KR0139515B1 - 신규의 항균 화합물 - Google Patents

신규의 항균 화합물

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KR0139515B1
KR0139515B1 KR1019920007740A KR920007740A KR0139515B1 KR 0139515 B1 KR0139515 B1 KR 0139515B1 KR 1019920007740 A KR1019920007740 A KR 1019920007740A KR 920007740 A KR920007740 A KR 920007740A KR 0139515 B1 KR0139515 B1 KR 0139515B1
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히데유끼 하루야마
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아끼라 이시이
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가와무라 요시부미
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Abstract

본 발명은 알테로모나스 속으로 부터 수득 가능하고 슈도모닉산과 구조적 유사점을 공유하는 신규의 항균 화합물에 관한 것이다.

Description

신규의 항균 화합물
본 발명은 티오마리놀(Thiomarinol) 이라 명명되고 이하에 나타낸 일반식을 갖는 신규의 화합물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 알테로모나스 (Alteromonas) 속의 미생물, 특히 그 자체로 신규이며 본 발명의 일부를 구성하는 신규의 알테로모나스 라바 (Alteromonas rava) 종의 균주 (SANK 73390으로 명명) 를 이용한 발효를 포함하는 티오마리놀의 제조방법을 제공한다. 티오마리놀은 다양한 치료적, 특히 항균 효과를 가지므로, 본 발명은 또한 상기 화합물을 이용한 조성물 및 치료 또는 예방 방법을 제공한다.
알테로모나스속의 미생물은 해수로 부터 분리 가능하며, 그의 일부가 잠재적인 치료용 화합물을 생성하는 것으로 알려져 있다. 예를 들면, 비스카벨린 (Viscabelin) 으로 공지된 화합물은 알테로모나스의 1 종으로 부터 수득되며, 항종양 활성을 나타내는 것으로 알려져 있다 (일본국 특허 출원 공개 소화 63-27484호).
티오마리놀의 구조에 대하여는, 유사한 구조를 갖는 몇가지 항생물질이 공지되어 있으며 이들은 3 개의 군으로 분류될 수도 있다.
제 1군은 슈도모나스(Pseudomonas) spp. 로 부터 처음으로 단리된 슈도모닉산을 포함한다. 이것은 슈도모닉산 A [슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) 에 의해 생성됨. 참고문헌 : J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 294 (1977)], 슈도모닉산 B [상동, 318(1977)], 슈도모닉산 C [상동, 2827 (1982)] 및 슈도모닉산 D [상동, 2655(1983)]을 포함한다. 슈도모닉산 A는 박트로반 (Bactroban) (Beecham, 등록상표) 이라는 이름으로 2%의 항균용 피부 연고의 형태로 시판되고 있다.
기타 슈도모닉산 유도체들은 해양 세균으로 부터 얻어지지만 [참고문헌 : Am, Chem. Soc. Abstr. Pap., 200(2), (1990)], 이 참고문헌에는 이들의 항균 활성에 대해서는 전혀 개시된 바가 없다.
본 발명의 화합물과 유사한 구조를 갖는 물질의 제 2 군으로는 항생물질 홀로마이신 [Helv. Chim. Acta, 42, 563 (1959)], 피로틴 [J. Am. Chem. Soc., 77, 2861(1955)], 티올루틴 [Angew. Chem., 66, 745 (1954)], 오레오트리신 [J. Am. Chem. Soc., 74, 6304 (1952)] 등 등을 포함하는 군을 들 수 있다. 이 항생물질들은 전형적으로 액티노마이세테스에 의해 생성되며, 황-함유 발색단에 의해 특징화 된다. 제노하브딘 I-V은 홀로마이신에 관련된 물질이며, 또한 세균으로 부터 단리된다 (WO 84/01775 에 게시됨).
상기 2 가지 군의 유도체에 대해 다양한 연구를 행하여 왔지만, 티오마리놀의 분자구조를 갖는 물질이나 그것의 특성에 대해서는 전혀 개시된 바가 없었다.
화합물의 제 3군은 일본국 특허 출원 공개 제 52-102279, 54-12375, 54-90179, 54-103871 및 54-125672 호와 같은 공보 문헌에 개시되어 있으며, 여기에 티오마리놀과 유사한 구조를 갖는 슈도모닉산 유도체가 개시되어 있지만, 이 유도체에서 말단 카르복실산은 아미드기로 대체된다. 이 화합물들은 필적할만한 항균 홀성을 발휘하지 않을뿐아니라, 넓은 항균 활성 스펙트럼을 나타내지도 않는다. 사실상, 이 화합물들은 본래의 슈도모닉산의 항균 활성보다 약한 활성을 갖는 것으로 증명되었다.
