HU219380B

HU219380B - Novel thiomarinol derivatives pharmaceutical compositions containing them and process for producing them

Info

Publication number: HU219380B
Application number: HU9302629A
Authority: HU
Inventors: Katsumi Fujimoto; Koichi Hirai; Akira Ishii; Yuji Iwano; Takeshi Kagasaki; Kentaro Kodama; Kaneo Ogawa; Yoshiharu Sakaida; Hideyuki Shiozawa; Shuji Takahashi; Akio Torikata
Original assignee: Sankyo Co
Priority date: 1992-09-18
Filing date: 1993-09-17
Publication date: 2001-03-28
Also published as: FI103055B1; MX9305720A; DK0595458T3; US5399711A; DE69322235D1; CA2106443A1; CN1092811A; FI103055B; TW255893B; HK1006935A1; FI981359A0; NO933328D0; NZ248696A; KR940007039A; AU665860B2; FI105814B; DE69322235T2; HU9302629D0; PH30111A; HU211907A9

Abstract

A találmány tárgya két antibakteriális és antimycoplasma-aktivitássalrendelkező származék, a (B2) képletű tiomarinol B és a (C) képletűtiomarinol C, melyet az Alteromonas genusba tartozó mikroorganizmusoktermelnek. A tiomarinol B a tiomarinol oxidációjával is előállítható. ŕ

Description

A találmány egyes új tiomarinolszármazékokra, azok előállítására, valamint antibakteriális szerként történő alkalmazásukra és az erre szolgáló készítményekre vonatkozik.

Az 512 824 számú európai szabadalmi leírás, melyet jelen szabadalom benyújtási dátuma előtt, de annak prioritási dátumai után hoztak nyilvánosságra, például leírja az (A) képletű tiomarinolt.

A tiomarinolt az Alteromonas genus, abból is az Alteromonas rava Sank 73390-es törzs termeli fermentációs úton. Felfedeztünk két tiomarinolszármazékot, melyek hasonló antibiotikus aktivitást fejtenek ki, mint maga az eredeti tiomarinol.

Az Alteromonas genus egyedei tengervízből izolálhatok, egyesekről kimutatták, hogy potenciálisan terápiás jelentőségű vegyületeket termelnek. így például a bisucaberin nevű vegyület, melyet egy Altemaria törzsből nyertek, daganatellenes hatású (Japán Kokai lajstromszám Sho 63-27484).

A tiomarinol szerkezetét tekintve számos antibiotikumnak van hasonló szerkezete, és ezek 4 csoportra oszthatók.

Az első csoportba tartoznak a pszeudomonsavak, melyeket először Pseudomonas törzsekből izoláltak. Ide sorolható a pszeudomonsav A [termelőtörzs: Pseudomonas fluorescens, J. Chem. Soc. Perkin Trans. I. 294 (1977)], a pszeudomonsav B [ibid. 318 (1977)], pszeudomonsav C [ibid. 2827 (1982)] és a pszeudomonsav D [ibid. 2655 (1983)]. A pszeudomonsav A „Bactroban” néven van forgalomban (Beecham, védjegyzett név) 2%-os bőrgyógyászati kenőcs formájában, antibakteriális célra. Azonban az összes eddig ismert vegyületnek gyengébb az antibakteriális aktivitása, mint a jelenlegi találmány tiomarinolszármazékaié.

A vegyületek második csoportja, melyeknek hasonló a szerkezete, mint a találmány vegyületeié, olyan antibiotikumokat tartalmaz, mint a holomycin [Helv. Chim. Acta 42, 563 (1959)], pyrrothine [J. Am. Chem. Soc. 77, 2861 (1955)], thiolutin [Angew. Chem., 66, 745 (1954)], aureothricin [J. Am. Chem. Soc., 74, 6304 (1952)] stb. Ezeket az antibiotikumokat jellemző módon fonalas gombák termelik, és molekulájuk kéntartalmú kromofort tartalmaz. A holomycinnel rokon vegyület még a xenorhabdin I-V, ezeket baktériumokból is izolálták (WO 84/01775).

A két csoport vegyületeivel különböző vizsgálatokat végeztek, de nincs tudomásunk arról, hogy a tiomarinolokhoz hasonló szerkezetű vagy tulajdonságú vegyületet írtak volna le.

A vegyületek harmadik csoportját olyan japán Kokai-lajstromszámok alatt írták le, mint az 52-102279, 54-12375, 54-90179, 54-103871 és 54-125672, és olyan pszeudomonsavszármazékokat ismertetnek, melyekben a terminális karboxilcsoport helyett egy amidcsoport van. Ezek a vegyületek nem fejtenek ki összemérhető antibakteriális aktivitást, és nem tekinthetők széles spektrumú antibiotikumnak, sőt, általában gyengébb az antibakteriális aktivitásuk, mint az eredeti pszeudomonsavé.

A negyedik csoport tartalmaz egy tiomarinolhoz hasonló vegyületet, mely tengeri baktérium anyagcsereterméke [Abstracts of Papers from the 200 Year Conference of the Am. Chem. Soc. (August 26-31, 1990), Part 2, ORGN. No. 139], de ebben a terminális karbonilcsoporthoz kapcsolódó heterocsoport egy 2-oxo-3-piperidilcsoport [Experientia 48, 1165-1169 (1992)].

Közülük a legközelebb eső előzménynek a pszeudomonsav A tekinthető, azonban az összes tiomarinol, vagyis az eredeti tiomarinol, a tiomarinol B és a tiomarinol C kifejezetten nagyobb antibakteriális aktivitást mutat, mint a pszeudomonsav A.

A jelen találmány célja egyes új tiomarinolszármazékok előállítása.

A találmány további specifikus célja kitűnő antibakteriális és antimycoplasma-aktivitással rendelkező vegyületek előállítása.

További célokra és előnyökre a leírás során térünk ki.

Általában a jelen találmány két új tiomarinolszármazékra vonatkozik, egyik egy S,S-dioxo-származék, melyet a továbbiakban „tiomarinol Β’’-nek, a másik egy dezoxiszármazék, melyet a továbbiakban „tiomarinol C”-nek nevezünk.

A tiomarinol B-t a következő fizikai-kémiai tulajdonságokkal jellemezzük.

a) Külső megjelenési forma: sárga por.

b) Összegképlet: C₃₀H₄₄N₂O₁iS₂.

c) Molekulatömeg: 672 (FAB-MS-sel mérve) „FAB-MS”=Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry.

d) Nagy felbontóképességű tömegspektrometria:

C₃oH45N₂OnS₂ [(M+H)⁺; FAB-MS-sel mérve] talált 673,2468, számított 673,2465.

e) Elemanalízis:

C^^NjOj [S₂+H₂O-ra számított: C, 52,16%; H, 6,71%; Ν, 4,06%;

S, 9,28% talált: C, 52,34%; H, 6,79%; N, 3,92%;

S, 9,02%.

f) Infravörös-abszorpciós spektrum: v^cm-·.

Az infravörös-abszorpciós spektrum kálium-bromid (KBr)-pasztillában mérve a következő:

3660, 3503, 3318, 3075, 2966, 2928, 2870, 1704, 1653, 1509, 1467, 1381, 1349, 1299, 1217, 1199, 1152, 1112, 1063, 1047, 1019, 975, 949, 884, 839, 764, 730, 660, 609, 553.

g) Ultraibolya-abszorpciós spektrum: X_max nm (ε):

Az ultraibolya-abszorpciós spektrum 1-propanolban mérve a következő:

377 (2900), 301 (13 000), 215 (21 000).

Az ultraibolya-abszorpciós spektrum 1-propanol és sósav elegyében mérve a következő:

377 (2900), 301 (13 000), 223 (17 000).

Az ultraibolya-abszorpciós spektrum 1-propanol és nátrium-hidroxid elegyében mérve a következő: 377 (2900), 301 (13 000), 221 (19 000).

h) Fajlagos forgatóképesség:

[a]²D⁵ =+7,7° (c=l,0, 1-propanol).

HU 219 380 Β

i) Nagy felbontóképességű folyadékkromatográfia: Elválasztásra alkalmazott oszlop: Senshu-Pak ODS H-2151 (oszlopátmérő 6 mm, hossz 150 mm, a Senshu Scientific Co., Ltd. védjegyezett terméke).

Oldószer: 40 térfogat% vizes acetonitril.

Áramlási sebesség: 1,5 ml/perc.

Retenciós idő: 8,4 perc.

j) 'H-magmágneses rezonanciaspektrum (δ: ppm):

A hexadeuterált dimetil-szulfoxidban tetrametil-szilán mint belső standard alkalmazásával mért magmágneses rezonanciaspektrum (360 MHz) a következő:

11.28 (IH, széles szingulett);

10,47 (IH, szingulett);

7,23 (IH, szingulett);

5,97 (IH, szingulett);

5,37 (2H, multiplett);

4,88 (IH, dublett, J=7,5 Hz);

4.61 (IH, széles szingulett);

4.43 (IH, dublett, J=7,2 Hz);

4.28 (IH, dublett, J=3,6 Hz);

4,18 (IH, dublett, J=7,2 Hz);

4,02 (2H, triplett, J=6,6 Hz);

3,74 (IH, széles szingulett);

3,64 (IH), 3,61 (IH), 3,54 (IH), 3,51 (IH);

3,35 (IH, dublett, J=10,9 Hz);

2.43 (2H, triplett, J=7,3 Hz);

2,12 (IH), 2,09 (IH), 2,03 (IH);

2,02 (3H, szingulett);

1.61 (IH), 1,58 (2H), 1,50 (2H), 1,32 (2H), 1,30 (2H), 1,25 (2H);

0,96 (3H, dublett, J=6,3 Hz);

0,92 (3H, dublett, J=6,9 Hz).

k) ¹³C-magmágneses rezonanciaspektrum (δ: ppm):

A hexadeuterált dimetil-szulfoxidban tetrametil-szilán mint belső standard alkalmazásával mért magmágneses rezonanciaspektrum (90 MHz) a következő:

173,5 (szingulett), 166,1 (szingulett), 165,7 (szingulett),

160.8 (szingulett), 143,2 (szingulett), 134,2 (dublett),

127.8 (dublett), 123,3 (szingulett), 115,2 (szingulett),

114,4 (dublett), 109,4 (dublett), 76,2 (dublett), 72,4 (dublett), 69,6 (dublett), 69,3 (dublett), 64,3 (triplett), 63,9 (dublett), 63,0 (triplett), 43,2 (dublett), 42,2 (dublett), 34,7 (triplett), 31,9 (triplett), 28,3 (triplett),

28,2 (triplett), 28,1 (triplett), 25,3 (triplett), 24,5 (triplett), 20,0 (kvartett), 15,7 (kvartett), 15,6 (kvartett).

l) Oldékonyság:

Oldódik alkoholokban, így például metanolban, etanolban, propanolban és butanolban, valamint dimetil-szulfoxidban, dimetil-formamidban, kloroformban, etil-acetátban, acetonban és dietil-éterben. Nem oldódik hexánban és vízben.

m) Vékonyréteg-kromatográfia :

Rf-érték: 0,52.

