SK10902001A3 - Spôsob izolácie kyseliny pseudomonovej z kultivačného bujónu obsahujúceho komplex kyseliny pseudomonovej - Google Patents
Spôsob izolácie kyseliny pseudomonovej z kultivačného bujónu obsahujúceho komplex kyseliny pseudomonovej Download PDFInfo
- Publication number
- SK10902001A3 SK10902001A3 SK1090-2001A SK10902001A SK10902001A3 SK 10902001 A3 SK10902001 A3 SK 10902001A3 SK 10902001 A SK10902001 A SK 10902001A SK 10902001 A3 SK10902001 A3 SK 10902001A3
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- pseudomonic acid
- extract
- isobutyl acetate
- water
- acid
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/16—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing two or more hetero rings
- C12P17/162—Heterorings having oxygen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. Lasalocid
Landscapes
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Predložený vynález sa týka spôsobu izolácie pseudomonovej kyseliny A (mupirocín) z kultivačného bujónu obsahujúceho komplex pseudomonovej kyseliny.
Doterajší stav techniky
Pseudomonová kyselina A, tiež známa ako mupirocín, je antibiotikom, ktorý má vzorec (I) :
Je známe, že reťazce Pseudomonas fluorescens sú schopné biosyntézy, okrem pseudomonovej kyseliny A ďalšie príbuzné antibiotiká označené písmenami B-D v malých množstvách ľ.E.B. Chain, G. Mellows. J. Chem. Soc. Perkin Trans I. 318 (1977); J.P. Clayton a kol., Tetrahedron Lett., 21, 881 (1980); P.J.O.Hanlon, N.H. Rogers, J.Chem. Soc. Perkin Trans 1.2665 (1983)], reprezentované vzorcami (II) - (IV), konkrétne :
OH
HjC.
OH o OH cra
OťCHjhCOjH
H°
CHj (II) r -
Medzi antibiotiká pseudomonovéj kyseliny je z terapeutického'·' hľadiska najhodnotnejšia pseudomonová kyselina A, ktorá má veľký inhibičný účinok najmä proti grampozitívnym baktériám (ako je Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumononiae) a niektorým gramnegatívnym baktériám (ako je Haemophilus infuenzae, Neisseria gonorrhoae) a jej minimálna inhibijúca koncentrácia je v rozpätí 0,02-0,5 mg/dm3. Pseudomonová kyselina A má inhibíciou izoleucín-tRNA syntézového enzýmu vplyv na syntézu peptidov patogénnych baktérií [J. Hughes a G. Mellows, Biochem. J. 191, 209-219, (1980)]. Výhodným znakom tohoto antibiotika je to, že je menej toxické ako pre ľudí, tak zvieratá a je negatívne v Ames teste. Pseudomonová kyselina A je v súčasnosti užívaná pri liečbe ľudí, v rôznych prostriedkoch, na liečenie kožných infekcií (ako je impetigo, pyoderma), nosných infekcií a infekcií vonkajšieho ucha, akné, popálenín, ekzémov, psoriázy, v prípade ulcerácie na liečenie sekundárnych infekcií, a na prevenciu nemocničných infekcií.
Jednou z metód izolácie pseudomonovej kyseliny A z kultivačného bujónu obsahujúceho antibiotický komplex je kvapalino-kvapalinová extrakcia. Podľa nemeckého patentu DE 2 227 739 a amerického patentu US 4 289 703 sú rozpustné soli bária pridávané do fermentačného bujónu, potom sú bunky mikroorganizmu s nerozpustným inaktivačným činidlom separované odstredením a nakoniec sú antibiotiká extrahované metylizobutylketónom. Potom sú antibiotiká odobraté z metylizobutylketónového extraktu alkalickou vodou a získaný alkalický vodný extrakt je čistený reextrakciou s metylizobutylketónom. Získaný surový produkt je podrobený chromatografii, a z komplexu antibiotík pseudomonovej kyseliny je pripravený esterový derivát, a je purifikovaný preparatívnou tenkovrstvou chromatografiou. Kyselinová forma čistého antibiotika je získaná hydrolýzou.
Belgický patent č. 870 855 sa týka spôsobu, kedy je kultivačný bujón extrahovaný metylizobutylketónom a z extraktu je účinná látka extrahovaná roztokom hydrogénuhličitanu sodného. Materiály nerozpustné v alkalickej vode sú separované filtráciou, potom je pH filtrátu okyselené a filtrát je extrahovaný metylizobutylketónom. Nakoniec je pseudomonová kyselina A získaná koncentrovaním extraktu a kryštalizáciou zo zmesi metylizobutylketón-n-heptánu.
za použitia pseudomonová
Japonský patent 52-70083 sa týka dvoch metód získania pseudomonovej kyseliny z kultivačného bujónu. Podľa jednej z týchto metód sú bunky baktérií separované z kultivačného bujónu odstredením, potom je účinná látka extrahovaná zo supernatantu etylacetátom. Potom je komplex pseudomonovej kyseliny reextrahovaný z etylacetátovej fáze roztokom hydrogénuhličitanu sodného a po okyselení je opäť extrahovaný etylacetátom. Po odparení je zvyšok purifikovaný na silikagélovej kolóne eluens chloroformmetanolu, a nakoniec je čistá kyselina A získaná kryštalizáciou z
- 4 diizopropyléteru. V inom postupe surový produkt získaný uvedeným postupom je podrobený chromatografii na DEAE Sephadex aniontovej výmennej kolóne za použitia eluens metanol-amonium a frakcie obsahujúce pseudomonovú kyselinu A sú oddelené.
A.D. Curzons popisuje odobratie kyseliny pseudomonovej A z kultivačného bujónu vytvorením lítnej soli (Európsky patent č. 0 005 614). Metylizobutylketónový extrakt obsahujúci účinnú látku získaný pri pH 4,5 reaguje s lítium-2-etyl-hexanoátom rozpusteným v metanole. Vyzrážaná lítna soľ pseudomonovej kyseliny A je oddelená, rozpustená vo vode a pseudomonová kyselina A uvoľnená pri pH 4,5 je extrahovaná v metylizobutylketóne a vyzrážaná za prítomnosti n-heptánu.