상기 기술한 화합물들중 어느것도 알테로모나스 spp. 로부터 단리되지 않으며, 어느 것도 티오마리놀과 동일하지 않다. 예를 들면, 티오마리놀의 구조적 특징의 하나는 6 - 원 고리와 α, β-불포화 카르보닐기 사이의 위치에 OH 기가 존재한다는 것이다. 따라서, 티오마리놀은 당 기술분야에서 명백히 구별되는 특징적인 것이다.
본 발명의 목적은 상기 기술한 항생물질군에 비해서 효능이 개선되고 항균 활성 스펙트럼이 더욱 넓은 신규의 화합물을 제공하는데 있다.
즉, 본 발명은 하기식(I)의 화합물을 제공한다 :
본 발명은 또한 알테로모나스 속의 티오마리놀 - 생성 미생물을 배양하고, 배양액으로 부터 티오마리놀을 분리함을 특징으로 하는 티오마리놀의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와 혼합된 티오마리놀을 함유하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 티오마리놀의 치료적 용도, 특히 세균감염의 치료 또는 예방용 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 세균감염의 치료 또는 예방용 약제를 제조하기 위한 티오마리놀의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 세균감염을 앓고 있거나 감수성이 있는 포유동물, 예를 들면 사람에게 티오마리놀의 유효량을 투여함을 특징으로 하는 세균감염의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.
상기 식으로 부터 명백히 알 수 있는 바와 같이, 티오마리놀은 다수의 비대칭 탄소원자와 수개의 이중 결합을 함유하고 있다. 특히 티오마리놀의 α,β - 불포화 카르보닐 잔기에서 이성질체화가 가능하다. 따라서, 티오마리놀은 다양한 광학 및 기하이성질체를 형성할 수 있다. 본 명세서에서는 이들을 모두 하나의 분자식으로 나타내고 있지만, 본 발명은 라세미체를 포함하여 개개의 단리된 이성질체 및 이들의 혼합물을 모두 포함한다. 입체 특이적 합성 기술이 사용도1는 경우 또는 광학적 활성 화합물을 출발물질로 사용하는 경우에는, 개개의 이성질체가 직접적으로 제조될 수도 있지만; 한편 만일 이성질체의 혼합물이 제조된다면 통상의 분할 기술에 의해 개개의 이성질체를 수득할 수도 있다.
자연 발생의 티오마리놀이 표준 광학 배열을 채택하는 경향이 있다. 따라서, 다른 배열이 제공될지라도, 자연적 배열이 바람직하다.
티오마리놀은 알테로모나스 속의 티오마리놀 - 생성 미생물을 배양한 다음, 배양 배지로 부터 티오마리놀을 수집함으로써 제조될 수도 있다. 원하는 항균 활성을 갖고 있는 티오마리놀의 변형체는, 목적 화합물을 생성하는 기타 알테로모나스 종 또는 균주로 부터 유사한 방식으로 수득될 수도 있고, 또는 상기 기술한 발효에 의해 수득된 화합물을 적절히 변형시킴으로써 수득 될 수도 있으며, 또는 화학적으로 직접 합성될 수도 있다.
특히, 미생물로서 신규의 알테로모나스 라바 종, 특히 본 발명자들이 SANK 73390 이라 명명한 균주인 알테로모나스 라바의 신규 단리 균주를 사용하는 것이 특히 바람직하다. 균주 SANK 73390은 일본국 시쥬오까현 미나미 - 이쥬 마찌 고이나의 해변에서 수집된 해수로 부터 단리되었으며, 이 균주는 부다페스트 조약하에 기탁 기관인 일본국 통상산업성 공업기술원 미생물 공업 기술 연구소에 1991년 4월 30일자로 수탁번호 제 FERM BP-3381 호로 기탁되었다.
알테로모나스 라바 균주 SANK 73390의 분류학적 특징은 하기 나타낸 바와 같다.
1. 형태학상 특징
알테로모나스 라바 균주 SANK 73390 을 마린 한천 (Marine Agar, Difco)상에 23℃에서 24 시간 동안 배양한다. 이어서 현미경으로 관찰하면, 세포가 막대형태이고 각각 직경 0.8~1.0㎛, 길이 2.0~3.6㎛임을 알수 있다. 이 균주는 그람 - 음성이고, 극성 단 편모에 의해 이동한다.