Adszorbens: szilikagél (Merck & Co., Inc,, Art. 5715).

Kifejlesztő oldószer: metilén-klorid:metanol 85:15 térfogatarányban.

A jelen találmány alapját képezi még egy további vegyület, a tiomarinol C, mely a következő, (C) képlettel jellemezhető.

A találmány tárgya továbbá egy eljárás tiomarinol B vagy C előállítására, amely abban áll, hogy az Alteromonas genusba tartozó tiomarinoltermelő mikroorganizmust tenyésztjük, és a tenyészetből izoláljuk a tiomarinol B-t vagy C-t.

A találmány tárgya továbbá egy eljárás tiomarinol B előállítására a tiomarinol oxidációjával.

A találmány tárgya továbbá egy gyógyszerkészítmény, mely az antibakteriális, vagy antimycoplasma-szeren kívül tartalmaz még fiziológiai szempontból elfogadható hordozót vagy hígitószert is, és melyben az antibakteriális, vagy antimycoplasma-szert egy tiomarinol B-t és C-t tartalmazó csoportból választják ki.

A találmány tárgya továbbá egy módszer bakteriális vagy antimycoplasma-fertőzések kezelésére, vagy megelőzésére, mely abban áll, hogy az antibakteriális vagy antimycoplasma-szer hatékony mennyiségével kezelik a fertőzött vagy az ilyen fertőzésre érzékeny emlősfajt, amely lehet ember is.

Bár a tiomarinol B szerkezete sokáig nem volt ismert [a (Bl) és (B2) szerkezeteket vázolták fel valószínű megoldásokként], ma már egyértelmű, hogy a (B2) képlettel írható le a vegyület.

A fenti képletekből világosan kitűnik, hogy a tiomarinol B és C molekula több királis szénatomot és számos kettős kötést tartalmaz. Izomerizáció különösen a tiomarinolmolekula α,β-telítetlen karbonilrészén lehet* séges. így a tiomarinolok különböző sztereo- és geometriai izomereket képezhetnek. Bár mindezeket itt egyetlen szerkezeti képlet képviseli, a jelen találmány vonatkozik mind az egyes izolált izomerekre, mind azok keverékére, beleértve a racemátokat is. Egyes izomerek közvetlenül előállíthatok sztereospecifikus szintézissel vagy optikailag aktív kiindulási anyagok alkalmazásával; másrészt, amennyiben izomerek keverékét állítjuk elő, az egyes izomerek előállíthatok hagyományos rezolválási módszerekkel.

Mivel azonban normális körülmények között a tiomarinolokat fermentációval vagy a fermentációs termék kémiai átalakításával állítják elő, ezek rendszerint egy standard optikai konfigurációt vesznek fel. így mikor más konfigurációk képződnek, a természetes konfigurációt részesítjük előnyben.

A tiomarinol C a következő fizikai-kémiai tulajdonságokkal jellemezhető.

a) Külső megjelenési forma: sárga por.

b) Összegképlet: CjoH^^O^.

c) Molekulatömeg: 624 (FAB-MS-sel mérve)

d) Elemanalízis:

C₃₀H44N₂O₈S₂+H₂O-ra számított: C, 56,05%; H, 7,21%; N, 4,36%;

S, 9,97%;

talált: C, 56,48%; H, 7,23%; N,4,30%;

S, 9,11%.

e) Infravörös-abszorpciós spektrum, v_max cnr¹ :

HU 219 380 Β

3256, 3068, 2928, 2858, 1645, 1596, 1530, 1455, 1384,1287,1225,1151,1104,1052,974, 820, 712.

f) Ultraibolya-abszorpciós spektrum, nm (ε):

Az ultraibolya-abszorpciós spektrum metanolban vagy metanol és sósav elegyében mérve a következő:

388 (9600), 300 (2700), 215 (17 000).

Az ultraibolya-abszorpciós spektrum metanol és nátrium-hidroxid elegyében mérve a következő:

386 (8600), 205 (49 000).

g) Fajlagos forgatóképesség:

[a]$= 1,4° (c=l,0, metanol).

h) Nagy felbontóképességű folyadékkromatográfia: Elválasztásra alkalmazott oszlop: Senshu-Pak ODS

H-2151 (oszlopátmérő 6 mm, hossz 150 mm, a Senshu Scientific Co., Ltd.).

Oldószer: 40 térfogat%-os vizes acetonitril. Áramlási sebesség: 1,5 ml/perc.

Retenciós idő: 11,3 perc.

i) ’H-magmágneses rezonanciaspektrum (δ: ppm):

10,70 (1H, szingulett);

9,81 (1H, szingulett);

7,05 (1H, szingulett);

5,68 (1H, szingulett);

5,37 (1H, multiplett);

5.33 (1H, multiplett);

4,64 (1H, széles szingulett);

4.55 (1H, széles multiplett);

4,32 (1H, dublett, J=4,3 Hz);

4,01 (2H, triplett, J=6,6 Hz);

3,67 (1H), 3,62 (1H), 3,58 (1H), 3,49 (1H), 3,35 (1H);

3,18 (1H, széles multiplett);

2.56 (1H, széles dublett, J=14,2 Hz);

2.34 (2H, triplett, J=7,3 Hz);

2,15 (1H);

2,11 (3H, szingulett);

2,08 (1H), 2,06 (2H);

1,63 (1H, multiplett);

1.56 (2H, multiplett);

1,51 (2H, multiplett);

1,30 (2H), 1,29 (2H), 1,26 (2H);

0,95 (3H, dublett, J=6,3 Hz);

0,91 (3H, dublett, J=6,9 Hz).

j) ¹³C-magmágneses rezonanciaspektrum (δ: ppm):

171.8 (szingulett), 167,9 (szingulett), 165,7 (szingulett),

157.9 (szingulett), 134,2 (dublett), 133,9 (szingulett), 133,6 (szingulett), 127,6 (dublett), 116,5 (dublett),

115.3 (szingulett), 110,4 (dublett), 74,4 (dublett),

69.3 (dublett), 69,2 (dublett), 68,1 (dublett), 64,0 (triplett), 63,0 (triplett), 43,1 (dublett), 42,5 (triplett), 42,0 (dublett), 34,6 (triplett), 32,1 (triplett), 28,4 (triplett), 28,3 (triplett), 28,1 (triplett), 25,2 (triplett),

24,9 (triplett), 20,0 (kvartett), 18,6 (kvartett), 15,7 (kvartett).

k) Oldékonyság:

l) Vékonyréteg-kromatográfia:

R_rérték: 0,66.

Adszorbens: szilikagél (Merck & Co., Inc., Art. 5719).

Kifejlesztő oldószer: metilén-klorid:metanol 85:15 térfogatarányban.

A találmány szerinti eljárás szerint a tiomarinol B-t és C-t egy Alteromonas genusba tartozó, tiomarinolt termelő mikroorganizmus tenyésztésével és a képződő tiomarinol B és/vagy C tenyészléből történő elkülönítésével állítjuk elő. A tiomarinol B és/vagy C azon variánsait, melyek antibakteriális aktivitása megfelel az elvárásoknak, hasonló módon állíthatjuk elő más Alteromonas törzsekből, melyek termelik a kívánt anyagot, vagy előállíthatjuk még a fent leírt fermentációval nyert anyag megfelelő módosításával, vagy közvetlenül szintetizálhatjuk kémiai úton.

A találmány szerinti eljárás egy előnyös kivitelezési módja szerint mikroorganizmusként egy Alteromonas rava faj, mégpedig előnyösen egy újabban izolált Alteromonas rava törzset használunk, melyet SANK 73390nek nevezünk el. A SANK 73390 egy tengeri mikroorganizmus, melyet Japánban, Shizuoka Prefekturában, Koina, Minami-lzu Machi tengerpartján gyűjtött tengervízből izoláltunk. A törzset a Budapesti Szerződés feltételei szerint, FERM BP-3381 (letéti) szám alatt, 1991. április 30-án letétbe helyeztük a „Deposition Institute, Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan”-ban.

Az Alteromonas rava Sank 73390 törzs taxonómiai jellemzése

a) Morfológiai tulajdonságok

Az Alteromonas rava SANK 73390 törzset 23 C°-on 24 óra hosszat tenyésztettük Maríné Agaron (Difco). A mikroszkópos vizsgálat során a sejtek pálcika alakúak voltak, átmérőjük 0,8-1,0 pm és hosszuk 2,0-3,6 pm közé esett. A törzs Gram-negatív és egy poláris, egycsillós flagellum segítségével mozog.

b) Növekedés Maríné Agaron

A SANK 73390-et 23C°-on, 24 óra hosszat tenyésztettük Maríné Agaron (Difco). A kapott telepek halvány szürkéssárga színűek, mattok, kerekek, laposak és épek. Nem termeltek vízben oldódó pigmentet.

c) Fiziológiai tulajdonságok

1. Tengervízigény: a Sank 73390 növekedéséhez tengervízre van szükség.

2. Oxidatív fermentációs teszt (Hugh-Leifson-módszer [J. Bsct., 66, 24-26 (1953)] mesterséges tengervízzel készített táptalajon]: szénhidrátra gyakorolt hatás nincs.