V postupoch diskutovaných vyššie sú polárne a s vodou nemiešateľné rozpúšťadlá (metylizobutylketón, etylacetát, n-butanol) použité pre odobratie komplexu pseudomonovej kyseliny z kultivačného bujónu. Podľa našej skúsenosti nemôže byť pri použití týchto postupov úspešne realizovaná selektívna extrakcia, pretože okrem komplexu pseudomonovej kyseliny sú tiež vo väčších množstvách extrahované iné polárne a nepoláme nečistoty. Pseudomonová kyselina A môže byť získaná v čistej forme iba s nízkym výťažkom (17-34 %) alkalickou extrakciou organických rozpúšťadiel obsahujúcich nečistoty vo väčších množstvách, potom reextrakciou organickým rozpúšťadlom pri kyselom pH, a potom kryštalizáciou surového produktu. Použitie chromatografických postupov na purifikáciu nie je výhodné vo výrobnom merítku, pre ich vysoké pracovné náklady a požiadavky na rozpúšťadlo. Naviac za prítomnosti chromatografických « adsorbentov a počas chromatografických postupov dochádza v účinnej látke k intramolekulárnym transformáciám, čo vedie k vytvoreniu biologicky neaktívnej bicyklickej zlúčeniny 9{4-[lS,6R-8R (1S, 3S-dihydrcxy-2S-metyl-butyl)-5S-hydroxy-3,7dioxabicyklo [4.3.0]ononan-4S-yl]-3-metyl-but-2(E)-enoyloxy) nonánová kyselina (vzorec V)
(V) a zlúčeniny 9-/4-[lS, 6S-4S, 10S-dihydroxy-3R-(2S-hydroxy-lSmetyl-propyl)-2,8-dioxabicyklo [4.4.0]dekan-9S-yl]-3-metylbut-2(E) enoyloxyjnonánová kyselina (vzorec VI).
Vznik týchto zlúčenín a ich eliminácia prostredníctvom rekryštylizácie značne redukuje získaný výťažok pseudomonovej kyseliny A.
Aj keď postup izolácie cez medziprodukt lítnej soli pseudomonovej kyseliny A neobsahuje žiadny chromatografický stupeň, nie je zvyčajným pre výrobu v rozsiahlom merítku, pretože lítna soľ použitá v postupe, robí tento postup komplikovaný a drahý pre použitie vo výrobnom rozsahu.
Preto je teda nutnosť v stave techniky nájsť nový postup izolácie antibiotika pseudomonovej kyseliny A, ktorý by bol bez nevýhod a známych postupov a ktorého aplikácia vo výrobnom merítku by priniesla veľký výťažok získaného vyššie uvedeného antibiotika.
Podstata vynálezu
Predložený vynález sa týka spôsobu izolácie antibiotika pseudomonovej kyseliny A vzorca (I)
zahŕňajúceho krok extrakcie pseudomonovej kyseliny A z kultúry druhov rodu baktérií Pseudomonas, produkujúcich pseudomonovú kyselinu A, pri kyselom pH, za použitia chlórovaného alifatického uhlovodíku alebo izobutylacetátu tak, že sa získa extrakt obsahujúci pseudomonovú kyselinu A; a purifikáciou pseudomonovej kyseliny A z uvedeného . extraktu. Výhodne je purifikované pseudomonová kyselina A kryštalizovaná.
V jednom uskutočnení predloženého vynálezu zahŕňa purifikačný stupeň distribúciu odpareného zvyšku extraktu medzi voľný alkohol a menej polárne rozpúšťadlá, aby sa odstránili nečistoty; zriedenie vodno-alkoholovej fáze vodou; a extrakciou s viacej polárnym rozpúšťadlom na získanie purifikovanej pseudomonovej kyseliny A.
V inom uskutočnení predloženého vynálezu zahŕňa purifikačný stupeň odobratie pseudomonovej kyseliny z extraktu vodným roztokom hydrogénuhličitanu amonného, hydroxidu alkalického kovu alebo hydroxidu amonného, takže sa vytvorí alkalický roztok; okyselenie alkalického roztoku tak, že sa vytvorí kyselý roztok; a extrakciu kyselého roztoku s chlórovaným alifatickým uhlovodíkom alebo Í2obutylacetátom.
p r
Podrobný popis vynálezu
Prekvapujúco bolo zistené, že pseudomonová kyselina A môže byť účinne a selektívne extrahovaná po okyselení ako z celého bujónu obsahujúceho mikrobiálne bunky, tak aj zo supernatantu získaného po separácii buniek, prostredníctvom chlórovaných alifatických uhľovodíkov, potom môže byť väčšina inaktívnych nečistôt doprevádzajúcich pseudomonovú kyselinu A eliminovaná zo surového produktu po odparení uvedeného extraktu rozdelením odpareného zvyšku medzi vodno-alkoholový roztok a alifatický uhlovodík, potom medzi vodný alkohol a aromatický uhľovodík. Výhodný alkohol je metanol. Použitím tohoto postupu môže byť zo surového produktu získaná pseudomonová kyselina A v medicinálnej kvalite po rekryštalizácii z izobutylacetátu, acetonitrilu alebo zmesi voda-acetonitril.
Podľa výhodného postupu predloženého vynálezu sú počas izolácie antibiotickej pseudomonovej kyseliny A bunky mikroorganizmu separované pri temer neutrálnom pH odstredením. Po odstredení kultivačného bujónu pri skoro neutrálnom pH je väčší podiel pseudomonove j kyseliny A v supernatante a môže byť odobratý extrakciou zo supernatantu, prednostne pri pH 4,5. Prednostne je extrakcia antibiotika uskutočnená chlórovaným alifatickým uhľovodíkom, najvýhodnejšie metylénchloridom.