2. 마린 한천(Marine Agar)상에서의 생육
SANK 73390 을 마린 한천 (Difco) 상에서 23℃에서 24 시간 동안 배양한다. 얻어진 콜로니는 회색을 띈 담황색이고, 투명하며, 납작한 원형이고 완전한 것으로 관찰된다. 수용성 색소는 형성되지 않는다.
3. 생리학적 특성
(1) 해수 요구성 : SANK 73390 은 생육을 위해 해수를 필요로 한다.
(2) 산화 - 발효 시험 (Hugh - Leifson 법 [J. Bact., 66, 24 ~ 26 (1953)], 인공 해수로 부터 제조된 배지내) : 탄수화물에 대해 작용하지 않음.
(3) 옥시다아제 : +
(4) 카탈라아제 : +
(5) 산소 요구성 : 호기성
(6) 질산염의 환원 : -
(7) 전분의 가수분해 : +
(8) 한천의 분해 : -
(9) 젤라틴의 액화 : +
(10) DNase 생성 : +
(11) 라파아제 생성 : +
(12) 생육온도 : 4℃에서 생육 빈약, 17℃~26℃에서 생육양호, 35℃에서 생육하지 않음.
(13) 생육인자 요구성 : Journal of Bacteriology 107, 268~294(1971)에 기재된 기초 배지상에서, SANK 73390 은 비타민 - 유리 카사미노산을 요구한다.
(14) 탄소원 동화 : 추가로 0.1% w/v 의 비타민 - 유리 카사미노산을 함유하는 기초 배지 [Journal of Bacteriology 107, 268~294(1971)에 기재됨] 상에서, 진탕배양시 :
[표]
4. 화학분류상 특징
(1) DNA 의 구아닌 및 시토신 (G + C 함량) 의 몰 % : 43.4% (HPLC법)
(2) 퀴논계 : 유비퀴논 Q-8
상기 나타낸 분류학적 특징을 고려하여, 알테로모나스 라바 균주 SANK 73390 을 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, vol. 1 (1984) 에 기재된 균주 뿐만 아니라 International Journal of systematic Bacteriology 의 최근호에 기재된 균주들과 비교하였다. 본 발명자들은 알테로모나스 라바 균주 SANK 73390 이 다른 해양 미생물인 알테로모나스 시트레아 (Alteromonas citrea) 와 유사점을 공유함을 알아내었다. SANK 73390 및 알테로모나스 시트레아, ATCC 29719(표준균주)를 비교하여 배양하고, 서로 비교해 보았다.
SANK 73390 은 회색을 띈 담황색인데 비하여, ATCC 29719 의 콜로니는 녹색을 띈 황색이다. 또한 SANK 73390 은 4℃에서 생육한다는 점이 알테로모나스 시트레아 와는 상이하며, 탄소원으로서 트레할로오스 및 프로피온산 나트륨을 이용하는 능력도 상이하다.
따라서, 알테로모나스 라바 균주 SANK 73390 은 신규의 알테로모나스 라바 종의 신규 균주이며, 수탁번호 ATCC 29719 로 기탁된 최근에 공지된 종과는 필수적 특징에서 서로 상이하다.
상기 - 기술된 특징들은 SANK 73390 특유의 것이다. 그러나, 알테로모나스 spp. 의 특징은 자연적 및 인공적으로 변화될 수 있음이 공지되어 있다. 상기 정의된 특징들은 기탁된 알테로모나스 라바 균주를 정의하지만, 티오마리놀 또는 이것의 자연발생적 변형체를 생성할 수 있는 알테로모나스의 기타 종 또는 알테로모나스 라바의 기타 균주에 대해서는 필수적으로 고유한 것이 아니다. 이러한 기타 균주들은 본 발명의 범주내에 포함된다.
SANK 73390, 또는 티오마리놀을 생성할 수 있는 임의의 기타 균주 또는 그의 변종을 2차 배양하거나 생물공학적으로 개조 또는 변이시켜, 다른 특징을 갖는 미생물을 만들 수도 있는 것으로 생각된다. 유일한 요구조건은 이렇게 얻어진 미생물이 목적 화합물을 생성할 수 있어야 한다는 것이다.
상기 개조 및 변이는 임의의 원하는 형태를 취할 수도 있거나, 예를 들면 배양 조건과 같은 고려사항에 따른 결과일 수도 있다. 균주를 배양에 의해 변이시킬 수도 있으며, 향상된 생육 또는 저온/고온에서의 생육과 같은 특징을 나타내도록 선택할 수도 있다.
