JPH0794458B2 - 新規化合物チオマリノールｂの製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は優れた抗菌作用を有する
新規化合物チオマリノ−ルＢ(Thiomarinol B) の製造方
法に関する。

【０００２】

【従来の技術】海水より分離したアルテロモナス (Alte
romonas)属に属する微生物が、例えば抗腫瘍活性を有す
るビスカベリン(bisucaberin) を生産することが知られ
ている（特開昭63-27484号）。しかし、ビスカベリンは
環状ペプチド化合物である。

【０００３】水酸基で置換されたテトラヒドロピラン骨
格を母核とした誘導体は数多いが、中でもチオマリノ−
ル（後述の式を参照）に類似した構造を有する化合物と
しては、例えばシュ−ドモナス フルオレセンス（Pseu
domonas fluorescens)が生産するシュ−ドモン酸(Pseud
omonic acid)Ａ(J.Chem.Soc.Perkin Trans.I,294頁(197
7 年))、シュ−ドモン酸Ｂ(J.Chem.Soc.Perkin Trans.
I,318頁(1977 年))、シュ−ドモン酸Ｃ(J.Chem.Soc.Per
kin Trans.I, 2827頁(1982 年))およびシュ−ドモン酸
Ｄ(J.Chem.Soc.Perkin Trans.I, 2655頁(1983 年))が知
られている。しかし、これらには例えばチオマリノ−ル
の特徴であるテトラヒドロピラン骨格とα、β−不飽和
カルボニルに挟まれたメチレンに水酸基が存在しない。
なお現在、シュ−ドモン酸Ａの 2 ％軟膏（商品名、「B
actroban」 、Beecham 社）が皮膚感染症治療剤として欧
米で実用に供されている。しかし、これらシュ−ドモン
酸の抗菌活性はチオマリノ−ルＢより弱い。

【０００４】また、シュ−ドモン酸の末端カルボン酸を
アミドに変換した誘導体も知られている（特開昭52−10
2279号、特開昭54−12375 号、特開昭54−90179 号、特
開昭54−103871号、特開昭54−125672号）。しかし、こ
れらの中にはチオマリノ−ルＢのような強い抗菌力、多
くのグラム陰性菌まで含む広い抗菌スペクトルを有する
ものはない。むしろ、その活性はシュ−ドモン酸より弱
くなる傾向がある。

【０００５】チオマリノ−ルＢの構造上の特徴のひとつ
に、テトラヒドロピラン骨格とα、β−不飽和カルボニ
ルに挟まれたメチレンに水酸基が存在する。このような
水酸基を有する化合物としては唯一、海洋細菌由来の化
合物が報告されている（Am.Chem.Soc.の 200年会（1990
年 8月 26-31日）の Abstracts of Papers、Part 2、
ORGN.No.139 ）。しかしながら、この化合物の末端のカ
ルボニル基に結合する複素環基は２−ピペリドン−３−
イル基であり、その抗菌活性の詳細は不明である。

【０００６】一方、ホロシン(holothin, Helv.Chim.Act
a,42巻,563頁(1959 年))骨格を母核とした誘導体として
は、例えば放線菌の一種 Streptomyces 属より単離され
たピロシン属抗生物質としてホロマイシン(holomycin,
Helv.Chim.Acta,42 巻,563頁(1959 年))、ピロシン(pyr
rothine, J.Am.Chem.Soc.,77巻, 2861頁(1955 年))、チ
オルチン(thiolutin, Angew.Chem.,66巻,745頁(1954
年))、アウレオスリシン(aureothricin, J.Am.Chem.So
c.,74巻, 6304頁(1952 年))などを挙げることができ
る。また、細菌由来の抗生物質としてゼノルアブジン
（xenorhabdin)Ｉ〜Ｖ(特表昭59−501950号；J.Natural
Products, 54巻、 774頁（1991年）) が単離されてい
る。しかし、これらの化合物にはチオマリノ−ルＢほど
の強い抗菌活性は報告されていない。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】チオマリノールおよび
チオマリノールＢは共にほぼ同等の非常に強力な抗菌力
を有する新規な化合物である。そして、チオマリノール
Ｂはチオマリノールに比べて毒性が弱いという利点を有
する。しかし、現在、両者は醗酵法で得られているのみ
であり、特にチオマリノールＢはその生産力価が低く、
十分な量を供給することは困難である。そこで、チオマ
リノールＢを十分に供給する方法の開発が望まれてい
る。

【０００８】本発明者らは、チオマリノールＢの製造方
法について鋭意研究を行い、容易に得られるチオマリノ
ールを酸化することにより、チオマリノールＢを製造す
る方法を見出して本発明を完成した。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明は新規化合物チオ
マリノールを酸化することによる新規化合物チオマリノ
ールＢの製造方法である。

【００１０】ここに、本発明の目的化合物チオマリノー
ルＢは、下記の構造式および理化学的性状を有する。

【００１１】

【化１】

【００１２】（１）物質の性状：黄色粉末 （２）分子式：C₃₀ H₄₄ N₂ O₁₁ S₂ （３）分子量：672 (FAB-MS 法により測定） （４）高分解能質量分析：C₃₀ H₄₅ N₂ O₁₁ S₂[(M+H)⁺;
FAB-MS法により測定］ 実測値 673.2468 計算値 673.2465 （５）元素分析値：（％） C₃₀ H₄₄ N₂ O₁₁ S₂＋H₂O と
して 実測値 C 52.34、 H 6.79、 N 3.92、 S 9.02 計算値 C 52.16、 H 6.71、 N 4.06、 S 9.28 （６）赤外線吸収スペクトル：ν_max cm^-1 臭化カリウム(KBr) 錠剤法で測定した赤外線吸収スペク
トルは、次に示す通りである。 3660、3503、3318、3075、2966、2928、2870、1704、1653、1509、 1467、1381、1349、1299、1217、1199、1152、1112、1063、1047、 1019、975 、949 、884 、839 、764 、730 、660 、609 、553 。

