NO300736B1 - Kjemisk forbindelse benevnt "Tiomarinol", biologisk ren kultur av Alteromonas rava stamme SANK 73390, og fremgangsmåte til fremstilling av forbindelsen - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en forbindelse benevnt "Tiomarinol", som har formelen som er vist nedenfor. Oppfinnelsen vedrører også fremgangsmåter til fremstilling av tiomarinol ved fermentering under anvendelse av en mikroorganisme av slekten Alteromonas, særlig en stamme av den nye art Alteromonas rava, betegnet SANK 73390, som selv er ny og utgjør en del av den foreliggende oppfinnelse. Tiomarinol har forskjellige terapeutiske, særlig antibakterielle, virkninger, og oppfinnelsen vedrører også preparater for terapi og profylakse inneholdende denne forbindelse.

Organismer av slekten Alteromonas kan isoleres fra sjøvann, og noen har vist seg å produsere forbindelser av potensiell terapeutisk anvendelse. F.eks. er en forbindelse som er kjent som Viscabelin oppnådd fra en av artene av Alteromonas og har vist seg å ha antitumoraktivitet (japansk patentsøknad Sho 63-27484).

Når det gjelder strukturen til tiomarinol er det kjent atskillige antibiotiske substanser med lignende struk-turer, og disse kan deles i tre grupper.

Den første gruppe omfatter pseudomoninsyrene som først ble isolert fra Pseudomonas spp. Disse omfatter pseudomoninsyre A (fremstilt ved hjelp av Pseudomonas fluorescens, beskrevet i J. Chem. Soc. Perkin Trans., I. 1977, p. 294), pseudomoninsyre B (samme publikasjon, 1977, p. 318), pseudomoninsyre C (samme publikasjon, 1982, p. 2827) samt pseudomoninsyre D (samme publikasjon, 1983, p. 2655). Pseudomoninsyre A markedsføres under navnet "Bacroban" (Beecham) i form av en 2 prosentig dermatologisk salve for antibakteriell anvendelse.

Andre pseudomoninsyrederivater er blitt oppnådd fra marine bakterier (Am. Chem. Soc. Abstr. Pap., 200 (2), 1990), men i denne publikasjon angis det ikke noe om antibakteriell aktivitet.

Den andre gruppe substanser som har lignende struktur som forbindelsene ifølge den foreliggende oppfinnelse omfatter den gruppe som inkluderer antibiotikaene holomycin (Heiv.

Chim. Acta, Vol 42, 1959, p. 563), pyrrotin (J. Am. Chem.

Soc, Vol 77, 1955, p. 2861), tiolutin (Angew. Chem., Vol 66, 1954, p. 745), aureotricin (J. Am. Chem. Soc, Vol 74, 1952, p. 6304), og andre. Disse antibiotika fremstilles typisk ved hjelp av actinomycetes og er kjennetegnet ved en svovelholdig kromofor. Xenorhabdiner I - V er substanser som er beslektet med holomycin og er også blitt isolert fra bakterier og er beskrevet i WI 84/01775.

Forskjellige studier av derivater av disse to grupper er blitt utført, men beskrivelse av en substans som har mole-kylstrukturen til tiomarinol eller som er kjennetegnet ved dens egenskaper er ikke kjent.

Den tredje gruppe av forbindelser er beskrevet i publikasjoner såsom japanske patentsøknader 52-102279, 54-12375, 54-90179, 54-103871 og 54-125672, hvor det beskrives pseudomoninsyrederivater som har lignende struktur som tiomarinol men hvor karboksylendegruppen er erstattet av en amido-gruppe. Disse forbindelser har ikke sammenlignbar antibakteriell aktivitet og oppviser ikke et bredt spektrum av antibakteriell aktivitet. Faktisk har disse forbindelser en ten-dens til å ha svakere antibiotisk aktivitet enn den opprin-nelige pseudomoninsyre.