생물공학적 변이는 일반적으로 고의적이며, 때때로 순도를 유지시키거나 배양액, 특히 종 배양액을 정제하기 위하여 제균 내성 또는 감수성, 또는 이들의 조합과 같은 선택 가능한 특성을 도입할 수도 있다.
유전자 조작에 의해 도입될 수도 있는 기타 특징들은 알테로모나스 spp.에서 허용가능한 임의의 것이다. 예를 들면, 내성을 코딩하는 플라스미드를 혼입시킬 수도 있고, 또는 임의의 자연 발생 플라스미드를 제거할 수도 있다. 유리한 플라스미드는 영양요구성을 부여하는 플라스미드이다. 플라스미드는 적절한 원천으로 부터 수득될 수도 있거나, 자연 발행 알테로모나스 플라스미드를 단리해내고 다른 원천으로 부터의 원하는 유전자를 삽입함으로써 조작시킬 수도 있다. 자연적 플라스미드를 또한 바람직하다고 생각되는 기타 방식으로 변이시킬 수도 있다.
적절한 미생물의 배양액으로 부터 티오마리놀을 수득하기 위하여, 미생물을 적절한 배지에서 발효시켜야 한다. 이러한 배지는 일반적으로 당 분야에 공지되어 있으며, 종종 다른 발효 생산물의 제조에서도 사용된다.
전형적으로, 배지는 탄소원, 질소원 및 적절한 미생물에 의해 동화되는 1종 이상의 무기염의 조합으로 이루어지는 것이 필요하다. 배지의 최소 요구조건은 배지가 미생물의 생육을 위해 필수적인 성분을 함유하는 것이다.
적절한 탄소원으로는 글루코오스, 프락토오스, 말토오스, 슈크로오스, 만니톨, 글리세롤, 덱스트린, 오티밀, 호밀, 옥수수 전분, 감자, 옥수수분말, 대두분, 면실유, 시럽, 시트르산 및 타르타르산이 있으며, 이들을 단독으로 또는 하나 이상의 다른 것과 조합하여 사용할 수도 있다. 전형적인 양은 배지 양의 약 1~10 %w/v 범위이지만, 양은 원하는 결과에 따라 원하는 대로 변화될 수도 있다.
적절한 질소원은, 예를들면 단백질을 함유하는 임의의 물질을 포함한다. 질소원의 대표적인 예는 대두분, 밀기울, 땅콩 분말, 면실분말, 카세인 가수분해물, 페르마민, 어류 분말, 옥수수침지액, 펩톤, 육추출물, 효모, 효모 추출물, 맥아추출물과 같은 자연산으로 부터의 추출물일 수 있는 식물 및 동물로 부터의 유기질소원; 및 질산나트륨, 질산암모늄 및 황산암모늄과 같은 무기질소원이다. 이들은 단독으로 또는 탄소원과 조합하여 사용할 수 있다. 적절한 양은 전형적으로 배지의 양의 약 0.1 내지 6% w/v이다.
적절한 영양무기염은 염의 주요한 성분 뿐만이 아니라 미량원소를 제공하는 것이다. 바람직하게, 염은 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 마그네슘, 철, 인산염, 황산염, 염화물 및 탄산염을 제공하여야 한다. 코발트, 망간 및 스트론튬과 같은 미량금속, 또는 브롬화물, 플루오르화물, 붕산염 또는 규산염 이온과 같은 이온을 제공할 수 있는 염도 또한 존재할 수 있다.
알테로모나스 라바는 해수에서 자연적으로 발생하므로, 반대의 지시가 없으면, 이의 배양조건은 해양 환경에 이상적으로 상응한다. 그러므로, 바다에서 발견되는 미량이온이 알테로모나스의 배양에 사용되는 임의의 배지에 이롭게 포함된다.
미생물이 액체 배양물로서 발효되면, 실리콘 오일 또는 식물성 오일과 같은 발포방지, 또는 적절한 계면활성제를 사용하는 것이 바람직하다.
티오마리놀의 생산을 위해서 사용될때, 알테로모나스 라바 균주 SANK 73390 의 배양 배지의 pH 는 pH 5.0 내지 pH 8.0의 범위로 유지되지만, 유일한 요구사항은 단지 pH가 미생물의 생육을 저해하지 않아야 하며 또는 최종 생성물의 품질에 비가역적으로 불리한 영향을 미치지 않아야 한다는 것이다. 과량의 산 또는 알칼리를 첨가하여 발효를 정지시키는 것이 바람직할 수도 있다.