【００１３】（７）紫外線吸収スペクトル：λ_max nm
(ε) １−プロパノール中で測定した紫外線吸収スペクトル
は、次に示す通りである。 377(2,900)、301(13,000) 、215(21,000) １−プロパノール＋塩酸中で測定した紫外線吸収スペク
トルは、次に示す通りである。 377(2,900)、301(13,000) 、223(17,000) １−プロパノール＋水酸化ナトリウム中で測定した紫外
線吸収スペクトルは、次に示す通りである。 377(2,900)、301(13,000) 、221(19,000) 。

【００１４】（８）比旋光度： [α]_D ²⁵ ＋ 7.7°（ C
＝1.0 、１−プロパノール） （９）高速液体クロマトグラフィー： 分離カラム；センシュウパック(Senshu Pak) ODS H-215
1 （カラムサイズ、φ 6× 150 mm 、センシュウ科学
（株）製） 溶媒； 40 ％アセトニトリル−水 流速； 1.5 ml ／分 保持時間； 8.4分 。

【００１５】（１０） ¹Ｈ−核磁気共鳴スペクトル：
（δ：ppm) 重ジメチルスルホキシド中、内部基準にテトラメチルシ
ランを使用して測定した核磁気共鳴スペクトル(360MHz)
は、次に示す通りである。 11.28(1H,s(br)) 、10.47(1H,s) 、7.23(1H,s)、 5.97(1H,s) 、 5.37(2H,m)、 4.88(1 H,d,J=7.5Hz)、 4.61(1H,s(br)) 、 4.43(1H,d,J=7.2Hz)、 4.28(1H,d,J=3.6Hz) 、4.18(1H,d,J=7.2Hz)、 4.02(2H,t,J=6.6Hz)、3.74(1H,s(br))、3.64(1H),3.61(1H) 、 3.54(1H)、 3.51(1H) 、3.35(1H,d,J=10.9Hz) 、 2.43(2H,t,J=7.3Hz)、 2.12(1H) 、2.09(1H)、 2.03(1H) 、 2.02(3H,s)、 1.61(1H) 、1.58(2H)、 1.50(2H) 、1.32(2H)、 1.30(2H)、 1.25(2H) 、 0.96(3H,d,J=6.3Hz) 、 0.92(3H,d,J=6.9Hz)。

【００１６】（１１）¹³Ｃ−核磁気共鳴スペクトル：
（δ：ppm) 重ジメチルスルホキシド中、内部基準にテトラメチルシ
ランを使用して測定した核磁気共鳴スペクトル（90MHz)
は、次に示す通りである。 173.5(s)、 166.1(s) 、 165.7(s) 、 160.8(s) 、 143.2(s) 、 134.2(d)、 127.8(d) 、 123.3(s) 、 115.2(s) 、 114.4(d) 、 109.4(d)、 76.2(d) 、 72.4(d) 、 69.6(d) 、 69.3(d) 、 64.3(t)、 63.9(d) 、 63.0(t) 、 43.2(d) 、 42.2(d) 、 34.7(t)、 31.9(t) 、 28.3(t) 、 28.2(t) 、 28.1(t) 、 25.3(t)、 24.5(t) 、 20.0(q) 、 15.7(q) 、 15.6(q) 。

【００１７】（１２）溶解性： メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等
のアルコール類、ジメチルスルホキシド、ジメチルホル
ムアミド、クロロホルム、酢酸エチル、アセトン、エチ
ルエーテルに可溶。ｎ−ヘキサン、水に不溶。

【００１８】（１３）薄層クロマトグラフィー： Ｒｆ値 ； 0.52 吸着剤 ；シリカゲル（メルク社製、Art. 5715) 展開溶剤；メチレンクロリド：メタノール＝85：15 。

【００１９】一方、本発明の原料化合物であるチオマリ
ノ−ルは下記の構造式および性状を有する。

【００２０】

【化２】

【００２１】１）物質の性状：黄色粉末 ２）融点：84−89 ℃ ３）分子式：C₃₀ H₄₄ N₂ O₉ S₂ ４）分子量： 640 (FAB-MS法により測定） ５）高分解能質量分析：C₃₀ H₄₅ N₂ O₉ S₂[(M+H)⁺ FAB
-MS 法により測定］ 実測値 641.2585 計算値 641.2567 ６）元素分析：（％） 実測値 C 55.92、 H 6.82 、 N 4.23 、 S
9.90 計算値 C 56.23、 H 6.92 、 N 4.37 、 S 1
0.01 。

【００２２】７）赤外線吸収スペクトル：ν_maxcm^-1 臭化カリウム(KBr) 錠剤法で測定した赤外線吸収スペク
トルは、次に示す通りである。 3394、2930、1649、1598、1526、1288、1216、1154、1102、1052。

【００２３】８）紫外線吸収スペクトル：λ_max nm
（ε） メタノールまたはメタノール＋塩酸中で測定した紫外線
吸収スペクトルは、次に示す通りである。 387(12、000) 、300(3、500)、214(26、000) メタノール＋水酸化ナトリウム中で測定した紫外線吸収
スペクトルは、次に示す通りである。 386(9、600)、306(3、200)、206(25、000) 。

【００２４】９）比旋光度：［α］_D ²⁵ ＋4.3 °(C＝
1.0 、メタノ−ル) １０）高速液体クロマトグラフィー： 分離カラム；センシュウパック(Senshu Pak) ODS H-215
1 ( カラムサイズ、 φ 6× 150 mm 、センシュウ科学
（株）製 ) 溶媒； 40 % アセトニトリル−水 流速； 1.5 ml ／分 波長； 220-350 nm （フォトダイオ−ドアレイ検出） 保持時間； 5.9 分 。

