CZ279780B6

CZ279780B6 - Nová antibakteriální látka, způsob výroby a farmaceutické prostředky s jejím obsahem

Info

Publication number: CZ279780B6
Application number: CS921392A
Authority: CZ
Inventors: Shuji Takahashi; Hideyuki Shiozawa; Hideyuki Haruyama; Takeshi Kagasaki; Kentaro Kodama; Akira Ishii
Original assignee: Sankyo Company Limited
Priority date: 1991-05-07
Filing date: 1992-05-07
Publication date: 1995-06-14
Also published as: HU9201526D0; HU214738B; NZ242648A; GR3018161T3; DK0512824T3; RU2077534C1; CS139292A3; IE70452B1; FI100112B; AU646615B2; CN1043786C; DE69204734T2; ZA923242B; AU1603392A; IS3855A; KR0139515B1; JP2766421B2; IL101786A0; TW224488B; IL101786A

Abstract

Řešení se týká nové antibakteriální látky thiomarinolu, která je strukturně příbuzná některým pseudomonovým kyselinám, má však velmi výhodné therapeutické vlastnosti. Řešení se týká také mikroorganismů z rodu Alteromonas, schopných tuto látku produkovat, zejména kmene Alteromonas rava SANK 73390, FERM BP-3381. Řešení se týká i farmaceutických prostředků s antibakteriálním účinkem, které jako svou účinnou složku obsahují thiomarinol.ŕ

Description

Vynález se týká nové antibakteriální látky, která byla nazvána Thiomarinol a jejíž vzorec bude dále uveden. Vynález se týká také způsobu výroby této látky a farmaceutických prostředků s jejím obsahem. Uvedenou látku je možno získat při použití mikroorganismu z rodu Alteromonas, jde o nový kmen Alteromonas rava SANK 73390. Thiomarinol má řadu léčebných, zejména antibakteriálních účinků, takže jej je možno použít k léčbě nebo profylaxi různých chorob.

Dosavadní stav techniky

Organismy z rodu Alteromonas je možno izolovat z mořské vody, některé kmeny produkují látky s potenciálním léčebným použitím. Z jednoho kmene byla získána například sloučenina, která byla pojmenována Viscabelin a má protinádorovou účinnost, jak bylo popsáno ve zveřejněné japonské patentové přihlášce Sho 63-27484.

Byla nalezena také řada látek s antibiotickým účinkem, se strukturou podobnou struktuře thiomarinolu, tyto látky je možno rozdělit do tří skupin.

V první skupině se nacházejí kyseliny, které byly poprvé izolovány z čeledi Pseudomonas spp. Jde o tak zvanou pseudomonovou kyselinu A, produkovanou Pseudomonas fluorescens, kmen byl popsán v J. Chem. Boc. Perkin Trans. I, 294 (1977), dále jde o pseudomonovou kyselinu B, popsanou tamtéž na str. 318, (1977), pseudomonovou kyselinu C, popsanou v tomtéž časopisu, str. 2827 (1982) a pseudomonovou kyselinu D, popsanou v totméž časopisu, str. 2655 (1983). Pseudomonová kyselina A se běžně dodává pod chráněnou slovní známkou Bactroban (Beecham) ve formě 2% dermatologického prostředku proti bakteriálním onemocněním kůže.

Další deriváty uvedených kyselin byly získány z bakterií, izolovaných z moře a popsaných v Am. Chem. Soc. Abstr. Pap., 200 (2), (1990), tato publikace však nepopisuje žádný antibakteriální účinek těchto látek.

Druhou skupinou látek s podobnou strukturou jsou sloučeniny, které zahrnují antibiotika holomycin, Helv. Chim. Acta, 42, 563, 1959, pyrrothin, J. Am. Chem. Soc., 77, 2861, 1955, thiolutin, Angew. Chem., 66, 745 1954, aureothricin, J. Am. Chem. Soc., 74, 6304, 1952 a další. Tato antibiotika jsou typickými produkty čeledi Actionomycetes a jsou charakterizována chromoforem, který obsahuje síru. Látkami, příbuznými holomycinu jsou xenorhabdinu I-V, tyto látky byly izolovány z bakterií a popsány ve Wo 83/01775.

Byla provedena řada studií s deriváty obou těchto skupin, avšak dosud nebyla popsána látka s molekulovou strukturou thiomarinolu ani látka s podobnými vlastnostmi.

-1CZ 279780 B6

Třetí skupina látek byla popsána například ve zveřejněných japonských patentových přihláškách č. 52-102279, 54-12375, 54-90179, 54-103871 a 54-125672. Tyto publikace popisují deriváty pseudomonových kyselin se strukturou, podobnou struktuře thiomarinolu, avšak koncová karboxylová skupina je v těchto derivátech nahrazena amidovou skupinou. Tyto látky nemají srovnatelný antibakteriální účinek a nemají široké spektrum antibakteriálního účinku. Tyto látky mají obvykle slabší antibiotický účinek než původní pseudomonová kyselina.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří nová antibakteriální látka thiomarinol, která je odlišná od všech látek, dosud izolovaných z čeledi Alteromonas. Jednou ze strukturních vlastností thiomarinolu je přítomnost hydroxylóvé skupiny, uložená mezi šestičlenným kruhem a alfa,beta-nenasycenou karbonylovou skupinou. Svoji strukturou se tedy thiomarinol jasně odlišuje od známých látek.