HU 219 380 Β

3. Oxidáz: +.

4. Kataláz: +.

5. Oxigénigény: aerob.

6. Nitrátredukció: +.

7. Keményítőhidrolízis: +.

8. Agarlebontás: -.

9. Zselatinszolubilizálás: +.

10. DNáz-termelés: +.

11. Lipáztermelés: +.

12. Növekedési hőmérséklet: a növekedés gyenge 4 °C-on, jó 17 °C és 26 °C között és nincs növekedés 35 °C-on.

13. Növekedésifaktor-igény: a Journal of Bacteriology 107, 268-294 (1971)-ben leírt alaptáptalajban a SANK 73390 vitaminmentes Casamino Acidot igényel.

14. Szénforrás-asszimiláció az alaptáptalajban [Journal of Bacteriology 107, 268-294 (1971)], mely kiegészítésként 0,1% (tömeg/térfogat) vitaminmentes Casamino Acidot tartalmaz, rázott tenyészetben.

Táblázat

L-Arabinóz	-	D-Ribóz	-
D-Xilóz	-	D-Glükóz	+
D-Galaktóz	-	D-Fruktóz	-
Maltóz	+	Szacharóz	-
Trehalóz		Cellobióz	-
Melibióz	-	Mannit	-
Szorbit	-	Glicerin	-
Nátrium-acetát	+	Nátrium-propionát	+

d) Kemotaxonómiaijellemzés

1. DNS-guanin és -citozin mol% (G+C tartalom) tartalma: 43,4% (HPLC-módszer).

2. Kinonrendszer: Ubiquinone Q - 8.

A fenti taxonómiai jellegzetességeket, azAlternaria rava SANK 73390 törzset összehasonlították a Bergey’s Manual of Systemic Bacteriology, Vol. 1-ben (1984), valamint az International Journal of Systematic Bacteriology legújabb számaiban leírt törzsekkel. Úgy találtuk, hogy az Alteromonas rava SANK 73390 törzs bizonyos hasonlóságot mutat az Alteromonas citreával, egy másik tengeri mikroorganizmussal. A SANK 73390-et és az Alteromonas citrea ATCC 29719-et (standard törzs) összehasonlítva tenyésztettük, és értékeltük.

A SANK 73390 telepek halvány szürkéssárga színével összehasonlítva az ATCC 29719 telepei zöldessárgák voltak. Különbözött még a SANK 73390 az Alteromonas citreá-tól a 4 °C-on megfigyelt növekedésben, valamint a trehalóz és nátrium-propionát szénforrásként való hasznosításában. Ennek értelmében az Alteromonas rava SANK 73390 törzs az új Alteromonas rava fajok egy új törzse, és alapvetően különbözik az ATCC 29719 számon letétbe helyezett legközelebbi ismert fajoktól.

A fenti tulajdonságok jellemzőek a SANK 73390re. Ismeretes azonban, hogy az Alteromonas fajok tulajdonságai változnak, mind természetes, mind mesterséges behatásra. A fent felsorolt tulajdonságok jellemzőek ugyan a letétbe helyezett Alteromonas rava törzsre, de nem szükségszerűen jellemzőek más tiomarinoltermelő Alteromonas fajokra vagy Alteromonas rava törzsekre, vagy bármely természetesen előforduló variánsukra. A találmány oltalmi köre kiterjed ezen többi törzsre is.

Elfogadjuk, hogy a SANK 73390 vagy bármely tiomarinoltermelő törís, azok bármely variánsa tenyésztés, vagy biotechnológiai átalakítás útján megváltoztatható vagy módosítható úgy, hogy egy megváltozott tulajdonságú organizmus képződik. Az egyetlen feltétel, hogy az előállított új organizmus képes legyen a kívánt vegyület termelésére.

A változtatások és módosítások kívánság szerint elvégezhetők, például elóidézhetők a tenyésztési körülmények módosításával is. A jobb növekedés vagy alacsonyabb/magasabb hőfokon való növekedés biztosítására tenyésztéssel és azt követő szelektálással is módosítani lehet a törzseket.

A biotechnológiai módosítások általában célzottak, és olyan szelektálható tulajdonságok beépítését szolgálják, mint a bakteriostatikus rezisztencia vagy érzékenység, illetve ezek kombinációja, annak érdekében, hogy biztosítsuk a tenyészetek tisztaságát vagy lehetővé tegyük a tenyészetek, különösen az oltótenyészetek időről időre történő tisztítását.

Genetikai manipulációval bármely Alteromonas fajok szempontjából megengedett tulajdonságot bevihetünk. Például beépíthetünk rezisztenciát kódoló plazmidot, illetve eltávolíthatunk bármely természetesen előforduló plazmidot. Az előnyös plazmidok közé tartoznak azok, melyek auxotrófíát visznek be. A plazmidok bármely forrásból nyerhetők, vagy például génsebészeti úton izolálhatok természetes előfordulású Alteromoζια.ν-ból, majd ebbe építhető be a kívánt gén vagy a más forrásból származó gén. A természetes géneket bármely más módon is módosíthatjuk, kívánság szerint.

A tiomarinol B és/vagy C megfelelő mikroorganizmus tenyészetéből történő előállításához a mikroorganizmusokat megfelelő táptalajon kell fermentálni. Ezek a táptalajok általában jól ismertek a szakmában és gyakran használatosak egyéb fermentációs termékek termelésére.

Egy ilyen tipikus táptalaj tartalmazhat bármely szénforrás-kombinációt, nitrogénforrást, valamint egy vagy több szervetlen sót, amit a szóban forgó mikroorganizmus hasznosítani tud. A táptalajjal szemben az a minimális igény, hogy tartalmazza mindazokat a komponenseket, melyek elengedhetetlenek a mikroorganizmus növekedéséhez.

Megfelelő szénforrás lehet a glükóz, ffuktóz, maltóz, szacharóz, mannit, glicerin, dextrin, zabliszt, rozs, kukoricakeményítő, burgonya, kukoricaliszt, szójaliszt, gyapotmagolaj, szirup, citromsav és borkősav. Ezek mindegyike alkalmazható egyedül vagy tetszőleges kombinációban egy vagy több komponenssel. A tipikus mennyiség a táptalaj 1-10%-a (tömeg/térfogat), de ez kívánság szerint változtatható az elvárt eredménytől függően.

HU 219 380 Β

Megfelelő nitrogénforrás lehet bármely anyag, mely például fehérjét tartalmaz. Tipikus nitrogénfonások lehetnek növényi és állati eredetű szerves nitrogénforrások vagy olyan természetes források extraktumai, mint a szójaliszt, korpa, földimogyoróliszt, gyapotmagliszt, kazeinhidrolizátum, fermamin, halliszt, kukoricalekvár, pepton, húskivonat, élesztő, élesztőkivonat, malátakivonat és olyan szervetlen nitrogénforrások, mint a nátrium-nitrát, ammónium-nitrát és az ammóniumszulfát. A szénforrásokhoz hasonlóan ezek egyedül és kombinációban is alkalmazhatók. A tipikus mennyiség a táptalaj 0,1-6%-a (tömeg/térfogat).

A táptalaj megfelelő szervetlen sói tartalmazzák mind a fő sóalkotóelemeket, mind pedig a nyomelemeket, előnyösen nátrium-, kálium-, ammónium-, kalcium-, magnézium-, vas-, foszfát-, szulfát-, klorid- és karbonátionokat, és olyan nyomelemeket, mint a kobalt, magnézium és stroncium, vagy olyan sókat, melyek bromid-, fluorid- vagy szilikátiont biztosítanak.

Ismeretes, hogy az Alteromonas rava természetes előfordulása a tengervíz, így ha azt más nem indokolja, az az optimális, ha a tenyésztési körülmények tengeri környezetnek felelnek meg. Ezért előnyös, ha az Alteromonas tenyésztésére alkalmazott táptalaj tartalmazza azokat a nyomelemeket, melyek a tengerben találhatók, így az eljárás előnyös kivitelezési módja szerint a mikroorganizmust tengervíz, mesterséges tengervíz vagy a tengervíznek megfelelő komponensek jelenlétében tenyésztjük.

Ha a mikroorganizmust folyadékkultúrában tenyésztjük, célszerű habzásgátlót, így szilikonolajat vagy növényi olajat, vagy egyéb megfelelő felületaktív anyagot alkalmazni.

Az eljárás egyik előnyös kivitelezési módja szerint az Alteromonas rava SANK 73390 törzs táptalajának pH-ját az 5,0 és 8,0 közötti tartományban tartjuk a tiomarinol B és/vagy C termelése során, bár egyedül azt ítjuk elő, hogy a pH nem gátolhatja a mikroorganizmus növekedését és nem hathat irreverzíbilis módon előnytelenül a végtermékre. A fermentáció leállítására előnyös módon sav vagy lúg feleslegét adjuk a fermentációhoz.

Az Alteromonas rava SANK 73390 törzs általánosságban 4 °C és 32 °C között növekszik, és jól növekszik 17 °C és 26 °C között. Más hőfokot is alkalmazhatunk, mely nincs ebben a tartományban, ha a kifejlesztett törzs növekedni tud alacsonyabb vagy magasabb hőmérsékleten. A tiomarinol B és/vagy C termelésre a 20 °C és 26 °C közötti hőfok az előnyös.

A tiomarinol B-t és/vagy C-t előnyösen aerob tenyészetben állítjuk elő, erre a célra alkalmas bármely aerob technika, így szilárd fázisú, rázott vagy levegőztetettkevert fermentáció.

A kisméretű tenyésztésre általában a több napon keresztül, 20-26 °C-on végzett rázott tenyésztés alkalmas.