【００２５】１１） ¹Ｈー核磁気共鳴スペクトル：
（δ：ppm ） 重ジメチルスルホキシド中、内部基準にテトラメチルシ
ランを使用して測定した核磁気共鳴スペクトル(270 MH
z) は、次に示す通りである。 0.91(3H,d,J=6.8Hz)、 0.95(3H,d,J=5.9Hz)、1.30(6H,m(br.)) 、 1.55(5H,m(br.)) 、2.03(3H,s)、2.09(3H,m)、2.34(2H,t,J=7.3Hz)、 3.33(1H,d,J=10.7Hz) 、3.52(2H,m)、3.64(2H,m)、 3.73(1H,dd) 、 4.02(2H,t,J=6.6Hz)、4.18(1H,d(br.),J=7.3Hz) 、 4.30(1H,d,J=4.4Hz)、4.44(1H,d,J=7.8Hz)、4.63(1H,d,J=3.4Hz)、 4.89(1H,d,J=7.3Hz)、5.37(2H,m)、5.97(1H,s(br.)) 、7.04(1H,s)、 9.80(1H,s (br.))、10.68(1H,s (br.)) 。

【００２６】１２）¹³Ｃー核磁気共鳴スペクトル：(
δ：ppm) 重メタノ−ル中、内部基準にテトラメチルシランを使用
して測定した核磁気共鳴スペクトル(68 MHz)は、次に示
す通りである。 174.3(s)、170.4(s)、168.6(s)、161.1(s)、137.9(s)、135.7(d)、 135.1(s)、129.8(d)、116.3(d)、115.8(s)、113.7(d)、 77.6(d)、 74.4(d)、 72.1(d)、 71.8(d)、 66.0(t)、 65.7(d)、 64.9(t)、 45.3(d)、 43.9(d)、 36.6(t)、 33.4(t)、 30.1(t)、 30.0(t)、 29.7(t)、 27.0(t)、 26.7(t)、 20.3(q)、 16.6(q)、 16.3(q)。

【００２７】１３）溶解性： メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等
のアルコール類、ジメチルスルホキシド、ジメチルホル
ムアミド、クロロホルム、酢酸エチル、アセトン、エチ
ルエーテルに可溶、ｎ−ヘキサン、水に不溶。

【００２８】１４）呈色反応： 硫酸、ヨード、過マンガン酸カリウムに陽性。 １５）薄層クロマトグラフィー： Ｒｆ値 ； 0.57 吸着剤 ；シリカゲル（メルク社製、Art.5715） 展開溶剤；ジクロロメタン：メタノール ＝ 85 ：15
。

【００２９】本発明の目的化合物チオマリノールＢおよ
び原料化合物チオマリノ−ルは、いくつかの不斉炭素原
子およびいくつかの二重結合を有する。特にα，β−不
飽和カルボニル部分は異性化される可能性がある。それ
故、種々の立体および幾何異性体が存在する。本発明に
おいては、これらの異性体がすべて単一の式で示されて
いる。従って、本発明においては、ラセミ化合物を含む
これらの異性体およびこれらの異性体の混合物をもすべ
て含むものである。立体特異的合成法が使用される場
合、または立体異性体が原料化合物として使用される場
合、個々の異性体は直接的に製造してもよいし、一方、
異性体の混合物が製造されれば個々の異性体は常法によ
り得てもよい。

【００３０】本発明のチオマリノールを酸化してチオマ
リノールＢを得る酸化反応は、チオマリノールに溶剤の
存在下で塩基の存在下または不存在下、酸化剤を作用さ
せることによって達成される。

【００３１】使用される酸化剤としては通常の酸化反応
に使用されるものであれば特に限定はなく、例えば過マ
ンガン酸カリウム；二クロム酸カリウム（重クロム酸カ
リウム）、二クロム酸ナトリウム（重クロム酸ナトリウ
ム）、酸化クロム(VI)、塩化クロミル、クロム酸ｔ−ブ
チルのようなクロム酸類；四酸化ルテニウム；塩素、臭
素、ヨウ素のようなハロゲン類；オゾン；酸素；過酸化
水素；ビス（トリメチルシリル）ペルオキシド、クミル
ヒドロペルオキシド、ｔ−ブチルヒドロペルオキシドの
ような有機過酸化物類；ジオキシラン、ジメチルジオキ
シラン、ビストリフルオロメチルジオキシラン、トリフ
ルオロメチルクロロジフルオロメチルジオキシラン、ジ
フルオロジオキシラン、エチルメチルジオキシラン、メ
チルプロピルジオキシラン、ブチルメチルジオキシラ
ン、ジエチルジオキシラン、メチルフルオロジオキシラ
ン、フルオロジオキシラン、メチルジオキシラン、メチ
ルトリフルオロメチルジオキシランのようなジオキシラ
ン類；過酢酸、過ギ酸、ｍ−クロロ過安息香酸のような
有機過酸類；ペルオキソ一硫酸、ペルオキソニ硫酸カリ
ウム、OXONE （商標名、アルドリッチ社製）のようなペ
ルオキソ硫酸類；等をあげることができる。好適には過
酸化水素、有機過酸類、有機過酸化物類、ジオキシラン
類、ペルオキソ硫酸類、であり、特に好適には、過酸化
水素、ジメチルジオキシラン、ペルオキソ硫酸類、であ
る。