알테로모나스 라바 균주 SANK 73390 은, 일반적으로 4℃내지 32℃에서 생육하며, 17℃내지 26℃에서 잘 생육한다. 보다 낮거나 높은 온도에서 자랄 수 있는 균주가 발육될때, 이들 범위내가 아닌 온도도 적용될 수 있다. 티오마리놀의 생산을 위하여 바람직한 온도는 20℃내지 26℃이다.
티오마리놀은 호기 배양에 의해 이상적으로 수득되며, 적절한 호기 배양 기술, 예컨대, 고체 배양, 진탕배양 또는 통기 - 교반 배양이 사용될 수 있다.
배양이 소규모로 진행된다면, 20 내지 26℃에서 수일간 배양되는 진탕배양이 일반적으로 바람직하다.
발효 배양을 시작하기 위하여, 바람직한 기술은 예를 들면 에를렌마이어 플라스크내에서 1 또는 2 단계로 제조된 초기 접종재료를 사용한다. 탄소원 및 질소원을 배양배지에 조합하여 사용할 수 있다. 종배양 플라스크를 항온 배양기내에서 23℃에서 1 내지 3일간 또는 충분한 성장이 관찰될 때까지 진탕한다. 얻어진 종 배양물을 두번째 종 배양물에 접종하는데, 또는 배양물을 생산하는데 사용할 수 있다. 두번째 접종이 실행된다면, 이를 유사한 방식으로 실행하고, 부분적으로 생산 배지에 접종하는데 사용 할 수 있다. 씨드가 접종된 플라스크를 적절한 온도에서 1~3일간 또는 최대 생산을 수득할때까지 진탕한다. 배양이 완결되면, 플라스크의 내용물을 원심분리 또는 여과에 의해 수집할 수 있다.
배양이 대규모로 진행된다면, 적절한 통기 - 교반 발료기내에서의 배양이 바람직할 수 있다. 이 방법에서, 영양배치를 발효기내에서 제조할 수 있다. 125℃에서 살균후에, 배지를 식히고 살균 배지상에서 미리 생육 시킨 접종물을 접종한다. 배양을 20 내지 26℃에서 교반 및 통기하면서 실행한다. 이 방법은 대량의 화합물을 수득하는데 적절하다.
배양에 의해 생산되는 시간에 따른 티오마리놀의 양은 예를 들면, HPLC에 의해 모니터할 수 있다. 일반적으로, 생산된 티오마리놀의 양은 19시간 내지 96시간 후에 최대치에 다다른다.
적절한 시간의 배양후에, 티오마리놀을 임의의 공지된 방법에 의해 단리하고 정제할 수 있다. 예를 들면, 배양 브로쓰내에 잔류하는 티오마리놀은 티오마리놀의 물리화학적 성질에 따른 정제방법에 의해서, 예를 들면 여과 보조제로서 판상 규조토를 사용하여 고형물을 여과함으로써 또는 원심분리후에 상층액으로 부터 추출함으로써 수득될 수 있다. 예를 들면, 여액 또는 상층액에 존재하는 티오마리놀을 수 - 불혼화성 유기 용매, 예컨대 에틸 아세테이트, 클로로포름, 에틸렌클로라이드, 메틸렌 클로라이드 또는 그의 임의의 혼합물로, 중성 또는 산성 조건하에서 추출하고 정제할 수 있다.
대안적으로, 흡착제로서, 활성 탄소 또는 Amberlite XAD-2, XAD-4(Rohm Hass) 또는 Diaion HP-20, HP-20, HP-50 (Mitsubishi Kasei Corporation)과 같은 흡수 수지를 사용할수 있다. 티오마리놀을 함유하는 액체를 흡수제의 층을 통과시킴으로써 흡착에 의해 불순물을 제거하거나; 적절한 용리제, 예컨대 수성메탄올, 수성아세톤 또는 부탄올 / 물로 용출시켜서 티오마리놀을 정제할 수 있다.
세포내 티오마리놀은 적절한 용매, 예컨대 50~90% 수성 아세톤 또는 수성 메탄올로 추출한후에 유기 용매를 제거하고, 상기한 바와 같이 여액 또는 상층액을 추출함으로써 정제할 수 있다.
