Of Switches (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Fats And Perfumes (AREA)
  • Control Of El Displays (AREA)
  • Superconductors And Manufacturing Methods Therefor (AREA)
  • Treating Waste Gases (AREA)
  • Crystals, And After-Treatments Of Crystals (AREA)
  • Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Description

A találmány bizonyos új tiomarinol származékokra, azok előállítására, valamint antibakteriális szerként történő alkalmazásukra és az erre szolgáló készítményekre vonatkozik.
Az 512 824 sz. európai szabadalmi leírás, melyet jelen szabadalom benyújtási dátuma előtt, de annak prioritási dátumai után hoztak nyilvánosságra, például leírja az (A) képletű tiomarinolt.
A tiomarinolt az Alteromonas genus, abból is az Alteromonas rava Sank 73390-es törzs termeli fermentációs úton. Felfedeztünk két tiomarinol származékot, melyek hasonló antibiotikus aktivitást fejtenek ki, mint maga az eredeti tiomarinol.
Az Alteromonas genus egyedei tengervízből izolálhatók, egyesekről kimutatták, hogy potenciálisan terápiás jelentőségű vegyületeket termelnek. így például a bisucaberin nevű vegyület, melyet egy Altemaria törzsből nyertek, daganatellenes hatású (Japán Kokai bejelentési szám Sho 63-27484).
A tiomarinol szerkezetét tekintve számos antibiotikumnak van hasonló szerkezete, és ezek 4 csoportra oszthatók.
Az első csoportba tartoznak a pseudomonsavak, melyeket először Pseudomonas törzsekből izoláltak. Ide sorolható a pseudomonsav A [termelő törzs Pseudomonas fluorescens, J. Chem. Soc. Perkin Trans. I. 294 (1977)], a pseudomonsav B [ibid. 318 (1977)], pseudomonsav C [ibid. 2827 (1982)] és a pseudomonsav D [ibid. 2655 (í 983)]. A pseudomonsav A ,J3actroban” néven van forgalomban (Beecham, védjegyzett név) 2%-os bőrgyógyászati kenőcs formájában, antibakteriális célra. Azonban az összes eddig ismert vegyületnek gyengébb az antibakteriális aktivitása, mint a jelenlegi találmány tiomarinol származékaié.
A vegyületek második csoportja, melyeknek hasonló a szerkezete, mint a találmány vegyületeié, olyan antibiotikumokat tartalmaz, mint a holomycin [Helv. Chim. Acta 42, 563 (1959)], pyrrothine [J. Am. Chem. Soc. 77, 2861 (1955)], thiolutin [Angew. Chem., 66, 745 (1954)], aureothricin [J. Am. Chem. Soc., 74, 6304 (1952)] stb. Ezeket az antibiotikumokat jellemző módon fonalas gombák termelik és molekulájuk kén tartalmú kromofort tartalmaz. A holomycinnel rokon vegyület még a xenorhabdin I-V, ezeket baktériumokból is izolálták (WO 84/01775).
A két csoport vegyületeivel különböző vizsgálatokat végeztek, de nincs tudomásunk arról, hogy a tiomarinolokhoz hasonló szerkezetű, vagy tulajdonságú vegyületet írtak volna le.
A vegyületek harmadik csoportját a következő Japán Kokai bejelentési számok alatt írták le, mint az 52-102 279, 54-12 375, 54-90 179, 54-103 871 és 54125 672, és olyan pseudomonsav származékokat ismertetnek, melyekben a terminális karboxil csoport helyett egy amid csoport van. Ezek a vegyületek nem fejtenek ki összemérhető antibakteriális aktivitást és nem tekinthetők széles spektrumú antibiotikumoknak, sőt, általában gyengébb az antibakteriális aktivitásuk, mint az eredeti pseudomonsavé.
A negyedik csoport tartalmaz egy tiomarinolhoz hasonló vegyületet, mely tengeri baktérium anyagcsereterméke [Abstracts of Papers from the 200 Year Conference of the Am. Chem. Soc. (August 26-31, 1990), Part 2, ORGN. No. 139], de ebben a terminális karbonil csoporthoz kapcsolódó hetero csoport egy 2-oxo-3piperidil csoport [Experientia 48,1165-1169 (1992)].
Közülük a legközelebb eső előzménynek a pseudomonsav A tekinthető, azonban az összes tiomarinol, vagyis az eredeti tiomarinol, a tiomarinol B és a tiomarinol C kifejezetten nagyobb antibakteriális aktivitást mutat, mint a pseudomonsav A.
A jelen találmány célja egyes új tiomarinol származékok előállítása.
A találmány további specifikus célja kitűnő antibakteriális és anti-mycoplasma aktivitással rendelkező vegyületek előállítása.
További célokra és előnyökre a leírás során térünk ki.
Általánosságban a jelen találmány két új tiomarinol származékra vonatkozik, egyik egy S,S-dioxo származék, melyet a továbbiakban „tiomarinol B”-nek, a másik egy dezoxi származék, melyet a továbbiakban „tiomarinol C”-nek nevezünk.
A tiomarinol B szerkezetét még nem sikerült egyértelműen meghatározni, de a tiomarinol képletéből [(A) képlet] jól látható, hogy két út áll nyitva az S-oxidációra. így a tiomarinol B-t a következő fizikai-kémiai tulajdonságokkal jellemezzük:
1. Külső megjelenési forma: sárga por.
2. Összegképlet: CjoH^NjO]^.
3. Molekulatömeg: 672 (FAJB-MS-el mérve) ,JFABMS” = Fást Atom Bombardment Mass Spectrometry.
4. Nagy felbontóképességű tömegspektrometria:
CjoH^NPuSj [(M+H)+; FAB-MS-el mérve] talált 673,2468 számított 673,2465
5. Elemanalízis:
C30H44N2O11S2 + H2O-ra számított: C, 52,16%; H,6,71%; N, 4,06%; S, 9,28% talált: C, 52,34%; H, 6,79%; N, 3,92%; S, 9,02%.
6. Infravörös abszorpciós spektrum: v,^ cm-1
Az infravörös abszorpciós spektrum kálium-bromid (KBr) pasztillában mérve a következő.
3660, 3503, 3318, 3075, 2966, 2928, 2870, 1704, 1653,1509, 1467,1381,1349, 1299, 1217,1199, 1152, 1112, 1063, 1047, 1019, 975, 949, 884, 839, 764, 730, 660, 609, 553.
7. Ultraibolya abszorpciós spektrum: nm (ε)
Az ultraibolya abszorpciós spektrum 1-propanolban mérve a következő:
377 (2900), 301 (13 000), 215 (21 000).
Az ultraibolya abszorpciós spektrum 1-propanol és sósav elegyében mérve a következő:
377 (2900), 301 (13 000), 223 (17 000).
Az ultraibolya abszorpciós spektrum 1-propanol és nátrium-hidroxid elegyében mérve a következő:
377 (2 900), 301 (13 000), 221 (19 000).
8. Fajlagos forgatóképesség:
[°1d = +7,7* (c = 1,0, 1-propanol)
9. Nagy felbontóképességű folyadékkromatográfia:
HU 211 907 A9
Elválasztásra alkalmazott oszlop: Senshu-Pak ODS H-2151 (oszlopátmérő 6 mm, hossz 150 mm, a Senshu Scientific Co„ Ltd. védjegyezett terméke). Oldószer: 40 tf.% vizes acetonitril.
Áramlási sebesség: 1,5 ml/perc.
Retenciós idő: 8,4 perc.
10. Ή-magmágneses rezonanciaspektrum: (δ: ppm)
A hexadeuterált dimetil-szulfoxidban tetrametil-szilán mint belső standard alkalmazásával mért magmágneses rezonanciaspektrum (360 MHz) a következő:
11.28 (IH, széles szingulett);
10,47 (IH, szingulett);
7,23 (IH, szingulett);
5,97 (IH, szingulett);
5,37 (2H, multiplett);
4,88 (IH, dublett, J = 7,5 Hz);
4.61 (IH, széles szingulett);
4.43 (IH, dublett, J = 7,2 Hz);
4.28 (IH, dublett, J = 3,6 Hz);
4,18 (IH, dublett, J = 7,2 Hz);
4,02 (2H, triplett, J = 6,6 Hz);
3,74 (IH, széles szingulett);
3,64 (IH), 3,61 (IH), 3,54 (IH), 3,51 (IH);
3,35 (IH, dublett, J = 10,9 Hz);
2.43 (2H, triplett, J = 7,3 Hz);
2,12 (IH), 2,09 (IH), 2,03 (IH);
2,02 ( 3H, szingulett);
1.61 (IH), 1,58 (2H), 1,50 (2H), 1,32 (2H), 1,30 (2H), 1,25 (2H);
0,96 (3H, dublett, J = 6,3 Hz);
0,92 (3H, dublett, J = 6,9 Hz).
11. 12 13C-magmágneses rezonanciaspektrum: (δ: ppm) A hexadeuterált dimetil-szulfoxidban tetrametil-szilán mint belső standard alkalmazásával mért magmágneses rezonanciaspektrum (90 MHz) a következő:
173,5 (szingulett) 166,1 (szingulett) 165,7 (szingulett)
160,8 (szingulett) 143,2 (szingulett) 134,2 (dublett)
127,8 (dublett) 123,3 (szingulett) 115,2 (szingulett)
114,4 (dublett) 109,4 (dublett) 76,2 (dublett)
72,4 (dublett) 69,6 (dublett) 69,3 (dublett)
64,3 (triplett) 63,9 (dublett) 63,0 (triplett)
43,2 (dublett) 42,2 (dublett) 34,7 (triplett)
31,9 (triplett) 28,3 (triplett) 28,2 (triplett)
28,1 (triplett) 25,3 (triplett) 24,5 (triplett)
20,0 (kvartett) 15,7 (kvartett) 15,6 (kvartett).