Primárna purifikácia pseudomonovej kyseliny A v metylénchloridovom extrakte sa môže uskutočniť za použitia distribúčnej separácie. Možné pigmenty a kvapalné nečistoty surového produktu môžu byť oddelené distribúciou medzi 10 % vody obsahujúcej zmes voda-alkohol a alifatický uhlovodík, ako je n-hexán al.ebo n-heptán. Väčší podiel nepolárnych inaktívnych nečistôt lipidového typu je prevedený do n-hexánovej alebo n-heptánovej fáze. Zvýšením obsahu vody vodno-metanolovej fáze na 25 % a jej extrakciou za použitia aromatického uhľovodíku, prednostne za použitia toluénu, môžu byť viacej polárne neaktívne nečistoty eliminované zo surového produktu.
Zvýšením obsahu vody vo vodno-metanolovej fázi na 50 % a jej extrakciou rozpúšťadlom nemiešateľným s vodou, prednostne metylénchloridom, etylacetátom, metylizobutylketónom, n-butylacetátom alebo izobutylacetátom, a odparením organického rozpúšťadla, je získaný surový produkt obsahujúci pseudomonovú kyselinu A. Pseudomonová kyselina A môže byť oddelená od ďalších zložiek komplexu pseudomonovej kyseliny, vytvoreného počas biosyntézy kryštalizáciou, prednostne za použitia rozpúšťadlovej zmesi metylizobutylketón-n-heptán.
V inom uskutočnení predloženého vynálezu sa môže uskutočniť extrakcia celého bujónu za prítomnosti buniek mikroorganizmu pri pH 4,5 chlórovaným alifatickým uhlovodíkom, prednostne metylénchloridom. Komplex pseudomonovej kyseliny je extrahovaný z metylénchloridového extraktu 2 % roztokom hydrogénuhličitanu sodného a komplex pseudomonovej kyseliny je získaný v kyselej forme z vodnej fáze, prednostne pri pH 4,5, metylénch1oridom.
Ďalej sa tiež zistilo, že po okyselení môže byť pseudomonová kyselina A, rozpustená v bujóne a viazaná na bunky biomasy, extrahovaná účinne a selektívne za použitia izobutylacetátu pre extrakciu. Rovnako bolo zistené, že po extrakcii kultivačného bujónu môže byť pseudomonová kyselina získaná z izobutylacetátového extraktu výhodnejšie hydrogénuhličítanom amonným, hydroxidom amonným alebo hydroxidom alkalického kovu. Preferovaným hydroxidom alkalického kovu je hydroxid sodný. Po okyselení uvedených extraktov a ich extrahovaní izobutylacetátom, môže byť získaný koncentrovaný extrakt organického rozpúšťadla, z ktorého sa dá pripraviť kryštalický surový produkt odparením. Po rekryštalizácii z izobutylacetátu, acetonitrilu alebo zmesi voda-acetonitril môže byť pseudomonová kyselina A získaná v medicinálnej kvalite.
Podľa výhodného uskutočnenia predloženého vynálezu je extrakcia antibiotika z celého bujónu uskutočnená izobutylacetátom, prednostne pri pH okolo 4,5. Aby sa eliminoval vznik emulzie, môže sa použiť deemulgátor, prednostne Armogad D5397 (AKZO Chemicals Ltd., Lancashire, Veľká Británia). Prednostne obsahuje deemulgátor asi 0,1 % v 10 % obj. roztoku izobutyläcetátu. Z izobutylacetátového extraktu .separovaného na separátoru typu Westfalia je komplex pseudomonovej kyseliny odobratý vodným roztokom hydroxidu sodného, a surový produkt získaný po extrakcii pri kyselom pH kryštalizuje zo zmesi petroléteru (bod varu v rozpätí 60° - 95° C) a izobutyläcetátu. Získaný produkt je rekryštalizovaný, prednostne z acetonitrilu; postupne je vodný roztok uchovávaný ako zvyšok, potom znovuzískaný po filtrácii.
Na použitie ako východzieho materiálu pre postup podľa predloženého vynálezu je vhodný akýkoľvek kultivačný bujón kmeňa mikroorganizmov rodu baktérií Pseudomonas, schopných biosyntetizovať pseudomonovú kyselinu A.
Na kyselé spracovanie buniek mikroorganizmov môžu byť použité minerálne kyseliny, ako je kyselina chlorovodíková, kyselina sírová a kyselina fosforečná, a organické kyseliny, ako je kyselina octová a kyselina oxalová. Oxalová kyselina a kyselina sírová sú pre daný účel najmä výhodné.
Na konci fermentácie je stanovený presný obsah pseudomonovej kyseliny A a príbuzných zlúčenín vysokotlakou kvapalinovou chromatografiou. Kultivačný bujón je zriedený na dvojnásobok etanolom, je aplikovaný ultrazvuk, odstredený, a supernatan je použitý pre analýzu. Pseudomonová kyselina A a príbuzné zlúčeniny pripravené použitím postupu podľa predloženého vynálezu boli definované nasledujúcimi dobami retencie : pseudomonová kyselina A vzorca (I) 8,34 min; pseudomonová kyselina B vzorca (II) 6,83 min? pseudomonová kyselina C vzorca (III) 16,8 min; pseudomonová kyselina D vzorca (IV) 6,8 min; menšia zložka vzorca (V) 6,55 min; menšia zložka vzorca (VI) 6,9 min [prístroj LKB 2248 čerpadlo, LKB 2157 auto-vzorkovač, LKB 2155 kolóna, LKB 2141 UV detektor, analýzy pri 222 nm, kolóna : Nucleosil C 10 mikrometrov (BST), eluens : zmes (35:65) acetonitrilu a vodného roztoku 0,1 M Ν3Η=ΡΟλ (pH = 4,2), prietoková rýchlosť 1,0 ml/min].