Thiomarinol, tvořící podstatu vynálezu má lepší účinek a širší spektrum antibakteriálního účinku ve srovnání se shora popsanou skupinou antibiotik.

Podstatu vynálezu tvoří tedy thiomarinol vzorce I

Podstatu který spočívá -thiomarinol z izoluje.

vynálezu tvoří také způsob výroby thiomarinolu, v tom, že se pěstuje mikroorganismus, produkující rodu Alteromonas a potom se thiomarinol z kultury

Podstatu vynálezu tvoří také farmaceutický prostředek, který jako svou účinnou složku obsahuje thiomarinol spolu s nosičem nebo ředidlem, přijatelným z farmaceutického hlediska.

Podstatu vynálezu tvoří také použití thiomarinolu pro výrobu farmaceutických prostředků, vhodných pro léčbu nebo profylaxi bakteriálních infekcí.

Farmaceutické prostředky podle vynálezu se užívají tak, aby bylo podáno vždy účinné množství thiomarinolu, látka je vhodná pro podávání savcům včetně člověka.

-2CZ 279780 B6

Thiomarinol má následující vlastnosti:

1) Povaha a vzhled: žlutý prášek

2) Teplota tání: 84 až 89 °C

3) Molekulový vzorec: C₃₀H₄₄N₂O₉S₂

4) Molekulová hmotnost: 640, stanoveno metodou FAB-MS, to znamená hmotovou spektrometrií při bombardováni rychlými atomy

5) Hmotové spektrum:

^C30^H45^N2°9^S2 /(^M+H)⁺ metodou FAB-MS/ vypočteno: 641,‘2567 nalezeno: 641,2585.

6) Elementární analýza:

Vypočteno: C 56,23, H 6,92, N 4,37, S 10,01 % nalezeno: C 55,92, H 6,82, N 4,23, S 9,90 %.

7) Spektrum v infračerveném světle v KBr má následující maxima v cm^-1:

394, 2 930, 1 649, 1 598, 1 526, 1 288, 1 216, 1 154,

102, 1 052.

8) Spektrum v ultrafialovém světle:

V methanolu nebo v methanolu s kyselinou chlorovodíkovou má thiomarinol následující maxima v ultrafilovém světle v nm (e):

387 (12 000), 300 (3 500), 214 (26 000), a v methanolu s hydroxidem sodným má thiomarinol následující spektrum v ultrafialovém světle v nm (e):

386 (9 600), 306 (3 200), 206 (25 000).

9) Specifická otáčivost: /alfa/²⁵ _D =+4,3° (C = 1,0, methanol).

10) Vysokotlaká kapalinová chromatografie:

Bylo užito dělicího sloupce Senshu-Pak ODS H-2151, rozměry sloupce 6 x 150 mm, (Senshu Scientific Co., Ltd.) Rozpouštědlo: 40% vodný acetonitril

Rychlost průtoku: 1,5 ml/min

Vlnová délka: 220 až 350 nm (průkaz fotodiodou) Doba retence: 5,9 minut.

¹H-NMR (ppm):

Spektrum v nukleární magnetické v hexadeuterovaném dimethylsulfoxidu methylsilanu jako vnitřního standardu: 0,91

0,95

1,30

1,55 2,03 2,09 (3H, (3H, (6H, (5H, (3H, (3H, dublet, J = 6,8 Hz), dublet, J = 5,9 Hz), široký multiplet), široký multiplet), singlet), multiplet), resonanci bylo provedeno při použití tetra11)

-3CZ 279780 B6

2.43 3,33 3,52 3,64 3,73 4,02 4,18 4,30

4.44 4,63 4,89 5,37 5,97 7,04 9,80

10,68

(2H, triplet, J = 7,3	Hz) ,
(1H, doblet, J = 10,7 (2H, multiplet),	Hz) ,
(2H, multipleti),
(1H, dublet dubletu),
(2H, triplet, J = 6,6	Hz) ,
(1H, široký dublet, J	= 7,3 Hz),

(1H,	dublet,	J = 7,8	HZ) ,
(1H,	dublet,	J = 7,8	Hz) ,
(1H,	dublet,	j = 3,4	Hz) ,
(1H,	dublet,	J = 7,3	Hz) ,

(2H, multiplet), (1H, široký singlet), (1H, singlet), (1H, široký singlet), (1H, širóký singlet).

12) ¹³C-NMR spektrum:

ppm, spektrum v nukleární magnetické resonanci bylo provedeno při 63 MHz v tetradeuterovaném methanolu při použití tetramethylsilanu jako vnitřního standardu, 174,3 (singlet),

170,4 (singlet), 168,6 (singlet), 161,1 (singlet), 137,9 (singlet), 135,7 (dublet), 135,1 (singlet), 129,8 (dublet),

116,3 (dublet), 115,8 (singlet), 113,7 (dublet), 77,6 (dublet), 74,4 (dublet), 72,1 (dublet), 71,8 (dublet), 66,0 (triplet), 65,7 (dublet), 74,9 (triplet), 45,3 (dublet), 43,9 (dublet), 36,6 (triplet), 33,4 (triplet), 30,1 (triplet), 30,0 (triplet), 29,7 (triplet), 27,0 (triplet), 26,7 (triplet), 20,3 (kvartér), 16,6 (kvartet), 16,3 (kvartet).

13) Rozpustnost:

Thiomarinol je rozpustný v alkoholech, například v methanolu, ethanolu, propanolu a butanolu, dále je rozpustný v dimethylsulfoxidu, dimethylformamidu, chloroformu, ethylacetátu, acetonu a ethyletheru, je však nerozpustný v hexanu a ve vodě.