12. Oldékonyság
Oldódik alkoholokban, így például metanolban, etanolban, propanolban és butanolban, valamint dimetil-szulfoxidban, dimetil-formamidban, kloroformban, etil-acetátban, acetonban és dietil-éterben. Nem oldódik hexánban és vízben.
13. Vékonyréteg-kromatográfia:
Rf érték: 0,52.
Adszorbens: szilikagél (Merck & Co., Inc., Art.
5715).
Kifejlesztő oldószer: metilén-klorid:metanol 85:15 térfogatarányban.
A jelen találmány alapját képezi még egy további vegyület, a tiomarinol C, mely a (C) képlettel jellemezhető.
A találmány tárgya továbbá egy eljárás tiomarinol B vagy C előállítására, amely abban áll, hogy az Alteromonas genusba tartozó tiomarinol-termelő mikroorganizmust tenyésztjük és a tenyészetből izoláljuk a tiomarinol B-t vagy C-t.
A találmány tárgya továbbá egy eljárás tiomarinol B előállítására a tiomarinol oxidációjával.
A találmány tárgya továbbá egy gyógyszerkészítmény, mely az antibakteriális vagy anti-mycoplasma szeren kívül tartalmaz még fiziológiai szempontból elfogadható hordozót, vagy hígítószert is, és melyben az antibakteriális, vagy antimycoplasma szert egy tiomarinol B-t és C-t tartalmazó csoportból választják ki.
A találmány tárgya továbbá egy módszer bakteriális, vagy anti-mycoplasma fertőzések kezelésére, vagy megelőzésére, mely abban áll, hogy az antibakteriális, vagy anti-mycoplasma szer hatékony mennyiségével kezelik a fertőzött, vagy az ilyen fertőzésre érzékeny emlős speciest, aki lehet ember is.
Bár a tiomarinol B szerkezete nem ismert egyértelműen, feltételezik, hogy az a (B1) vagy a (B2) képlettel írható le.
Lehetséges, hogy a tiomarinol B a két vegyület közül az egyik, de az is lehet, hogy a két vegyület keveréke. Keverék esetén előírható a komponensek viszonylagos aránya, de az változhat is az előállítás módszerétől függően.
A fenti képletekből világosan kitűnik, hogy a tiomarinol B és C molekula több királis szénatomot és számos kettős kötést tartalmaz. Izomerizáció különösen a tiomarinol molekula α,β-telítetlen karbonil részén lehetséges. így a tiomarinolok különböző sztereo- és geometriai izomereket képezhetnek. Bár mindezeket itt egyetlen szerkezeti képlet képviseli, a jelen találmány vonatkozik mind az egyes izolált izomerekre, mind azok keverékére, beleértve a racemátokat is. Egyes izomerek közvetlenül előállíthatók sztereospecifikus szintézissel, vagy optikailag aktív kiindulási anyagok alkalmazásával; másrészt, amennyiben izomerek keverékét állítjuk elő, az egyes izomerek előállíthatók hagyományos rezolválási módszerekkel.
Mivel azonban normális körülmények között a tiomarinolokat fermentációval, vagy a fermentációs termék kémiai átalakításával állítják elő, ezek rendszerint egy standard optikai konfigurációt vesznek fel. így mikor más konfigurációk képződnek, a természetes konfigurációt részesítjük előnyben.
A tiomarinol C a következő fizikai-kémiai tulajdonságokkal jellemezhető:
1. Külső megjelenési forma: sárga por.
2. Összegképlet: C30H44N2OgS2.
HU 211 907 A9
3. Molekulatömeg: 624 (FAB-MS-el mérve)
4. Elemanalízis:
^-'30^44^2θ8^21' H2O-ra számított: C, 56,05%; H,7,21%; N,4,36%; S,9,97% talált: C, 56,48%; H, 7,23%; N,4,30%; S, 9,11%.
5. Infravörös abszorpciós spektrum: vmax cm'
Az infravörös abszorpciós spektrum kálium-bromid (KBr) pasztillában mérve a következő.
3256, 3068, 2928, 2858, 1645, 1596, 1530, 1455, 1384, 1287, 1225,1151, 1104, 1052, 974, 820,712.
6. Ultraibolya abszorpciós spektrum; nm (ε)
Az ultraibolya abszorpciós spektrum metanolban, vagy metanol és sósav elegyében mérve a következő: 388 (9600), 300 (2700), 215(17 000).
Az ultraibolya abszorpciós spektrum metanol és nátrium-hidroxid elegyében mérve a következő:
386 (8600), 205 (49 000).
7. Fajlagos forgatóképesség:
[ex] d = (c = 1,0, metanol)
8. Nagy felbontóképességű folyadékkromatográfia:
Elválasztásra alkalmazott oszlop: Senshu-Pak ODS
H-2151 (oszlopátmérő 6 mm, hossz 150 mm, a
Senshu Scientific Co., Ltd.).
Oldószer: 40 tf%-os vizes acetonitril.
Áramlási sebesség: 1,5 ml/perc.
Retenciós idő: 11,3 perc.
9. Ή-magmágneses rezonanciaspektrum: (δ: ppm)
A hexadeuterált dimetil-szulfoxidban tetrametilszilán mint belső standard alkalmazásával mért magmágneses rezonanciaspektrum (360 MHz) a következő;
10,70 (IH, szingulett);
9,81 (IH, szingulett);
7,05 (IH, szingulett);
5,68 (IH, szingulett);
5,37 (IH, multiplett);
5.33 (IH, multiplett);
4,64 (IH, széles szingulett);
4.55 (IH, széles multiplett;
4,32 (IH, dublett, J = 4,3 Hz);
4,01 (2H, triplett, J = 6,6 Hz);
3,67 (IH), 3,62 (IH), 3,58 (IH), 3,49 (IH), 3,35 (IH);
3,18 (IH, széles multiplett);
2.56 (IH, széles dublett, J = 14,2 Hz);
2.34 (2H, triplett, J = 7,3 Hz);
2,15 (IH);
2,11 (3H, szingulett);
2,08 (IH),
2,06 (2H);
1,63 (IH, multiplett);
1.56 (2H, multiplett);
1,51 (2H, multiplett);
1,30 (2H), 1,29 (2H), 1,26 (2H)
0,95 (3H, dublett, J = 6,3 Hz);
0,91 (3H, dublett, J = 6,9 Hz).
10. 13C-magmágneses rezonanciaspektrum; (δ: ppm)
A hexadeuterált dimetil-szulfoxidban tetrametilszilán mint belső standard alkalmazásával mért magmágneses rezonanciaspektrum (90 MHz) a következő:
171,8 (szingulett) 167,9 (szingulett) 165,7 (szingulett)
157,9 (szingulett) 134,2 (dublett) 133,9 (szingulett)
133,6 (szingulett) 127,6 (dublett) 116,5 (dublett)
115,3 (szingulett) 110,4 (dublett) 74,4 (dublett)
69,3 (dublett) 69,2 (dublett) 68,1 (dublett)
64,0 (triplett) 63,0 (triplett) 43,1 (dublett)
42,5 (triplett) 42,0 (dublett) 34,6 (triplett)
32,1 (triplett) 28,4 (triplett) 28,3 (triplett)
28,1 (triplett) 25,2 (triplett) 24,9 (triplett)
20,0 (kvartett) 18,6 (kvartett) 15,7 (kvartett).
11. Oldékonyság
Oldódik alkoholokban, így például metanolban, etanolban, propanolban és butanolban, valamint dimetil-szulfoxidban, dimetil-formamidban, kloroformban, etil-acetátban, acetonban és dietil-éterben. Nem oldódik hexánban és vízben.
12. Vékonyréteg-kromatográfia:
Rf érték: 0,66.
Adszorbens: szilikagél (Merck & Co., Inc., Art. 5719).
Kifejlesztő oldószer: metilén-klorid:metanol 85:15 térfogatarányban.
A találmány szerinti eljárás szerint a tiomarinol B-t és C-t egy Alteromonas genusba tartozó, tiomarinolt termelő mikroorganizmus tenyésztésével és a képződő tiomarinol B és/vagy C tenyészléből történő elkülönítésével állítjuk elő. A tiomarinol B és/vagy C azon variánsait, melyek antibakteriális aktivitása megfelel az elvárásoknak, hasonló módon állíthatjuk elő más Alteromonas törzsekből, melyek termelik a kívánt anyagot, vagy előállíthatjuk még a fent leírt fermentációval nyert anyag megfelelő módosításával, vagy közvetlenül szintetizálhatjuk kémiai úton.
A találmány szerinti eljárás egy előnyös kivitelezési módja szerint mikroorganizmusként egy Alteromonas rava speciest, mégpedig előnyösen egy újabban izolált Alteromonas rava törzset használunk, melyet SANK 73 390-nek nevezünk el. A SANK 73 390 egy tengeri mikroorganizmus, melyet Japánban, Shizuoka Prefekturában, Koina, Minami-Izu Machi tengerpartján gyűjtött tengervízből izoláltunk. A törzset a Budapesti Szerződés feltételei szerint, FERM BP-3381 (letéti) szám alatt, 1991. április 30-án letétbe helyeztük a „Deposition Institute, Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan” -bán.
Az Alteromonas rava Sank 73 390 törzs taxonómiai jellemzése:
1. Morfológiai tulajdonságok
Az Alteromonas rava SANK 73 390 törzset 23 ’Con 24 óra hosszat tenyésztettük Maríné Agar-on (Difco). A mikroszkópos vizsgálat során a sejtek pálcika alakúak voltak, átmérőjük 0,8-1,0 pm és hosszuk 2,0-3,6 pm közé esett. A törzs gramnegatív és egy poláris, egycsillós flagellum segítségével mozog.
HU 211 907 A9
2. Növekedés Maríné Agar-on
SANK 73 390-et 23 ’C-on, 24 óra hosszat tenyésztettük Maríné Agar-on (Difco). A kapott telepek halvány szürkés sárga színűek, mattok, kerekek, laposak és épek. Nem termeltek vízben oldódó pigmentet.