Ingen av forbindelsene som er beskrevet ovenfor er isolert fra Alteromonas spp. og ingen er identisk med tiomarinol. F.eks. er ett av de strukturelle trekk ved tiomarinol nærværet av en OH-gruppe mellom den seksleddete ring og den a, p-umettede karbonylgruppe. Følgelig avviker tiomarinol klart fra kjente forbindelser.

Det er et formål med den foreliggende oppfinnelse å frembringe en forbindelse som har forbedret effektivitet og et bredere spektrum av antibakteriell aktivitet sammenlignet med gruppen av antibiotika som er beskrevet ovenfor.

Oppfinnelsen angår således en forbindelse, hvilken forbindelse er kjennetegnet ved at den har formelen (I):

Oppfinnelsen vedrører også en biologisk ren kultur av Alteromonas rava stamme SANK 73390, som er kjennetegnet ved at stammen er identifisert ved aksesjonsnummer FERM BP-3381.

Oppfinnelsen vedrører også et farmasøytisk preparat som inneholder tiomarinol i blanding med en farmasøytisk akseptabel bærer eller tynningsmiddel.

Dessuten vedrører oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av tiomarinol, hvilken fremgangsmåte er kjennetegnet ved dyrkning av mikroorganismen Alteromonas rava stamme SANK med aksesjonsnummer FERM BP-3381 eller mutanter derav med vesentlig de samme morfologiske og biokjemiske egenskaper under aerobe betingelser i et næringsmedium som inneholder kilder av karbon, nitrogen og uorganiske salter, ved en pH mellom 5,0-8,0 og en temperatur fra 4 °C - 32 °C, og forbindelsen blir isolert og renset fra kulturkraften på vanlig måte.

For behandling eller profylakse av bakterielle infek-sjoner administreres en effektiv mengde av tiomarinol til et pattedyr, som kan være et menneske, som lider av eller er utsatt for en slik infeksjon.

Det er klart av formelen ovenfor at tiomarinol inneholder et antall asymmetriske karbonatomer og atskillige dobbeltbindinger. Isomerisering er særlig mulig i den a, (3-umettede karbonyldel av tiomarinol. Tiomarinol kan derfor danne forskjellige optiske og geometriske isomerer. Selv om danne forskjellige optiske og geometriske isomerer. Selv om alle disse her er representert ved hjelp av én eneste molekylformel omfatter oppfinnelsen både de individuelle, isolerte isomerer og blandinger derav, inklusive racemater. Når det benyttes stereospesifikke fremstillingsmetoder eller det anvendes optisk aktive forbindelser som utgangsmaterialer kan individuelle isomerer fremstilles direkte. På den annen side kan de individuelle isomerer oppnås ved konvensjonelle spalt-ningsmetoder dersom det fremstilles en blanding av isomerer.

Naturlig forekommende tiomarinol vil være tilbøyelig til å innta en standard optisk konfigurasjon. Selv om andre konfigurasjoner frembringes foretrekkes følgelig den naturlige konf igurasj on.

Tiomarinol kan fremstilles ved dyrking av en tiomari-nolproduserende mikroorganisme av slekten Alteromonas og deretter utvinning av tiomarinol fra dyrkingsmediet. Varianter av tiomarinol, som har den nødvendige antibakterielle aktivitet kan oppnås på lignende måte fra andre stammer eller arter av Alteromonas som produserer den nødvendige forbindelse, eller de kan oppnås ved egnet modifisering av en forbindelse som er oppnådd ved fermentering slik som beskrevet eller de kan fremstilles direkte kjemisk.

Spesielt anvendes som mikroorganisme den nye art Alteromonas rava, nemlig nylig isolerte stamme av Alteromonas rava som er gitt stammebetegnelsen SANK 73390. Stammen SANK 73390 er en marin mikroorganisme som ble isolert fra sjøvann oppsamlet ved stranden Koina, Minami-Izu Machi, Shizuoka Prefecture, Japan, og denne stamme er blitt deponert hos the Deposition Institute, Research Institute of Microbiological Technology, Agency of Industrial Science & Technology, Japan, 30. april 1991 med aksessjonsnummeret FERM BP-3381, ifølge Budapest-konvensj onen.