14) Barevná reakce:

Pozitivní barevná reakce je na kyselinu sírovou, na jod a na manganistan draselný.

15) Chromatografie na tenké vrstvě:

Rf = 0,57

Absorpční činidlo silikagel (Měrek and Co. Inc., výrobek č. 5715)

Eluční činidlo: směs methylenchloridu a methanolu v objemovém poměru 85 : 15.

Podrobný popis jednotlivých provedení

Ze shora uvedeného vzorce je zřejmé, že thiomarinol obsahuje celou řadu asymetrických uhlíkových atomů a několik dvojných vazeb. Může tedy dojít ke tvorbě isomerů například na alfa-beta-nenasycené karbonylové skupině thiomarinolu. Thiomarinol tedy může tvořit různé optické a geometrické isomery. Přesto, že všechny tyto isomery jsou vyjádřeny jediným molekulárním vzorcem, zahrnuje vynález jak jednotlivé, izolované isomery, tak

-4CZ 279780 B6 jejich směsi včetně racemátů. V případě, že se užije stereospecifických postupů při syntéze nebo se užijí jako výchozí materiály opticky aktivní látky, je možno přímo připravit jednotlivé isomery. Na druhé straně v případě, že produktem je směs isomerů, je možno jednotlivé isomery získat obvyklým dělením.

Přírodně se vyskytující thomarinol má tendenci ke standardní optické konfiguraci. To znamená, že i když je možno získat jiné konfigurace, je přírodní konfigurace výhodným provedením.

Thiomarinol je možno získat tak, že se pěstuje mikroorganismus z rodu Alteromonas, produkující tuto látku a thiomarinol se potom izoluje ze živného prostředí. Varianty thiomarinolu s požadovaným antibakteriálním účinkem je možno získat i z jiných kmenů Alteromonas, schopných tyto látky produkovat obdobným způsobem, nebo je možno tyto 'látky získat modifikací sloučeniny, získané svrchu uvedenou fermentací, nebo je možno je přímo chemicky syntetizovat.

Zvláště vhodné je pro fermentací užít nový mikroorganismus Alteromonas rava, zejména nově izolovaný kmen této čeledi, který byl označen SANK 73390. Jde o mořský mikroorganismus, který byl izolován z mořské vody na pobřeží Koina, Minami-Izu Machi, prefektura Shizuoka, Japonsko, tento kmen byl uložen do veřejné sbírky kultur Deposition Institute, Research Institute of Microbiological Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Japonsko, 30. dubna 1991 pod číslem FERM BP-3381, podmínky odpovídající podmínkám Budapešťské úmluvy.

Dále bude uvedena taxonomická charakteristika nového kmene Alteromonas rava SANK 73390.

1. Morfologické vlastnosti

Alteromonas rava kmen SANK 73390 byl pěstován 24 hodin při teplotě 23 °C na mořském agaru (Difco). Při mikroskopickém pozorování mají jednotlivé buňky tvar tyčinek s průměrem 0,8 až 1,0 a délkou 2,0 až 3,6 mikrometru. Kmen je gram-negativní a pohybuje se pomocí jednotlivého polárního bičíku.

2. Růst na mořském agaru

Uvedený kmen byl pěstován 24 hodin při teplotě 26 °C na mořském agaru (DIFCO). Výsledné kolonie mají bleděšedožlutou barvu, jsou opakní, kruhové, ploché a kompaktní. Nevytvářejí ve vodě rozpustný pigment.

3. Fyziologické vlastnosti

1) Kmen SANK 73390 vyžaduje ke svému růstu mořskou vodu.

2) Při oxidativně fermentativním testu podle Hugh-Leifsona, J.Bact., 66, 24 až 26, 1953 v prostředí, připraveném ve formě umělé mořské vody není možno pozorovat žádné působení na uhlohydráty.

3) Oxidasa: +

5CZ 279780 B6

4) kataláza: +

5) Požadavky na kyslík: kmen je aerobní

6) Redukce nitrátu: -

7) Hydrolýza škrobu: +

8) Rozpouštění agaru: -

9) Zkapalnění želatiny: +

10) Produkce DNázy: +

11) Produkce lipázy: +

12) Teplota růstu: špatný růst v 4 ”C, dobrý růst v rozmezí 17 až 26 °C, nad 36 °C neroste.

13) Požadavky na růstový faktor: při použití základního prostředí, popsaného v Journal of Bacteriology 107, 268 až 294,

1971, vyžaduje SANK 73390 aminokyseliny kaseinu bez vitaminů

14) Využití uhlíkový zdrojů: na základním prostředí, které bylo popsáno ve shora uvedené publikaci, s přísadou 0,1 % hmot, aminokyselin kaseinu, prostých vitaminů, ve třepací kultuře: výsledky jsou uvedeny v tabulce:

Tabulka
L. Arabinosa:	—	D-Ribosa:	—
D-xylosa	-	D-Glukosa	+
D-galaktosa:	-	D-fruktosa:	-
maltosa:	+	sacharosa:	-
trehalosa:	+	cellobiosa:	-
melibiosa:	-	mannitol:	-
sorbitol:	-	glycerol:	-
octan sodný:	+	Na-propionát:	+

4. Chemotaxonomické vlastnosti

1) Mol % guaninu a cytosinu (obsah G + C) v DNA: 43,4 % při vysokotlaké kapalinové chromatografii.

2) Chinonový systém: ubichinon Q-8.