3. Fiziológiai tulajdonságok (1) Tengervíz igény: A Sank 73 390 növekedéséhez tengervízre van szükség.
(2) Oxidatív fermentációs teszt (Hugh-Leifson módszer [J. Bsct., 66, 24-26 (1953)] mesterséges tengervízzel készített táptalajon]: szénhidrátra gyakorolt hatás nincs.
(3) Oxidáz: +.
(4) Kataláz: +.
(5) Oxigén-igény: aerob.
(6) Nitrát redukció: +.
(7) Keményítő hidrolízis: +.
(8) Agar lebontás: (9) Zselatin szolubilizálás: +.
(10) DNáz termelés: +.
(11) Lipáz termelés: +.
(12) Növekedési hőmérséklet: a növekedés gyenge 4 ’C-on, jó 17 ’C és 26 ’C között és nincs növekedés 35 ’C-on.
(13) Növekedési faktor igény: a Journal of Bacteriology 107, 268-294 (1971)-ben leírt alaptáptalajban a SANK 73 390 vitamin-mentes Casamino Acid-ot igényel.
(14) Szénforrás asszimiláció az alaptáptalajban [Journal of Bacteriology 107, 268-294 (1971)], mely kiegészítésként 0,1% (tömeg/térfogat) vitamin-mentes Casamino Acid-ot tartalmaz, rázott tenyészetben:
Táblázat
L-Arabinóz - D-Ribóz -
D-Xilóz - D-Glükóz +
D-Galaktóz - D-Fruktóz -
Maltóz + Szacharóz -
Trehalóz + Cellobióz -
Melibióz - Mannit -
Szorbit - Glicerin -
Nátrium-acetát + Nátrium-pro- pionát +
4. Kemotaxonómiai jellemzés (1) DNS guanin és citozin mol% (G + C tartalom) tartalma: 43,4% (HPLC módszer).
(2) Kínon rendszer: Ubiquinone Q-8.
A fenti taxonómiai jellegzetességeket, az Altemaria rava SANK 73 390 törzset összehasonlították a Bergey’s Manual of Systemic Bacteriology, Vol. 1 (1984)-ben valamint az International Journal of Systematic Bacteriology legújabb számaiban leírt törzsekkel. Úgy találtuk, hogy az Alteromonas rava SANK 73 390 törzs bizonyos hasonlóságot mutat az Alteromonas citrea-va.\, egy másik tengeri mikroorganizmussal. A SANK 73 390-et és az Alteromonas cit reá ATCC 29 719-et (standard törzs) összehasonlítva tenyésztettük, és értékeltük.
A SANK 73 390 telepek halvány szürkés sárga színével összehasonlítva az ATCC 29 719 telepei zöldes sárgák voltak. Különbözött még a SANK 73 390 az Alteromonas citrea-fd/ a 4 °C-on megfigyelt növekedésben valamint a trehalóz és nátrium propionát szénforrásként való hasznosításában. Ennek értelmében az Alteromonas rava SANK 73 390 törzs az új Alteromonas rava species egy új törzse, és alapvetően különbözik az ATCC 29 719 számon letétbe helyezett legközelebbi ismert speciestől.
A fenti tulajdonságok jellemzőek a SANK 73 390re. Ismeretes azonban, hogy az Alteromonas speciesek tulajdonságai változnak, mind természetes, mind mesterséges behatásra. A fent felsorolt tulajdonságok jellemzőek ugyan a letétbe helyezett Alteromonas rava törzsre, de nem szükségszerűen jellemzőek más tiomarinol termelő Alteromonas speciesekre, vagy Alteromonas rava törzsekre, vagy bármely természetesen előforduló variánsukra. A találmány oltalmi köre kiterjed ezen többi törzsre is.
Elfogadjuk, hogy a SANK 73 390, vagy bármely tiomarinol termelő törzs, azok bármely variánsa tenyésztés, vagy biotechnológiai átalakítás útján megváltoztatható, vagy módosítható úgy, hogy egy megváltozott tulajdonságú organizmus képződik. Az egyetlen feltétel, hogy az előállított új organizmus képes legyen a kívánt vegyület termelésére.
A változtatások és módosítások kívánság szerint elvégezhetők, például előidézhetők a tenyésztési körülmények módosításával is. A jobb növekedés, vagy alacsonyabb/magasabb hőfokon való növekedés biztosítására tenyésztéssel és azt követő szelektálással is módosítani lehet a törzseket.
A biotechnológiai módosítások általában célzottak és olyan szelektálható tulajdonságok beépítését szolgálják, mint a bakteriostatikus rezisztencia, vagy érzékenység, ill. ezek kombinációja, annak érdekében, hogy biztosítsuk a tenyészetek tisztaságát, vagy lehetővé tegyük a tenyészetek, különösen az oltó-tenyészetek időről-időre történő tisztítását.
Genetikai manipulációval bármely Alteromonas speciesek szempontjából megengedett tulajdonságot bevihetünk. Például beépíthetünk rezisztenciát kódoló plazmidot, ill. eltávolíthatunk bármely természetesen előforduló plazmidot. Az előnyös plazmidok közé tartoznak azok, melyek auxotrófiát visznek be. A plazmidok bármely forrásból nyerhetők, vagy pl. génsebészeti úton izolálhatók természetes előfordulású Alteromonas-ból, majd ebbe építhető be a kívánt gén, vagy a más forrásból származó gén. A természetes géneket bármely más módon is módosíthatjuk, kívánság szerint.
A tiomarinol B és/vagy C megfelelő mikroorganizmus tenyészetéből történő előállításához a mikroorganizmusokat megfelelő táptalajon kell fermentálni. Ezek a táptalajok általában jól ismertek a szakmában és gyakran használatosak egyéb fermentációs termékek termelésére.
Egy ilyen tipikus táptalaj tartalmazhat bármely szénforrás kombinációt, nitrogén forrást, valamint egy vagy több szervetlen sót, amit a szóban forgó mikroor5
HU 211 907 A9 ganizmus hasznosítani tud. A táptalajjal szemben az a minimális igény, hogy tartalmazza mindazokat a komponenseket, melyek elengedhetetlenek a mikroorganizmus növekedéséhez.
Megfelelő szénforrás lehet a glükóz, fruktóz, maltóz, szacharóz, mannit, glicerin, dextrin, zabliszt, rozs, kukorica-keményítő, burgonya, kukoricaliszt, szójaliszt, gyapotmag-olaj, szirup, citromsav és borkősav. Ezek mindegyike alkalmazható egyedül, vagy tetszőleges kombinációban egy, vagy több komponenssel. A tipikus mennyiség a táptalaj 1-10% (tömeg/térfogat)-a, de ez kívánság szerint változtatható az elvárt eredménytől függően.
Megfelelő nitrogénforrás lehet bármely anyag, mely például fehérjét tartalmaz. Epikus nitrogénforrások lehetnek növényi és állati eredetű szerves nitrogénforrások, vagy olyan természetes források extraktumai, mint a szójaliszt, korpa, földimogyoróliszt, gyapotmagliszt, kazeinhidrolizátum, fermamin, halliszt, kukoricalekvár, pepton, húskivonat, élesztő, élesztőkivonat, malátakivonat, és olyan szervetlen nitrogén források, mint a nátrium-nitrát, ammónium-nitrát és az ammónium-szulfát. A szénforrásokhoz hasonlóan ezek egyedül és kombinációban is alkalmazhatók. A tipikus mennyiség a táptalaj 0,1-6% (tömeg/térfogat )-a.
A táptalaj megfelelő szervetlen sói tartalmazzák mind a fő só-alkotóelemeket, mind pedig a nyomelemeket, előnyösen nátrium, kálium, ammónium, kalcium, magnézium, vas, foszfát, szulfát, klorid és karbonát ionokat, és olyan nyomelemeket, mint a kobalt, magnézium és stroncium, vagy olyan sókat, melyek bromid, fluorid vagy szilikát iont biztosítanak.
Ismeretes, hogy az Alteromonas rava természetes előfordulása a tengervíz, így ha azt más nem indokolja, az az optimális, ha a tenyésztési körülmények tengeri környezetnek felelnek meg. Ezért előnyös, ha az Alteromonas tenyésztésre alkalmazott táptalaj tartalmazza azokat a nyomelemeket, melyek a tengerben találhatók. így az eljárás előnyös kivitelezési módja szerint a mikroorganizmust tengervíz, mesterséges tengervíz, vagy a tengervíznek megfelelő komponensek jelenlétében tenyésztjük.
Ha a mikroorganizmust folyadékkultúrában tenyésztjük, célszerű habzásgátlót, így szilikonolajat vagy növényi olajat, vagy egyéb megfelelő felületaktív anyagot alkalmazni.
Az eljárás egyik előnyös kivitelezési módja szerint az Alteromonas rava SANK 73 390 törzs táptalajának pH-ját az 5,0 és 8,0 közötti tartományban tartjuk a tiomarinol B és/vagy C termelés során, bár egyedül azt írjuk elő, hogy a pH nem gátolhatja a mikroorganizmus növekedését és nem hathat irreverzíbilis módon előnytelenül a végtermékre. A fermentáció leállítására előnyös módon sav, vagy lúg feleslegét adjuk a fermentációhoz.
Az Alteromonas rava SANK 73 390 törzs általánosságban 4 ‘C és 32 °C között növekszik és jól növekszik 17 ’C és 26 ’C között. Más hőfokot is alkalmazhatunk, mely nincs ebben a tartományban, ha a kifejlesztett törzs növekedni tud alacsonyabb, vagy magasabb hőmérsékleten. A tiomarinol B és/vagy C termelésre a 20 ’C és 26 ’C közötti hőfok az előnyös.
A tiomarinol B és/vagy C-t előnyösen aerob tenyészetben állítjuk elő, erre a célra alkalmas bármely aerob technika, így szilárd fázisú, rázott vagy levegőztetett-kevert fermentáció.