De taksonomiske egenskaper til Alteromonas rava stamme SANK 73390 er vist nedenfor.

1. Morfologiske karakteristika

Alteromonas rava stamme SANK 73390 ble dyrket i 24 timer ved 23°C på Marin Agar (Difco). Etterfølgende mikro-skopisk iakttakelse viste at cellene var stavlignende av form, og hver var fra 0,8 til 1,0 um i diameter og fra 2,0 til 3,6 um lang. Denne stamme er Gram-negativ og beveger seg ved hjelp av et polart flagellum med bare én svingtråd.

2. Vekst på marin agar

SANK 73390 ble dyrket i 24 timer ved 23°C på marin agar (Difco). De resulterende kolonier var lys gråaktig gule av farge, opake, sirkulære, flate og hele. Vannløselig pigment ble ikke dannet.

3. Fysiologiske egenskaper

4. Kjemotaksonomisk karakter

Under hensyntagen til de taksonomiske karakteristika som er vist ovenfor ble Alteromonas rava stammen SANK 73390 sammenlignet med de stammer som er beskrevet i Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Vol 1, 1984, og med de stammer som er beskrevet i senere utgaver av International Journal of Systematic Bacteriology. Det viste seg at Alteromonas rava stamme SANK 73390 hadde visse likheter med Alteromonas citrea, en annen marin mikroorganisme. SANK 73390 og Alteromonas citrea, ATCC 29719 (en standardstamme) ble dyrket på sammenlignbar måte og sammenlignet.

Sammenlignet med den svakt gråaktig gule farge av SANK 73390 var koloniene av ATCC 29719 grønnaktig gul i farge. SANK 73390 avvek også fra Alteromonas citrea i vekst ved 4°C og i evnen til å utnytte trehalose og natriumpropionat som karbonkilder.

Følgelig er Alteromonas rava stamme SANK 73390 en ny stamme av den nye art Alteromonas rava og avviker i vesentlige karakteristika fra den nærmest kjente art som er deponert med aksessjonsnummeret ATCC 29719.

De ovenfor beskrevne karakteristika er typiske for SANK 73390. Men det er velkjent at karakteristika til Alteromonas spp. er foranderlige, både naturlig og kunstig. Karakteristika som er definert ovenfor definerer stammen av Alteromonas rava slik som deponert, men er ikke nødvendigvis typiske for andre arter av Alteromonas eller av stammer av Alteromonas rava som er i stand til å produsere tiomarinol eller en naturlig forekommende variant derav.

Det vil forstås at SANK 73390 eller enhver annen stamme som er i stand til å produsere en tiomarinol eller en variant derav kan sub-dyrkes eller forandres eller modifiseres bioteknologisk slik at det dannes en organisme med andre karakteristika. Den eneste fordring er at den resulterende organisme er i stand til å produsere den nødvendige forbindelse.

Slike forandringer og modifikasjoner kan ha enhver ønsket form eller kan være følge av slike betraktninger som f.eks. dyrkingsbetingelser. Stammer kan modifiseres ved dyrking og valgt slik at de oppviser slike karakteristika som økt vekst eller vekst ved lavere/høyere temperaturer.

Bioteknologiske modifikasjoner vil vanligvis være tilsiktet og kan bevirke valgbare karakteristika, såsom bakte-riostatresistens eller -mottakelighet eller kombinasjoner derav for å bibeholde renhet eller å muliggjøre rensing av kulturer, særlig kimkulturer, fra tid til annen.

Andre karakteristika som kan frembringes ved genetisk manipulering er enhver som er tillatelig i Alteromonas spp. F.eks. kan plasmider som bevirker resistenser inkorporeres, eller vilkårlig naturlig forekommende plasmider kan fjernes. Fordelaktige plasmider omfatter de som gir auksotrofi. Plasmider kan oppnås fra enhver egnet kilde eller kan konstrueres ved isolering av naturlig forekommende Alteromonas-plasmid og innføring av ett eller flere ønskelige gener fra en annen kilde. Naturlige plasmider kan også modifiseres på vilkårlig annen måte som kan anses for å være ønskelig.