Na základě svých taxonomických vlastností, tak jak byly shora popsány, byl Alteromonas rava kmen SANK 73390 srovnáván se kmeny, popsanými v Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, sv. 1, 1984 a také s těmi kmeny, které byly v poslední době popsány v International Journal of Systematic Bacteriology. Bylo zjištěno, že Alteromonas rava kmen SANK 73390 má určité podobnosti s Alteromonas citrea, dalším mořským mikroorganismem. Oba

-6CZ 279780 B6 kmeny, tj. SANK 73390 a Slteromonas citrea, ATCC 29719, standardní kmen, byly pěstovány a potom srovnávány.

Ve srovnání s bleděšedožlutou barvou kolonií kmene SANK 73390, byly kolonie kmene ATCC 29719 zelenavěžlué. SANK 73390 se od Alteromonas citrea liší také tím, že je schopen růst při teplotě 4 ’C a svou schopností využívat trehalosu a propionát sodný jako zdroje uhlíku. Je tedy možno uzavřít, že Alteromonas rava kmen SANK 73390 je novým kmene nové čeledi Alteromonas rava a liší se podstatnými vlastnostmi od nejbližší známé čeledi, uložené ve sbírce kultur pod číslem ATCC 29719.

Shora uvedené vlastnosti jsou typické pro kmen SANK 73390. Je však dobře známo, že vlastnosti čeledi Alteromonas se mohou měnit jak v přírodě, tak uměle. Shora uvedené vlastnosti definují kmen Alteromonas rava tak, jak byl uložen, avšak nejsou nutně typické pro jiné čeledi Alteromonas nebo pro kmeny Alteromonas rava, které jsou schopné produkovat thiomarinol nebo pro přírodně se vyskytující varianty těchto kmenů. Je tedy zřejmé, že tyto kmeny také spadají do rozsahu vynálezu.

Je zřejmé, že SANK 73390 nebo jakýkoliv další kmen, schopný produkovat thiomarinol nebo některá z jeho variant může být pěstován v subkultuře nebo biotechnologicky pozměněn nebo modifikován k získání organismu s odlišnými vlastnostmi. Jediným požadavkem je, aby výsledný organismus byl schopen produkovat požadovanou látku.

Uvedené změny a modifikace mohou mít jakoukoliv požadovanou formu nebo mohou být důsledkem například podmínek pěstování. Kmeny mohou být modifikovány způsobem pěstování a podrobeny selekci tak, aby byly získány některé výhodné vlastnosti, například rychlejší růst nebo růst při nižších nebo vyšších teplotách.

Biotechnologické modifikace jsou obvykle cílené a mohou například vést k zavedení vlastností, usnadňujících selekci, například odolnosti proti bakteriostatickým látkám nebo naopak vnímavosti k těmto látkám nebo může jito kombinace různých vlastností, které mohou pomoci udržet čistotu nebo usnadnit čiš-tění kultury, zejména kultury, určené k očkování, alespoň v časových intervalech.

Dalšími vlastnostmi, které je možno zavést pomocí genetických manipulací mohou být jakékoliv vlastnosti, přípustné pro čeleď Alteromonas. Je například možno zařadit plasmidy, které jsou kódem pro různé typy odolnosti nebo je možno jakýkoliv přírodně se vyskytující plasmid vyjmout. Výhodné plasmidy jsou například ty, které jsou příčinou auxotrofie. Tyto plasmidy je možno získat z jakéhokoliv vhodného zdroje nebo je možno je zkonstruovat tak, že se izoluje přírodně se vyskytující plasmid z čeledi Alteromonas a do něj se uloží požadovaný gen nebo geny z jiného zdroje. Přírodní plasmidy je možno modifikovat i dalšími způsoby, které mohou být považovány za žádoucí.

Aby bylo možno získat thiomarinol z kultury příslušného mikroorganismu, je nutno mikroorganismus pěstovat ve vhodném živném prostředí. Tato prostředí jsou v oboru velmi dobře známa a často se užívají i při získáváni jiných fermentačních produktů.

-7CZ 279780 B6

Živné prostředí obvykle musí obsahovat jakoukoliv kombinaci zdroje uhlíku, zdroje dusíku a jedné nebo většího počtu anorganických solí, které použitý mikroorganismus může využít. Minimální požadavek na živné prostředí je, že toto prostředí musí obsahovat ty složky, které jsou nezbytné pro růst zvoleného mikroorganismu.

Vhodnými zdroji uhlíku jsou například glukosa, fruktosa, maltosa, sacharosa, mannitol, glycerol, dextrin, ovesná mouka, žito, kukuřičný škrob, bramborový škrob, kukuřičná mouka, sojová mouka, bavlníkový olej, melasa, kyselina citrónová a kyselina vinná, tyto zdroje mohou být užity jednotlivě nebo ve směsi dvou nebo většího počtu složek. Typické množství je v rozmezí 1 až 10 g/100 ml prostředí, ačkoliv množství je možno měnit podle potřeby v závislosti na požadovaném výsledku.

Vhodnými zdroji dusíku jsou jakékoliv látky, které obsahují bílkoviny, reprezentativními příklady dusíkových zdrojů jsou organické zdroje dusíku z živočichů a rostlin, může jít například o extrakty z přírodních zdrojů jako jsou sojová mouka, výpalky, arašídová mouka, mouka z bavlníkových semen, hydrolyzát kaseinu, fermamin, rybí moučka, kukuřičný výluh, pepton, extrakt z masa, kvasinky, extrakt z kvasinek, sladový extrakt. Z anorganických zdrojů dusíku je možno uvést dusičnan sodný, dusičnan amonný a síran amonný. Stejně jako v případě uhlíkových zdrojů, je. možno užít zdroje dusíku jednotlivě nebo ve směsích. Vhodné množství se typicky pohybuje v rozmezí 0,1 až 6 g/100 ml prostředí.