얻어진 티오마리놀을 공지기술, 예를 들면 : 등록상표 Florisil 로 판매되는 실리카겔 또는 마그네숨 - 실리카겔과 같은 담체를 사용하는 흡착 컬럼 크로마토그래피; Sephadex LH-20 (Pharmacia 제품의 등록상표) 과 같은 흡착제를 사용하는 분배 컬럼 크로마토그래피; 또는 정규상 또는 역상 컬럼을 사용하는 HPLC에 의해 더 정제할 수 있다. 당분야에 공지되어 있는 바와같이, 이들 단리 및 정제방법을 단독으로 또는 적절하게 조합하여, 그리고 필요하다면 반복적으로 실행함으로써 목적 최종 생성물을 단리 및 정제할 수도 있다.
본 발명의 화합물이 치료용으로 사용된다면, 그들은 단독으로 또는 활성 화합물에 추가하여 하나 이상의 통상적인 희석제, 담체, 부형제 또는 보조제를 함유하는 적절한 제약학적 제제 형태로 투여될 수 있다. 제제의 성질은 물론 의도되는 투여 경로에 의존한다. 그러나, 경구 투여용으로는, 화합물은 바람직하게는 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 시럽으로 제형된다. 비경구 투여용으로는, 바람직하게는 주사제 (정맥내, 근육내 또는 피하) 또는 점안제 또는 좌약으로서 제형된다.
제제는 부형제, 결합제, 붕해제, 윤활제, 안정제, 교정제, 용해제, 현탁제 또는 코팅제와 같은 첨가제를 첨가함으로써 공지방법에 의해 제조될 수 있다. 투여량은 환자의 중상 및 연령, 감염의 성질 및 정도 및 투여의 경로 및 방법에 따라서 변화할 수 있으나, 성인 환자의 경구 투여의 경우에 있어서는, 본 발명의 화합물을 20mg 내지 2000mg의 일일 투여량으로 통상적으로 투여할 수도 있다. 화합물을 1일 1회 투여, 또는 예를들면 1일 2회 또는 3회로 나누어 분할 투여할 수 있다.
티오마리놀은 동물 (예를 들면, 사람, 개, 고양이 및 토끼) 내의 그램 - 양성 및 그램 - 음성 균에 대해 항균효과를 나타내기 때문에, 전형적으로 크림, 연고 또는 겔 형태로 국소국으로 적용하는 것이 종종 바람직하다. 이들 투여형태의 성분 및 제조방법에 대하여는 상기한 바와 유사하게 고려된다.
하기 실시예는 티오마리놀의 제조 및 그의 항균 활성을 예중하고 있지만, 어떤 방식으로도 본 발명을 제한하지 않는다.
실시예 1
티오마리놀의 통 발효
A) 배양
알테로모나스 라바 균주 SANK 73390을 마린 한천 (Marine Agar) (Difco의 제품) 의 슬랜트상에서 22℃에서 3일간 배양한다. 생성 배양물을 3ml의 인공 해수에 현탁한다. 0.1ml의 현탁액을 무균적으로 취하고 100ml의 살균 배지 [1ℓ의 탈이온수내의 37.4g의 마린 브로쓰 (Difco의 제품), pH 조정안됨]를 함유하는 500ml의 에를렌마이어 플라스크내로 접종한다.
플라스크를 회전 진탕기를 사용하여 200rpm (회전 반경 70mm) 에서 진탕하면서 23℃에서 24시간 동안 배양한다. 이 시간후에, 상기한 바와 같은 살균배지 15ℓ를 각각 함유하고 있는 네개의 30ℓ통 발효기 각각에 에를렌마이어 플라스크로 부터 무균적으로 취한 15ml의 배양물을 접종한다. 통발효기를 7.5ℓ/분의 통기속도로 교반(100rpm) 시키면서 23℃에서 23시간 동안 항온 처리한다.
B) 단리
23 시간후에, 발효기의 내용물을 합하여 60ℓ의 배양액을 수득한다. 염산을 첨가하여 액체의 pH를 3으로 조정한후에, 60ℓ의 아세톤을 첨가하고, 혼합물을 교반시키면서 30분간 추출한다. 1.2kg의 Celite 545 필터 보조제(Johns Manville Co. 제품의 등록상표) 를 사용하여, 용액을 여과한다.
110ℓ의 생성 여액을 60ℓ의 에틸 아세테이트로 한번, 그리고 각각 30ℓ의 에틸 아세테이트로 두번 추출한다. 유기층을 30ℓ의 5% w/v 탄산수소나트륨 수용액으로 세척하고, 이어서 30ℓ의 포화 염화나트륨 수용액으로 세척하고, 무수 황산 나트륨으로 건조시키고 감압하에서 증발시켜 건조상태까지 농축하여 14g의 오일상 물질을 수득한다.