For å oppnå tiomarinol fra en kultur av en egnet mikroorganisme bør mikroorganismene fermenteres i et egnet medium. Slike medier er generelt velkjente på området og vil ofte anvendes ved fremstillingen av andre fermenteringspro-dukter.

Typisk vil det være nødvendig at mediet inneholder en kombinasjon av en karbonkilde, en nitrogenkilde og én eller flere uorganiske salter som er assimilerbare ved hjelp av den relevante mikroorganisme. Den minste fordring til mediet vil være at det inneholder de bestanddeler som er essensielle for veksten av mikroorganismen.

Egnete karbonkilder omfatter glukose, fruktose, maltose, sukrose, mannitol, glycerol, dekstrin, havremel, rug, maisstivelse, potet, maispulver, soyabønnepulver, bomullsfrø-olje, sirup, sitronsyre og vinsyre, som kan anvendes alene eller i kombinasjon med én eller flere andre. Typiske mengder vil være i et område fra 1 til 10% vekt/volum av mengden medium, selv om mengden kan varieres etter ønske og i overensstemmelse med det ønskede resultat.

Egnete nitrogenkilder omfatter enhver substans som inneholder et protein f.eks.. Representative eksempler på nitrogenkilder er organiske nitrogenkilder fra dyr og planter og kan være ekstrakter fra slike naturlige kilder som soyabøn-nepulver, kli, jordnøttpulver, bomullsfrøpulver, kaseinhydro-lysat, fermamin, fiskepulver, maisstøpevæske, pepton, kjøtt-ekstrakt, gjær, gjærekstrakt og maltekstrakt, samt fra slike uorganiske nitrogenkilder som natriumnitrat, ammoniumnitrat og ammoniumsulfat. Som med karbonkilden kan disse anvendes alene eller i kombinasjon. Egnete mengder er typisk i et område fra 0,1 til 6% vekst/volum av mengden medium.

Egnete uorganiske næringssalter er de som tilfører sporelementer og hovedbestanddelen i saltet. Fortrinnsvis skal saltene tilføres slike ioner som natrium, kalium, ammonium, kalsium, magnesium, jern, fosfat, sulfat, klorid og karbonat. Slike spormetaller som kobolt, mangan og strontium eller salter som er i stand til å tilføre slike ioner som bromid, fluorid, borat eller silikat kan også foreligge.

Det vil forstås at Alteromonas rava opptrer naturlig i sjøvann, slik at uten indikasjoner på det motsatte vil betingelser for dens dyrking ideelt sett tilsvare et marint miljø. Således inneholder sporioner som finnes i sjøen med fordel i ethvert medium som anvendes for dyrkingen av Alteromonas .

Dersom mikroorganismen fermenteres som en væskeformet kultur foretrekkes det at det anvendes et antiskummingsmiddel, såsom en silikonolje eller vegetabilsk olje eller et annet

egnet overflateaktivt stoff.

Det foretrekkes at pH i dyrkingsmediet for Alteromonas rava stamme SANK 73390 når den anvendes til fremstilling av tiomarinol holdes i pH-området 5,0-8,0, selv om den eneste fordring er at pH ikke skal hindre vekst av mikroorganismen eller irreversibelt påvirke sluttproduktets kvali-tet ugunstig. Det kan være å foretrekke å tilsette et over-skudd av en syre eller et alkali for å stoppe fermentering.

Alteromonas rava stamme SANK 73390 vokser generelt ved temperaturer i området fra 4°C til 32°C og vokser godt ved fra 17°C til 26°C. Andre temperaturer som ikke ligger i disse områder kan benyttes når det har vært utviklet en stamme som kan vokse ved lavere eller høyere temperaturer. For fremstillingen av tiomarinol er en foretrukket temperatur mellom 20°C og 26°C.

Tiomarinol oppnås ideelt ved aerobisk dyrking, og enhver egnet aerobisk dyrkingsmetode, såsom f.eks. fast kultur, rystet kultur eller luftet-rystet kultur kan anvendes.

