DE60121150T2

DE60121150T2 - Verfahren zur herstellung von ansamitocin

Info

Publication number: DE60121150T2
Application number: DE60121150T
Authority: DE
Inventors: GlaxoSmithKline Mark Worthing FULSTON; GlaxoSmithKline Anna Harlow STEFANSKA; GlaxoSmithKline Jan Worthing THIRKETTLE
Original assignee: SmithKline Beecham Ltd
Current assignee: SmithKline Beecham Ltd
Priority date: 2000-04-12
Filing date: 2001-04-11
Publication date: 2007-05-16
Anticipated expiration: 2021-04-12
Also published as: AU9333501A; EP1272653A2; NO20024893L; US6573074B2; ATE331804T1; EP1272653B1; JP4832697B2; HUP0300473A3; JP2003530114A; AU2001293335B2; PL365577A1; BR0109975A; ES2266243T3; WO2001077360A3; US20020015984A1; AR028002A1; DE60121150D1; MXPA02010109A; NO20024893D0; CZ20023356A3

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von Ansamitocinen, insbesondere Ansamitocinen, die zu Maytansinol umgewandelt werden können.
Hintergrund der Erfindung
Hoch cytotoxische Maytansinoid-Wirkstoffe und ihre therapeutische Verwendung wurden in US-PS 5,208,020 beschriebne. Diese Wirkstoffe können aus Ansamitocin-Vorstufen hergestellt werden, die durch Fermentation von Mikroorganismen wie Actinosynnema hergestellt werden.
Unter definierten Kulturbedingungen erzeugen Actinosynnema spp. wie Actinosynnema pretiosum eine Anzahl verwandter Ansamitocine. Das Hauptprodukt ist Ansamitocin P-3 mit einer Isobutyryl-Einheit in der C-3-Stellung. Andere Ansamitocine, die sich nur in der C-3-Acyl-Seitenkette unterscheiden, werden als Nebenkomponenten erzeugt, P-1 (Ethionyl-Einheit), P-2 (Propionyl-Einheit), P-3' (Butyryl-Einheit), P-4 (Isovaleryl-Einheit) und P-4' (Valeryl-Einheit). All diese Verbindungen können eine reduktive Spaltung unter Erzeugung eines gemeinsamen Produkts erfahren, Maytansinol (Form P-0). Zusätzlich werden eine Anzahl anderer Ansamitocine in geringen Mengen erzeugt, die an anderen Orten im Molekül modifiziert sind (hydroxyliert oder n-demethyliert). Diese erzeugen nicht das gewünschte P-0 bei Deacylierung.
Verfahren zur Ansamitocin P-3-Produktion aus Actinosynnema spp. wurden in US-PSen 4,162,940, 4,228,239, 4,356,265 und 4,450,234 beschrieben. Allgemein erfordern diese Verfahren das Zugeben einer Filterhilfe und eines wassermischbaren Lösungsmittels zur vollständigen Fermentationsbouillon, das Entfernen von Feststoffen und Extrahieren der wäßrigen Fraktion mit einem wasserunmischbaren Lösungsmittel, das Auf konzentrieren und Ausfällen mit Petrolether, das Reinigen der Ausfällung unter Verwendung von Kieselerde-Chromatographie und das Kristallisieren, gefolgt von weiterer Chromatographie oder Umkristallisation. Alternative Verfahren verwenden Diaion HP-10-Adsorption anstelle von Kieselerde-Chromatographie, gefolgt von einer weiteren Lösungsmittelextraktion und Kristallisation.
Diese Verfahren können verwendet werden, um akzeptable Ausbeuten von Ansamitocin P-3 zu gewinnen, aber die Verfahren beinhalten eine große Anzahl von Stufen, die Beschränkungen in Herstellungsabläufen in großem Maßstab einführen, insbesondere wegen der äußerst toxischen Natur der Ansamitocin-Verbindungen und der Notwendigkeit, die Sicherheit des menschlichen Betriebspersonals für die Verfahren sicherzustellen. Daher besteht ein Bedarf an einem sichereren alternativen Verfahren, das weniger und stärker eingedämmte Stufen verwendet:
Zusammenfassung der Erfindung
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung gereinigter Ansamitocine, das die folgenden Schritte umfaßt:

(a) Kultivieren eines Ansamitocin-erzeugenden Mikroorganismus in einem flüssigen Kulturmedium;
(b) Behandeln des Kulturmediums zur Erleichterung der Lösungsmittelextraktion von Ansamitocinen;
(c) Extrahieren von Ansamitocinen aus dem Kulturmedium mit einem aromatischen Kohlenwasserstoff-Lösungsmittel;
(d) Auf konzentrieren der extrahierten Ansamitocine; und
(e) Reinigen der Ansamitocine durch Kristallisation.

Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung gereinigter Ansamitocine, das die folgenden Schritte umfaßt:

(a) Kultivieren eines Ansamitocin-erzeugenden Mikroorganismus in einem flüssigen Kulturmedium;
(b) Extrahieren von Ansamitocinen aus dem Kulturmedium mit einem aromatischen Kohlenwasserstoff-Lösungsmittel;
(c) Auf konzentrieren der extrahierten Ansamitocine; und
(d) Reinigen der Ansamitocine durch Kristallisation.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Verfahren werden bereitgestellt zur Herstellung gereinigter Ansamitocine ohne einen Filtrationsschritt. Die Verfahren umfassen die Schritte aus Kultivieren eines Ansamitocin-erzeugenden Mikroorganismus in einem flüssigen Kulturmedium, Behandeln des Kulturmediums zur Freisetzung von Ansamitocinen aus dem Mikroorganismus in das Kulturmedium, um dadurch die Lösungsmittelextraktion zu erleichtern, Extrahieren von Ansamitocinen aus dem behandelten Kulturmedium mit einem aromatischen Kohlenwasserstoff-Lösungsmittel, Auf konzentrieren der extrahierten Ansamitocine und Reinigen der Ansamitocine durch Kristallisation. Alternativ kann der Behandlungsschritt ausgelassen werden.
Die gereinigten Ansamitocine können zu Maytansinol reduziert werden und schließen Ansamitocin P-3, P-1, P-2, P-3', P-4 und P-4' ein. Die gereinigten Ansamitocine enthalten nur sehr geringe Mengen von unerwünschten Ansamitocinen mit Modifikationen an anderen Stellen im Molekül. Bevorzugt ist der Ansamitocin-erzeugende Mikroorganismus Actinosynnema spp. Besonders bevorzugt ist Actinosynnema pretiosum ATCC 31565. Auch besonders bevorzugt ist Actinosynnema pretiosum ATCC 31281. Die Mikroorganismen können durch Fermentationskulturtechniken gezüchtet werden, die den Fachleuten allgemein bekannt sind, wie zum Beispiel durch diejenigen, die in US-PS 4,450,234 offenbart werden.
Eine Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung verwendet die Behandlung des Mikroorganismus, um die Freisetzung von intrazellulären Ansamitocinen zu unterstützen und die zellassoziierten Ansamitocine der Lösungsmittelextraktion zugänglicher zu machen. Exemplarische Behandlungsverfahren schließen die Ultraschallbehandlung, erhöhten Druck oder erhöhte Temperatur ein. Bevorzugt ist die Behandlung eine Wärmebehandlung. Die Wärmebehandlung kann bei ca. 60 bis ca. 80°C durchgeführt werden. Bevorzugt wird der Wärmebehandlungsschritt bei ca. 75°C durchgeführt, was den Mikroorganismus abtötet und die Lösungsmittelextraktion von Ansamitocinen erleichtert. In einer alternativen Ausführungsform wird kein Behandlungsschritt vor der Extraktion verwendet, da ca. 60% der gesamten Ansamitocine im Kulturmedium gefunden werden können.
Ansamitocine können aus Kulturmedium unter Verwendung von aromatischen Kohlenwasserstoff-Lösungsmitteln extrahiert werden. Die aromatischen Kohlenwasserstoffe haben eine besondere Selektivität für die Ansamitocine gegenüber anderen Bouillonbestandteilen, was sicherstellt, daß nur einfache Verfahren stromabwärts zur Isolierung von reinem Produkt erforderlich sind. Bevorzugt ist das aromatische Kohlenwasserstoff-Lösungsmittel Toluol oder Xylol. Besonders bevorzugt ist Toluol, da dies zugänglicher für eine Verdampfung bei geringer Temperatur ist. Die Eigenschaften von Toluol und Xylol sind derart, daß das Lösungsmittel und wäßrige Schichten leicht unter der Schwerkraft getrennt werden, ohne Notwendigkeit für eine mechanische Trennung, und somit werden eine stärkere Eindämmung des Verfahrens und eine erhöhte Personalsicherheit erreicht. Die Extraktion kann bei ca. 20 bis ca. 60°C durchgeführt werden. Bevorzugt wird die Extraktion bei ca. 45°C durchgeführt. Der pH der wäßrigen Lösung vor der Extraktion sollte im Bereich von 3 bis 9 sein. Bevorzugt ist der pH nahe Neutralität, d.h. pH 6 bis 8.
Allgemein ist ein äquivalentes Volumen von Lösungsmittel zu gesamten Bouillon (1:1) bevorzugt für die Extraktion. Alternative Verhältnisbereiche von 2:1 bis 1:4 können auch verwendet werden. Die Lösungen werden allgemein langsam unter Rühren vermischt und die Mischung gerührt, bis ca. > 80% der Ansamitocine in die organische Schicht extrahiert sind. Bevorzugt wird die Mischung unter Schwerkraft bei einer Temperatur zwischen 15 und 50°C absetzen gelassen. Die bevorzugte Temperatur für das Absetzen ist ca. 45°C.
Die organische Schicht wird entfernt, und das Auf konzentrieren des Extrakts durch Volumenreduktion des Lösungsmittels kann im Vakuum oder durch andere, den Fachleuten allgemein bekannte Verfahren durchgeführt werden. Nach der Volumenreduktion kann der konzentrierte Extrakt gegebenenfalls in einem polaren Lösungsmittel wie Methanol gelöst und unter Verwendung eines Membranfilters wie PTFE oder eines Tiefenfilters wie Kieselerde oder Aluminiumoxid geklärt werden.