A találmány szerinti eljárás egyik előnyös kivitelezési módja szerint az indítóinokulumot egy vagy két lépésben, Erlenmeyer-lombikban állítjuk elő, táptalajként szénforrás és nitrogénforrás kombinációjának alkalmazásával. Az oltólombikot termosztátban rázatjuk 23 °C-on, 1-3 napig, míg kielégítő növekedést nem tapasztalunk. Az így nyert oltótenyészet, vagy egy második oltótenyészet vagy egy termelőtenyészet beoltására használható fel. A második oltótenyészet készítésénél hasonló módon járunk el, és azt részben a termelő táptalaj beoltására használjuk fel. A lombikot, amelyet beoltottunk az oltóanyaggal, megfelelő ideig, például 1-3 napig, a maximális termelés eléréséig rázatjuk megfelelő hőfokon, például a fentiek szerint. Az inkubálás befejezése után a lombik tartalmát lecentrifugáljuk vagy szűqük.

Nagy léptékben végzett tenyésztést célszerű megfelelő levegőztetett-kevert fermentorban végezni. Ebben az eljárásban a táptalajt a fermentorban készítjük el. A 125 °C-on végzett sterilezés után a táptalajt lehűtjük és beoltjuk az inokulummal, amelyet előzőleg steril táptalajon növesztettünk. A tenyésztést kevertetés és levegőztetés mellett, 20-26 C°-on végezzük. Az eljárás alkalmas nagy mennyiségű hatóanyag előállítására.

A tenyészetben a tiomarinol B és/vagy C termelésének időbeli lefutását például nagy felbontóképességű folyadékkromatográfiával lehet nyomon kö verni. Általában mind a tiomarinol B, mind a tiomarinol C termelése 19-200 órás fermentálás után ér el maximumot, míg a tiomarinoltermelés 19-96 óra után.

Megfelelő tenyésztési idő eltelte után a tiomarinol B és/vagy C bármely ismert módszenei izolálható és tisztítható. így például izolálhatjuk a tiomarinol B-t és/vagy C-t olyan módon is, hogy szűrési segédanyagként diatomitot alkalmazva kiszűrjük a fermentléből a szilárd összetevőket vagy lecentrifugáljuk azokat, majd a felülúszót a tiomarinol B vagy C fizikai-kémiai tulajdonságait kiaknázva extraháljuk. így például a szűrletben vagy felülúszóban levő tiomarionol B és/vagy C extrahálható olyan vízzel nem elegyedő oldószenei, mint az etil-acetát, kloroform, etilén-klorid, metilénklorid vagy azok keveréke, mind semleges, mind savas körülmények között, ezt követően pedig tisztítható.

Az eljárás egyik előnyös kivitelezési módja szerint adszorbensként aktív szenet vagy adszorpciós gyantát, például Amberlite (védjegyzett név) XAD-2-t, XAD-4-et (Rohm & Haas) vagy Diaion (védjegyzett név) ΗΡ-10-et, ΗΡ-20-at, CHP-20-at, ΗΡ-50-et (Mitsubishi Kaséi Corporation) alkalmazhatunk. A szennyeződéseket eltávolíthatjuk adszorpcióval, úgy, hogy a tiomarinol B-t és/vagy C-t tartalmazó oldatot átengedjük az adszorbensrétegen, vagy úgy, hogy a tiomarinol B-t és/vagy C-t megkötjük az adszorbensen, majd eluáljuk egy megfelelő oldószenei, így vizes metanollal, vizes acetonnal, vagy butanol/vízzel.

Az intracelluláris tiomarinol B-t és/vagy C-t oldószeres extrakcióval tisztíthatjuk olyan alkalmas oldószenei, mint a vizes aceton vagy a vizes metanol, előnyösen 50-90% (térfogat) koncentrációban, ezt követően eltávolítjuk az oldószert, majd ismét extrahálunk a szüredéknél, illetve felülúszónál leírt eljárással.

Az így nyert tiomarinol B-t, és/vagy C-t ismert módon tisztíthatjuk tovább, például: adszorpciós kromatográfiával, olyan adszorbens alkalmazásával, mint a szilikagél, vagy magnézium-szilikagél, például amelyet a kereskedelemben „Florosil” néven hoznak forgalom6

HU 219 380 Β ba; megoszlási kromatográfiával, olyan adszorbens alkalmazásával, mint a Sephadex LH-20 (Pharmacia védjegyzett terméke); vagy nagy felbontóképességű folyadékkromatográfiával, normálfázisú vagy fordított fázisú oszlopon. A technikában ismert módon ezeket az izolálási és tisztítási eljárásokat alkalmazhatjuk akár egyedül, akár tetszés szerinti kombinációban, szükség szerint akár ismételten is, a kívánt végtermék izolálására és tisztítására.

A találmány szerinti eljárás egy további kivitelezési módja szerint a tiomarinol B-t előállíthatjuk még a tiomarinol oxidációjával is. Ez az eljárás azért előnyös, mivel a tiomarinol B a fermentáció során csak viszonylag kis mennyiségben keletkezik.

Az oxidáció során a tiomarinolt előnyösen egy oxidálószerrel reagáltatjuk valamilyen oldószerben, egy bázis jelenlétében vagy távollétében.

Az oxidálószer jellege nem alapvető a találmány szerinti eljárás szempontjából, bármely általánosan használt oxidálószer alkalmazható a jelen eljárásban is. Ilyenek például a kálium-permanganát, kromátok, mint a kálium-dikromát (kálium-bikromát), nátrium-dikromát (nátrium-bikromát), króm-oxid (VI), króm-klorid és t-butil-kromát; ruténium-tetroxid; halogének, mint a klór, bróm és jód; ózon; oxigén; hidrogén-peroxid; szerves peroxidok, mint a bisz(tetrametil-szilil)-peroxid, kumil-hidroperoxid és t-butil-hidroperoxid; dioxiránok, mint a dioxirán, metil-dioxirán, dimetil-dioxirán, dietildioxirán, etil-metil-dioxirán, metil-propil-dioxirán, butil-metil-dioxirán, fluor-dioxirán, metil-fluor-dioxirán, difluor-dioxirán, bisz(trifluor-metil)-dioxiránok, metil(trifluor-metil)-dioxirán és (trifluor-metil)-(klór-difluor-metil)-dioxirán; szerves persavak és sóik, mint a perecetsav, perhangyasav és m-klór-perbenzoesav; és peroxi-kénsavak, valamint sóik, mint a peroxi-monokénsav, kálium-peroxi-diszulfát és kálium-peroximonoszulfát (különös tekintettel az Aldrich Chemical Co. „Oxone” elnevezésű kereskedelmi termékére). Előnyös oxidálószer a hidrogén-peroxid, szerves persavak, valamint sóik, szerves peroxidok, dioxiránok és peroxikénsavak, valamint sóik, és különösen előnyös a hidrogén-peroxid, a dimetil-dioxirán és a peroxi-kénsav, valamint sói.

Hasonló módon nincs különösebb korlátozás a reakcióban alkalmazott bázis típusa tekintetében, feltéve, hogy nincs káros hatással a reakcióra vagy a reagensekre. Alkalmazható bázisok például szervetlen sók, mint például alkálifém-karbonátok (nátrium-karbonát, kálium-karbonát vagy lítium-karbonát), alkálifém-hidrogén-karbonátok (nátrium-hidrogén-karbonát, káliumhidrogén-karbonát vagy lítium-hidrogén-karbonát), alkálifém-hidridek (lítium-hidrid, nátrium-hidrid vagy kálium-hidrid), alkálifém-hidroxidok (nátrium-hidroxid, kálium-hidroxid, bárium-hidroxid vagy lítium-hidroxid) és alkálifém-fluoridok (nátrium-fluorid, káliumfluorid vagy cézium-fluorid), szerves sók, például alkálifém-alkoxidok (nátrium-metoxid, nátrium-etoxid, kálium-t-butoxid vagy lítium-metoxid), alkálifém-alkilszulfidok (nátrium-metil-szulfid vagy nátrium-etil-szulfid); és nitrogénvegyületek (trietil-amin, tributil-amin, diizopropil-etil-amin, N-metil-morfolin, piridin, 4(N,N-dimetil-amino)-piridin, Ν,Ν-dimetil-anilin, N,Ndietil-anilin, l,5-diazabiciklo[4.3.0]non-5-én (DBN), l,4-diazabiciklo[2.2.2]oktán (DABO) és 1,8-diazabiciklo[5.4.0]undek-7-én (DBU). Különösen előnyös alkálifém-karbonátok és alkálifém-hidrogén-karbonátok alkalmazása.

A reakciót normálkörülmények között célszerű oldószerben végrehajtani. Az oldószer típusának nincs jelentősége, feltéve, hogy nem befolyásolja kedvezőtlenül a reakciót és legalább bizonyos mértékig oldja a reagenseket. Ilyen alkalmas oldószer a víz; alkoholok, mint a metanol, etanol, vagy propanol; ketonok, mint az aceton vagy metil-etil-keton; szerves savak, mint az ecetsav és hangyasav; észterek, mint az etil-acetát; éterek, mint a dietil-éter vagy a tetrahidrofurán; amidok, mint a dimetil-formamid vagy dimetil-acetamid; illetve egy vagy több ilyen oldószer keveréke. Különösen alkalmas oldószerek az alkoholok, valamint víz és ketonok keverékei, különlegesen előnyös a víz-aceton keverék.

Kívánság szerint a reakció felgyorsítása érdekében azt valamilyen szervetlen katalizátor jelenlétében hajtjuk végre, mint a platina-oxid vagy vanádium-oxid, bár a reakció katalizátor nélkül is végbemegy.

A reakció széles hőmérséklet-tartományban végbemegy, így a reakció kiválasztott pontos hőfoka nem alapvető a találmány szempontjából. Általában úgy találtuk, hogy legalkalmasabb, ha a reakciót -78 °C és 100 °C között, célszerűen -10 °C és szobahőfok között végezzük. Hasonló módon a reakcióidő is széles határok között változhat számos tényező függvényében, mint például a reakció hőfoka vagy a reagensek típusa, különös tekintettel az alkalmazott oxidálószerre és a bázisra. Legtöbb esetben azonban a 15 perctől 30 óráig, célszerűen 15 perctől 2 óráig tartó reakcióidő elegendő.