Štruktúra izolovanej pseudomonovej kyseliny bola stanovená metódami UV, IR, ^’H-NMR, 13C-NMR a hmotové j špektroskopie. Pseudomonová kyselina A, pripravená podľa predloženého vynálezu, bola identická s polymorfnou formou I publikovanou v medzinárodnom patente W092/10493.
Postup podľa predloženého vynálezu je doložený nasledujúcimi príkladmi. Avšak, predložený vynález by tým nemal byť obmedzený.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Hodnota pH piatich litrov kultivačného bujónu so 1200 jag/ml mupirocínu bola upravená za kontinuálneho miešania na 4,5 prostredníctvom 20 % kyseliny sírovej (60 ml). Okyselená tekutina bola extrahovaná 2,5 litra metylénchloridu. Potom boli fáze separované a ostrá fáza bola pripravená z emulgovanej organickej fáze odstredením. Podľa predchádzajúceho kroku bol kultivačný bujón extrahovaný dvakrát opäť 1,25 litra metylénchloridu. Spojené metylénchloridové extrakty boli premyté s 1,25 litra deionizovanej vody. Fáze boli oddelené a, pri teplote pod 20° C, bol extrahovaný metylénchloridový extrakt najprv 0,5 litra a potom 0,25 litra 2 % roztoku hydrogénuhličitanu sodného. Fáze boli oddelené a extrakty boli spojené. Spojené extrakty boli ochladené pod 20° C a pH extraktu bolo upravené za kontinuálneho miešania na 4,5 20 % kyselinou sírovou. Získaný kyselý roztok bol extrahovaný jedenkrát s 0,38 litra a jedenkrát s 0,19 litra metylénchloridu. Spojené metylénchloridové extrakty boli premyté s 0,19 litra deionizovanej vody, a potom bol metylénchloridový extrakt čistený pri izbovej teplote dreveným uhlím (0,42 g). Po vyčistení bol metylénchloridový extrakt odparený. Zvyšok po odparení (okolo 8 g) bol rozpustený pri izbovej teplote v 16 ml izobutylacetátu. Za miešania bol roztok ochladený na 0-5° C a miešanie pokračovalo, dokiaľ nebola zahájená kryštalizácia. Potom kryštalizácia prebiehala pri tejto teplote cez noc. Vyzrážaný mupirocín bol odfiltrovaný, premývanie bolo uskutočnené 2 x 4 ml studeným (pod 5° C) izobutylacetátom a 6 ml zmesi (2:1) izobutylacetát-petroléter. Potom boli tieto antibiotiká premyté suspenziou v 2 x 25 ml petroléteru (rozpätie varu 60°-95° C) a sušené za vákua pri 50° C. Získaný mupirocín bol rozpustený pri 40°-45° C v 60 ml izobutylacetátu. Roztok bol ochladený na izbovú teplotu a 60 ml petroléteru (rozpätie varu 60°-95° C) bolo zavádzané po kvapkách do roztoku. Potom prebiehala kryštalizácia pri 0-5° C cez noc. Vyzrážané kryštále boli filtrované a premývanie bolo uskutočnené 2 x 4 ml studenej (pod 5° C) zmesi izobutylacetát-petroléter (1:2). Potom bol produkt premytý jeho suspendovaním v 3 x 20 ml petroléteru. Mupirocín bol sušený vo vákuu pri teplote 50° C do konštantnej hmotnosti. Týmto spôsobom bolo získaných 3,3 g čistého mupirocínu, ktorý má nasledujúce charakteristiky :
Teplota topenia : 73° - 75° C
UV špektrum (10 ;ug/ml, v 95 % roztoku etanolu) : J, = 222 nm xn ax
E1% = 303,6 lem '
IČ špektrum (MBr) : y OH 3483 a 3306, yc = O 1728 (COOCHa),
1720 (COOH) cm-1.
1H-NMR spektrum (CDC13, = 0,00 ppm) :
S (ppm)
Priradenie
Interakčná konštanta (Hz)
| 5.75 (lH)q | 2-H =1.1 2.15 | |
| 4.08 (2H)t | 9'-H 3J = 6.4 2 8.9 | |
| 3.93—3.72 (4H)m | 5,7,13-H;16-¾ | |
| 3.55 (lH)dd | 16-Ηλ 3 J =11.8; | 3 |
| 3.48 (lH)dd | 6-H 3J =8.4; 2.15 | 3ď 1 |
| 2.82 (lH)td | 10-H 3J =6.3; 9.10 | v |
| 2.74 (lH)dd | 11-H 3 J =2.3; 10.11 | v |
| 2.60 (lH)dd | 4—H 3J =14.5; | 3 |
| 2.36-2.28 (3H)m | 4-Ηλ;2'-Η= | |
| 2.20 (3H)d | 15-H =1.1 3 2 - 15 | |
| 2.02-1.92 (lH)m | 8-H | |
| 1.76-1.61 (6H)m | 9-H ;3'-H ;8'-H 2 2 2 | |
| 1.43-1.33 (9H)m | 12-H;4'-H ;5'-H ; 2 2 6'-H ;7'-H 2 2 | |
| 1.22 (3H)d | 14-H 3 J =6.4 3 13.14 | |
| 0.94 (3H)d | 17-H 3 J =7.0 3 1 2 _ X 7 |
12.17
- =2· =3.2 =2.3 =7.8 =2.7
S 13C-NMR spektrum (CDC13 roztok, ^TMS = 0,00 ppm) :
| £7ppm) | Priradenie | £7 ppm) | Priradenie |
| 177.8s | C-ľ | 42.7t,d | C-9,C—12 |
| 166.9S | C-l | 39.4d | C-8 |
| 156.OS | C-3 | 33.9t,t | C-9,C-2' |
| 117.7d | C-2 | 31.6t | C-4'* |
| 74.9d | C-5 | 28.9t | C-5'* |
| 71.4d | C-l 3 | 28.8t | C-6'* |
| 70.4d | C-7 | 28.5t | C-8'* |
| 69. Od | C-6 | 25.9t | C-7' |
| 65.3t | C—16 | 24.61 | C-3' |
| 63.9t | C-9' | 20.8q | C-14 |
| 61.3d | C-ll | 19.lq | C-l 5 |
| 55.6d | C-10 | 12.7g | C-l 7 |
* zameniteľné priradenie
Hmotové spektrum
Charakteristické spektrálne dáta :
| M/Z | RI (%) | Priradenie |
| 501 | 100 | (M + H)* |
| 327 | 45 | (M + H - H0/CH3/aC00H) |
| 309 | 16 | (M/z 327 -H=O)* |
| 227 | 33 | (C H 0 ) + ' X 2 X <> Λ ' |
odstredením. extrahovaný i zobutylacetátové deionizovanej vody.