Dersom dyrkingen utføres i liten skala foretrekkes vanligvis rystet kultur som fermenteres i atskillige dager ved fra 20°C til 26°C.

For å starte en fermenteringsdyrking anvendes det i en foretrukket metode et startinokuleringsmedium i ett eller to trinn i f.eks. en Erlenmeyer-kolbe. En karbonkilde og en nitrogenkilde kan anvendes i kombinasjon til dyrkingsmediet. Kimkolben rystes i en termostatisk inkubator ved 23°C i fra 1 til 3 dager inntil det er iakttatt tilstrekkelig vekst. Den resulterende kimkultur kan deretter anvendes til å inokulere en andre kimkultur eller en produserende kultur. Dersom det anvendes en andre kimkultur kan denne behandles på en lignende måte og anvendes delvis til inokulering av produksjonsmediet. Kolben hvori kimen inokuleres rystes i fra 1 til 3 dager eller inntil maksimal produksjon er oppnådd, ved en egnet temperatur. Når inkubering er fullført kan innholdene i kolben opp-samles ved sentrifugering eller filtrering.

Dersom dyrkingen utføres i stor skala kan dyrking i en egnet luftings-omrøringsfermentor være å foretrekke. Ved denne fremgangsmåte kan næringsmediet fremstilles i en fermen-tor. Etter sterilisering ved 125°C avkjøles mediet og tilføres kim med et inokuleringsmedium som på forhånd har vokst på et sterilisert medium. Dyrkingen utføres ved fra 20 til 26°C under omrøring og lufting. Denne fremgangsmåte er egnet for å oppnå en stor mengde av forbindelsen.

Mengden tiomarinol som dannes med tiden under dyrkingen kan overvåkes ved f.eks. væskekromatografi. Generelt når mengden tiomarinol som dannes et maksimum etter et tidsrom på mellom 19 timer og 96 timer.

Etter et passende dyrkingstidspunkt kan tiomarinolen isoleres og renses på kjent måte. F.eks. kan tiomarinol i dyrkingsmediet oppnås ved avfiltrering av faststoffene under anvendelse av diatomitt som en filtreringshjelper, eller ved sentrifugering og etterfølgende ekstrahering fra supernatanten med rensing i overensstemmelse med tiomarinols fysikokjemiske egenskaper. F.eks. kan tiomarinol i filtratet eller supernatanten ekstraheres med et ikke-vannblandbart organisk løsningsmiddel, såsom etylacetat, kloroform, etylenklorid, metylenklorid eller en vilkårlig blanding av disse under nøytrale eller sure betingelser, og renses.

Alternativt kan det som en adsorbent anvendes aktivt karbon eller en adsorberende harpiks, såsom "Amberlite" XAD-2 eller XAD-4 (Rohm and Haas) eller "Diaion" HP-10, HP-20, CHP-20 eller HP-50 (Mitsubishi Kasei Corporation). Urenheter kan fjernes etter adsorpsjon ved å lede væsken som inneholder tiomarinolen gjennom et lag av adsorbent, eller tiomarinol kan renses etter absorpsjon ved eluering med et egnet eluerings-middel, såsom vandig metanol, vandig aceton eller butanol/ vann.

Intracellulær tiomarinol kan renses ved ekstraksjon med et egnet løsningsmiddel, såsom 50-90% vandig aceton eller vandig metanol, med etterfølgende fjerning av det organiske løsningsmiddel etterfulgt av ekstraksjon slik som beskrevet ovenfor av filtratet eller supernatanten.

Den resulterende tiomarinol kan renses ytterligere ved velkjente metoder, f.eks. adsorpsjonskolonnekromatografi under anvendelse av en bærer, såsom silikagel eller magnesium-silikagel, f.eks. den som selges under varemerket "Florisil", delingskolonnekromatografi under anvendelse av en adsorbent, såsom "Sephadex" LH-20 (Pharmacia), eller væskekromatografi under anvendelse av en kolonne med normal fase eller omvendt fase. Slik det er velkjent på området kan disse isolerings- og rensemetoder utføres alene eller i vilkårlig egnet kombinasjon, og dersom det er ønskelig gjentatte ganger, for å iso-lere og rense det ønskede sluttprodukt.