A reakció befejezése után a kívánt terméket hagyományos módszerekkel nyerjük ki a reakciókeverékből. Egyik erre alkalmas módszer szerint a reakciókeveréket vízbe öntjük, valamely vízzel nem elegyedő oldószerrel extraháljuk, mint például egy aromás szénhidrogén (például benzol), éter (például dietil-éter), észter (például etil-acetát) vagy halogénezett szénhidrogén (például metilén-klorid), majd ledesztilláljuk az oldószert az extraktumról. A kapott terméket kívánság szerint tovább tisztítjuk hagyományos módszerekkel, például különböző kromatográfiás eljárásokkal, így oszlopkromatográfiával vagy preparatív vékonyréteg-kromatográfiával.

A tiomarinolt, az oxidációs reakció kiindulási anyagát fermentációval állítjuk elő, melyhez egy Alteromonas genusba tartozó mikroorganizmust, célszerűen Alteromonas rava SANK 73390-et használunk, amint azt a tiomarinol B és C előállításánál már leírtuk.

A tiomarinol B és C Gram-pozitív és Gram-negatív baktériumokkal és mycoplasmával szemben fejt ki antibakteriális hatást állatokban (például: kutya, macska és nyúl), és emberben alkalmazhatók bakteriális vagy mycoplasma-fertőzések kezelésére vagy megelőzésére, a fertőzés jellegétől függően különböző adagolási formában.

HU 219 380 Β

Terápiás célra a vegyületek adagolhatok egyedül vagy megfelelő gyógyszerkészítmény formájában, mely a hatóanyagon kívül egy vagy több hagyományos hígítószert, hordozót, excipienst vagy adalékot tartalmaz. A formuláció jellege természetesen a tervezett adagolási forma függvénye. Perorális adagoláshoz a vegyületet célszerű por, granulátum, tabletta, kapszula vagy szirup formájában kiszerelni. A parenterális adagoláshoz az injekció (mely lehet intravénás, intramuszkuláris vagy szubkután), csepp, kúp, kenőcs és híg kenőcs (linimentum) a célszerű kiszerelési forma.

Ezeket a formulációkat ismert módszerekkel állíthatjuk elő a hatóanyaghoz olyan adalékokat adva, mint vehikulumok, kötőanyagok, szétesést előmozdító anyagok, kenőanyagok, stabilizálószerek, szolubilizálók, illatanyagok, parfümök, szuszpendálószerek és bevonatok. Noha az adagolás a beteg szimptómáinak és korának, a fertőzés jellegének és súlyosságának, valamint a beadás útjának függvénye, perorális adagolás mellett, felnőtt ember esetében a normál napi adag 20 mg és 2000 mg között változhat. Az anyagok adhatók egyetlen dózisban vagy osztott dózisban, például 2-3-szor naponta.

A találmány szerinti eljárást nem korlátozó jelleggel az alábbi példákkal szemléltetjük. A biológiai aktivitásokat a következő tesztpéldák mutatják be. A 6. példa írja le tiomarinol előállítását, melyet kiindulási anyagként használunk a tiomarinol B oxidációs úton történő előállításánál.

1. példa

A tiomarinol B előállítása fermentorban végzett tenyésztéssel

A) Tenyésztés

Az Alteromonas rava SANK 73390 törzset 3 napig 22 °C-on tenyésztettük ferde Maríné Agáron (Difcotermék). Az így nyert tenyészetet felszuszpendáltuk 3 ml mesterséges tengervízben. A kapott szuszpenzió 0,1 ml-ével beoltottunk két 500 ml-es Erlenmeyer-lombikot, melyekbe előzőleg 100-100 ml sterilizált táptalajt tettünk a következő összetételben:

Marina Broth (Difco) 37,4 g ionmentes víz 1000 ml (pH-állítás nem történt).

Ezt követően a tenyészetet 24 óra hosszat inkubáltuk rotációs rázóasztalon (210/perc) 23 °C-on, majd ezzel a tenyészettel oltottuk be a 600 literes levegőztetett, kevert fermentorban levő 200 liter táptalajt, melynek ugyancsak a fenti összetétele volt, és amelyet külön sterilizáltunk. A fermentorban a tenyésztést 26 órán keresztül folytattuk 23 °C-on, 0,5 ttp levegőáramban („térfogat/térfogat/perc”: 1 ttp a percenként befújt levegőmennyiség, mely egyenlő a fermentorban levő levegő térfogatával), 82,5-170/perc keverési sebesség mellett, 5,0 ppm oldottoxigén-koncentráció biztosítása érdekében.

B) Izolálás

A 230 liter fermentléhez annyi vizes sósavat öntöttünk, hogy pH-ja 2,5-re álljon be. A kapott keverékhez ezután 200 liter acetont adtunk, és az extrakciót 0,5 órás keverés mellett folytattuk, majd 4,0 kg Celite 545 szűrési segédanyagot (Jones Manvill Project Corporation, U.

S. A. védjegyzett terméke) adtunk a keverékhez, és leszűrtük. A szüredéket (430 liter) egyszer 200 liter etilacetáttal, majd kétszer 100 liter etil-acetáttal extraháltuk. Az egyesített etil-acetátos extraktumokat 200 liter 5%-os (tömeg/térfogat) vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, majd 100 liter telített, vizes nátrium-klorid-oldattal mostuk, vízmentes nátrium-szulfáton szárítottuk, és ezt követően csökkentett nyomáson szárazra pároltuk. Kitermelés: körülbelül 80 g olaj.

A kapott olaj teljes mennyiségét feloldottuk metilén-kloridban, és az oldatot egy 1,1 kg szilikagélből készített oszlopon adszorbeáltattuk, melyet előzőleg metilén-kloriddal telítettünk. Az oszlopot először metilénklorid és etil-acetát 1:1 térfogatarányú keverékével, ezt követően egyedül etil-acetáttal, végül etil-acetát :metanol = 9:l térfogatarányú keverékével eluáltuk, 500 ml-es frakciókat szedve. A tiomarinol B az etil-acetát-metanol eleggyel eluálódott az oszlopról. Ezeket a frakciókat összegyűjtve, csökkentett nyomáson bepárolva, 60 g olajat nyertünk.

Az így nyert olaj teljes mennyiségét feloldottuk 6 liter 50%-os (térfogat/térfogat) vizes metanolban, és az oldatot 2,3 liter, vízzel telített Diaion HP-20 (védjegyzett név) oszlopon adszorbeáltattuk. Az oszlopot lépésenként gradienseluálással mostuk olyan vizes metanololdatokkal, melyekben a metanol térfogat-koncentrációját fokozatosan 30%-ról 90%-ra emeltük. Részletezve, miután 4-4 liter, 30, 50, 60, 70 és 80%-os vizes metanolt vittünk fel az oszlopra, végül 90%-os vizes metanollal eluáltuk azt. Az eluálást mindaddig folytattuk, míg nagy felbontóképességű folyadékkromatográfiával még anyagot tudtunk kimutatni, ehhez körülbelül 10 liter 90%-os vizes metanolra volt szükség. A 90%-os vizes metanollal eluált frakciókat egyesítettük és csökkent nyomáson bepároltuk. Hozam: 3,8 g sárga por. Ezt a sárga port kromatográfiával tisztítottuk 320 g Sephadex LH-20-szal töltött oszlopon, melyet metilén-klorid: etil-acetát: metanol = 19:19:2 térfogatarányú elegyével telítettünk. A hatóanyagot ugyanezzel az oldószerrendszerrel eluáltuk.

A kapott terméket tovább tisztítottuk nagy felbontóképességű folyadékkromatográfiával, fordított fázisú oszlopon [Senshu-Pak ODS H-5251, a Shenshu Scientifíc Co., Ltd. védjegyzett terméke; oszlopméret: 20 mm-es átmérő, 250 mm hosszú], eluensként 40 térfogat%-os vizes acetonitrilt használva, 15 ml/perces áramlási sebesség mellett. A detektálást 220 nm-en, abszorpció méréssel végeztük. Mivel a tiomarinol Β 13-14 perces retenciós időnél adott maximumot, ezt a frakciót elkülönítettük és csökkent nyomáson szárazra pároltuk. Hozam: 130 g címbeli vegyület, melynek fizikai-kémiai paramétereit már előzőleg felsoroltuk.

2. példa

Tiomarinol B előállítása a tiomarinol oxidációjával

100,9 g tiomarinolt (előállítása 6. példa szerint) feloldottunk 5 ml aceton és 5 ml víz keverékében, majd a kapott oldatot jéggel hűtöttük, hozzáadtunk 112,2 g

HU 219 380 Β

OXONE-t (Aldrich Chemical Co., Inc. kereskedelmi terméke), és a keveréket jéghűtés mellett kevertettük 40 percig. Ezt követően 1,2 ml telített vizes nátriumhidrogén-karbonát-oldatot adtunk a keverékhez, melyet jéghűtés mellett tovább kevertettünk 30 percig. 5 ml víz hozzáadása után a keveréket metilén-klorid és tetrahidrofurán 10:1 térfogatarányú keverékével extraháltuk. Az extraktumot vízmentes nátrium-szulfáton való szárítás után csökkentett nyomáson bepároltuk. A képződő maradékot izoláltuk, és fordított fázisú, nagy felbontóképességű folyadékkromatográfiával (Senshu Pák ODS-5251-N oszlop és 40 térfogat%-os vizes acetonitril eluens) tisztítottuk. Termelés: 79,5 mg (75%) halványsárga tiomarinol B, melynek fizikai-kémiai tulajdonságai megegyeznek a fent felsorolt értékekkel.