【００３２】使用される塩基としては、反応に影響を与
えないものであれば特に限定はなく、好適には、炭酸ナ
トリウム、炭酸カリウム、炭酸リチウムのようなアルカ
リ金属炭酸塩類；炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウ
ム、炭酸水素リチウムのようなアルカリ金属炭酸水素塩
類；水素化リチウム、水素化ナトリウム、水素化カリウ
ムのようなアルカリ金属水素化物類；水酸化ナトリウ
ム、水酸化カリウム、水酸化バリウム、水酸化リチウム
のようなアルカリ金属水酸化物類；弗化ナトリウム、弗
化カリウム、弗化セシウムのようなアルカリ金属弗化物
類；等の無機塩類、またはナトリウムメトキシド、ナト
リウムエトキシド、カリウムｔ−ブトキシド、リチウム
メトキシドのようなアルカリ金属アルコキシド類；ナト
リウムメチルスルフィド(sodium methyl sulfide) 、ナ
トリウムエチルスルフィド(sodiumethyl sulfide)のよ
うなアルカリ金属アルキルスルフィド類(alkali metala
lkyl sulfides) ；トリエチルアミン、トリブチルアミ
ン、ジイソプロピルエチルアミン、N-メチルモルホリ
ン、ピリジン、4-（N,N-ジメチルアミノ）ピリジン、N,
N-ジメチルアニリン、N,N-ジエチルアニリン、1,5-ジア
ザビシクロ［4.3.0］ノナ-5- エン（DBN ）、1,4-ジア
ザビシクロ［2.2.2 ］オクタン（DABCO ）、1,8-ジアザ
ビシクロ［5.4.0 ］ウンデセ-7- エン（DBU ）のような
窒素化合物類；等の有機塩類、をあげることができ、好
適には、アルカリ金属炭酸塩類およびアルカリ金属炭酸
水素塩類である。

【００３３】使用される溶剤としては反応に影響を与え
ないものであれば特に限定はなく、例えば水；メタノー
ル、エタノール、プロパノールのようなアルコール類；
アセトン、メチルエチルケトンのようなケトン類；酢
酸、ギ酸のような有機酸類；酢酸エチルのようなエステ
ル類；ジエチルエーテル、テトラヒドロフランのような
エーテル類；ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトア
ミドのようなアミド類；およびこれらの混合溶剤をあげ
ることができる。好適にはアルコール類、水とケトン類
の混合溶剤であり、特に、水−アセトンである。

【００３４】また、必要により反応の促進剤として、酸
化白金、酸化バナジウムなどの無機触媒を使用すること
ができる。

【００３５】反応温度としては、通常 −78 ℃乃至 1
00 ℃であり、好適には −10 ℃乃至室温である。

【００３６】反応時間としては、使用される酸化剤、塩
基、反応温度等により変化するが、通常 15 分乃至 30
時間であり、好適には 15 分乃至 2 時間である。

【００３７】反応終了後、目的化合物は、常法、例えば
反応液を水に注ぎ、水と混和しない溶剤、例えば、ベン
ゼンのような芳香族炭化水素類、ジエチルエーテルのよ
うなエーテル類、酢酸エチルのような有機酸エステル
類、ジクロロメタンのようなハロゲン化炭化水素類など
で抽出し、抽出液より溶剤を留去することによって得ら
れる。このようにして得られた目的化合物は所望によ
り、常法に従って各種クロマトグラフィー等に付すこと
により、更に精製することもできる。

【００３８】本発明の原料化合物チオマリノ−ルおよび
目的化合物チオマリノ−ルＢは、微生物培養によっても
得られる。

【００３９】すなわち、海水より分離したアルテロモナ
ス(Alteromonas) 属に属する SANK73390株の培養液か
ら、チオマリノールおよびチオマリノールＢが生産され
る。本発明の、チオマリノールおよびチオマリノールＢ
を生産する上記SANK 73390株は静岡県南伊豆町小稲の海
岸で採取した海水から常法により分離した海洋細菌であ
る。

【００４０】チオマリノ−ルおよびチオマリノールＢの
生産菌である SANK 73390 株の菌学的性状は次の通りで
ある。

【００４１】１．形態学的性状 マリンアガ−（Difco 社製）上で 23 ℃、 24 時間培養
後の観察では、細胞は直径 0.8−1.0 μm 、長さ 2.0−
3.6 μm の桿状であり、単極毛を有し、運動する。胞
子を形成せず、グラム染色は陰性である。

【００４２】２．マリンアガ−培地上での生育状態 23℃で 24 時間培養したコロニ−はいくぶん灰色を帯び
た黄色、不透明で円形、扁平状、全縁である。水溶性の
色素を生成しない。

【００４３】３．生理学的性状 （１）海水の要求性：生育に海水を要求する。 （２）Ｏ−Ｆ（オキシダティブ−ファ−メンタティブ）
テスト［ヒュ−・レイフソン（ Hugh ・Leifson ）法
(J.Bact.,66巻、24-26 頁、(1953年))、人工海水で調
製］：糖を分解しない。 （３）オキシダ−ゼ：＋ （４）カタラ−ゼ：＋ （５）酸素に対する態度：好気的。 （６）硝酸塩の還元：− （７）デンプンの加水分解：＋ （８）寒天の分解：− （９）ゼラチンの液化：＋ （１０）ＤＮａｓｅの産生：＋ （１１）リパ−ゼの産生：＋ （１２）生育温度：4 ℃では微弱に生育し、17−26℃で
は良好な生育を示す。35℃では生育しない。 （１３）栄養要求性：ジャ−ナル・オブ・バクテリオロ
ジ−（Journal of Bacteriology)、 107巻、 268-294頁
(1971年) 記載の基本培地を用いた場合、ビタミンフリ
−のカザミノ酸を要求する。 （１４）炭素化合物の利用性：ジャ−ナル・オブ・バク
テリオロジ−（Journal of Bacteriology)、 107巻、 2
68-294頁 (1971年) 記載の基本培地にビタミンフリ−の
カザミノ酸を 0.1 ％ 濃度添加し、振とう培養を行っ
た場合。 Ｌ−アラビノ−ス：− Ｄ−リボ−ス：− Ｄ−キシロ−ス：− Ｄ−グルコ−ス：＋ Ｄ−ガラクト−ス：− Ｄ−フラクト−ス：− 麦芽糖：＋ ショ糖：− トレハロ−ス：＋ セロビオ−ス：− メリビオ−ス：− マンニト−ル：− ソルビト−ル：− グリセリン：− 酢酸ソ−ダ：＋ プロピオン酸ソ−ダ：＋ 。