A kis méretű tenyésztésre általában a több napon keresztül, 20-26 ‘C-on végzett rázott tenyésztés alkalmas.
A találmány szerinti eljárás egyik előnyös kivitelezési módja szerint az indító inokulumot egy vagy két lépésben, Erlenmeyer lombikban állítjuk elő, táptalajként szénforrás és nitrogén forrás kombinációjának alkalmazásával. Az oltólombikot termosztátban rázatjuk 23 ’Con, 1-3 napig, míg kielégítő növekedést nem tapasztalunk. Az így nyert oltótenyészet vagy egy második oltótenyészet vagy egy termelő tenyészet beoltására használható fel. A második oltótenyészet készítésénél hasonló módon járunk el, és azt részben a termelő táptalaj beoltására használjuk fel. A lombikot, amelyet beoltottunk az oltóanyaggal, megfelelő ideig, pl. 1-3 napig, a maximális termelés eléréséig rázatjuk megfelelő hőfokon, pl. a fentiek szerint. Az inkubálás befejezése után a lombik tartalmát lecentrifugáljuk, vagy szüljük.
Nagy léptékben végzett tenyésztést célszerű megfelelő levegőztetett-kevert fermentorban végezni. Ebben az eljárásban a táptalajt a fermentorban készítjük el. A 125 ’C-on végzett sterilezés után a táptalajt lehűtjük és beoltjuk az inokulummal, amelyet előzőleg steril táptalajon növesztettünk. A tenyésztést kevertetés és levegőztetés mellett, 20-26 ’C-on végezzük. Az eljárás alkalmas nagymennyiségű hatóanyag előállítására.
A tenyészetben a tiomarinol B és/vagy C termelés időbeli lefutását pl. nagy felbontóképességű folyadékkromatográfiával lehet nyomon követni. Általában mind a tiomarinol B, mind a tiomarinol C termelés 19-200 órás fermentálás után ér el maximumot, mig a tiomarinol termelés 19-96 óra után.
Megfelelő tenyésztési idő eltelte után a tiomarinol B és/vagy C bármely ismert módszered izolálható és tisztítható. így például izolálhatjuk a tiomarinol B-t és/vagy C-t olyan módon is, hogy szűrési segédanyagként diatomitot alkalmazva kiszűrjük a fermentléből a szilárd összetevőket vagy lecentrifugáljuk azokat, majd a felülúszót a tiomarinol B vagy C fizikai-kémiai tulajdonságait kiaknázva extraháljuk. így például a szűrletben, vagy felülúszóban levő tiomarionol B és/vagy C extrahálható olyan vízzel nem elegyedő oldószerrel mint az etil-acetát, kloroform, etilén-klorid, metilénklorid, vagy azok keveréke, mind semleges, mind savas körülmények között, ezt követően pedig tisztítható.
Az eljárás egyik előnyös kivitelezési módja szerint adszorbensként aktív szenet, vagy adszorpciós gyantát, pl. Amberlite (védjegyzett név) XAD-2-öt, XAD-4-et (Rohm & Haas) vagy Diaion (védjegyzett név) HP-10et, ΗΡ-20-at, CHP-20-at, ΗΡ-50-et (Mitsubishi Kaséi Corporation) alkalmazhatunk. A szennyeződéseket eltávolíthatjuk adszorpcióval, úgy, hogy a tiomarinol B-t és/vagy C-t tartalmazó oldatot átengedjük az adszorbens rétegen, vagy úgy, hogy a tiomarinol B-t és/vagy C-t megkötjük az adszorbensen, majd eluáljuk egy
HU 211 907 A9 megfelelő oldószerrel, így vizes metanollal, vizes acetonnal, vagy butanol/vízzel.
Az intracelluláris tionarinol B-t és/vagy C-t oldószeres extrakcióval tisztíthatjuk olyan alkalmas oldószerrel, mint a vizes aceton, vagy a vizes metanol, előnyösen 50-90% (térf.) koncentrációban, ezt követően eltávolítjuk az oldószert, majd ismét extrahálunk a szüredéknél, ill. feliilúszónál leírt eljárással.
Az így nyert tiomarinol B-t, és/vagy C-t ismert módon tisztíthatjuk tovább, pl.: adszorpciós kromatográfiával, olyan adszorbens alkalmazásával, mint a szilikagél, vagy magnézium-szilikagél, pl. amelyet a kereskedelemben „Florosil” néven hoznak forgalomba; megoszlási kromatográfiával, olyan adszorbens alkalmazásával, mint a Sephadex LH-20 (Pharmacia védjegyzett terméke); vagy nagy felbontóképességű folyadékkromatográfiával, normál fázisú, vagy fordított fázisú oszlopon. A technikában ismert módon ezeket az izolálási és tisztítási elárásokat alkalmazhatjuk akár egyedül, akár tetszés szerinti kombinációban, szükség szerint akár ismételten is, a kívánt végtermék izolálására és tisztítására.
A találmány szerinti eljárás egy további kivitelezési módja szerint a tiomarinol B-t előállíthatjuk még a tiomarinol oxidációjával is. Ez az eljárás azért előnyös, mivel a tiomarinol B a fermentáció során csak viszonylag kis mennyiségben keletkezik.
Az oxidáció során a tiomarinolt előnyösen egy oxidálószerrel reagáltatjuk valamilyen oldószerben, egy bázis jelenlétében, vagy távollétében.
Az oxidálószer jellege nem alapvető a találmány szerinti eljárás szempontjából, bármely általánosan használt oxidálószer alkalmazható a jelen eljárásban is. Ilyenek például a kálium-permanganát, kromátok, mint a kálium-dikromát (kálium-bikromát), nátrium-dikromát (nátriumbikromát), krómoxid (VI), króm-klorid és t-butil-kromát; ruténium-tetroxid; halogének, mint a klór, bróm és jód; ózon; oxigén; hidrogén-peroxid; szerves peroxidok, mint a bisz(tetrametil-szilil)-peroxid, kumil-hidroperoxid és t-butil-hidroperoxid; dioxiránok, mint a dioxirán, metil-dioxirán, dimetil-dioxirán, dietil-dioxirán, etil-metil-dioxirán, metil-propildioxirán, butil-metil-dioxirán, fluor-dioxirán, metil-fluor-dioxirán, difluor-dioxirán, bisz(trifluór-metil)-dioxiránok, metil-(trifluor-metil)-dioxirán és (trifluor-metil)-(klór-difluor-metil)-dioxirán; szerves persavak és sóik, mint a perecetsav, pertiangyasav, és m-klór-perbenzoesav; és peroxi-kénsavak, valamint sóik, mint a peroxi-monokénsav, kálium-peroxi-diszulfát és kálium-peroxi-monoszulfát (különös tekintettel az Aldrich Chemical Co. „Oxone” elnevezésű kereskedelmi termékére). Előnyös oxidálószer a hidrogén-peroxid, szerves persavak, valamint sóik, szerves peroxidok, dioxiránok és peroxi-kénsavak, valamint sóik és különösen előnyös a hidrogén-peroxid, a dimetil-dioxirán és a peroxi-kénsav, valamint sói.
Hasonló módon nincs különösebb korlátozás a reakcióban alkalmazott bázis típusa tekintetében, feltéve, hogy nincs káros hatással a reakcióra, vagy a reagensekre. Alkalmazható bázisok például szervetlen sók, mint pl. alkálifém-karbonátok (nátrium-karbonát, kálium-karbonát vagy lítium-karbonát), alkálifém-hidrogén-karbonátok (nátrium-hidrogén-karbonát, káliumhidrogén-karbonát vagy lítium-hidrogén-karbonát), alkálifém-hidridek (lítium-hidrid, nátrium-hidrid, vagy kálium-hidrid), alkálifém-hidroxidok (nátrium-hidroxid, kálium-hidroxid, bárium-hidroxid vagy lítium-hidroxid) és alkálifém-fluoridok (nátrium-fluorid, káliumfluorid vagy cézium-fluorid), szerves sók, pl. alkálifém-alkoxidok (nátrium-metoxid, nátrium-etoxid, kálium-t-butoxid vagy lítium-metoxid), alkálifém-alkilszulfidok (nátrium-metil-szulfid cagy nátrium-etilszulfid); és nitrogén vegyületek (trietil-amin, tributilamin, diizopropil-etil-amin, N-metil-morfolin, piridin,
4-(N,N-dimetil-amino)-piridin, N,N-dimetil-anilin, Ν,Ν-dietil-anilin, 1,5-diazabiciklo[4.3.0]non-5-én (DBN), 1,4-diazabiciklo[2.2.2]oktán (DABO) és 1,8diazabiciklo[5.4.0]undec-7-én (DBU). Különösen előnyös alkálifém-karbonátok és alkálifém-hidrogén-karbonátok alkalmazása.
A reakciót normál körülmények között célszerű oldószerben végrehajtani. Az oldószer típusának nincs jelentősége, feltéve, hogy nem befolyásolja kedvezőtlenül a reakciót és legalább bizonyos mértékig oldja a reagenseket. Ilyen alkalmas oldószer a víz; alkoholok, mint a metanol, etanol, vagy propanol; ketonok, mint az aceton vagy metil-etil-keton; szerves savak, mint az ecetsav és hangyasav; észterek, mint az etil-acetát; éterek, mint a dietil-éter, vagy a tetrahidrofurán; amidok, mint a dimetilformamid vagy dimetil-acetamid; ill. egy vagy több ilyen oldószer keveréke. Különösen alkalmas oldószerek az alkoholok, valamint víz és ketonok keverékei, különlegesen előnyös a víz-aceton keverék.
Kívánság szerint a reakció felgyorsítása érdekében azt valamilyen szervetlen katalizátor jelenlétében hajtjuk végre, mint a platina-oxid, vagy vanádium-oxid, bár a reakció katalizátor nélkül is végbemegy.