3. példa

Tiomarinol B előállítása a tiomarinol oxidációjával A 100 mg tiomarinolt (előállítása 6. példa szerint) feloldottuk 15 ml aceton és 7,5 ml víz elegyében, majd 0,074 ml 35%-os vizes hidrogén-peroxidot és 2 csepp híg, vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldatot adtunk a keverékhez. A reakcióelegyet 5 percig kevertettük, majd csökkentett nyomáson eltávolítottuk az acetont, és acetonitrilt adtunk a maradékhoz. A tiomarinol B képződését fordított fázisú, nagy felbontóképességű folyadékkromatográfiával (Senshu Pák ODS-H-2151es oszlop és 40 térfogat%-os vizes acetonitril eluens) igazoltuk. Az oldószert csökkentett nyomáson végzett desztillációval eltávolítottuk a reakcióelegyből, és a maradékot 40 térfogat%-os vizes acetonitrilben oldottuk fel. A terméket izoláltuk, és fordított fázisú, nagy felbontóképességű folyadékkromatográfiával (Senshu Pák ODS-4251-N-es oszlop és 40 térfogat%-os vizes acetonitril eluens) tisztítottuk. Termelés: 43,2 mg (41%) halványsárga tiomarinol B, melynek fizikai-kémiai tulajdonságai azonosak a fent felsorolt értékekkel.

4. példa

Tiomarinol B előállítása tiomarinol oxidációjával A 100 mg tiomarinolt (6. példa szerint előállítva) feloldottunk 40 ml acetonban, majd jéghűtés és keverés mellett 134 mg m-klór-perbenzoesavat adtunk az oldathoz, és tovább kevertettük szobahőfokon 1,5 óra hosszat. Ekkor a reakcióelegyet metilén-kloriddal extraháltuk, az extraktumot mostuk háromszor vízzel és egyszer nátrium-hidrogén-karbonát vizes oldatával. Az extraktumot vízmentes nátrium-szulfáton szárítottuk, majd az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláltuk. A terméket izoláltuk és fordított fázisú, nagy felbontóképességű folyadékkromatográfiával (Senshu Pák ODS-4251-N-es oszlop és 40 térfogat%-os vizes acetonitril eluens) tisztítottuk. Termelés: 8,5 mg (8%) halványsárga tiomarinol B, melynek fizikai-kémiai tulajdonságai azonosak a fent felsorolt értékekkel.

5. példa

A tiomarinol C előállítása fermentorban végzett tenyésztéssel A) Tenyésztés

Baktériumszuszpenzió előállítása céljából az Alteromonas rava SANK 73390 egy Maríné Agáron (Difco) növesztett ferde tenyészetét hozzáadtuk 10 ml steril

Maríné Broth-hoz (Difco).

liter ugyanilyen Maríné Broth táptalajt 30 literes üvegfermentorban hősterileztünk, majd beoltottuk a fenti baktériumszuszpenzió teljes mennyiségével. A fermentációt 23 °C-on, 7,5 liter/perc levegőáramban végeztük 24 óra hosszat. A kiindulási keverési sebesség 100/perc volt, ezt a későbbiekben úgy szabályoztuk, hogy 5,0 ppm oldottoxigén-koncentrációt biztosítsunk.

Két 600 literes fermentorba 300 liter táptalajt tettünk, melynek összetétele a következő.

Glükóz	1,5%
Bactopeptone (Difco)	1,5%
Bactoyeast extract (Difco)	0,2%
NaCl	3,89%
MgCl₂.6 H₂O	2,52%
Na₂SO₄	0,648%
CaCl₂.2 H₂O	0,4767%
KC1	0,11%
Na₂CO³	0,038%
Ferri-citrát	0,02%
(sterilezés előtt a pH 7,6) A fermentorokat ezután hősterileztük, majd beoltot-

tűk 3-3 liter inokulumtenyészettel és 23 °C-on, 150 liter/perces levegőztetés mellett, 29 óra hosszat fermentáltunk. Az indító keverési sebesség 82/perc volt, amit később úgy szabályoztunk, hogy az 5,0 ppm-es oldottoxigén-koncentrációt biztosítson.

B) Izolálás

A 700 liter fermentléhez annyi vizes sósavat adtunk, hogy pH-ja 3-ra álljon be, majd 700 liter acetonnal elegyítettük, és egy óra hosszat keveréssel extraháltunk. A kapott extraktumot először 700 liter, majd másodszor 300 liter etil-acetáttal extraháltuk. Az egyesített etil-acetátos extraktumokat mostuk először 300 liter 5 vegyes%-os vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, majd 300 liter telített vizes nátrium-klorid-oldattal, végül megszárítottuk vízmentes nátrium-szulfáton. Az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláltuk, miközben 540 g szilikagélt adagoltunk, és úgy pároltuk szárazra.

A kapott maradékot metilén-kloridban szuszpendáltuk, és rávittük egy 4 kg szilikagélből készült, metilénkloriddal telített oszlopra. Az oszlopot növekvő polaritású oldószerelegyekkel eluáltuk a következő sorrendben : metilén-klorid: metilén-klorid-etil-acetát= 1:1 térfogatarányú elegye; etil-acetát: etil-acetát-metanol=9:l térfogatarányú elegye. Kétliteres frakciókat eluáltunk, és a tiomarinol C-t tartalmazó frakciót, mely az etil-acetát-metanol eleggyel eluálódott, elkülönítettük, majd csökkentett nyomáson ledesztilláltuk, miközben 50 g szilikagélt adtunk a frakcióhoz, és úgy pároltuk szárazra.

A kapott maradékot felszuszpendáltuk hexán és aceton keverékében, és a kapott szuszpenziót rávittük egy 200 g szilikagélből készült, hexánnal telített oszlopra. Az oszlopot hexán: aceton =1:1 térfogatarányú oldószerelegyével eluáltuk. 500 ml-es frakciókat szedtünk, az 1. és a 2. frakció tartalmazta a tiomarinol C-t. Az 1.

HU 219 380 Β frakciót csökkentett nyomáson bepároltuk, miközben 25 g szilikagélt adtunk a frakcióhoz, és úgy pároltuk szárazra.

A kapott maradékot felszuszpendáltuk hexán, aceton és etil-acetát 1:1:2 térfogatarányú keverékében, és a kapott szuszpenziót rávittük egy 200 g szilikagélből készült, hexánnal telített oszlopra. Az oszlopot hexán : aceton: etil-acetát = 1:1:2 térfogatarányú oldószerelegyével eluáltuk. 500 ml-es frakciókat szedtünk. A tiomarinol C-t tartalmazó frakciót elkülönítettük, és egyesítettük az előző kromatográfiánál kapott 2. frakcióval. Az egyesített frakciókat csökkentett nyomáson bepároltuk, miközben 20 g szilikagélt adtunk a frakciókhoz, és úgy pároltuk szárazra.

A kapott maradékot felszuszpendáltuk hexán, aceton és etil-acetát 1:1:1 térfogatarányú keverékében, és a kapott szuszpenziót rávittük egy 200 g szilikagélből készült, hexánnal telített oszlopra. Az oszlopot hexán : aceton: etil-acetát=1:1:1 térfogatarányú elegyével eluáltuk. 500 ml-es frakciókat szedtünk. A tiomarinol C-t tartalmazó frakciókat egyesítettük, és csökkentett nyomáson bepároltuk. Olajos terméket kaptunk.

Az egész olajos maradékot ismét kromatografáltuk egy 200 ml Sephadex LH-20-szal töltött és metilénklorid : etil-acetát: metanol = 19:19:2 térfogatarányú elegyével telített oszlopon. Eluensként ugyanezt az oldószerelegyet használtuk. A tiomarinol C-t tartalmazó frakciókat összegyűjtöttük, és csökkentett nyomáson szárazra bepároltuk, miközben 25 g szilikagélt adtunk az elegyhez.

A kapott maradékot felszuszpendáltuk metilén-kloridban, és a szuszpenziót rávittük egy 200 g szilikagélből készített, metilén-kloriddal telített oszlopra. Az oszlopot növekvő polaritású, 9:1-1:9 térfogatarányú metilén-klorid-aceton elegyekkel eluáltuk. Egyliteres frakciókat szedtünk. A tiomarinol C-t tartalmazó frakciókat összegyűjtöttük, és csökkentett nyomáson szárazra pároltuk. Kitermelés 150 mg tiomarinol C, melynek fizikai-kémiai paraméterei megegyeztek a fent említett értékekkel,

6. példa

A tiomarinol előállítása üvegfermentorban végzett fermentációval A) Tenyésztés

Az Alteromona rava SANK 73390-es törzsből ferde tenyészetet készítettünk Maríné Agáron (Difco), 22 °C-on 3 napig végzett tenyésztéssel. A kapott tenyészetet felszuszpendáltuk 3 ml mesterséges tengervízben. A szuszpenzió 0,1 ml-ével, amit steril körülmények között vettünk ki, beoltottunk 100 ml steril táptalajt [37,4 g Maríné Broth (Difco) 1 liter ionmentes vízben, pH-állítás nélkül] egy 500 ml-es Erlenmeyer-lombikban.

A lombikot rázógépen (200/perc, rotációs átmérő 70 mm) inkubáltuk 23 °C-on, 24 óra hosszat. A tenyészet sterilen kivett 15 ml-es részleteivel beoltottunk 4 darab 30 literes üvegfermentort, melyekben 15 liter előbb leírt összetételű steril táptalaj volt. Az üvegfermentorokat 23 óra hosszat inkubáltuk 23 °C-on, 7,5 liter/perc levegőztetés és keverés (100/perc) mellett.

B) Izolálás óra elteltével egyesítettük a fermentorok tartalmát, így összesen 60 liter fermentlét nyertünk. Sósav hozzáadásával a fermentlé pH-ját 3-ra állítottuk, hozzáadtunk 60 liter acetont, majd 30 percen keresztül, keverés mellett extraháltunk. Az elegyet 1,2 kg Celite 545 (Johns Manville Co.) szűrési segédanyaggal szűrtük. A kapott 110 liter szüredéket először 1 x60 liter etil-acetáttal majd 2x30 liter etil-acetáttal extraháltuk. Az egyesített szerves extraktumokat 30 liter 5%-os (tömeg/térfogat) vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, majd ezt követően 30 liter telített vizes nátrium-klorid-oldattal mostuk. Vízmentes nátriumszulfáton való szárítás után a keveréket csökkentett nyomáson szárazra pároltuk, mikor is 14 g olajat nyertünk.