【００４４】４．化学分類学的性状 （１）ＤＮＡのＧ＋Ｃ（グアニン＋シトシン含量）：4
3.4 ％（HPLC法） （２）キノン系：ユビキノンＱ−８。

【００４５】以上の菌学的性状を有する SANK 73390 株
はバ−ジ−ズ・マニュアル・オブ・システマティック・
バクテリオロジ−（Bergey's Manual of Systematic Ba
cteriology）、 1 巻（1984年）および最新のインタ−ナ
ショナル・ジャ−ナル・オブ・システマティック・バク
テリオロジ−（International Journal of Systematic
Bacteriology）に記載の種と照合すると、海洋細菌のア
ルテロモナス・サイトレア（Alteromonas citrea）に類
似した菌と推定された。但し、本菌はアルテロモナス・
サイトレア（Alteromonas citrea）の基準株 ATCC 297
19 株との比較培養を行ったところ、本菌のコロニ−の
色調がいくぶん灰色を帯びた黄色であるのに対し、ATCC
29719 株は緑色を帯びた黄色であり、SANK 73390 株
は 4 ℃で生育し、トレハロ−スとプロピオン酸ソ−ダ
を炭素源として利用する点でアルテロモナス・サイトレ
ア（Alteromonas citrea）と異なっている。それ故、本
発明者らは本菌をアルテロモナス属に属する新種である
と確認し、アルテロモナス属・ラバ種（Alteromonas ra
va）と命名し、新菌株をアルテロモナス・ラバ・ SANK
73390 （Alteromonas rava SANK 73390 ）株と命名し
た。

【００４６】本菌株は、アルテロモナス・ラバ・ SANK
73390 （Alteromonas rava SANK 73390 ）株としてブダ
ペスト条約に従って通商産業省工業技術院微生物工業技
術研究所（1993年 1月 1日より「通商産業省工業技術院
生命工学工業技術研究所」と改称）に国際寄託されてい
る（寄託番号、微工研条寄第 3381 号 (FERM BP-3381)
：原寄託日、1991年 4月30 日）。

【００４７】以上、SANK 73390 株について説明した
が、周知の如くアルテロモナス属の菌類の諸性質は一定
したものではなく、自然的、または人工的な操作（例え
ば、紫外線照射、放射線照射、化学薬品処理等）によ
り、変異を起こし易く、本発明のSANK 73390 株もこの
点は同じである。本発明にいう SANK 73390 株はその
すべての変異株を包含する。また、これらの変異株の中
には、遺伝学的方法、例えば、組み替え、形質導入、形
質転換等により得られたものも包含される。即ち、アル
テロモナス属に属するチオマリノ−ルを生産する、SANK
73390 株、その変異株およびそれらと明確に区別され
ない菌株は、すべて SANK 73390 株に包含されるもので
ある。

【００４８】原料化合物チオマリノ−ルおよび目的化合
物チオマリノ−ルＢを得るため、これらの微生物の培養
は他の発酵生成物を生産するために用いられるような培
地中で行なわれる。このような培地中には、微生物が資
化出来る炭素源、窒素源および無機塩を含有する。

【００４９】一般に、炭素源としてグルコース、フラク
トース、マルトース、シュークロース、マンニトール、
グリセロール、デキストリン、オート麦、ライ麦、トウ
モロコシデンプン、ジャガイモ、トウモロコシ粉、大豆
粉、綿実油、糖蜜、クエン酸、酒石酸などを単一に、あ
るいは併用して用いる事が出来る。一般には、培地量の
1ー10 重量％で変量する。

【００５０】窒素源としては、一般に蛋白質を含有する
物質を発酵工程に用いる。適当な窒素源としては、大豆
粉、フスマ、落花生粉、綿実粉、カゼイン加水分解物、
ファーマミン、魚粉、コーンスチープリカー、ペプト
ン、肉エキス、イースト、イーストエキス、マルトエキ
ス等の動物系、植物系またはエキス類の窒素源、硝酸ナ
トリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等の無
機窒素源である。窒素源は、単一または併用して培地量
の 0.1-6 重量％の範囲で用いる。

【００５１】培地中に取り入れる栄養無機塩は、ナトリ
ウム、アンモニウム、カルシウム、カリウム、マグネシ
ウム、鉄、フォスフェート、サルフェート、クロライ
ド、カーボネート等のイオンを得ることの出来る通常の
塩類である。また、コバルト、マンガン、ストロンチウ
ム等の微量の金属、その他ブロマイド、フルオライド、
ボレ−ト、シリケ−ト等の微量イオンを得る塩も含む。

【００５２】液体培養に際しては、消泡剤としてシリコ
ン油、植物油、界面活性剤等が使用される。

【００５３】アルテロモナス・ラバ（Alteromonas rav
a） SANK 73390 株を培養しチオマリノ−ルおよびチオ
マリノ−ルＢを生産する培地の pH は、5.0ー8.0 に変化
させることが出来る。