A reakció széles hőmérséklet tartományban végbemegy, így a reakció kiválasztott pontos hőfoka nem alapvető a találmány szempontjából. Általában úgy találtuk, hogy legalkalmasabb, ha a reakciót -78 ‘C és 100 ’C között, célszerűen -10 C és szobahőfok között végezzük. Hasonló módon a reakcióidő is széles határok között változhat számos tényező függvényében, mint pl. a reakció hőfoka, vagy a reagensek típusa, különös tekintettel az alkalmazott oxidálószerre és a bázisra. Legtöbb esetben azonban a 15 perctől 30 óráig, célszerűen 15 perctől 2 óráig tartó reakcióidő elegendő.
A reakció befejezése után a kívánt terméket hagyományos módszerekkel nyerjük ki a reakciókeverékből. Egyik erre alkalmas módszer szerint a reakciókeveréket vízbe öntjük, valamely vízzel nem elegyedő oldószerrel extraháljuk, mint pl. egy aromás szénhidrogén (pl. benzol), éter (pl. dietil-éter), észter (pl. etil-acetát) vagy halogénezett szénhidrogén (pl. metilén-klorid), majd ledesztilláljuk az oldószert az extraktumról. A kapott terméket kívánság szerint tovább tisztítjuk hagyományos módszerekkel, pl. különböző kromatográ7
HU 211 907 A9 fiás eljárásokkal, így oszlopkromatográfiával vagy preparatív vékonyréteg-kromatográfiával.
A tiomarinolt, az oxidációs reakció kiindulási anyagát fermentációval állítjuk elő, melyhez egy Alteromonas genusba tartozó mikroorganizmust, célszerűen Alteromonas rava SANK 73 390-et használunk, amint azt a tiomarinol B és C előállításánál már leírtuk.
A tiomarinol B és C grampozitív és gramnegatív baktériumokkal és mycoplasmával szemben fejt ki antibakteriális hatást állatokban (például: kutya, macska és nyúl) és emberben alkalmazhatók bakteriális, vagy mycoplasma fertőzések kezelésére, vagy megelőzésére, a fertőzés jellegétől függően különböző adagolási formában.
Terápiás célra a vegyületek adagolhatók egyedül, vagy megfelelő gyógyszerkészítmény formájában, mely a hatóanyagon kívül egy vagy több hagyományos hígítószert, hordozót, excipienst vagy adalékot tartalmaz. A formuláció jellege természetesen a tervezett adagolási forma függvénye. Perorális adagoláshoz a vegyületet célszerű por, granulátum, tabletta, kapszula vagy szirup formájában kiszerelni. A parenterális adagoláshoz az injekció (mely lehet intravénás, intramuszkuláris, vagy szubkután), csepp, kúp, kenőcs és híg kenőcs (linimentum) a célszerű kiszerelési forma.
Ezeket a formulációkat ismert módszerekkel állíthatjuk elő a hatóanyaghoz olyan adalékokat adva, mint vehikulumok, kötőanyagok, szétesést előmozdító anyagok, kenőanyagok, stabilizáló szerek, szolubilizálók, illatanyagok, parfümök, szuszpendáló szerek és bevonatok. Noha az adagolás a beteg szimptómáinak és korának, a fertőzés jellegének és súlyosságának, valamint a beadás útjának függvénye, perorális adagolás mellett, felnőtt ember esetében a normál napi adag 20 mg és 2000 mg között változhat. Az anyagok adhatók egyetlen dózisban, vagy osztott dózisban pl. 2-3szor naponta.
A találmány szerinti eljárást nem korlátozó jelleggel az alábbi példákkal szemléltetjük. A biológiai aktivitásokat a következő Teszt Példák mutatják be. A 6. példa írja le tiomarinol előállítását, melyet kiindulási anyagként használunk a tiomarinol B oxidációs úton történő előállításánál.
1. példa
A tiomarinol B előállítása fermentorban végzett tenyésztéssel
A) Tenyésztés
Az Alteromonas rava SANK 73 390 törzset 3 napig 22 °C-on tenyésztettük ferde Maríné Agar-on (Difco termék). Az így nyert tenyészetet felszuszpendáltuk 3 ml mesterséges tengervízben. A kapott szuszpenzió 0,1 ml-ével beoltottunk két 500 ml-es Erlenmeyer lombikot, melyekbe előzőleg 100-100 ml sterilizált táptalajt tettünk a következő összetételben:
Maríné Broth (Difco) 37,4 g
Ionmentes víz 1000 ml (pH állítás nem történt).
Ezt követően a tenyészetet 24 óra hosszat inkubáltuk rotációs rázóasztalon (210 fordulat/perc) 23 ”C-on, majd ezzel a tenyészettel oltottuk be a 600 literes levegőztetett, kevert fermentorban levő 200 liter táptalajt, melynek ugyancsak fenti összetétele volt, és amelyet külön sterilizáltunk. A fermentorban a tenyésztést 26 órán keresztül folytattuk 23 C-on, 0,5 ttp levegőáramban („térfogat per térfogat per perc”: 1 ttp a percenként befújt levegőmennyiség, mely egyenlő a fermentorban levő levegő térfogatával), 82,5-170 fordulat/perc keverési sebesség mellett, 5,0 ppm oldott oxigén koncentráció biztosítása érdekében.
B) Izolálás
A 230 liter fermentléhez annyi vizes sósavat öntöttünk, hogy pH-ja 2,5-re álljon be. A kapott keverékhez ezután 200 liter acetont adtunk és az extrakciót 0,5 órás keverés mellett folytattuk, majd 4,0 kg Celite 545 szűrési segédanyagot (Jones Manvill Project Corporation, U. S. A. védjegyzett terméke) adtunk a keverékhez és leszűrtük. A szüredéket (430 liter) egyszer 200 liter etil-acetáttal, majd kétszer 100 liter etil-acetáttal extraháltuk. Az egyesített etil-acetátos extraktumokat 200 liter 5% (tömeg/térfogat)-os vizes nátrium-hidrogénkarbonát oldattal, majd 100 liter telített, vizes nátriumklorid oldattal mostuk, vízmentes nátrium-szulfáton szárítottuk, és ezt követően csökkentett nyomáson szárazra pároltuk. Kitermelés: kb. 80 g olaj.
A kapott olaj teljes mennyiségét feloldottuk metilén-kloridban és az oldatot egy 1,1 kg szilika-gélből készített oszlopon adszorbeáltattuk, melyet előzőleg metilén-kloriddal telítettünk. Az oszlopot először metilén-klorid és etil-acetát 1:1 térfogatarányú keverékével, ezt követően egyedül etil-acetáttal, végül etil-acetát:metanol = 9:1 térfogatarányú keverékével eluáltuk, 500 ml-es frakciókat szedve. A tiomarinol B az etilacetát-metanol eleggyel eluálódott az oszlopról. Ezeket a frakciókat összegyűjtve, csökkentett nyomáson bepárolva, 60 g olajat nyertünk.
Az így nyert olaj teljes mennyiségét feloldottuk 6 liter 50% (térf./térf.)-os vizes metanolban és az oldatot
2,3 liter, vízzel telített Diaion HP-20 (védjegyzett név) oszlopon adszorbeáltattuk. Az oszlopot lépésenként gradiens eluálással mostuk olyan vizes metanol oldatokkal, melyekben a metanol térfogat-koncentrációját fokozatosan 30%-ról 90%-ra emeltük. Részletezve, miután 4-4 liter 30, 50, 60, 70 és 80%-os vizes metanolt vittünk fel az oszlopra, végül 90%-os vizes metanollal eluáltuk azt. Az eluálást mindaddig folytattuk, míg nagy felbontóképességű folyadékkromatográfiával még anyagot tudtunk kimutatni, ehhez kb. 10 liter 90%-os vizes metanolra volt szükség. A 90%-os vizes metanollal eluált frakciókat egyesítettük és csökkent nyomáson bepároltuk. Hozam: 3,8 g sárga por. Ezt a sárga port kromatográfiával tisztítottuk 320 g Sephadex LH-20-al töltött oszlopon, melyet metilén-klorid.etil-acetát.metanol = 19:19:2 térfogatarányú elegyével telítettünk. A hatóanyagot ugyanezzel az oldószer rendszerrel eluáltuk.
A kapott terméket tovább tisztítottuk nagy felbontóképességű folyadékkromatográfiával, fordított fázisú oszlopon [Senshu-Pak ODS H-5251, a Shenshú Scien8
HU 211 907 A9 tific Co., Ltd. védjegyzett terméke; oszlop méret: 20 mm-es átmérő, 250 mm hosszú], eluensként 40 tf.%-os vizes acetonitrilt használva, 15 ml/perces áramlási sebesség mellett. A detektálást 220 nm-en, abszorpció méréssel végeztük. Mivel a tiomarinol B 13-14 perces retenciós időnél adott maximumot, ezt a frakciót elkülönítettük és csökkent nyomáson szárazra pároltuk. Hozam: 130 g címbeli vegyület, melynek fizikai-kémiai paramétereit már előzőleg felsoroltuk.
2. példa
Tiomarinol B előállítása a tiomarinol oxidációjával
100,9 g tiomarinolt (előállítása 6. Példa szerint) feloldtunk 5 ml aceton és 5 ml víz keverékében, majd a kapott oldatot jéggel hűtöttük, hozzáadtunk 112,2 g OXONE-t (Aldrich Chemical Co., Inc. kereskedelmi terméke) és a keveréket jéghűtés mellett kevertettük 40 percig. Ezt követően 1,2 ml telített vizes nátrium-hidrogén-karbonát oldatot adtunk a keverékhez, melyet jéghűtés mellett tovább kevertettünk 30 percig. 5 ml víz hozzáadása után a keveréket metilén-klorid és tetrahidrofurán 10:1 térfogatarányú keverékével extraháltuk. Az extraktumot vízmentes nátrium-szulfáton való szárítás után csökkentett nyomáson bepároltuk. A képződő maradékot izoláltuk és fordított fázisú, nagy felbontóképességű folyadékkromatográfiával (Senshu Pák ODS-5251-N oszlop és 40tf%-os vizes acetonitril eluens) tisztítottuk. Termelés: 79,5 mg (75%) halvány sárga tiomarinol B, melynek fizikai-kémiai tulajdonságai megegyeznek a fent felsorolt értékekkel.