Vhodné anorganické soli jsou zejména ty soli, které kromě hlavní složky soli poskytují také stopové prvky. Soli by s výhodou měly dodat potřebné ionty, jako ionty sodné, draselné, amonné, vápenaté, hořečnaté, ionty železa, fosfátové, sulfátové, chloridové a karbonátové ionty. Mohou být přítomny i soli stopových kovů, jako kobaltu, manganu a stroncia nebo soli, schopné dodat tyto ionty, například bromidy, fluoridy, boritany nebo křemičitany.

Čeleď Alteromonas rava se vyskytuje přirozeně v mořské vodě, takže v případě, že není uveden opak, jsou ideálními podmínkami .v kultuře podmínky, odpovídající prostředí v moři. Je tedy vhodné do prostředí pro pěstování těchto mikroorganismů včlenit stopové ionty, které se obvykle vyskytují v mořské vodě.

V případě, že se mikroorganismus pěstuje v kapalném živném prostředí, je výhodné přidávat protipěnivé činidlo, například silikonový olej nebo rostlinný olej nebo jiné vhodné povrchově aktivní činidlo.

Je výhodné udržovat pH živného prostředí pro Alteromonas rava, kmen SANK 73390 při produkci thiomarinolu v rozmezí 5,0 až 8,0 přesto, že jediným požadavkem je, aby použité pH nebránilo růstu mikroorganismu a aby neovlivnilo nepříznivě irreversinilně kvalitu výsledného produktu. Může být výhodné přidat přebytek kyseliny nebo zásady k zastavení fermentace.

Alteromonas rava, kmen SANK 73390 obvykle roste při teplotě v rozmezí 4 až 32 °C, dobře roste v teplotním rozmezí 17 až 26 °C. Jiné teploty, nespadající do uvedeného rozmezí je možno

-8CZ 279780 B6 použít v případě, že se podaří vyvinout kmen, schopný růst při vyšší nebo nižší teplotě. Pro výrobu thiomarinolu je vhodné použit výhodného teplotního rozmezí 20 až 26 °C.

Thiamarinol je výhodné získávat z aerobní kultury, k tomuto účelu je možno užit jakéhokoliv pěstování za aerobních podmínek, například v kultuře na pevném prostředí, třepací kultuře nebo v kapalném živném prostředí za provzdušnění a míchání.

V případě, že se kmen pěstuje v malém rozměru, je obvykle výhodné použít pěstování několik dnů v třepací kultuře při teplotě 20 až 26°C.

Při založení fermentační kultury se s výhodou užívá očkovacího materiálu, připraveného v jednom nebo ve dvou stupních, například v Erlenmeyerově baňce. V živném prostředí se obvykle užívá směs zdroje uhlíku a zdroje dusíku. Baňky se protřepávají v termostatu při teplotě 23 °C celkem jeden až tři dny nebo tak dlouho, až se dosáhne dostatečného růstu. Výsledná očkovací kultura se potom užije k naočkování další očkovací kultury nebo přímo k naočkování produkční kultury. V případě, že se užije druhé očkovací kultury, může tato kultura být založena obdobným způsobem a potom je ji možno částečně použít k naočkování produkčního živného prostředí. Baňka, v níž je založena očkovací kultura se protřepává 1 až 3 dny nebo tak dlouho, až se dosáhne maximální produkce, užije se vhodné teploty. Po ukončení inkubace je možno mikroorganismus od živného prostředí oddělit odstředěním nebo filtrací.

V případě, že se mikroorganismus pěstuje ve velkém měřítku, může být výhodná kultura ve vhodném fermentačním zařízení za současného provzdušnění a míchání. Při tomto postupu je možno živné prostředí připravit přímo ve fermentačním zařízení. Po sterilizaci při teplotě 125 °C se živné prostředí zchladí a naočkuje očkovacím materiálem, předběžně vypěstovaným na sterilizovaném živném prostředí. Kultura se inkubuje za míchání a provzdušnění při teplotě 20 až 26 °C. Tento postup je vhodný v případě, že má být získáno velké množství výsledného produktu.

Množství thiomarinolu, produkované kulturou v průběhu času je možno sledovat například vysokotlakou kapalinovou chromatograf ií. Obvykle je možno dosáhnout maximálního množství produkovaného thiomarinolu v časovém rozmezí 19 hodin až 96 hodin.

Po vhodné době pěstování je možno thiomarinol izolovat a čistit jakýmkoliv známým způsobem. Je například možno thiomarinol ze živného prostředí izolovat tak, že se odfiltruje pevný podíl, například při použití diatomitu jako pomocného prostředku při filtraci nebo odstředěním, potom se supernatant extrahuje a thiomarinol se čistí na základě svých fyzikálně-chemických vlastnostech. Thiomarinol je z filtrátu nebo ze supernatantu možno extrahovat například organickým rozpouštědlem, nemísitelným s vodou, jako ethylacetátem, chloroformem, ethylenchloridem, methylenchloridem nebo jakoukoliv směsí těchto rozpouštědel v neutrálním nebo kyselém prostředí, potom je možno extrahovaný thiomarinol čistit.