【００５４】菌の生育温度は 4 ℃ から 32 ℃ まで
であるが 17 ℃ から 26 ℃ の範囲が生育良好であ
り、 更にチオマリノ−ルおよびチオマリノ−ルＢの生産
には、20 ℃ から 26 ℃ が好適である。

【００５５】チオマリノ−ルおよびチオマリノ−ルＢ
は、好気的に培養して得られるが通常用いられる好気的
培養法、例えば固体培養法，振とう培養法、通気撹拌培
養法等が用いられる。

【００５６】小規模な培養においては、20 ℃ から 2
6 ℃で数日間振とう培養を行うのが良好である。培養は
三角フラスコ中で、１ー２段階の種の発育工程により開
始する。種発育段階の培地は、炭素源および窒素源を併
用出来る。種フラスコは定温インキュベーター中で 23
℃、1 乃至 3 日間振とうするか、または充分に成長す
るまで振とうする。成長した種は第二の種培地、または
生産培地に接種するのに用いる。中間の発育工程を用い
る場合には、本質的に同様の方法で成長させ、生産培地
に接種するためにそれを部分的に用いる。接種したフラ
スコを一定温度で 1 乃至3 日間、または生産量が最大
に達するまで振とうし、インキュベーションが終わった
らフラスコの含有物を遠心分離またはろ過する。

【００５７】大量培養の場合には、撹拌機、通気装置を
付けた適当なタンクで培養するのが好ましい。この方法
によれば、栄養培地をタンクの中で作成出来る。栄養培
地を125 ℃ まで加熱して滅菌し、冷却後、滅菌培地
にあらかじめ成長させてあった種を接種する。培養は 2
0 ℃乃至 26 ℃で通気撹拌して行う。この方法は、多量
の化合物を得るのに適している。

【００５８】培養の経過に伴って生産されるチオマリノ
−ルおよびチオマリノールＢの量の経時変化は、高速液
体クロマトグラフィーを用いて測定することが出来る。
通常は、チオマリノールの生産量は 19 時間から 96 時
間の培養で最高値に達し、チオマリノールＢの生産量は
19 時間から 200 時間の培養で最高値に達する。

【００５９】培養終了後、培養液中の液体部分及び菌体
内に存在するチオマリノ−ルおよびチオマリノ−ルＢ
は、菌体、その他の固形部分を珪藻土をろ過助剤とす
る、ろ過操作または遠心分離によって分別し、そのろ液
または上清中および菌体中に存在するチオマリノ−ルお
よびチオマリノ−ルＢを、その物理化学的性状を利用し
抽出精製することにより得られる。例えば、ろ液また
は、上清中に存在するチオマリノ−ルおよびチオマリノ
−ルＢは、中性または酸性 pH 条件下で水と混和しない
有機溶剤、例えば酢酸エチル、クロロホルム、塩化エチ
レン、塩化メチレンなどの単独または、それらの組み合
わせにより抽出精製することができる。あるいは吸着剤
として、例えば活性炭または吸着用樹脂であるアンバー
ライト XAD−2、XAD −4 ( ローム・アンド・ハース社
製) 等や、ダイアイオン HP −10、HP−20、 CHP−20、
HP−50( 三菱化成( 株) 製) 等が使用される。チオマリ
ノ−ルおよびチオマリノ−ルＢを含む液を上記のごとき
吸着剤の層を通過させて不純物を吸着させて取り除く
か、またはチオマリノ−ルおよびチオマリノ−ルＢを吸
着させた後、メタノール水、アセトン水、ｎ−ブタノー
ル水などを用いて溶出させることにより得られる。ま
た、菌体内に存在するチオマリノ−ルおよびチオマリノ
−ルＢは、50-90 ％ 含水アセトンまたは含水メタノー
ルにより抽出し有機溶剤を除去した後、ろ液と同様な抽
出精製操作を行なうことにより得られる。

【００６０】このようにして得られた原料化合物チオマ
リノ−ルおよび目的化合物チオマリノ−ルＢは、更にシ
リカゲル、マグネシウムーシリカゲル系のフロリジルの
ような担体を用いた吸着カラムクロマトグラフィー、セ
ファデックス LH −20( ファルマシア社製) などを用い
た分配カラムクロマトグラフィー、および順相、逆相カ
ラムを用いた高速液体クロマトグラフィー等で精製する
ことが出来る。以上の分離、精製の手段を単独または適
宜組み合わせ反復用いることによりチオマリノ−ルまた
はチオマリノ−ルＢを分離精製することができる。

【００６１】

【作用】本発明の目的化合物チオマリノ−ルＢは、文献
未載の新規化合物であり、動物( 例、ヒト、イヌ、ネ
コ、ウサギ等) において、グラム陽性細菌、グラム陰性
細菌およびマイコプラズマ菌に対し抗菌作用を示すこと
から、各種細菌感染症を対象とする抗菌剤として有用で
ある。

【００６２】本発明のチオマリノ−ルＢを医薬として用
いる場合、常法に従って種々の形態で投与される。その
投与形態としては例えば散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル
剤、シロップ剤などの形態で経口的または注射剤（静脈
内、筋肉内、皮下）、点滴剤、座剤、塗布剤、軟膏剤な
どの形態で非経口的に安全に投与することが出来る。こ
れらの各種製剤は、常法に従って主薬に賦形剤、結合
剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味矯臭剤、溶解補助
剤、懸濁剤、コ−ティング剤、希釈剤などの医薬の製剤
技術分野において通常使用しうる既知の補助剤を用いて
製剤化することができる。投与量は対象疾患、投与経路
および投与回数などにより異なるが、例えば成人に対し
ては 1 日 20 mg から 2000 mg を、症状に応じて 1
回または数回に分けて投与するのが好ましい。