Hodnota pH piatich litrov kultivačného bujónu so 1500 jjg/ml mupirocínu bola upravená za kontinuálneho miešania na 4,5 prostredníctvom 20 % kyseliny sírovej. Okyselená tekutina bola extrahovaná 2,5 litra izobutylacetátu. Fáze boli separované a ostrá fáza bola pripravená z emulgovanej organickej fáze Podľa predchádzajúceho kroku bol kultivačný bujón opäť 1,25 litru izobutylacetátu. Spojené extrakty boli premyté s 1,25 litra Fáze boli oddelené a do izobutylacetátového extraktu bolo pridaných 0,5 litra deionizovanej vody. pH zmesnej fáze bolo upravené na 8,0+0,2 5 % hydroxidom amonným.
Fáze boli oddelené a izobutylacetátový extrakt bol opäť extrahovaný s 0,5 litru deionizovanej vody pri pH 8,0+0,2.
Spojené alkalické extrakty boli ochladené pod 20° C a pH extraktu bolo upravené za kontinuálneho miešania na 4,5 20 % kyselinou sírovou. Získaný kyselý roztok bol extrahovaný jedenkrát s 0,5 litra a potom jedenkrát s 0,25 litra izobutylacetátu. Spojené izobutylacetátové extrakty boli premyté s 0,25 litra deionizovanej vody, potom bol izobutylacetátový extrakt čistený pri izbovej teplote dreveným uhlím (0,52 g). Po vyčistení bol izobutylacetátový extrakt koncentrovaný vo vákuu na finálny objem 13 ml. Potom kryštalizácia a rekryštalizácia mupirocínu prebiehala ako v príklade 1. Týmto spôsobom bolo získaných 3,75 g mupirocínu, ktorý má rovnaké fyzikálne vlastnosti, ako je popísané v príklade 1.
Príklad 3 litrov kultivačného bujónu s koncentráciou mupirocínu 1000 >ig/ml bolo odstredené na super odstredivke typu F-100 (výrobca : Budapešti Vegyipari Gépgyár), potom bolo pH supematantu upravené na 4,5 prostredníctvom kyseliny oxalovej (okolo 0,69 litru). Okyselený roztok bol extrahovaný dvakrát 24 litrami metylénchloridu, a spojené extrakty boli odparené vo vákuu. Olejový zvyšok (asi 0,14 kg) bol rozpustený v 0,56 litra metanolu obsahujúceho 10 % vody a potom bol roztok extrahovaný dvakrát 0,56 litra n-hexánu. Metanolový roztok bol zriedený deionizovanou vodou na obsah 25 % vody a roztok bol extrahovaný dvakrát 0,56 litra toluénu. Nasledovne bol metanolový roztok zriedený deionizovanou vodou na obsah vody 50 % a roztok bol extrahovaný raz 0,56 litra metylénchloridu, potom raz 0,28 litra metalénchloridu. Spojené metylénchloridové extrakty boli odparené vo vákuu. Po odparení získaný zvyšok (asi 0,11 kg) bol spracovaný podľa postupu v príklade 1, za získania 44 g mupirocínu, ktorý má rovnaké fyzikálne vlastnosti, ako v príklade 1.
Príklad 4
Hodnota pH 160 litrov kultivačného bujónu obsahujúceho mupirocín v koncentrácii 1200 jig/ml bola upravená za kontinuálneho miesenia na 4,5 + 0,2 prostredníctvom 20 % • P
- 16 kyseliny sírovej (asi 2,7 litru). Potom bola okyselená tekutina extrahovaná 80 litrami izobutylacetátu. Po 30 minútach miešania bol pridaný 0,1 % deemulgátor (1 g Armogard D5397/liter bujónu v roztoku izobutylacetátu). Fáze boli separované separátorom typu Westfalia SA1-01-175 (Westfalia Separator A.G., Oelde, Nemecko). Kultivačný bujón bol opäť extrahovaný 40 litrami izobutylacetátu a separovaný podľa predchádzajúcich krokov.