Når forbindelsen ifølge oppfinnelsen er beregnet for terapeutisk anvendelse kan den administreres alene eller i et egnet farmasøytisk preparat som inneholder i tillegg til den aktive forbindelse én eller flere konvensjonelle tynnere, bærere, eksipienser eller hjelpestoffer. Preparatets natur vil selvfølgelig avhenge av den beregnete administreringsmåte. Men for den orale administrering formuleres forbindelsen fortrinnsvis som pulver, granulat, tablett, kapsel eller sirup. For parenteral administrering formuleres den fortrinnsvis som en injeksjon (som kan være intravenøs, intramuskulær eller sub-kutan) eller som dråper eller stikkpiller.

Preparatene kan fremstilles på kjent måte ved tilsetning av slike tilsetningsmidler som vehikler, bindemidler, oppsmuldringsmidler, smøremidler, stabilisatorer, korrigentia, løseliggjørende midler, suspenderingsmidler eller beleggings-midler. Selv om doseringen varierer avhengig av symptomene og alderen til pasienten, infeksjonens natur og hvor alvorlig den er samt administreringsveien og -måten kan forbindelsene ifølge oppfinnelsen vanligvis administreres i en daglig dose på fra 20 mg til 2000 mg. Forbindelsene kan administreres i én eneste dose eller i delte doser, f.eks. to eller tre ganger pr. dag.

Som følge av at tiomarinol oppviser en antibakteriell effekt mot Gram-positive og Gram-negative bakterier i dyr, (f.eks. menneske, hund, katt og kanin) vil det ofte være ønskelig å anvendes ved topisk administrering, typisk i form av en krem, en salve eller en gel. Tilsvarende betraktninger for bestanddelene og fremstillingen av disse administrerings-former gjelder slik som for de ovenfor.

Fremstillingen av tiomarinol og dens antibakterielle aktivitet vil bli nærmere belyst i de etterfølgende eksempler.

EKSEMPEL 1

Krukkefermentering av tiomarinol

A) Dyrking

Alteromonas rava stamme SANK 73390 ble dyrket i 3 dager ved 22°C på en skrå marin agar (produkt fra Difco). Den resulterende kultur ble suspendert i 3 ml kunstig sjøvann. 0,1 ml av suspensjonen ble tatt aseptisk og inokulert en 500 ml Erlenmeyer-kolbe som inneholdt 100 ml sterilisert medium [37,4 g Marine Broth (produkt fra Difco) i 1 liter avionisert vann, pH ikke regulert].

Kolben ble inkubert i 24 timer ved 24°C under rysting ved 200 omdr./min. (rotasjonsradius på 70 mm) under anvendelse av en roterende rystemaskin. Etter dette tidsrom ble hver av fire 30 liters krukkefermentorer som hver inneholdt 15 liter av det ovenfor beskrevne sterile medium inokulert med 15 ml av kulturen som ble tatt aspetisk fra Erlenmeyer-kolben. Krukke-fermentorene ble inkubert i 23 timer ved 23°C ved en luftings-hastighet på 7,5 l/min. under omrøring ved 100 omdr./min.

B) Isolering

Etter 23 timer ble innholdene i fermentorene kom-binert, hvorved det ble oppnådd 90 liter kulturvæske. Væskens pH ble deretter regulert til en verdi på 3 ved tilsetning av saltsyre, etterfulgt av tilsetning av 60 liter aceton, og blandingen ble ekstrahert i 30 minutter under omrøring. Under anvendelse av 1,2 kg "Celite" 545 filtreringshjelper ble løs-ningen filtrert. 110 liter av det resulterende filtrat ble deretter ekstrahert med 60 liter etylacetat og to ganger med etylacetat med 30 liter hver gang. Det organiske sjikt ble vasket med 30 liter av en 5 prosentig vekt/volum vandig natriumhydrogenkarbonatløsning og deretter med 30 liter mettet vandig natriumkloridløsning, tørket over vannfritt natrium-sulfat og konsentrert til tørr tilstand ved inndampning under senket trykk, hvorved det ble oppnådd 14 g av en oljeaktig substans.