【００６３】

【実施例】次に実施例、参考例および試験例をあげて本
発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらに限定
されるものではない。実施例１．チオマリノール 100.9
mg をアセトン 5 ml および水 5 ml の混合溶剤に溶解
し、氷冷下で冷却した。この溶液に、OXONE （商標名、
アルドリッチ社製）112.2 mg を加え、氷冷下で 40 分
間攪拌した。この混合物に、飽和炭酸水素ナトリウム水
溶液 1.2 ml を加え、氷冷下で 30 分間攪拌した。反応
混合物に水 5 mlを加え、次いでジクロロメタン−テト
ラヒドロフラン（10:1）にて抽出した。抽出液を乾燥
後、溶剤を留去した。得られた残渣を逆相高速液体クロ
マトグラフィー（Senshu Pak ODS-5251-N 、40％CH₃CN
(H₂O)）にて単離精製することにより淡黄色のチオマリ
ノールＢ 79.5mg（75％）が得られた。

【００６４】実施例２． チオマリノール 100 mg をアセトン 15 mlおよび水 7.5
ml の混合溶剤に溶解し、35 ％過酸化水素水 0.074 m
l を加え、希炭酸水素ナトリウムを 2 滴加えた。反応
混合物を 5 分間攪拌した後、アセトンを留去し、次い
でアセトニトリルを加え、逆相高速液体クロマトグラフ
ィー（Senshu Pak ODS-H-2151, 40 ％CH₃CN(H₂O)）に
て、チオマリノールＢの生成を確認した。反応混合物よ
り溶剤を留去し、得られた残渣を 40 ％アセトニトリル
に溶解し、逆相高速液体クロマトグラフィー（Senshu P
ak ODS-4251-N 、40％CH₃CN(H₂O)）にて単離精製するこ
とにより淡黄色のチオマリノールＢ 43.2mg（41％）が
得られた。

【００６５】実施例３． チオマリノール 100 mg をアセトン 40 ml に溶解し、
氷冷下で 134 mg の m- クロロ過安息香酸を加え、室温
で、1.5 時間攪拌した。反応混合物をジクロロメタンで
抽出後、3 回水洗し、有機層をさらに、炭酸水素ナトリ
ウム水溶液で洗浄した。抽出液を乾燥後、溶剤を留去し
た。得られた残渣を逆相高速液体クロマトグラフィー
（Senshu Pak ODS-4251N、 40 ％CH₃CN(H₂O)）にて単離
精製することにより、淡黄色のチオマリノールＢ 8.5
mg（8 ％）が得られた。

【００６６】参考例１．チオマリノ−ルのジャ−培養 Ａ）培養 アルテロモナス・ラバ SANK 73390 株を、マリンアガ−
スラント（MarineAgar Slant、Difco 社製）上で 22 ℃
で 3 日間培養を行い、それを人工海水3 ml に懸濁さ
せ、その 0.1 ml を無菌的に滅菌した後述の組成の培地
100 mlを含む 500 ml の三角フラスコに接種し、 23
℃ で、 200 rpm (7 cmの回転半径) のロータリー振と
う培養機で 24 時間培養した。その 15 ml を無菌的に
滅菌した同様の組成の培地 15 リットルを含む 30 リッ
トルのジャ−ファ−メンタ−4 機に埴菌し、 23 ℃で、
通気（7.5 リットル／分）、攪拌（100 rpm ）下に23
時間培養した。

【００６７】 培地組成 マリンブロス（Difco 社製） 37.4 g ────────────────────────── 脱イオン水 1000 ml pH 無調整 。

【００６８】Ｂ）単離 得られた培養液 60 リットルは、塩酸で pH 3 に調整
し、アセトン 60 リットルを添加、0.5 時間攪拌しな
がら抽出した。抽出液にろ過助剤としてセライト545
（米国ジョーンズ・マンビル・プロジェクト・コーポレ
ーション製）1.2 Kgを加えてろ過を行った。そのろ液 1
10 リットルは酢酸エチル 60 リットルで1 回、さ
らに 30 リットルで 2 回抽出した。得られた酢酸エチ
ル層を 30 リットルの 5 ％重炭酸ナトリウム、30 リ
ットルの飽和食塩水で洗浄し、さらに無水硫酸ナトリウ
ムで乾燥した後、減圧下で濃縮乾固して 14 g の油状物
が得られた。

【００６９】得られた油状物をシリカゲル 200 g をメ
チレンクロリドで充填したカラムに、同溶剤に溶解して
吸着させ、次いでメチレンクロリド−酢酸エチル（ 1：
1 ）、酢酸エチル、酢酸エチル−メタノ−ル（ 9：1 ）
と順次展開溶媒の極性を上げて溶出した。溶出液を 18
ml づつ分画し、酢酸エチル−メタノ−ルで溶出したチ
オマリノ−ルを含むフラクションを集め、減圧下で濃縮
乾固して油状物 7 gが得られた。得られた油状物をダイ
アイオンHP−20 を水で充填したカラム 600ml に、50
％メタノ−ル 400 ml に溶解して吸着させ、次いで
50 ％メタノ−ルで洗浄し、90 ％メタノ−ルで溶出
した。これを減圧下で濃縮乾固して黄色粗粉末 1 g が
得られた。黄色粗粉末はさらにセファデックス LH −20
を用いてクロマトを行い、メチレンクロリド−酢酸エ
チル−メタノ−ル（ 19 ： 19：2 ）で展開し、活性の
フラクションを集めて、黄色粉末のチオマリノ−ルが75
0 mg 得られた。