Izobutylacetátové extrakty deionizovanej vody. Premytý boli premyté 40 litrami izobutylacetátový extrakt bol zmiešaný s 20 litrami deionizovanej vody, a potom bolo pridaných do zmesi 400 ml roztoku 10 % hmotn. roztoku síranu horečnatého ako deemulgátoru. Nasledovne bolo pH vodnej zmesi izobutylacetátu upravené hydroxidom sodným na 8,0 + 0,2. Po 20 minútach miešania boli fáze oddelené a izobutylacetátový extrakt bol opäť extrahovaný pri pH 8,0 + 0,2. Spojený vodný alkalický roztok bol extrahovaný 12 litrami izobutylacetátu za prítomnosti 800 ml 10 % hmotn. síranu horečnatého. Po oddelení fáz bolo do vodnej fáze pridaných 8 litrov izobutylacetátu, potom bolo pH vodnej izobutylacetátovéj zmesi upravené na 4,5 + 0,2 20 % roztokom kyseliny sírovej. Po 20 minútach miešania boli fáze separované a okyselený roztok bol opäť extrahovaný, ako bolo popísané vyššie. Spojené izobutylacetátové extrakty boli premyté 5 litrami deionizovanej vody za prítomnosti 100 ml 10 % hmotn. roztoku síranu sodného. Fáze boli oddelené a izobutylacetátový extrakt bol odparený vo vákuu na finálny objem 1,1 litra. Izobutylacetátový koncentrát bol zmiešaný so 110 ml petroléteru (rozpätie varu 60° - 95° C), a kryštalizácia prebiehala pri 0-5° C po 24 hodín. Vyzrážané kryštále boli odfiltrované a premyté chladným (pod 5° C) izobutylacetátom. Potom bol vlhký surový produkt suspendovaný v 600 ml petroléteru, filtrovaný a sušený vo vákuu pri 40° C. Získaný mupirocín bol rozpustený v 550 ml acetonitrilu pri 40° - 50° C, a čistený pri predchádzajúcej teplote s dreveným uhlím (5,5 g). Po vyčistení bol roztok ochladený na izbovú teplotu, potom udržiavaný pri 0° - 5° C po 24 hodín. Vyzrážaný mupirocín bol
- 17 odfiltrovaný, potom bolo uskutočnené premývanie 50 ml chladného (pod 5° C) acetonitrilu. Vlhké kryštále boli suspendované v 200 ml deionizovanej vody, potom bolo do suspenzie pridané d’aľšie množstvo 200 ml deionizovane j vody. Potom prebiehala kryštalizácia pri 0°-5° C po 24 hodín. Kryštále boli odfiltrované, potom bolo uskutočnené premývanie 2 x 50 ml deionizovanej vody. Produkt bol sušený pod vákuom pri 40° C po 72 hodín. Týmto spôsobom bolo získaných 80,6 g mupirocínu, ktorý má rovnaké fyzikálne vlastnosti ako v príklade 1.
Aj keď tu boli popísané niektoré výhodné uskutočnenia vynálezu, je odborníkovi znalému stavu techniky zrejmé, že môžu byť uskutočnené rôzne obmeny a variácie popísaného uskutočnenia, aniž, že by bol opustený duch a rozsah vynálezu. Preto sa predpokladá, že vynález je obmedzený iba rozsahom daným pripojenými nárokami a aplikovateľnými právnymi pravidlami.
Claims (17)
1. Spôsob izolácie antibiotickej pseudomonovej kyseliny A vzorca (I) vyznačujúci sa tým, že zahŕňa kroky :
extrakciu pseudomonovej kyseliny A z kultúry druhov rodu baktérií Pseudomonas, produkujúcich pseudomonovú kyselinu A, pri kyselom pH, použitím chlórovaného alifatického uhlovodíku alebo izobutylacetátu tak, že sa získa extrakt obsahujúci pseudomonovú kyselinu A; a purifikáciu pseudomonovej kyseliny A z uvedeného extraktu.
2. Spôsob podľa nároku 1 vyznačujúci sa tým, že purifikačný krok zahŕňa rozdelenie extraktu medzi vodno-alkoholovú fázu a organickú fázu obsahujúcu aspoň jedno organické rozpúšťadlo; a odparenie organického rozpúšťadla.
3. Spôsob podľa nároku 2 vyznačujúci sa tým, že uvedeným alkoholom je metanol.
4. Spôsob podľa nároku 3 vyznačujúci sa tým, že extrakt sa rozdelí medzi roztok 10 % vody - metanolu a alifatický uhľovodík.
e e
- 19
5. Spôsob podľa nároku 4 vyznačujúci sa tým, že alifatický uhľovodík je hexán alebo heptán.
6. Spôsob podľa nároku 5 vyznačujúci sa tým, že alifatický uhľovodík je n - hexán.
r
7. Spôsob podľa nároku 3 vyznačujúci sa tým, že extrakt sa rozdelí medzi roztok 25 % vody - metanolu a aromatický uhlovodík.
8. Spôsob podľa nároku 7 vyznačujúci sa tým, že aromatický uhlovodík je toluén.
9. Spôsob podľa nároku 3 vyznačujúci sa tým, že extrakt sa rozdelí medzi roztok 50 % vody - metanolu a rozpúšťadlo je nemiešateľné s vodou.
10. Spôsob podľa nároku 9 vyznačujúci sa tým, že rozpúšťadlo nemiešateľné s vodou je vybraté zo skupiny pozostávajúcej z metylénchloridu, etylacetátu, metylizobutylketónu, n- butylacetátu a izobutylacetátu.
11. Spôsob podľa nároku l vyznačujúci sa tým, že krok purifikácie zahŕňa získanie pseudomonovéj kyseliny A z extraktu vodným roztokom hydrogénuhličitanu amonného, hydroxidu alkalického kovu alebo hydroxidu amonného tak, že sa vytvorí alkalický roztok; okyselenie alkalického roztoku, takže sa vytvorí kyselinový roztok; a extrakciu kyselého roztoku i zobutylacetátom.
12. Spôsob podľa nároku 11 vyznačujúci sa tým, že pseudomonová kyselina A sa získa z extraktu vodným roztokom hydroxidu sodného.
- 20
13. Spôsob podľa nároku 11 vyznačujúci sa tým, že pseudomonová kyselina A sa získa z extraktu vodným roztokom hydroxidu amonného.
14. Spôsob podľa nároku 11 vyznačujúci sa tým, že pseudomonová kyselina sa získa z extraktu vodným roztokom hydrogénuhličitanu amonného.
15. Spôsob podľa nároku 1 vyznačujúci sa tým, že ďalej zahŕňa krok odparenia a kryštalizácie purifikovanéj pseudomonovej kyseliny A.
16. Spôsob podľa nároku 15 vyznačujúci sa tým, že surová pseudomonová kyselina A kryštalizuje z izobutylacetátu alebo zmesi izobutylacetát-petroléteru.