수득한 오일상 물질을 메틸렌 클로라이드에 용해시키고 용액을 메틸렌 클로라이드내의 200g의 실리카겔로 채워진 컬럼상에 흡착시킨다. 전개 용매의 극성을 메틸렌 클로라이드 / 에틸 아세테이트 ; 에틸 아세테이트; 에틸 아세테이트 / 메탄올의 순서로 상승시킴으로서 목적화합물을 용출시킨다. 용출물을 18ml의 분획으로 수집하고 에틸아세테이트 메탄올로 용출된 티오마리놀을 함유하는 분획을 저장한다.
저장한 분획을 증발에 의해 건조될때까지 농축하여 7g의 오일상 물질을 수득하고, 이를 400ml의 50 부피 %의 수성 메탄올에 용해시키고 물내의 Diaion HP-20 (Mitsubishi Chem. Ind. 제품의 등록상표)으로 채워진 600ml의 컬럼에 흡착시킨다. 50% v/v 수성 메탄올로 세척한후에, 목적 물질을 90% v/v수성 메탄올로 용출하고, 감압하에 건조될때까지 농축하여 1g의 황생 분말을 수득한다. 황색 분말을 Sephadex LH-20을 사용하는 컬럼 크로마토그램상에서 더욱 용출하고 메틸렌 클로라이드 : 에틸 아세테이트 : 메탄올 (19 : 19: 2 부피비) 로 전개하여 활성 분획을 수집한다. 750mg의 티오마리놀을 황색 분말로서 수득한다.
생성 티오마리놀은 하기와 같은 특성을 갖는다.
1) 특성 및 외관 : 황색 분말
2) 융점 : 84~89℃
3) 분자식 : C30H44N2O9S2.
4) 분자량 : FAB - MS 방법에 의해 측정시 640. (FAB-MS 는 고속 원자 충격 질량 분광법 (Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry)이다).
5) 고분해능 질량 스펙트럼 :
C30H45H2O9S2[FAB - MS 방법에 의한 (M + H+)] :
계산치 : 641.2567
실측치 : 641.2585.
6) 원소분석치 :
계산치 : C, 56.23%; H, 6.92%; N, 4.37%; S, 10.01%
실측치 : C, 55.92%; H, 6.82%; N, 4.23%; S, 9.90%
7) IR 흡수 스펙트럼 : IR 스펙트럼은 하기 흡수 최대값을 보여준다(KBr 디스크 방법, νmax cm-1) :
3394, 2930, 1649, 1598, 1526, 1288, 1216, 1154, 1102, 1052
8) UV흡수 스펙트럼 :
메탄올 또는 메탄올 + HCl 내에서, 티오마리놀은 하기와 같은 UV 흡수 스펙트럼을 보여준다 [λmaxnm (ε)].
387(12,000), 300(3,500), 214(26,000)
그리고 메탄올 + NaOH내에서, 하기와 같은 UV 스펙트럼을 갖는다 [λmaxnm(ε)].
386(9,600), 306(3,200), 206(25,000).
9) 고유 광회전도 : [α]D 25= 4.3°(C = 1.0, 메탄올)
10) HPLC :
분리컬럼 : Senshu - Pak ODS H-2151 (컬럼크기, 6 x 150mm, Senshu Scientific Co., Ltd 제품)
용매 : 40% v/v 수성 아세토니트릴
유속 : 1.5ml/분
파장 : 220~350nm (광다이오드 배열에 의해 측정)
체류 시간 : 5.9분
11)1H - NMR 스펙트럼 : (δ ppm)
내부 표준으로서 테트라메틸실란을 사용하는 d6-DMSO 내의 NMR 스펙트럼(270MHz)은 하기와 같다.
0.91 (3H, d, J=6.8Hz) ;
0.95 (3H, d, J=5.9Hz) ;
1.30 (6H, br, m) ;
1.55 (5H, br, m) ;
2.03 (3H, s) ;
2.09 (3H, m) ;
2.34 (2H, t, J=7.3Hz) ;
3.33 (1H, d, J=10.7Hz) ;
3.52 (2H, m) ;
3.64 (2H, m) ;
3.73 (1H, dd) ;
4.02 (2H, t, J=6.6Hz) ;
4.18 (1H, br, d, J=7.3Hz) ;
4.30 (1H, d, J=4.4Hz) ;
4.44 (1H, D, J=7.8Hz) ;
4.63 (1H, D, J=3.4Hz) ;
4.89 (1H, D, J=7.3Hz) ;
5.37 (2H, m) ;
5.97 (1H, br, s) ;
7.04 (1H, s) ;
9.80 (1H, br, s) ;
10.68 (1h, br, s).