Jako adsorpční činidla je možno užít aktivní uhlí nebo

-9CZ 279780 B6 adsorpční pryskyřici, například Amberlit XAD-2, XAD-4 (Rohm a Haas) nebo Diaion HP-10, HP-20, CHP-20, HP-50 (Mitsubishi Kasei Corporation). Nečistoty je možno po adsorpci odstranit tak, že se kapalina s obsahem thiomarinolu nechá projít vrstvou adsorpčního činidla nebo je možno thiomarinol čistit po adsorpci elucí pomocí vhodného elučního činidla, například při použití vodného methanolu, vodného acetonu nebo směsi butanolu a vody.

Intracelulární thiomarinol je možno čistit extrakcí vhodným rozpouštědlem, například 50 až 90 % vodným acetonem nebo vodným methanolem s následným odstraněním organického rozpouštědla s následnou extrakcí tak, jak byla popsána shora při izolaci thiomarinolu z filtrátu nebo ze supernatantu.

Výsledný thiomarinol je možno dále čistit známým způsobem, například chromatografií na sloupci při použiti nosiče, například silikagelu nebo silikagelu s obsahem hořčíku, který se dodává například pod obchodním názvem Florisil, dále dělicí chromatograf ií na sloupci při použití adsorpčního činidla, například Sephadexu LH-20 (obchodní název, Pharmacia), nebo vysokotlakou kapalinovou chromatografií v obvyklé fázi nebo na sloupci v reverzní fázi. Jak je známo, je možno všechny tyto postupy, vedoucí k izolaci a čistění výsledného produktu provádět jednotlivě nebo v jakékoliv vhodné kombinaci a popřípadě ještě opakovat, tak, aby bylo dosaženo dostatečné izolace a čištění výsledného produktu.

V případě, že sloučeniny podle vynálezu mají být užity k léčebným účelům, je možno je podávat jako takové nebo ve formě vhodného farmaceutického prostředku, obsahujícího kromě účinné složky ještě jedno nebo větší počet běžných ředidel, nosičů, popřípadě dalších pomocných látek. Povaha farmaceutického prostředku bude záviset především na předpokládaném způsobu podání. Například pro perorální podání se účinná složka obvykle zpracovává na prášky, granule, tablety, kapsle nebo sirupy. Pro parenterální podání je vhodné zpracování na injekční roztoky, které je možno podávat nitrožilně, nitrosvalově nebo podkožně, mimoto připadají v úvahu také kapky nebo čípky.

Tyto farmaceutické prostředky je možno připravit známým způsobem při použití běžných nosných prostředí, pojiv, látek, napomáhajících rozpadu, kluzných látek, stabilizátorů, prostředků pro úpravu chuti, prostředků pro lepší rozpuštění, pro vznik suspenze nebo pro tvorbu povlaku. Přestože se dávka může měnit v širokém rozmezí v závislosti například na příznacích choroby, věku nemocného, povaze a závažnosti infekce a zvoleném způsobu podání, v případě perorálního podání se dospělému člověku sloučeniny podle vynálezu obvykle podávají v denní dávce v rozmezí 20 až 2 000 mg. Sloučeniny je možno podat jako jednotlivou dávku nebo ve formě několika dílčích dávek, například dvakrát nebo třikrát denně.

Vzhledem k tomu, že thiomarinol má antibakteriální účinky proti gram-pozitivním i gram-negativním bakteriím u různých živočichů, například u člověka, psa, kočky, nebo králíka, může být často žádoucí podávat uvedenou látku místně, typicky ve formě krému, mazání nebo gelu. Při tomto způsobu podání je stejně jako shora možno užít nejrůznějších pomocných látek, jinak se prostředky pro místní podání připravují obvyklým způsobem.

-10CZ 279780 B6

Praktické provedení vynálezu, zejména příprava thiomarinolu a jeho antibakteriální účinnost budou osvětleny následujícími příklady, které vsak nemají sloužit k omezení rozsahu vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Fermentace thiomarinolu v baňce

A) Kultura

Alteromonas rava kmen SANK 73390 se pěstuje 3 dny při teplotě 22 °C na šikmém mořském agaru (Difco). Výsledná kultura se uvede do suspenze ve 3 ml umělé mořské vody. Potom se 0,1 ml suspenze asepticky odebere a užije k naočkování Erlenmeyerovy baňky s objemem 500 ml, obsahující 100 ml sterilizovaného živného prostředí, získaného rozpuštěním 37,4 g mořského bujónu (Difco) v 1 litru deionizované vody bez úpravy pH.

Baňka se inkubuje 24 hodin při teplotě 23 °C při protřepávání rychlostí 200 ot/min při poloměru otáčení 70 mm na rotační třepačce. Po této době se materiál užije k naočkování čtyř velkých fermentačních nádob s objemem 30 litrů, z nichž každá obsahuje 15 litrů shora popsaného sterilního živného prostředí, k naočkování se užije vždy 15 ml kultury, asepticky odebrané z Erlenmeyerovy baňky. Velké fermentační nádoby se inkubují 23 hodin při teplotě 23 °C, provzdušnění rychlostí 7,5 litr/min za současného míchání rychlostí 100 ot/min.