Den oppnådde oljeaktige substans ble løst i metylenklorid, og løsningen ble adsorbert på en kolonne som var pakket med 200 g silikagel i metylenklorid. Målforbindelsen ble eluert ved økning av fremkallingsløsningsmidlets polaritet i følgende rekkefølge: metylenklorid/etylacetat, etylacetat, etylacetat/metanol. Elueringsmidlet ble oppsamlet i fraksjoner på 18 ml, og fraksjonene som var eluert med etylacetat/ metanol, som inneholdt tiomarinol, ble tatt vare på.

Fraksjonene som var tatt vare på ble konsentrert til tørr tilstand ved inndampning, hvorved det ble oppnådd 7 g av en oljeaktig substans som ble løst i 400 ml 50 volumprosentig vandig metanol og adsorbert på 600 ml av en kolonne som var pakket med "Diaion" HP-20 i vann. Etter vasking med 50 volum-prosent ig vandig metanol ble målsubstansen eluert med 90 volumprosentig vandig metanol, og etter konsentrering til tørr tilstand under senket trykk ble det oppnådd 1 g av et gult pulver. Det gule pulver ble eluert ytterligere på et kolonne-kromatogram under anvendelse av "Sephadex" LH-20 og fremkalt med metylenklorid:etylacetatretanol = 19:19:2 etter volum for å samle opp de aktive fraksjoner. 750 mg tiomarinol ble oppnådd som et gult pulver.

Den resulterende tiomarinol hadde de nedenfor angitte egenskaper:

1) Natur og utseende: Gult pulver.

2) Smp.: 84-89°C.

3) Molekylformel: C3QH44<N>2<0>gS2.

4) Molekylvekt: 640, bestemt ved FAB-MS-metoden ("FAB-MS" er Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry).

5) Høyoppløsnings-massespektrum:

C30<H>45<N>2°9S2 [(M+H)<+> ved FAB-MS-metoden]:

Beregnet: 641,2567

Funnet: 641,2585.

6) Elementæranalyse:

Beregnet: C: 56,23%, H: 6,92%, N: 4,37%, S: 10,01% Funnet: C: 55,92%, H: 6,82%, N: 4,23%, S: 9,90%. 7) IR-spektrum: IR-spektret viste følgende absorpsjons-maksima (KBr-platemetode, vmaks> cm"^): 3394, 2930, 1649, 1598, 1526, 1288, 1216, 1154, 1102, 1052.

i

8) UV-spektrum:

I metanol eller etanol + HC1 har tiomarinol det nedenfor angitte UV-spektrum [angitt som ^•majcs> nm

(G)] 387 (12.000), 300 (3.500), 214 (26.000)

og har i metanol + NaOH det nedenfor angitte UV-spektrum [angitt som Amaks nm (€)]

386 (9.600), 306 (3.200), 206 (25.000). 9) Spesifikk dreining; [a]<25> = +4,3° (C=1,0, metanol).

D

10) Høytrykks-væskekromatografi:

Kolonne for separering: Senshu-Pak ODS H-2151 (kolon ne størrelse: 6 x 150 mm, produkt fra Senshu Scien-tific Co., Ltd.)

Løsningsmiddel: 40 volumprosentig vandig acetonitril Strømningshastighet: 1,5 ml/min.

Bølgelengde: 220-350 nm (bestemt ved hjelp av fotodi ode oppstilling)

Oppholdstid: 5,9 minutter.