12)13C-NMR 스펙트럼 :
(δppm) : 내부 표준으로서 테트라메틸실란을 사용하는 d4- 메탄올내의 NMR 스펙트럼 (68MHz) 은 하기와 같다.
174.3 (s), 170.4 (s), 168.6 (s), 161.1 (s), 137.9 (s),
135.7 (d), 135.1 (s), 129.8 (d), 116.3 (d), 115.8 (s),
113.7 (d), 77.6 (d), 74.4 (d), 72.1 (d), 71.8 (d),
66.0 (t), 65.7 (d), 64.9 (t), 45.3(d), 43.9 (d),
36.6 (t), 33.4 (t), 30.1 (t), 30.0 (t), 29.7 (t),
27.0 (t), 26.7 (t), 20.3 (q), 16.6 (q), 16.3 (q),
13) 용해도 :
메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올과 같은 알콜내에서 가용성; 및 디메틸술폭시드, 디메틸포름아미드, 클로로포름, 에틸아세테이트, 아세톤 및 에틸에테르내에서 가용성; 헥산 및 물내에서 불용성.
14) 색 반응 :
황산, 요오드 및 과망간산 칼륨에 대하여 향성.
15) TLC :
Rf 값 : 9.57
흡착제 : 실리카겔
(Merck Co. Inc., Art. 5715)
전개용매 : 메틸렌 클로라이드 : 메탄올 - 85 : 15 부피비
시험예 1
티오마리놀의 항균활성
그램 - 양성 및 그램 - 음성균에 대한 티오마리놀의 최소 저해 농도(MIC, ㎍/ml) 를 영양 한천 배지 (Eiken Chemical Co., Ltd의 제품) 를 사용하여 한천배지 희석법에 의해 측정한다.
결과를 하기 표 1에 나타낸다.
[표 1]
시험예 2
티오마리놀의 항미코플라스마 활성
시험예 1과 동일한 방법에 따라서 다양한 종의 미코플라스마에 대하여 티오마리놀의 활성을 분석한다. 결과를 하기 표 2에 나타낸다.
[표 2]
접종물질 : 0.005ml의 105CFU/ml
분석용 배지 :
M. 보비스 및 M. 갈리셉니툼 Chanock 배지 [P.N.A.S., 48, 41 ~ 49 (1962) 에 기재된 바와 같이 제조되고 20% 말 혈청이 보충됨].
M. 시노비아 Frey 배지 [ J. Vet. Res., 29, 2163~2171 (1968) 에 기재된 바와 같이 제조되고 12 % 돼지 혈청이 보충됨].
M. 히오시노비아 Mucin PPLO*한천 배지 [15% 말혈청이 보충됨].
배양 조건 : 37℃, 5일간, 약간 호기 조건 (BBL 기체 충진 방법 [Becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, MD 2103 USA 의 처치가능한 CO2발생기내에서의 배양])
* - PPLO (PleuroPneumonia - Like Organism)
CV 가 없는 PPLO 브로쓰 (Difco)
세균성 뮤신 (Difco)5g
증류수800ml
아가 노블 (Agar Noble) (Difco)12g
말 혈청150ml
25% 생 효모 추출물50ml

Claims (9)

  1. 하기식 (I) 의 화합물 :
  2. 알테로모나스 라바의 배양배지로부터 분리되는 제 1 항 기재의 화합물을 함유하는 생물학적 순수 배양물.
  3. 알테로모나스 라바 균주 SANK 73390 (수탁번호 FERM BP-3381) 의 배양배지로부터 분리되는 제 1 항 기재의 화합물을 함유하는 생물학적 순수 배양물.
  4. 제 1 항에 따른 화합물 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 세균 감염 치료 또는 예방용 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서, 피부투여에 적합한 조성물.
  6. 제 1 항에 따른 화합물의 유효량을 세균 감염을 앓고 있거나 이에 감수성이 있는 인간을 제외한 포유동물에 투여함을 특징으로 하는 세균 감염의 치료 또는 예방방법.
  7. 제 1 항에 따른 화합물을 생성할 수 있는 알테로모나스 속의 미생물을 배양하고, 이 배양물로부터 상기 화합물을 단리함을 특징으로 하는, 제 1 항에 따른 화합물의 제조방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 미생물이 알테로모나스 라바인 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 미생물이 알테로모나스 라바 균주 SANK 73390 (수탁번호 FERM BP-3381) 인 방법.
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