B) Izolace

Po 23 hodinách se obsah fermentačních nádob spojí, čímž se získá 60 litrů materiálu. Potom se pH kapaliny upraví na hodnotu 3 přidáním kyseliny chlorovodíkové s následným přidáním 60 litrů acetonu a směs se 30 minut extrahuje za míchání. Přidá se 1,2 kg .Celítu 545 jako pomocného prostředku pro filtraci (slovní známka, Johns Manville Co.) a roztok se zfiltruje. 110 litrů výsledného filtrátu se potom extrahuje při použití 60 litrů ethylacetátu a potom ještě dvakrát vždy 30 litry ethylacetátu. Organická vrstva se promyje 30 litry roztoku hydrogenuhličitanu sodného v množství 5 g/100 ml a potom ještě 30 litry nasyceného vodného roztoku chloridu sodného, vysuší se bezvodým síranem sodným a odpaří do sucha za sníženého tlaku, čímž se získá 14 g olej ovitého materiálu.

Získaný olejovitý materiál se rozpustí v methylenchloridu a roztok se nechá adsorbovat na sloupec, naplněný 200 g silikagelu v methylenchloridu. Výsledná látka se vymývá tak, že se zvyšuje polarita vyvíjecího roztoku v pořadí směs methylenchloridu a ethylacetátu, ethylacetát a směs ethylacetátu a methanolu. Eluát se odebírá po frakcích s objemem 18 ml a dále se zpracovávají frakce, vymyté směsí ethylacetátu a methanolu, které obsahují thiomarinol.

-11CZ 279780 B6

Uvedené frakce se odpaří do' sucha, čímž se získá 7 g olejovité látky, která se rozpustí ve 400 ml 50% vodného methanolu a roztok se nanese na sloupec s objemem 600 ml s náplní pryskyřice Diaion HP-20 (slovní známka, Mitsubishi Chem. Ind.) ve vodě. Po promytí 50% vodným methanolem se výsledný produkt vymývá 90% vodným methanolem, čímž se po odpaření do sucha za sníženého tlaku získá 1 g žlutého prášku. Tento žlutý prášek se nanese na chromatografický sloupec s náplní pryskyřice Sephadex LH-20, sloupec se potom vyvíjí směsí methylenchloridu, ethylacetátu a methanolu v objemovém poměru 19:19:2 a odebírají se frakce s obsahem produktu. Tímto způsobem se získá 750 mg thiomarinolu ve formě žlutého prásku.

Zkušební příkld 1

Antibakteriální účinnost thiomarinolu

Byly určeny minimální inhibiční koncentrace MIC pro thiomarinol v mikrogramech/ml pro gramopozitivní a gramnegativní bakterie na agaru při použití zředovací řady, jako živné prostředí byl užit živný agar (Eiken Schemical Co. Ltd.).

Získané výsledky jsou shrnuty v následující tabulce 1

Tabulka 1
bakteriální kmen	MIC Ug/ml)
Staphylococcus aureus 209P	< 0,01
Staphylococcus aureus 56R	> 0,01
Staphylococcus aureus 535 (MRSA)	> 0,01
Enterococcus feacalis 681	0,02
Escherichia coli NHIJ	0,8
Escherichia coli 609	0,8
Salmonella enteritidis	0,4
Klebsiella pneumoniae 806	0,8
Klebsiella pneumoniae 846 (R)	0,2
Enterobacter cloacae 963	1,5
Serratia marcescens 1184	3,1
Próteus vulgaris 1420	0,05
Morganella morginii 1510	6,2
Pseudomonas aeruginosa 1001	0,2
Pseudomonas aeruginosa NO7	0,4

Zkušební příklad 2

Účinnost thiomarinolu proti mycoplasmatům

Bylo použito stejného postupu jako ve zkušebním příkladu 1, v tomto případě byla stanovena účinnost hiomarinolu proti různým čeledím mycoplasmat. Získané výsledky jsou shrnuty v následující tabulce 2.

-12CZ 279780 B6

Tabulka	2
kmen	MIC (mg/ml)
Mycoplasma bovis Donetta	0,0125
Mycoplasma gallisepticum PG-31	0,05
Mycoplasma gallisepticum S-6	0,10
Mycoplasma gallisepticum K-l	0,05
Mycoplasma synoviae WVU1853	<0,006
Mycoplasma hyosynoviae S-16	0,025

Očkovací materiál: 0,005 ml 10⁵CFU/ml

Prostředí, užité ke zkouškám:

M. bovis a M. gallisepticum: Chanockovo prostředí, připravené způsobem podle publikace P.N.A.S., 48, 41 až 49 (1962) a doplněné 20 % koňského sera.

M. synoviae: Freyovo prostředí, připravené způsobem podle publikace Am. J. Vet. Res., 29, 2163 až 2171 (1968) a doplněné 12 % sera vepře

M. hyosynoviae: agarové prostředí Mucin PPLO^X,doplněné 15 % koňského sera.

Podmínky při pěstování:

Teplota 37 ’C, 5 dnů, mírně aerobní podmínky. Bylo užito metody, při níž se kultivace provádí v prostředí generátoru oxidu uhličitého pro jedno použití (Becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, MD 2103 USA), metoda se označuje BBL gas pack method.