3. példa
Tiomarinol B előállítása a tiomarinol oxidációjával
100 mg tiomarinolt (előállítása 6. példa szerint) feloldottuk 15 ml aceton és 7,5 ml víz elegyében, majd 0,074 ml 35%-os vizes hidrogén-peroxidot és 2 csepp híg, vizes nátrium-hidrogén-karbonát oldatot adtunk a keverékhez. A reakcióelegyet 5 percig kevertettük, majd csökkentett nyomáson eltávolítottuk az acetont, és acetonitrilt adtunk a maradékhoz. A tiomarinol B képződését fordított fázisú, nagy felbontóképességű folyadékkromatográfiával (Senshu Pák ODS-H-2151-es oszlop és 40 tf%-os vizes acetonitril eluens) igazoltuk. Az oldószert csökkentett nyomáson végzett desztillációval eltávolítottuk a reakcióelegyből és a maradékot 40 tf%-os vizes acetonitrilben oldtuk fel. A terméket izoláltuk és fordított fázisú, nagy felbontáképességű folyadékkromatográfiával (Senshu Pák ODS-4251-N-es oszlop és 40 tf%-os vizes acetonitril eluens) tisztítottuk. Termelés: 43,2 mg (41%) halvány sárga tiomarinol B, melynek fizikai-kémiai tulajdonságai azonosak a fent felsorolt értékekkel.
4. példa
Tiomarinol B előállítása tiomarinol oxidációjával
100 mg tiomarinolt (6. példa szerint előállítva) feloldtunk 40 ml acetonban, majd jéghűtés és keverés mellett 134 mg m-klórperbenzoesavat adtunk az oldathoz és tovább kevertettük szobahőfokon 1,5 óra hoszszat. Ekkor a reakcióelegyet metilén-kloriddal extraháltuk, az extraktumot mostuk háromszor vízzel és egyszer nátrium-hidrogén-karbonát vizes oldatával. Az extraktumot vízmentes nátrium-szulfáton szárítottuk, majd az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláltuk. A terméket izoláltuk és fordított fázisú, nagy felbontóképességű folyadékkromatográfiával (Senshu Pák ODS-4251-N-es oszlop és 40tf%-os vizes acetonitril eluens) tisztítottuk. Termelés: 8,5 mg (8%) halvány sárga tiomarinol B, melynek fizikai-kémiai tulajdonságai azonosak a fent felsorolt értékekkel.
5. példa
A tiomarinol C előállítása fermentorban végzett tenyésztéssel
A) Tenyésztés
Baktérium szuszpenzió előállítása céljából az Alteromonas rava SANK 73 390 egy Maríné Agar (Difco)on növesztett ferde tenyészetét hozzáadtuk 10 ml steril Maríné Broth (Difco)-hoz.
liter ugyanilyen Maríné Broth táptalajt 30 literes üvegfermentorban hősterileztünk, majd beoltottuk a fenti baktérium szuszpenzió teljes mennyiségével. A fermentációt 23 *C-on, 7,5 liter/perc levegőáramban végeztük 24 óra hosszat. A kiindulási keverési sebesség 100/perc volt, ezt a későbbiekben úgy szabályoztuk, hogy 5,0 ppm oldott oxigén koncentrációt biztosítsunk.
Két 600 literes fermentorba 300 liter táptalajt tettünk, melynek összetétele a következő:
Glükóz 1,5%
Bactopeptone (Difco) 1,5%
Bactoyeast extract (Difco) 0,2%
NaCl 3,89%
MgCl2-6 H2O 2,52%
Na2SO4 0,648%
CaCl2 2 H2O 0,4767%
KCl 0,11%
Na2CO3 0,038%
Ferri-citrát (sterilezés előtt pH 7,6). 0,02%
A fermentorokat ezután hősterileztük, majd beoltot-
tűk 3-3 liter inokulum-tenyészettel és 23 ”C-on, 150 liter/perces levegőztetés mellett, 29 óra hosszat fermentáltunk. Az indító keverési sebesség 82/perc volt, amit később úgy szabályoztunk, hogy az 5,0 ppm-es oldott oxigén koncentrációt biztosítson.
B) Izolálás
A 700 liter fermentléhez annyi vizes sósavat adtunk, hogy pH-ja 3-ra álljon be, majd 700 liter acetonnal elegyítettük és egy óra hosszat keveréssel extraháltunk. A kapott extraktumot először 700 liter, majd másodszor 300 liter etil-acetáttal extraháltuk. Az egyesített etil-acetátos extraktumokat mostuk először 300 liter 5 vegyes%-os vizes nátrium-hidrogén-karbonát oldattal, majd 300 liter telített vizes nátrium-klorid oldattal, végül megszárítottuk vízmentes nátrium-szulfáton. Az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláltuk, miközben 540 g szilikagélt adagoltunk és úgy pároltuk szárazra.
HU 211 907 A9
A kapott maradékot metilén-kloridban szuszpendáltuk és rávittük egy 4 kg szilikagélből készült, metilénkloriddal telített oszlopra. Az oszlopot növekvő polaritásé oldószer elegyekkel eluáltuk a következő sorrendben: metilén-klorid:metilén-klorid-etil-acetát = 1:1 térfogatarányú elegye; etil-acetát:etil-acetát-metanol = 9:1 térfogatarányú elegye. Két literes frakciókat eluáltunk és a tiomarinol C-t tartalmazó frakciót, mely az etil-acetátmetanol eleggyel eluálódott elkülönítettük, majd csökkentett nyomáson ledesztilláltuk, miközben 50 g szilikagélt adtunk a frakcióhoz és úgy pároltuk szárazra.
A kapott maradékot felszuszpendáltuk hexán és aceton keverékében és a kapott szuszpenziót rávittük egy 200 g szilikagélből készült, hexánnal telített oszlopra. Az oszlopot hexán:aceton =1:1 térfogatarányú oldószer elegyével eluáltuk. 500 ml-es frakciókat szedtünk, az 1. és a
2. frakció tartalmazta a tiomarinol C-t. Az 1. frakciót csökkentett nyomáson bepároltuk, miközben 25 g szilikagélt adtunk a frakcióhoz és úgy pároltuk szárazra.
A kapott maradékot felszuszpendáltuk hexán, aceton és etil-acetát 1:1:2 térfogatarányú keverékében és a kapott szuszpenziót rávittük egy 200 g szilikagélből készült, hexánnal telített oszlopra. Az oszlopot hexán:aceton:etil-acetát - 1:1:2 térfogatarányú oldószer elegyével eluáltuk. 500 ml-es frakciókat szedtünk. A tiomarinol C-t tartalmazó frakciót elkülönítettük és egyesítettük az előző kromatográfiánál kapott 2. frakcióval. Az egyesített frakciókat csökkentett nyomáson bepároltuk, miközben 20 g szilikagélt adtunk a frakciókhoz és úgy pároltuk szárazra.
A kapott maradékot felszuszpendáltuk hexán, aceton és etil-acetát 1:1:1 térfogatarányú keverékében és a kapott szuszpenziót rávittük egy 200 g szilikagélből készült, hexánnal telített oszlopra. Az oszlopot hexán:aceton:etil-acetát - 1:1:1 térfogatarányú elegyével eluáltuk. 500 ml-es frakciókat szedtünk. A tiomarinol C-t tartalmazó frakciókat egyesítettük és csökkentett nyomáson bepároltuk. Olajos terméket kaptunk.
Az egész olajos maradékot ismét kromatografáltuk egy 200 ml Sephadex LH-20-al töltött és metilén-klorid:etil-acetát:metanol = 19:19:2 térfogatarányú elegyével telített oszlopon. Eluensként ugyanezt az oldószerelegyet használtuk. A tiomarinol C-t tartalmazó frakciókat összegyűjtöttük és csökkentett nyomáson szárazra bepároltuk, miközben 25 g szilikagélt adtunk az elegyhez.
A kapott maradékot felszuszpendáltuk metilén-kloridban és a szuszpenziót rávittük egy 200 g szilikagélből készített, metilén-kloriddal telített oszlopra. Az oszlopot növekvő polaritású 9:1-1:9 térfogatarányú meülén-klorid - aceton elegyekkel eluáltuk. Egy literes frakciókat szedtünk. A tiomarinol C-t tartalmazó frakciókat összegyűjtöttük és csökkentett nyomáson szárazra pároltuk. Kitermelés 150 mg tiomarinol C, melynek fizikai-kémiai paraméterei megegyeztek a fentemlített értékekkel.
6. példa
A tiomarinol előállítása üvegfermentorban végzett fermentációval
A) Tenyésztés
Az Alteromona rava SANK 73 390-es törzsből ferde tenyészetet készítettünk Maríné Agaron (Difco), 22 ’C-on 3 napig végzett tenyésztéssel. A kapott tenyészetet felszuszpendáltuk 3 ml mesterséges tengervízben. A szuszpenzió 0,1 ml-ével, amit steril körülmények között vettünk ki, beoltottunk 100 ml steril táptalajt [37,4 g Maríné Broth (Difco) 1 liter ionmentes vízben, pH állítás nélkül] egy 500 ml-es Erlenmeyer lombikban.
A lombikot rázógépen (200/perc, rotációs átmérő 70 mm) inkubáltuk 23 ’C-on, 24 óra hosszat. A tenyészet sterilen kivett 15 ml-es részleteivel beoltottunk 4 db 30 literes üvegfermentort, melyekben 15 liter előbb leírt összetételű steril táptalaj volt. Az üvegfermentorokat 23 óra hosszat inkubáltuk 23 ’C-on, 7,5 liter/perc levegőztetés és keverés (100/perc) mellett.