A kapott olaj teljes mennyiségét feloldottuk metilén-kloridban, és az oldatot felvittük egy 200 g szilikagélből készített, metilén-kloriddal telített oszlopra. Növekvő polaritású oldószerkeverékekkel eluáltunk, a következő sorrendben: metilén-klorid:etil-acetát=l: 1 (térfogatarány), egyedül etil-acetát és etil-acetát-metanol 9:1 (térfogatarány). 18 ml-es frakciókat szedtünk. Az etil-acetát-metanol keverékkel eluált frakciókat, melyek a tiomarinolt tartalmazták, elkülönítettük.

Az elkülönített frakciókat szárazra pároltuk. A kapott 7 g olajat feloldottuk 400 ml 50 térfogat%-os vizes metanolban, és felvittük egy 600 ml Diaion ΗΡ-20-szal (Mitsubishi Chem. Ind.) töltött, vízzel telített oszlopra. Az oszlopot 50 térfogat%-os vizes metanollal mostuk, majd a hatóanyagot 90 térfogat%-os vizes metanollal eluáltuk. Az oldószert csökkentett nyomáson bepárolva, 1 g sárga port nyertünk. Ezt a sárga port tovább tisztítottuk Sephadex LH-20 oszlopon, metilén-klorid-etil-acetát-metanol 19:19:2 térfogatarányú elegyével eluálva. Az aktív frakciókból 750 g tiomarinolt nyertünk sárga por formájában.

A kapott tiomarinol a következő fizikai-kémiai tulajdonságokkal rendelkezik.

a) Külső megjelenési forma: sárga por.

b) Olvadáspont: 84-89 °C.

c) Összegképlet: 0₃qH₄₄N₂O₉S₂.

d) Molekulatömeg: 640 (FAB-MS-sel mérve) („FAB-MS” = Fast Atom Bombardment Mass

Spectrometry).

e) Nagy felbontású tömegspektrum:

C₃₀H₄₅N₂O₉S₂ [(M+H)+ FAB-MS-sel mérve]: számított: 641,2567, talált: 641,2585.

f) Elemanalízis:

számított: C, 56,23%; H, 6,92; N, 4,37%;

S, 10,01%;

talált: C, 56,92%; H, 6,82%; N,4,23%;

S, 9,90%.

g) Infravörös-abszorpciós spektrum:

Az infravörös-abszorpciós spektrum kálium-bromid (Kbr)-pasztillában mérve a következő (^vmax^cm_1):

3394, 2930, 1649, 1598, 1526, 1288, 1216, 1154, 1102,1052.

HU 219 380 Β

h) Ultraibolya-abszorpciós spektrum:

Az ultraibolya-abszorpciós spektrum metanolban vagy metanol és sósav elegyében mérve a következő (Xmaxcm-¹):

387 (12 000), 300 (3500), 214 (26 000).

Az ultraibolya-abszorpciós spektrum metanol és nátrium-hidroxid elegyében mérve a következő (^max^m ')·

386 (9600), 306 (3200), 206 (25 000).

i) Faj lagos forgatóképesség:

[a]g=+4,3° (c=l,0, metanol).

j) Nagy felbontóképességű folyadékkromatográfia: Elválasztásra alkalmazott oszlop: Senshu-Pak ODS H-2151 (oszlopátmérő 6 mm, hossz 150 mm; Senshu Scientific Co., Ltd.).

Oldószer: 40 térfogat% vizes acetonitril.

Áramlási sebesség: 1,5 ml/perc.

Hullámhossz: 220-350nm (fotodiódásdetektálás). Retenciós idő: 5,9 perc.

k) *H-magmágneses rezonanciaspektrum (δ ppm):

A hexadeuterált dimetil-szulfoxidban tetrametil-szilán mint belső standard alkalmazásával mért magmágneses rezonanciaspektrum (270 MHz) a következő:

10,68 (1H, széles szingulett);

9,80 (1H, széles szingulett);

7,04 (1H, szingulett);

5,97 (1H, széles szingulett);

5,37 (2H, multiplett);

4,89 (1H, dublett, J=7,3 Hz);

4.63 (1H, dublett, J=3,4 Hz);

4,44 (1H, dublett, 1=1,8 Hz);

4.30 (1H, dublett, J=4,4 Hz);

4,18 (1H, széles dublett, J=7,3 Hz);

4,02 (2H, triplett, J=6,6 Hz);

3,73 (1H, dublettek dublettje);

3.64 (2H, multiplett);

3,52 (2H, multiplett);

3.33 (1H, dublett, J=10,7 Hz);

2.34 (2H, triplett, J=7,3 Hz);

2,09 (3H, multiplett);

2,03 (3H, szingulett);

1,55 (5H, széles multiplett);

1.30 (6H, széles multiplett);

0,95 (3H, dublett, J=5,9 Hz);

0,91 (3H, dublett, J=6,8 Hz).

l) ¹³C-magmágneses rezonanciaspektrum (δ ppm):

A hexadeuterált dimetil-szulfoxidban tetrametil-szilán mint belső standard alkalmazásával mért magmágneses rezonanciaspektrum (68 MHz) a következő:

174,3 (szingulett), 170,4 (szingulett), 168,6 (szingulett), 161,1 (szingulett), 137,9 (szingulett), 135,7 (dublett), 135,1 (szingulett), 129,8 (dublett), 116,3 (dublett), 115,8 (szingulett), 113,7 (dublett), 77,6 (dublett), 74,4 (dublett), 72,1 (dublett), 71,8 (dublett), 66,0 (triplett), 65,7 (dublett), 64,9 (triplett), 45,3 (dublett),

43,9 (dublett), 36,6 (triplett), 33,4 (triplett), 30,1 (triplett), 30,0 (triplett), 29,7 (triplett), 27,0 (triplett), 26,7 (triplett), 20,3 (kvartett), 16,6 (kvartett), 16,3 (kvartett).

m) Oldékonyság:

Oldódik alkoholokban, így például metanolban, etanolban, propanolban és butanolban, valamint dimetil-szulfoxidban, dimetil-formamidban, kloro20 formban, etil-acetátban, acetonban és dietil-éterben. Nem oldódik hexánban és vízben.

n) Színreakciók:

Pozitív színreakció kénsavval, jóddal és kálium-permanganáttal.

o) Vékonyréteg-kromatográfia:

Rférték: 0,57.

Adszorbens: szilikagél (Merck & Co., Inc., Art. 5715).

Kifejlesztő oldószer: metilén-klorid:meta30 nol=85:15-ös térfogatarány.

BIOLÓGIAI AKTIVITÁS

A pszeudomonsav A-val és a tiomarinollal összehasonlítva a tiomarinol B és C biológiai aktivitását az 1. tesztpélda mutatja be.

1. teszt példa

A tiomarinol B és C antibakteriális aktivitása

A tiomarinol, tiomarinol B, tiomarinol C és pszeudomonsav A (továbbiakban „A”, „B”, „C” és „P”-vel je40 lölve) agardiffuziós módszerrel, agar táptalajon (Eiken Chemical Co., Ltd.) mért minimális gátlási koncentrációját (MIC) Gram-pozitív és Gram-negatív mikroorganizmusokkal szemben, pg/ml-ben, a következő 1. táblázat foglalja össze.

1. táblázat

Tcsztbaktérium	MIC (pg/ml)
A	B	C	P
Staphylococcus aureus 209P	<0,01	<0,01	<0,01	0,05
Staphylococcus aureus 56R	<0,01	<0,01	<0,01	0,1
Staphylococcus aureus 535 (MRSa)	<0,01	<0,01	<0,01	0,2
Enterococcus faecalis 681	0,02	0,05	0,8	25
Escherichia coli NIHJ	0,8	0,8	3,1	100
Escherichia coli 609	0,8	0,8	1,5	100
Salmonella enteritidis	0,4	0,4	1,5	50

HU 219 380 Β

1. táblázat (folytatás)

Tcsztbaktérium	MIC (pg/ml)
A	B	C	P
Klebsiella pneumoniae 806	0,8	0,8	1,5	100
Klebsiella pneumoniae 846 (R)	0,2	0,2	0,8	100
Enterobacter cloacae 963	1,5	0,8	3,1	>100
Serratia marcescens 1184	3,1	3,1	6,2	>100
Proteus vulgáris 1420	0,05	0,05	0,2	0,4
Morganella morganii 1510	6,2	6,2	12,5	>100
Pseudomonas aeruginosa 1001	0,2	0,2	0,8	>100
Pseudomonas aeruginosa No. 7	0,4	0,4	0,8	>100
Pseudomonas aeruginosa 3719	-	0,8	0,4	>100

2. tesztpélda

A tiomarinol B és C antimycoplasma-aktivitása

Az 1. tesztpélda szerint eljárva meghatároztuk a tiomarinol, tiomarinol B, tiomarinol C és pszeudomonsav

A (továbbiakban „A”, „B”, „C” és „P”-vei jelölve) aktivitását különböző mycoplasmatörzsekkel szemben. Az eredményeket a 2. táblázat szemlélteti.

2. táblázat

T csztmycoplasma	MIC (pg/ml)
A	B	C	P
Mycoplasma bovis Donetta	0,0125	0,006	<0,006	<0,006
Mycoplasma gallisepticum PG 31	0,05	0,1	0,05	6,25
Mycoplasma gallisepticum K-1	0,05	0,1	0,05	6,25
Mycoplasma hyosynoviae S-16	0,025	-	-	-
Mycoplasma hyorhinis BTS7	-	0,78	1,56	0,39

Inoeuíum: 0,005 ml 10⁵ CFU/ml.