* Agarové prostředí Mucin PPLO * obsahuje materiál z mikroorganismů, podobných organismům, vyvolávajícím pleuropneumonii a má následující složení:

PPLO bujón bez CV (Difco)	21 g
bakteriologický mucin (Difco)	5 g
destilovaná voda	800 ml
agar Noble (Difco)	12 g
koňské sérum	150 ml
25% čerstvý extrakt z kvasnic	50 ml

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1,55

1.30

1 102, 1 052,

8) spektrum v ultrafialovém světle:

v methanolu nebo v methanolu s kyselinou chlorovodíkovou má thiomarinol následující maxima v ultrafialovém světle v nm (e):

387 (12 000), 300 (3 500), 214 (26 000) a v methanolu s hydroxidem sodným má triomarinol následující spektrum v ultrafialovém světle v nm (e):

386 (9 600), 306 (4 200), 206 (25 000),

9) specifická otáčivost: /alfa/²⁵ _D = +4,3° (C = 1,0, methanol),

10) vysokotlaká kapalinová chromatografie: bylo užito dělicího sloupce Senshu-Pak ODS H-2151, rozměry sloupce 6 x 150 mm, (senshu Scientific Co., Ltd.), rozpouštědlo: 40% vodný acetonitril, rychlost průtoku: 1,5 ml/min,

-14CZ 279780 B6 vlnová délka: 220 až 350 nm (průkaz fotodiodou), doba retence: 5,9 minut, ^XH-NMR (ppm):

spektrum v nukleární magnetické rezonanci bylo provedeno v hexadeuterovaném dimethylsulfoxidu při použití tetramethylsilanu jako vnitřního standardu:

0,91

0,95

1) . povaha a vzhled: žlurý prášek,

1. Thiomarinol vzorce I

2,34

2,09

2,03

2) teplota tání: 84 až 89 °C,

2. Sloučenina vzorce I podle nároku 1 s následujícími vlastnostmi :

3. Biologicky čistá kultura kmen Alteromonas rava SANK 73390, identifikovatelný číslem ve veřejné sbírce kultur FERM

BP-3381, produkující sloučeninu vzorce I.

3,73

3,64

3,52

3,33

3 394, 2 930, 1 649, 1 598, 1 526, 1 288, 1 216, 1 154,

3) molekulový vzorec: ^c30^H44^N2°9^S2'

4. Farmaceutický prostředek k léčení nebo profylaxi bakteriálních infekcí, vyznačující se tím, že jako svou účinnou složku obsahuje sloučeninu podle nároků 1 nebo 2 a nosič, přijatelný z farmaceutického hlediska.

4,89

4,63

4,44

4.30

4,18

4,02

4) molekulová hmotnost: 640, stanoveno metodou FAB-MS, to znamená hmotovou spektrometrií při bombardování rychlými atomy,

5. Farmaceutický prostředek podle nároku 4, vyznačující se tím, že je určen pro dermatologické účely.

5,97

7,04

9,80

10,68 (1H, široký singlet), dublet, J = 6,8 Hz), dublet, J = 5,9 Hz), široký multiplet), široký multiplet), singlet), multiplet), triplet, J = 7,3 dublet, J = 10,7 multiplet), multiplet), dublet dubletů), triplet, J = 6,6 široký dublet, J dublet, J dublet, J dublet, J dublet, J multiplet), široký singlet), singlet), široký singlet) = 4,4 = 7,8 = 3,4 = 7,3

Hz) Hz) = 7*3 Hz), :z), z) , :z), z),

12) ¹³C-NMR spektrum:

ppm, spektrum v nukleární magnetické rezonanci bylo provedeno při 68 MHz v tetradeuterovaném methanolu při použití tetramethylsilanu jako vnitřního standardu, 174,3 (singlet), 170,4 (singlet), 168,6 (singlet), 161,1 (singlet), 137,9 (singlet), 135,7 (dublet), 135,1 (singlet), 129,8 (dublet), 116,3 (dublet), 115,8 (singlet), 113,7 (dublet),

77.6 (dublet), 74,4 (dublet), 72,1 (dublet) 71,8 (dublet, 66,0 (triplet), 65,7 (dublet), 64,9 (triplet), 45,3 (dublet), 43,9 (dublet), 36,6 (triplet), 33,4 (triplet), 30,1 (triplet), 30,0 (triplet), 29,7 (triplet), 27,0 (triplet),

26.7 (triplet), 20,3 (kvartet), 16,6 (kvartet), 16,3 (kvartet) ,

13) rozpustnost:

thiomarinol je rozpustný v alkoholech, například v methanolu, ethanolu, propanolu a butanolu, dále je rozpustný v dimethylsulfoxidu, dimethylformamidu, chloroformu, ethylacetátu, acetonu a ethyletheru, je však nerozpustný v hexanu a ve vodě,

14) barevné reakce:

pozitivní barevná reakce je na kyselinu sírovou, na jod a na manganistan draselný,

15) chromatografie na tenké vrstvě:

Rf = 0,57 absorpční činidlo silikagel (Měrek and Co., Inc., výrobek

-15CZ 279780 B6

č. 5715), eluční činidlo: směs methylenchloridu a methanolu v objemovém poměru 85:15.

5,37

5) hmotové spektrum: ^c3o^H45^N2°9^S2 /(M+H)⁺ metodou FAB-MS/ vypočteno: 641,2567 nalezeno: 641,2585,

6) elementární analýza:

vypočteno: C 56,23, H 6,92, N 4,37, S 10,01 % nalezeno: C 55,92, H 6,82, N 4,23, S 9,90 %,

7) spektrum v infračerveném světle v KBr má následující maxima v cm :

6. Způsob výroby sloučeniny vzorce I podle nároků 1 nebo 2 , vyznačující se tím, že se pěstuje kmen mikroorganismu Alteromonas rava SANK 73390, FERM BP-3381, schopný takovou sloučeninu produkovat a sloučenina se z kultury izoluje.