B) Izolálás óra elteltével egyesítettük a fermentorok tartalmát, így összesen 60 liter fennentlét nyertünk. Sósav hozzáadásával a fermentlé pH-ját 3-ra állítottuk, hozzáadtunk 60 liter acetont, majd 30 percen keresztül, keverés mellett extraháltunk. Az elegyet 1,2 kg Celite 545 (Johns Manville Co.) szűrési segédanyaggal szűrtük. A kapott 110 liter szüredéket először 1 x 60 liter etil-acetáttal majd 2 x 30 liter etil-acetáttal extraháltuk. Az egyesített szerves extraktumokat 30 liter 5% (tömeg/térfogat)-os vizes nátriumhidrogén-karbonát oldattal, majd ezt követően 30 liter telített vizes nátriumklorid oldattal mostuk. Vízmentes nátrium-szulfáton való szárítás után a keveréket csökkentett nyomáson szárazra pároltuk, mikoris 14 g olajat nyertünk.
A kapott olaj teljes mennyiségét feloldottuk metilén-kloridban és az oldatot felvittük egy 200 g szilikagélből készített, metilén-kloriddal telített oszlopra. Növekvő polaritású oldószer keverékekkel eluáltunk, a következő sorrendben: metilén-klorid:etil-acetát =1:1 (térfogatarány), egyedül etil-acetát és etil-acetát-metanol 9:1 (térfogatarány). 18 ml-es frakciókat szedtünk. Az etil-acetát-metanol keverékkel eluált frakciókat, melyek a tiomarinolt tartalmazták, elkülönítettük.
Az elkülönített frakciókat szárazra pároltuk.
A kapott 7 g olajat feloldottuk 400 ml 50 tf%-os vizes metanolban, és felvittük egy 600 ml Diaion HP20 (Mitsubishi Chem. Ind.)-al töltött, vízzel telített oszlopra. Az oszlopot 50 tf%-os vizes metanollal mostuk, majd a hatóanyagot 90 tf%-os vizes metanollal eluáltuk. Az oldószert csökkentett nyomáson bepárolva, 1 g sárga port nyertünk. Ezt a sárga port tovább tisztítottuk Sephadex LH-20 oszlopon, metilén-klorid etil-acetát-metanol 19:19:2 térfogatarányú elegyével eluálva. Az aktív frakciókból 750 g tiomarinolt nyertünk sárga por formájában.
A kapott tiomarinol a következő fizikai-kémiai tulajdonságokkal rendelkezik:
1. Külső megjelenési forma: sárga por.
2. Olvadáspont 84-89 °C.
3. Összegképlet: CjqH^^O^.
4. Molekulatömeg: 640 (FAB-MS-el mérve) („FAB-MS” = Fást Atom Bombardment Mass
Spectrometry)
HU 211 907 A9
5. Nagy felbontású tömegspektrum:
C30H45N2O9S2 [(M+H)+ FAB-MS-el mérve]:
számított: 641,2567 talált: 641,2585.
6. Elemanalízis:
számított: C, 56,23%; H, 6,92; N, 4,37%; S, 10,01% talált: C, 55,92%; H, 6,82%; N, 4,23%; S, 9,90%.
7. Infravörös abszorpciós spektrum:
Az infravörös abszorpciós spektrum kálium-bromid (KBr) pasztillában mérve a következő (v,^ cm1): 3394, 2930, 1649, 1598, 1526, 1288, 1216,1154,1102, 1052.
8. Ultraibolya abszorpciós spektrum:
Az ultraibolya abszorpciós spektrum metanolban vagy metanol és sósav elegyében mérve a következő:
cm )·
387 (12 000), 300 (3500), 214 (26 000).
Az ultraibolya abszorpciós spektrum metanol és nátrium-hidroxid elegyében mérve a következő: (v,^ cm-1); 386 (9600), 306 (3200), 206 (25 000).
9. Fajlagos forgatóképesség:
[ajő = +4,3” (c = 1,0, metanol)
10. Nagy felbontóképességű folyadékkromatográfia: Elválasztásra alkalmazott oszlop: Senshu-Pak ODS H-2151 (oszlopátmérő 6 mm, hossz 150 mm; Senshu Scientific Co., Ltd.).
Oldószer: 40 térf.% vizes acetonitril.
Áramlási sebesség: 1,5 ml/perc.
Hullámhossz: 220-350 nm (fotodiódás detektálás). Retenciós idő: 5,9 perc.
11. ’H-magmágneses rezonanciaspektrum: (öppm)
A hexadeuterált dimetil-szulfoxidban tetrametilszilán mint belső standard alkalmazásával mért magmágneses rezonanciaspektrum (270 MHz) a következő:
0,91 (3H, dublett, J = 6,8 Hz).
0,95 (3H, dublett, J = 5,9 Hz);
1.30 (6H, széles multiplett);
1,55 (5H, széles multiplett);
2,03 (3H, szingulett);
2, 09 (3H, multiplett);
2,34 (2H, triplett, J = 7,3 Hz);
3,33 (IH, dublett, J = 10,7 Hz);
3,52 (2H, multiplett);
3,64 (2H, multiplett);
3,73 (IH, dublettek dublettje);
4,02 (2H, triplett, J = 6,6 Hz);
4,18 (IH, széles dublett, J = 7,3 Hz);
4.30 (IH, dublett, J = 4,4 Hz);
4,44 (IH, dublett, J = 7,8 Hz);
4,63 (IH, dublett, J = 3,4 Hz);
4,89 (IH, dublett, J = 7,3 Hz);
5, 37 ( 2H, multiplett);
5,97 (IH, széles szingulett);
7,04 (IH, szingulett);
9,80 (IH, széles szingulett);
10,68 (IH, széles szingulett).
12. l3C-magmágneses rezonanciaspektrum: (δ ppm) A hexadeuterált dimetil-szulfoxidban tetrametil-szilán mint belső standard alkalmazásával mért magmágneses rezonanciaspektrum (68 MHz) a következő:
174,3 (szingulett) 170,4 (szingulett) 168,6 (szingulett)
161,1 (szingulett) 137,9 (szingulett) 135,7 (dublett)
135,1 (szingulett) 129,8 (dublett) 116,3 (dublett)
115,8 (szingulett) 113,7 (dublett) 77,6 (dublett)
74,4 (dublett) 72,1 (dublett) 71,8 (dublett)
66,0 (triplett) 65,7 (dublétt) 64,9 (triplett)
45,3 (dublett) 43,9 (dublett) 36,6 (triplett)
33,4 (triplett) 30,1 (triplett) 30,0 (triplett)
29,7 (triplett) 27,0 (triplett) 26,7 (triplett)
20,3 (kvartett) 16,6 (kvartett) 16,3 (kvartett).
13. Oldékonyság
Oldódik alkoholokban, így például metanolban, etanolban, propanolban és butanolban, valamint dimetil-szulfoxidban, dimetil-formamidban, kloroformban, etil-acetátban, acetonban és dietil-éterben. Nem oldódik hexánban és vízben.
14. Színreakciók:
Pozitív színreakció kénsavval, jóddal és káliumpermanganáttal.
15. Vékonyréteg-kromatográfia:
Rf érték: 0,57.
Adszorbens: Szilikagél (Merck & Co., Inc., Art.
5715).
Kifejlesztő oldószer: metilén-klorid:metanol = 85:15-ös térfogatarány.
BIOLÓGIAI AKTIVITÁS
A pszeudomonsav A-val és a tiomarinollal összehasonlítva a tiomarinol B és C biológiai aktivitását az 1. teszt példa mutatja be.
/. teszt példa
A tiomarinol BésC antibakteriális aktivitása
A tiomarinol, tiomarinol B, tiomarinol C és pszeudomonsav A (továbbiakban „A”, „B”, „C” és „P”-vel jelölve) agar diffúziós módszerrel, agar táptalajon (Elken Chemical Co„ Ltd.) mért minimális gátlási kon45 centrációját (MIC) grampozitív és gramnegatív mikroorganizmusokkal szemben, pg/ml-ben, a következő 1. táblázat foglalja össze:
/. táblázat
Teszt baktérium MIC (pg/ml)
A B c P
Staphylococcus aureus 209P <0,01 <0,01 <0,01 0,05
Staphylococcus aureus 56R <0,01 <0,01 <0,01 0,1
Staphylococcus aureus 535 (MRSa) <0,01 <0,01 <0,01 0,2
HU 211 907 A9
Teszt baktérium MIC (pg/ml)
A B C P
Enterococcus faecalis 681 0,02 0,05 0,8 25
Escherichia coli N1HJ 0,8 0,8 3,1 100
Escherichia coli 609 0,8 0,8 1,5 100
Salmonella enteritidis 0,4 0,4 1,5 50
Klebsiella pneumoniae 806 0,8 0,8 1,5 100
Klebsiella pneumoniae 846 (R) 0,2 0,2 0,8 100
Enterobacter cloacae 963 1,5 0,8 3,1 >100
Serratia marcescens 1184 3,1 3,1 6,2 >100
Proteus vulgáris 1420 0,05 0,05 0,2 0,4
Morganella morganii 1510 6,2 6,2 12,5 >100
Pseudomonas aerucrinosa 1001 0,2 0,2 0,8 >100
Pseudomonas aerucrinosa No. 7 0,4 0,4 0,8 >100
Pseudomonas aeruginosa 3719 - 0,8 0,4 >100
2. teszt példa
A tiomarinol B és C antimycoplasma aktivitása Az 1. teszt példa szerint eljárva meghatároztuk a tiomarinol, tiomarinol B, tiomarinol C és pszeudomonsav A (továbbiakban ,A”, „B”, „C” és „P”-vel jelölve) aktivitását különböző mycoplasma törzsekkel szemben. Az eredményeket a 2. Táblázat szemlélteti.
2. táblázat
Teszt mycoplasma MIC (pg/ml)
A B C P
Mycoplasma hyosynoviae S-16 0,025 - - -
Mycoplasma hyorhinis BTS7 - 0,78 1,56 0,39
InocuJum: 0,005 ml 105 CFU/ml.