17. Spôsob podľa nároku 15 vyznačujúci sa tým, že surová pseudomonová kyselina A kryštalizuje z acetonitrilu, vody alebo zmesi acetonitrilu a vody.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US11844799P | 1999-02-03 | 1999-02-03 | |
| PCT/US2000/002824 WO2000046388A1 (en) | 1999-02-03 | 2000-02-03 | Process for the isolation of pseudomonic acid a from pseudomonic acid complex-containing culture broth |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK10902001A3 true SK10902001A3 (sk) | 2002-04-04 |
Family
ID=22378653
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK1090-2001A SK10902001A3 (sk) | 1999-02-03 | 2000-02-03 | Spôsob izolácie kyseliny pseudomonovej z kultivačného bujónu obsahujúceho komplex kyseliny pseudomonovej |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6245921B1 (sk) |
| EP (1) | EP1147210A4 (sk) |
| JP (1) | JP2002535996A (sk) |
| KR (1) | KR20010112258A (sk) |
| CN (1) | CN1345377A (sk) |
| AU (1) | AU771214B2 (sk) |
| BG (1) | BG105775A (sk) |
| BR (1) | BR0009178A (sk) |
| CA (1) | CA2360840A1 (sk) |
| CZ (1) | CZ20012725A3 (sk) |
| HK (1) | HK1041294A1 (sk) |
| HR (1) | HRP20010570A2 (sk) |
| HU (1) | HUP0105286A3 (sk) |
| IL (1) | IL144678A0 (sk) |
| IS (1) | IS6034A (sk) |
| MX (1) | MXPA01007805A (sk) |
| NO (1) | NO20013790L (sk) |
| PL (1) | PL349153A1 (sk) |
| SK (1) | SK10902001A3 (sk) |
| TR (1) | TR200102232T2 (sk) |
| WO (1) | WO2000046388A1 (sk) |
| YU (1) | YU55501A (sk) |
| ZA (1) | ZA200106057B (sk) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000046389A1 (en) * | 1999-02-03 | 2000-08-10 | Biogal Gyogyszergyar Rt | Process for the preparation of pseudomonic acid a antibiotic by microbiological method |
| AU2002345856A1 (en) * | 2001-06-21 | 2003-01-08 | Biogal Gyogyszergyar Rt | Metabolic controlled fermentation process for pseudomonic acid production |
| DE20220885U1 (de) * | 2001-12-28 | 2004-06-24 | BIOGAL Gyógyszergyár Rt. | Kristallines und amorphes Mupirocin-Calcium |
| IL150907A (en) * | 2002-07-25 | 2007-07-04 | Stephan Cherkez | Process for the preparation of stable amorphous calcium pseudomonate |
| WO2005117837A1 (en) * | 2004-06-01 | 2005-12-15 | Teva Gyógyszergyár Zàrtköruen Muködo Rèszvènytàrsasàg | Process for preparation of amorphous form of a drug |
| US7619102B2 (en) | 2005-02-21 | 2009-11-17 | Axellia Pharmaceuticals Aps | Purification of mupirocin |
| GB2441328A (en) * | 2006-08-30 | 2008-03-05 | Alpharma Aps | A method for obtaining mupirocin calcium |
| US8268975B2 (en) * | 2009-04-03 | 2012-09-18 | Dow Agrosciences Llc | Demulsification compositions, systems and methods for demulsifying and separating aqueous emulsions |
| CN104370896A (zh) * | 2013-11-29 | 2015-02-25 | 江苏汉邦科技有限公司 | 一种纯化假单孢菌素的方法 |
| CN103820369B (zh) * | 2014-03-07 | 2015-11-18 | 浙江瑞邦药业有限公司 | 一种萤光假单胞菌及其应用 |
| CN109053707B (zh) * | 2018-09-19 | 2021-08-17 | 福建康鸿生物科技有限公司 | 一种莫匹罗星的提纯方法 |
| CN110823649A (zh) * | 2019-10-21 | 2020-02-21 | 河南中烟工业有限责任公司 | 一种卷烟主流烟气中有机酸的收集方法和检测方法 |
| US20230312540A1 (en) * | 2020-08-25 | 2023-10-05 | Hangzhou Zhongmeihuadong Pharmaceutical Co., Ltd | Method for extracting mupirocin |
| CN116867905A (zh) * | 2021-02-07 | 2023-10-10 | 杭州中美华东制药有限公司 | 一种莫匹罗星的发酵方法 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1395907A (en) | 1971-06-12 | 1975-05-29 | Beecham Group Ltd | Antibiotics |
| JPS5270083A (en) | 1975-12-04 | 1977-06-10 | Yoshitomi Pharmaceut Ind Ltd | Manufacture of an antibiotics, trans-pseudomonic acid |
| CA1103264A (en) * | 1977-09-30 | 1981-06-16 | Norman H. Rogers | Purification of pseudomonic acid |
| CA1115699A (en) | 1978-05-20 | 1982-01-05 | Alan D. Curzons | Lithium pseudomonate and its preparation |
| IS1606B (is) * | 1991-05-07 | 1996-10-18 | Sankyo Company Limited | Aðferð til framleiðslu nýs sýkladrepandi efnasambands Thiomarinol, fengið með ræktun Alteromanas rava SANK 73390 |
-
2000
- 2000-02-03 HU HU0105286A patent/HUP0105286A3/hu unknown
- 2000-02-03 KR KR1020017009823A patent/KR20010112258A/ko not_active Application Discontinuation
- 2000-02-03 SK SK1090-2001A patent/SK10902001A3/sk unknown
- 2000-02-03 BR BR0009178-2A patent/BR0009178A/pt not_active IP Right Cessation
- 2000-02-03 YU YU55501A patent/YU55501A/sh unknown
- 2000-02-03 TR TR2001/02232T patent/TR200102232T2/xx unknown
- 2000-02-03 EP EP00908467A patent/EP1147210A4/en not_active Withdrawn