Értékméréshez alkalmazott táptalaj:

A tiomarinol B, tiomarinol C és pszeudomonsav

A biológiai meghatározásához Chanock táptalajt [Proc. 45 Nat. Acad. Sci., 48, 41-49 (1962), 20% lószérumadalékkal kiegészítve] alkalmaztunk minden mikroorganizmus esetében.

A tiomarinolt a következő táptalajon határoztuk meg. Mycoplasma bovis és Mycoplasma gallisepticum: 50

Chanock táptalaj (a fentiek szerint előállítva).

Mycoplasma hyosynoviae: Mucin PPLO* agar táptalaj (15 lószérumadalékkal).

* PPLO (PleuroPneumonia-Like Organism):

CV-mentes PPLO-tenyészet (Difco)	21 g	55
Mucin bakteriológiai táptalaj (Difco)	5g
Desztillált víz	800 ml
Agar Noble (Difco)	12 g
Lószérum	150 ml
25% friss élesztőkivonat	50 ml	60

Tenyésztési körülmények: enyhén aerob, 37C°, 5 nap [BBL gázpakolású módszer (tenyésztés a Becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, MD 2103 USA-féle eldobható C0₂-generátorban)].

Az eredmények egyértelműen bizonyítják, hogy a tiomarinol B és C kitűnő antibakteriális és antimycoplasma-aktivitást mutat, mely legalább olyan szintű, mint a tiomarinolé, és általában jelentős mértékben jobb, mint a pszeudomonsav A-é.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. A (B2) képletű tiomarinol B elnevezésű vegyület.
2. Az 1. igénypont szerinti tiomarinol B elnevezésű vegyület, azzal jellemezve, hogy fizikai-kémiai tulajdonságai a következők:

a) külső megjelenési forma: sárga por;

b) összegképlet: C₃₀H4₄N₂O₁iS₂;

HU 219 380 Β

c) molekulatömeg: 672 (FAB-MS-sel mérve); „FAB-MS”=Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry;

d) nagy felbontóképességű tömegspektrometria C₃₀H₄₅N₂O|,S2 [(M+H)⁺; FAB-MS-sel mérve): talált 673,2468, számított 673,2465;

e) elemanalízis:

C30H44N ₂O | j S₂+H₂O-ra számított: C, 52,16%; H, 6,71%; N, 4,06%;

S, 9,28%;

talált: C, 52,34%; H, 6,79%; N, 3,92%;

S, 9,02%;

f) infravörös-abszorpciós spektrum: v_max cm-':

Az infravörös-abszorpciós spektrum káliumbromid (KBr)-pasztillában mérve a következő: 3660, 3503, 3318, 3075, 2966, 2928, 2870, 1704, 1653, 1509, 1467, 1381, 1349, 1299, 1217, 1199, 1152, 1112, 1063, 1047, 1019, 975, 949, 884, 839, 764, 730, 660, 609, 553;

g) ultraibolya-abszorpciós spektrum, v_max nm (ε):

az ultraibolya-abszorpciós spektrum 1-propanolban mérve a következő:

377 (2900), 301 (13 000), 215 (21 000);

az ultraibolya-abszorpciós spektrum 1-propanol és sósav elegyében mérve a következő:

377 (2900), 301 (13 000), 223 (17 000);

az ultraibolya-abszorpciós spektrum 1-propanol és nátrium-hidroxid elegyében mérve a következő: 377 (2900), 301 (13 000), 221 (19 000).

h) fajlagos forgatóképesség:

[a]²D⁵=+7,7° (c=l,0,1-propanol);

i) nagy felbontóképességű folyadékkromatográfia: elválasztásra alkalmazott oszlop: Senshu-Pak ODS H-2151 (oszlopátmérő 6 mm, hossz 150 mm, a Senshu Scientifíc Co., Ltd. védjegyzett terméke) oldószer: 40 térfogat%-os vizes acetonitril, áramlási sebesség: 1,5 ml/perc, retenciós idő: 8,4 perc;

j) 'H-magmágneses rezonanciaspektrum (δ: ppm):

a hexadeuterált dimetil-szulfoxidban tetrametil-szilán mint belső standard alkalmazásával mért magmágneses rezonanciaspektrum (360 MHz) a következő:

11.28 (1H, széles szingulett);

10,47 (1H, szingulett);

7,23 (1H, szingulett);

5,97 (1H, szingulett);

5,37 (2H, multiplett);

4,88 (1H, dublett, J=7,5 Hz);

4,61 (1H, széles szingulett);

4.43 (1H, dublett, J=7,2 Hz);

4.28 (1H, dublett, J=3,6 Hz);

4,18 (1H, dublett, J=7,2 Hz);

4,02 (2H, triplett, J=6,6 Hz);
3,74 (1H, széles szingulett);

3,64 (1H), 3,61 (1H), 3,54 (1H), 3,51 (1H);

3,35 (1H, dublett, J=10,9 Hz);

2.43 (2H, triplett, J=7,3 Hz);

2,12 (1H), 2,09 (1H), 2,03 (1H);

2,02 (3H, szingulett);

1,61 (1H), 1,58 (2H), 1,50 (2H), 1,32 (2H),

1,30 (2H), 1,25 (2H);

0,96 (3H, dublett, J=6,3 Hz);

0,92 (3H, dublett, J=6,9 Hz).

k) ¹³C-magmágneses rezonanciaspektrum (δ: ppm):

a hexadeuterált dimetil-szulfoxidban tetrametil-szilán mint belső standard alkalmazásával mért magmágneses rezonanciaspektrum (90 MHz) a következő:

173,5 (szingulett), 166,1 (szingulett), 165,7 (szingulett),

160.8 (szingulett), 143,2 (szingulett), 134,2 (dublett),

127.8 (dublett), 123,3 (szingulett), 115,2 (szingulett), 114,4 (dublett), 109,4 (dublett), 76,2 (dublett), 72,4 (dublett), 69,6 (dublett), 69,3 (dublett), 64,3 (triplett),

63,9 (dublett), 63,0 (triplett), 43,2 (dublett), 42,2 (dublett), 34,7 (triplett), 31,9 (triplett), 28,3 (triplett), 28,2 (triplett), 28,1 (triplett), 25,3 (triplett), 24,5 (triplett), 20,0 (kvartett), 15,7 (kvartett), 15,6 (kvartett);

l) oldékonyság:

oldódik alkoholokban, így például metanolban, etanolban, propanolban és butanolban, valamint dimetil-szulfoxidban, dimetil-formamidban, kloroformban, etil-acetátban, acetonban és dietil-éterben; nem oldódik hexánban és vízben;

m) vékonyréteg-kromatográfia:

Rférték: 0,52, adszorbens: szilikagél (Merck & Co., Inc., Art.

5715), kifejlesztő oldószer: metilén-klorid: metanol=85:15 térfogatarányban.

3. A (C) képletű tiomarinol C elnevezésű vegyület.
4. Eljárás az 1. vagy 2. igénypont szerinti vegyület előállítására, azzal jellemezve, hogy egy tiomarinol B-t termelő, Alteromonas genusba tartozó mikroorganizmust tenyésztünk, majd a tenyészetből izoláljuk a tiomarinol B-t.
5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alkalmazott mikroorganizmus Alteromonas rava.
6. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alkalmazott mikroorganizmus Alteromonas rava SANK 73390, melynek letéti száma a FERM BP-3381 szám.
7. Eljárás a 3. igénypont szerinti vegyület előállítására, azzal jellemezve, hogy egy tiomarinol C-t termelő, Alteromonas genusba tartozó mikroorganizmust tenyésztünk, majd a tenyészetből izoláljuk a tiomarinol C-t.
8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a mikroorganizmus Alteromonas rava.
9. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alkalmazott mikroorganizmus Alteromonas rava SANK 73390, melynek letéti száma FERM BP-3381.
10. Eljárás az 1. vagy 2. igénypont szerinti vegyület előállítására, azzal jellemezve, hogy a tiomarinolt oxidáljuk.
11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az oxidációhoz a következő csoport oxidálószereiből választunk ki reagenst: kálium-permanganát, kromátok, ruténium-tetroxid, halogének, ózon, oxigén,

HU 219 380 Β hidrogén-peroxid, szerves peroxidok, dioxiránok, szerves persavak és sóik és peroxikénsavak és sóik.
12. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az oxidációhoz a következő csoport oxidálószereiből választunk ki reagenst: hidrogén-peroxid, szerves persavak és sóik, szerves peroxidok, dioxiránok, valamint peroxikénsavak és sóik.
13. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az oxidációhoz a következő csoport oxidálószereiből választunk ki reagenst: hidrogén-peroxid, dimetil-dioxiránok, valamint peroxikénsavak és sóik.
14. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az oxidációhoz a következő csoport oxidálószereiből választunk ki reagenst: kálium-permanganát, kálium-dikromát, nátrium-dikromát, króm(VI)-oxid, kromil-klorid, t-butil-kromát, ruténium-tetroxid, klór, bróm, jód, ózon, oxigén, hidrogén-peroxid, bisz(trimetil-szilil)-peroxid, kumil-hidroperoxid, t-butil-hidroperoxid, dioxirán, metil-dioxirán, dimetil-dioxirán, dietildioxirán, etil-metil-dioxirán, metil-propil-dioxirán, butil-metil-dioxirán, fluor-dioxirán, metil-fluor-dioxirán, difluor-dioxirán, bisz(trifluor-metil)-dioxirán, metil-(trifluor-metil-dioxirán, (trifluor-metil)-(klór-difluor-metil)-dioxirán, perecetsav, perhangyasav, m-klór-perbenzoesav, peroxi-monokénsav, kálium-peroxi-diszulfát és kálium-peroxi-monoszulfát.
15. Készítmény, azzal jellemezve, hogy az 1. vagy

2. igénypont szerinti vegyületet, valamint egy gyógyászatilag alkalmazható hordozóanyagot tartalmaz.
16. Készítmény, azzal jellemezve, hogy a 3. igénypont szerinti vegyületet, valamint egy gyógyászatilag alkalmazható hordozóanyagot tartalmaz.