Értékméréshez alkalmazott táptalaj:
A tiomarinol B, tiomarinol C és pszeudomonsav A biológiai meghatározásához Chanock táptalajt [Proc. Nat. Acad. Sci., 48, 41—49 (1962), 20% lószérum adalékkal kiegészítve] alkalmaztunk minden mikroorganizmus esetében.
A tiomarinolt a következő táptalajon határoztuk meg:
Mycoplasma bovis és Mycoplasma gallisepticum·. Chanock táptalaj (fentiek szerint előállítva).
Mycoplasma hyosynoviae·. Mucin PPLO* agar táptalaj (15% lószérum adalékkal).
* PPLO (Pleuro Pneumonia-Like Organism):
CV mentes PPLO tenyészet (Difco) 21 g
Mucin bakteriológiai táptalaj (Difco) 5g
Desztillált víz 800 ml
Agar Noble (Difco) 12 g
Lószérum 150 ml
25% friss élesztőkivonat 50 ml.
Tenyésztési körülmények: 37 C, 5 nap, enyhén ae-
rob [BBL gáz-pakolású módszer (tenyésztés a Becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, MD 2103 USA féle eldobható CO2 generátorban)].
Az eredmények egyértelműen bizonyítják, hogy a tiomarinol B és C kitűnő antibakteriális és antimycoplasma aktivitást mutat, mely legalább olyan szintű, mint a tiomarinolé és általában jelentős mértékben jobb, mint a pszeudomonsav A-é.

Claims (8)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. A (C) képletű „Tiomarinol C” elnevezésű vegyület.
  2. 2. Anyagkészítmény, mely az 1. igénypont szerinti vegyületet és egy gyógyászatilag elfogadható hordozót tartalmaz.
  3. 3. Eljárás bakteriális fertőzés kezelésére vagy megelőzésére, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti vegyület hatásos mennyiségét egy ilyen fertőzésben szenvedő vagy arra érzékeny emlősnek adagoljuk.
  4. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett emlős ember.
  5. 5. A (B) képletű „tiomarinol B” elnevezésű vegyület.
  6. 6. Anyagkészítmény, mely az 5. igénypont szerinti vegyületet és egy gyógyászatilag elfogadható hordozót tartalmaz.
  7. 7. Eljárás bakteriális fertőzés kezelésére vagy megelőzésére, azzal jellemezve, hogy az 5. igénypont szerinti vegyület hatásos mennyiségét egy ilyen fertőzésben szenvedő vagy arra érzékeny emlősnek adagoljuk.
  8. 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett emlős ember.
HU95P/P00570P 1992-09-18 1995-06-29 Thiomarinol compounds HU211907A9 (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP24897092 1992-09-18
JP29417092 1992-11-02
JP29569592 1992-11-05

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HU211907A9 true HU211907A9 (en) 1996-01-29

Family

ID=27333780

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9302629A HU219380B (en) 1992-09-18 1993-09-17 Novel thiomarinol derivatives pharmaceutical compositions containing them and process for producing them
HU95P/P00570P HU211907A9 (en) 1992-09-18 1995-06-29 Thiomarinol compounds

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9302629A HU219380B (en) 1992-09-18 1993-09-17 Novel thiomarinol derivatives pharmaceutical compositions containing them and process for producing them

Country Status (20)

Country Link
US (1) US5399711A (hu)
EP (1) EP0595458B1 (hu)
KR (1) KR0177839B1 (hu)
CN (1) CN1053446C (hu)
AT (1) ATE173735T1 (hu)
AU (1) AU665860B2 (hu)
CA (1) CA2106443A1 (hu)
CZ (1) CZ281324B6 (hu)
DE (1) DE69322235T2 (hu)
DK (1) DK0595458T3 (hu)
ES (1) ES2125309T3 (hu)
FI (2) FI103055B (hu)
HK (1) HK1006935A1 (hu)
HU (2) HU219380B (hu)
IL (1) IL107017A (hu)
MX (1) MX9305720A (hu)
NO (1) NO304947B1 (hu)
NZ (1) NZ248696A (hu)
PH (1) PH30111A (hu)
TW (1) TW255893B (hu)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH08510223A (ja) * 1993-05-13 1996-10-29 スミスクライン・ビーチャム・パブリック・リミテッド・カンパニー デオキシチオマリノール誘導体、その製法および製造用中間体ならびにその殺菌剤および除草剤としての使用
AU4496996A (en) * 1995-01-31 1996-08-21 Sankyo Company Limited Pseudomonic acid derivatives
CA2217957A1 (en) * 1995-04-11 1996-10-17 Genhui Chen Xenorxides with antibacterial and antimycotic properties
US6583171B1 (en) * 1996-04-04 2003-06-24 Welichem Biotech Inc. Antineoplastic agents
AU780751B2 (en) * 1999-10-13 2005-04-14 Pharmacia & Upjohn Company Process to prepare androst-4-en-17-carboxylic acid cross-reference to related applications
AR026743A1 (es) * 1999-12-09 2003-02-26 Pharmacia Ab Produccion de peptidos
US7100736B2 (en) 2003-10-14 2006-09-05 Fleetguard, Inc. Serviceable muffler
US8986971B2 (en) * 2006-09-22 2015-03-24 Triphase Research And Development I Corp. Salt formulations for the fermentation of marine microorganisms
CN103074395B (zh) * 2011-10-26 2015-01-07 上海医药工业研究院 一种用于生产Safracin B的发酵培养基

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1565083A (en) * 1976-02-20 1980-04-16 Beecham Group Ltd Pseudomonic acid amides
JPS5412375A (en) * 1977-06-25 1979-01-30 Yoshitomi Pharmaceut Ind Ltd Derivative of pseudomonic acid
JPS603311B2 (ja) * 1977-12-27 1985-01-26 ウェルファイド株式会社 抗生物質シユ−ドモン酸誘導体およびその製法
JPS54103871A (en) * 1978-01-28 1979-08-15 Yoshitomi Pharmaceut Ind Ltd Pseudomonic acid derivative and its preparation
JPS54125672A (en) * 1978-03-23 1979-09-29 Yoshitomi Pharmaceut Ind Ltd Pseudomonic acid amide derivative, or its salt, and their preparation
CA1214130A (en) * 1982-10-26 1986-11-18 Stuart H. Rhodes Xenorhabdin antibiotics
JPS6327484A (ja) * 1986-07-22 1988-02-05 Microbial Chem Res Found ビスカベリンおよびその製造法
IL94051A0 (en) * 1989-04-12 1991-01-31 Beecham Group Plc 1-normon-2-yl-heterocycles,process for their preparation and pharmaceutical compositions containing them
IS1606B (is) * 1991-05-07 1996-10-18 Sankyo Company Limited Aðferð til framleiðslu nýs sýkladrepandi efnasambands Thiomarinol, fengið með ræktun Alteromanas rava SANK 73390

Also Published As

Publication number Publication date
DK0595458T3 (da) 1999-06-23
CN1092811A (zh) 1994-09-28
CZ193093A3 (en) 1996-06-12
FI981359A0 (fi) 1993-09-17
EP0595458B1 (en) 1998-11-25
TW255893B (hu) 1995-09-01
EP0595458A1 (en) 1994-05-04
PH30111A (en) 1996-12-27
CN1053446C (zh) 2000-06-14
FI981359A (fi) 1998-06-12
HUT70185A (en) 1995-09-28
AU4737993A (en) 1994-03-24
IL107017A (en) 1998-01-04
FI103055B1 (fi) 1999-04-15
KR0177839B1 (ko) 1999-03-20
IL107017A0 (en) 1993-12-28
KR940007039A (ko) 1994-04-26
NZ248696A (en) 1995-03-28
FI105814B (fi) 2000-10-13
DE69322235T2 (de) 1999-07-29
HU219380B (en) 2001-03-28
AU665860B2 (en) 1996-01-18
US5399711A (en) 1995-03-21
ATE173735T1 (de) 1998-12-15
HU9302629D0 (en) 1993-12-28
CA2106443A1 (en) 1994-03-19
NO933328L (no) 1994-03-21
HK1006935A1 (en) 1999-03-26
FI934076A0 (fi) 1993-09-17
NO304947B1 (no) 1999-03-08
FI103055B (fi) 1999-04-15
CZ281324B6 (cs) 1996-08-14
FI934076A (fi) 1994-03-19
ES2125309T3 (es) 1999-03-01
MX9305720A (es) 1994-05-31
NO933328D0 (no) 1993-09-17
DE69322235D1 (de) 1999-01-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU211907A9 (en) Thiomarinol compounds
US5405762A (en) Culture of alteromonas and process of using the same to produce an antibacterial compound
AU646615B2 (en) Novel anti-bacterial compound
DK170892B1 (da) 14-Oxa-1,11-diazatetracyclo[7.4.1.02,7.010,12]tetra-deca-2,4,6-trien-forbindelser, fremgangsmåde til fremstilling heraf, farmaceutiske præparater der indeholder forbindelserne samt anvendelse af forbindelserne til fremstilling af lægemidler og en kultur af mikroorganismen Streptomyces sandaensis
US6395711B1 (en) Macrolides with antitumor activity
RU2101353C1 (ru) Тиомаринол b и способ его получения (варианты)
RU2089548C1 (ru) Тиомаринол c и способ его получения
JPH0365944B2 (hu)
JP3123864B2 (ja) 新規化合物チオマリノールｃおよびその製造法
JP4730879B2 (ja) キガマイシノン類及びその製造方法、並びに、該キガマイシノン類を含む薬用組成物
JPH0794458B2 (ja) 新規化合物チオマリノールｂの製造方法
JPH07291992A (ja) 新規化合物ｂ４３１７
JPH08208658A (ja) 新規化合物チオマリノールｄ、ｅおよびｆ
JPH06336487A (ja) 新規化合物チオマリノールｂ