- 2000-02-03 CA CA002360840A patent/CA2360840A1/en not_active Abandoned
- 2000-02-03 CN CN00805537A patent/CN1345377A/zh active Pending
- 2000-02-03 IL IL14467800A patent/IL144678A0/xx unknown
- 2000-02-03 US US09/497,806 patent/US6245921B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-02-03 WO PCT/US2000/002824 patent/WO2000046388A1/en not_active Application Discontinuation
- 2000-02-03 MX MXPA01007805A patent/MXPA01007805A/es unknown
- 2000-02-03 CZ CZ20012725A patent/CZ20012725A3/cs unknown
- 2000-02-03 AU AU29802/00A patent/AU771214B2/en not_active Ceased
- 2000-02-03 PL PL00349153A patent/PL349153A1/xx not_active Application Discontinuation
- 2000-02-03 JP JP2000597447A patent/JP2002535996A/ja active Pending
-
2001
- 2001-07-24 ZA ZA200106057A patent/ZA200106057B/en unknown
- 2001-07-27 HR HR20010570A patent/HRP20010570A2/hr not_active Application Discontinuation
- 2001-08-01 IS IS6034A patent/IS6034A/is unknown
- 2001-08-02 NO NO20013790A patent/NO20013790L/no not_active Application Discontinuation
- 2001-08-03 BG BG105775A patent/BG105775A/xx active Pending
-
2002
- 2002-04-22 HK HK02103004.6A patent/HK1041294A1/zh unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BR0009178A (pt) | 2001-11-20 |
| MXPA01007805A (es) | 2003-06-04 |
| ZA200106057B (en) | 2002-07-24 |
| US6245921B1 (en) | 2001-06-12 |
| AU771214B2 (en) | 2004-03-18 |
| EP1147210A1 (en) | 2001-10-24 |
| IS6034A (is) | 2001-08-01 |
| HRP20010570A2 (en) | 2002-08-31 |
| NO20013790D0 (no) | 2001-08-02 |
| CN1345377A (zh) | 2002-04-17 |
| KR20010112258A (ko) | 2001-12-20 |
| BG105775A (en) | 2002-03-29 |
| HK1041294A1 (zh) | 2002-07-05 |
| IL144678A0 (en) | 2002-06-30 |
| EP1147210A4 (en) | 2004-06-02 |
| JP2002535996A (ja) | 2002-10-29 |
| AU2980200A (en) | 2000-08-25 |
| CA2360840A1 (en) | 2000-08-10 |
| CZ20012725A3 (cs) | 2002-03-13 |
| WO2000046388A1 (en) | 2000-08-10 |
| YU55501A (sh) | 2003-07-07 |
| NO20013790L (no) | 2001-10-02 |
| TR200102232T2 (tr) | 2002-02-21 |
| PL349153A1 (en) | 2002-07-01 |
| HUP0105286A3 (en) | 2003-03-28 |
| HUP0105286A2 (hu) | 2002-05-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SK10902001A3 (sk) | Spôsob izolácie kyseliny pseudomonovej z kultivačného bujónu obsahujúceho komplex kyseliny pseudomonovej | |
| Takahashi et al. | Altemicidin, a new acaricidal and antitumor substance II. Structure determination | |
| DE60121150T2 (de) | Verfahren zur herstellung von ansamitocin | |
| AU661469B2 (en) | Bridged cyclic ketal derivatives | |
| JPH04217986A (ja) | 抗高コレステロール血症薬 | |
| DE4320023A1 (de) | Holotyp-Stamm Aspergillus obscurus und Verfahren zur Herstellung von µ,£-Di-(hydroxy)-7-[1,2,6,7,8,8a-hexa-(hydro)-2,6-di-(methyl)-8-(2'-{methyl}-butyryloxy)-naphthalin-1-yl]-heptansäure-£-lacton{Mevinolin} und/oder µ,5-Di-(hydroxy)-7-[1,2,6,7,8,8a-hexa-(hydro)-2,6-di-(methyl)-8-(2'-{mehtyl}-butyryloxy)-naphthalin-1-yl]-heptansäure | |
| JPH032867B2 (sk) | ||
| EP0318849A2 (de) | Manumycin-Derivate, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung | |
| HUT70524A (en) | Novel makrolides and their use | |
| EP0196628B1 (de) | Ein neues Ansamycin-Antibiotikum, ein mikrobielles Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung als Arzneimittel | |
| EP1856111B1 (en) | Purification of mupirocin | |
| EP0116150A2 (en) | Pharmaceutically active heterocyclic compounds containing at least four ring-nitrogen atoms, their preparation and fermentation broths of ASPERGILLUS ALLIACEUS ATCC 20655 and 20656 | |
| DE3234203C2 (sk) | ||
| DE60203937T2 (de) | Herstellung von trans-kondensierte 3,3a,8,12b-tetrahydro-2h-dibenzo[3,4:6,7]cyclohepta[1,2-b]furan derivaten | |
| JPS6259701B2 (sk) | ||
| EP0068680B1 (en) | Antibiotics | |
| FR2518546A1 (fr) | Dihydro- et tetrahydromonacolines l, leur procede de preparation et leur application en therapeutique | |
| DE2746209C2 (sk) | ||
| PL205567B1 (pl) | Sposoby krystalizacji kwasów hydroksykarboksylowych | |
| EP0469480A2 (de) | Verfahren zur stereoselektiven Herstellung von 5-substituierten delta-Lactonen und deren Verwendung | |
| US5281533A (en) | Scytophycins-producing Scytonema pseudohofmanni microorganisms | |
| JP3795604B2 (ja) | Ｇｅｘ１化合物 | |
| KR0130473B1 (ko) | 새로운 항생물질, 베나노마이신 a와 b 및 덱실오실베나노마이신 b와 이들의 제조 방법과 용도 | |
| JPH0556332B2 (sk) | ||
| WO2002026744A1 (fr) | Derives de mpc1001 |