11) <1>H-NMR-spektrum: (6 ppm) NMR-spektret (270 MHz) i heksa-deuterert dimetylsulfoksid under anvendelse av trimetylsilan som intern standard er angitt nedenfor:

0,91 (3H, dublett, J=6,8 Hz),

0,95 (3H, dublett, J=5,9 Hz),

1,30 (6H, bred multiplett),

1,55 (5H, bred multiplett),

2,03 (3H, singlett),

2,09 (3H, multiplett),

2,34 (2H, triplett, J=7,3 Hz),

3,33 (1H, dublett, J=10,7 Hz),

3,52 (2H, multiplett),

3,64 (2H, multiplett),

3,73 (1H, dublett av dubletter),

4,02 (2H, triplett, J=6,6 Hz),

4,18 (1H, bred dublett, J=7,3 Hz),

4,30 (1H, dublett, J=4,4 Hz),

4,44 (1H, dublett, J=7,8 Hz),

4,63 (1H, dublett, J=3,4 Hz),

4,89 (1H, dublett, J=7,3 Hz),

5,37 (2H, multiplett),

5,97 (1H, bred singlett),

7,04 (1H, singlett),

9,80 (1H, bred singlett),

10,68 (1H, bred singlett).

12) <13>C-NMR-spektrum: (6 ppm): NMR-spektret (68 MHz) i tetradeuterert metanol under anvendelse av tetra-metylsilan som intern standard er vist nedenfor: 174,3 (singlett), 170,4 (singlett), 168,6 (singlett) 161,1 (singlett), 137,9 (singlett), 135,7 (dublett), 135,1 (singlett), 129,8 (dublett), 116,3 (dublett), 115,8 (singlett), 113,7 (dublett), 77,6 (dublett), 74,4 (dublett), 72,1 (dublett), 71,8 (dublett),

66,0 (triplett), 65,7 (dublett), 64,9 (triplett), 45.3 (dublett), 43,9 (dublett), 36,6 (triplett), 33.4 (triplett), 30,1 (triplett), 30,0 (triplett), 29,7 (triplett), 27,0 (triplett), 26,7 (triplett), 20,3 (kvartett), 16,6 (kvartett), 16,3 (kvartett).

13) Løselighet:

Løselig i alkoholer, såsom metanol, etanol, propanol og butanol, og løselig i dimetylsulfoksid, dimetyl-formamid,

kloroform, etylacetat, aceton og etyleter. Uløselig i heksan og vann.

14) Fargereaksj oner:

Positiv for svovelsyre, jod og kaliumpermanganat.

15) Tynnsj iktskromatografi:

Rf-verdi: 0,57

Adsorpsjonsmiddel: Silikagel

(Merck & Co. Inc., Art. 5715).

Fremkallingsløsningsmiddel: Metylenklorid:metanol = 85:15 etter volum.

FORSØKSEKSEMPEL 1

Antibakteriell aktivitet for tiomarinol

Minste hemmende konsentrasjon (MIC) for tiomarinol, angitt som ug/ml, mot Gram-positive og Gram-negative bakterier ble bestemt ved hjelp av agar-medium-tynningsmetoden under anvendelse av et agarnæringsmedium (produkt fra Eiken Chemical Co., Ltd. ).

Resultatene er angitt i tabell 1 nedenfor.

FORSØKSEKSEMPEL 2

Antimycoplasmisk aktivitet for tiomarinol

Ved å følge samme fremgangsmåte som i forsøkseksempel 1 ble aktiviteten til tiomarinol prøvet mot forskjellige arter av mycoplasma. Resultatene er angitt i tabell 2 nedenfor.

Inokuleringsmedium: 0,005 ml av 10^ CFU/ml

Forsøksmedier:

M. bovis og M. gallisepticum Chanock-medium [fremstilt slik som beskrevet i P.N.A.S., Vol 48, 1962, p.

41-49 og supplert med 20% hesteserum]

M. synoviae Frey-medium [fremstilt slik som beskrevet i Am.

J. Vet. Res., Vol 29, 1968, p. 2163-2171, og

supplert med 12% svineserum]

M. hyosynoviae Mucin PPLO<*> agarmedium (supplert med 15% ;hesteserum) ;Dyrkingsbetingelser: 37°C, 5 dager, svakt aerobisk ;(BBL gasspakkemetode [dyrking i CX^-engangs-generator fra Becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, MD 2103 USA]) ;<*> - PPLO (PleuroPneumonia-lik organisme)

Claims (1)

1. Kjemisk forbindelse,

karakterisert ved at den har formelen (I):