【００７０】参考例２．チオマリノールＢのタンク培養 Ａ）培養 アルテロモナス・ラバSANK 73390株を、マリンアガー
（Marine Agar 、Difco社製）斜面培地上で 22 ℃、3
日間培養を行なった後、斜面培養物を滅菌した人工海水
3 ml に懸濁した。無菌的に滅菌した後述の組成の培地
100 ml を含む500 ml 容の三角フラスコ 2 本に先の
懸濁液を各々 0.1 ml 接種し、23 ℃、210 rpm の条件
下、24 時間回転振とう培養を行なった。別に滅菌した
同様の組成の培地 200 リットルを含む 600 リットル
容の通気攪拌培養槽に上記培養物全量を接種し、次いで
溶存酸素濃度を 5.0 ppmに保持するように回転数を 82.
5〜170 rpmに調整し、23 ℃、通気量 0.5 vvmの条件
下 26 時間培養した。 培地組成 マリンブロス（Difco 社製） 37.4 g ────────────────────────── 脱イオン水 1000 ml pH 無調整 。

【００７１】Ｂ）単離 得られた培養液 230 リットルは、塩酸で pH 2.5 に調
整し、アセトン 200リットルを添加、0.5 時間攪拌しな
がら抽出した。抽出液にろ過助剤としてセライト 545
（米国ジョーンズ・マンビル・プロジェクト・コーポレ
ーション製）4.0 kg を加えてろ過を行なった。そのろ
液 430 リットルは酢酸エチル 200リットルで 1 回、
さらに 100 リットルで 2 回抽出した。得られた酢酸
エチル層を 200 リットルの 5 ％重炭酸ナトリウム、
100 リットルの飽和食塩水で洗浄し、さらに無水硫酸ナ
トリウムで乾燥した後、減圧下で濃縮乾固して約 80g
の油状物が得られた。

【００７２】得られた油状物をメチレンクロリドに溶解
し、シリカゲル 1.1 kg を同溶剤で充填したカラムに吸
着させ、次いでメチレンクロリド−酢酸エチル（ 1：1
）、酢酸エチル、酢酸エチル−メタノール（ 9：1 ）
と順次展開溶媒の極性を上げて溶出した。溶出液を 500
ml ずつ分画し、酢酸エチル−メタノールで溶出したチ
オマリノールＢを含むフラクションを集め、減圧下で濃
縮乾固して油状物 60 gが得られた。

【００７３】得られた油状物を 50 ％メタノール 6 リ
ットルに溶解して、ダイアイオンHP-20 を水で充填した
カラム 2.3 リットルに吸着させ、次いで 30 ％メタノ
ールから 90 ％メタノールまで、順次メタノール濃度を
上げるステップワイズ・グラジエント溶出を行なった。
即ち、順に 30 ％メタノール、50 ％メタノール、60
％メタノール、70 ％メタノール、80 ％メタノールを
それぞれ 4 リットルずつ流し、次いで 90 ％メタノー
ルによる溶出を行なった。HPLCによるモニターでさらな
る溶出がなくなるまで行ない、約 10 リットルを要し
た。90 ％メタノール溶出画分を集めて、これを減圧下
で濃縮乾固して黄色粉末 3.8 g が得られた。この黄色
粉末はさらにセファデックス LH-20 を用いてクロマト
を行なった。320 g のセファデックス LH-20 をメチレ
ンクロリド−酢酸エチル−メタノール(19:19:2) で充填
したカラムを用い、同溶媒で展開して精製した。

【００７４】さらに逆相カラムを用いた高速液体クロマ
トグラフィーによる精製を行なった。分離カラムとして
センシュウパック（Senshu Pak) ODS H-5251（カラムサ
イズ、φ20×250 mm, センシュウ科学（株）製）を用
い、展開溶媒として 40 ％アセトニトリル−水を 15 ml
/ 分の流速で流し、220 nm の吸光度をモニターしなが
ら精製した。チオマリノールＢは保持時間 13 〜14 分
のピークとして得られたので、これを集め、減圧下で濃
縮乾固して 130 mg を単離した。

【００７５】試験例１．チオマリノ−ルＢの抗菌作用 一般グラム陽性および陰性細菌に対するチオマリノ−ル
Ｂの最小発育阻止濃度（MIC ）は、普通寒天培地（栄研
化学（株）製）を用いた寒天培地希釈法によって測定し
た。結果を表１に示す。

【００７６】

【表１】

【００７７】表１から明かのごとく、チオマリノ−ルＢ
は一般グラム陽性および陰性細菌に対して優れた効果を
示した。

【００７８】以上から、本発明の新規化合物チオマリノ
ールＢは抗菌作用を示し、各種細菌に対する抗菌剤とし
て有用である。

【００７９】試験例２．チオマリノ−ルＢの抗マイコプ
ラズマ菌作用 一般マイコプラズマ菌に対するチオマリノ−ルＢの最小
阻止濃度（MIC ）は、以下の測定条件下において、寒天
平板希釈法によって測定した。

【００８０】測定条件 接種菌量 ：10⁵ CFU ／ml を 0.005 ml 接種 測定用培地：チャノック(Chanock) の培地(P.N.A.S.,48
巻、41-49頁(1962 年) 記載の培地に 20 % 馬血清を添加
した培地) 培養条件 ：37℃、5 日間、微好気培養［BBL ガスパッ
ク(BBL GasPac(商品名、Becton Dickinson Microbiolog
y Systems 社、米国))法］ 結果を表２に示す。

【００８１】

【表２】

【００８２】表２から明かのごとく、チオマリノ−ルＢ
は一般マイコプラズマ菌に対して優れた効果を示した。

【００８３】

【発明の効果】チオマリノールＢはチオマリノ−ルを酸
化することにより得られた。本発明の新規化合物チオマ
リノールＢは抗菌作用を示し、各種細菌に対する抗菌剤
として有用である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】チオマリノールを酸化することを特徴とす
   るチオマリノールＢの製造方法。