Kristallisation wird zur Reinigung der gewünschten Ansamitocine, insbesondere P-3, durch Reduzieren der Mengen von ungewollten Ansamitocinen verwendet. Eine bevorzugte Lösungsmittelmischung für die Kristallisation ist Ethylacetat und Heptan. Eine solche Kristallisation wird in einer herkömmlichen Weise durchgeführt. Zur Unterstützung der Auflösung des Feststoffs zur Kristallisation kann ein kleines Volumen Methanol oder eines ähnlichen polaren Lösungsmittels vor der Zugabe von Ethylacetat und der anschließenden Behandlung mit größeren Volumina von Heptan zugegeben werden, gegebenenfalls unter Rühren und Abkühlen, um das kristallisierte Produkt zu liefern. Das Produkt kann unter Befolgen des gleichen Verfahrens umkristallisiert werden.
Alternativ können die aus der Fermentationsbouillon extrahierten unreinen Ansamitocine vor der Kristallisation unter Verwendung von Kieselgel gereinigt werden, z.B. durch Hindurchleiten einer Lösung aus dem Lösungsmittelextrakt durch ein Bett aus Kieselerde. Für die Chromatographie verwendete Lösungsmittel können Toluol und Toluol-Methanol-Mischungen sein. Andere, den Fachleuten bekannte Lösungsmittel können auch verwendet werden. Die Fraktionen, die Ansamitocin P-3 enthalten, werden vereinigt und unter reduziertem Druck aufkonzentriert.
Verfahren werden auch zur Analyse von Ansamitocinen durch HPLC bereitgestellt. Die Quantifizierung von Ansamitocin P-3 und Analyse von Ansamitocin-Verhältnissen werden durch die Verfahren erreicht. Diese Verfahren wurden in den nachfolgend dargestellten Beispielen eingesetzt.
Die Quantifizierung von Ansamitocin P-3 in Bouillon und Extraktionsproben kann an einer Säule C18 Waters Q Spherisorb S5 ODS2, 4,6 × 250 mm, mit einer 10 mm-Vorsäule bestimmt werden. UV-Detektion erfolgt bei 252 und 205 nm. Eine isokratische mobile Phase mit 1 ml/min 60% MeCN (0,05% TFA) in Wasser (0,05% TFA) und ein 20 μl-Injektionsvolumen werden verwendet.
Die Analyse von Ansamitocin-Verhältnissen in Verfahrensproben stromabwärts kann an einer Säule C8 Waters Symmetry Shield, 3,9 × 150 mm, ohne Vorsäule bestimmt werden. UV-Detektion erfolgt bei 252 und 205 nm. Ein Gradient der mobilen Phase mit 1 ml/min 35–45% MeCN (0,05% TFA) in Wasser (0,05% TFA) während 30 Minuten mit einer 10-minütigen Re-Äquilibrierung bei 40°C und ein 10 μl-Injektionsvolumen werden verwendet.
Die Analyse von Ansamitocin-Verhältnissen in Chromatographiefraktionen und dem Endprodukt kann an einer Säule C8 Waters Symmetry Shield, 3,9 × 150 mm, ohne Vorsäule mit einem LC-MS-Detektionssystem unter Elektrospray-Ionisierung bei Atmosphärendruck im +ve-Ionenmodus bestimmt werden. Die Massendetektion mit 30 V-Kegelspannung zur positiven Identifizierung der Peaks wird durch MS mit vollständiger Abtastung (Abtastung von 600–700 AMU mit Quad 1) erreicht. MS-MS-Fragmentierung zur Bestimmung der Klasse des Ansamitocins wird unter Verwendung des gleichen Gradientensystems durchgeführt. Eine mobile Phase mit Gradient mit 1 ml/min 35–45% MeCN (0,05% TFA) in Wasser (0,05% TFA) während 30 Minuten mit einer 10-minütigen Re-Äquilibrierung bei 40°C und ein 10 μl-Injektionsvolumen werden verwendet.
Die Quantifizierung von Ansamitocin P-3 in Abfallströmen und anderen Proben mit geringen Mengen, die eine hohe Empfindlichkeit erfordern, kann an einer Säule C18 Waters Spherisorb S5 ODS2, 4,6 × 250 mm, mit einer 10 mm-Vorsäule und einem LC-MS-MS-Elektrospray-Ionisationsdetektionssystem bei Atmosphärendruck, +ve-Ionenmodus, 30 V Kegelspannung, bestimmt werden. Zur Bestimmung des Strukturtyps wurden die Molekülionen der Haupttypen ausgewählt, und die beobachteten Fragmentierungsmuster waren ein vorherrschendes 547-Ion, was N-methyliert anzeigt, und ein 533-Ion, was N-demethyliert anzeigt. Eine isokratische mobile Phase mit 1 ml/min 60% MeCN (0,05 TFA) in Wasser (0,05% TFA) und ein 20 μl-Injektionsvolumen werden verwendet.
Das Verfahren der Erfindung kann zur Herstellung von Zellbindungsmittel/Maytansinoid-Komplexen verwendet werden, die nützlich als Tumoraktivierte Prodrugs sind. Durch das Verfahren der Erfindung hergestellte Ansamitocine können eine reduktive Spaltung zu Maytansinol erfahren, das wie in US-PS 5,208,020 beschrieben verwendet werden kann, um N-Methyl-L-Alanin-haltige Maytansinoid-Derivate herzustellen. Diese Derivate werden dann mit Zellbindungsmitteln, bevorzugt Antikörpern, über verschiedene Linker wie eine Disulfidbindung konjugiert.
Ein exemplarischer Zellbindungsmittel/Maytansinoid-Komplex kann durch ein Verfahren hergestellt werden, das die folgenden Schritte umfaßt:

(1) Reduzieren von Ansamitocinen, die durch das Verfahren der Erfindung hergestellt wurden, zu Maytansinol;
(2) Verestern von Maytansinol mit N-Methyl-L-Alanin-Derivaten zur Bildung eines Disulfid-haltigen Maytansinoidesters;
(3) Reduzieren des durch Schritt (2) hergestellten Disulfid-haltigen Maytansinoidesters zu einem Thiol-haltigen Maytansinoid;
(4) Einführen von Dithiopyridyl-Gruppen in ein Zellbindungsmittel; und
(5) Verbinden des durch Schritt (3) hergestellten Thiol-haltigen Maytansinoids mit dem Dithiopyridyl-Zellbindungsmittel aus Schritt (4) durch eine Disulfidbindung.

Die vorliegende Erfindung wird jetzt unter Bezugnahme auf die folgenden spezifischen, nicht-beschränkenden Beispiele beschrieben.
Beispiel 1
Extraktion von Actinosynnema pretiosum-Kulturbouillon und Ansamitocinreinigung
37 l von Vollbouillon, die den Erzeugerstamm Actinosynnema pretiosum ATCC 31565 enthielt (Ansamitocin P-3-Titer 86,3 mg/l), wurden in situ bei 75°C für 60 min wärmebehandelt, um den Mikroorganismus abzutöten und die Lösungsmittelextraktion der Ansamitocine zu erleichtern. 40 l Toluol wurden hinzugegeben und die Mischung auf 45°C erwärmt. Die Phasen wurden gerührt, so daß ein Wirbel der oberen Toluolphase in die untere Bouillonphase gezogen wurde, aber ohne Emulgieren oder vollständige Homogenisierung der Phasen. Die Extraktion war innerhalb von 16 Stunden vollendet und die Trennung unter Schwerkraft innerhalb von 2 Stunden.
39 l Toluol, das 80 mg/l P-3 enthielt, wurden durch ein Absaugrohr gewonnen und unter Verwendung eines 20 l-Rotationsverdampfers eingeengt (Badtemperatur 40–45°C, Rate ~9 l/h). 11,2 g mobiles Öl, das 3,1 g P-3 enthielt (27,6% G/G), wurden nach dem Einengen erzeugt. Der resultierende Extrakt wurde durch Auflösen in Toluol und erneutes Einengen in einen Kolben überführt (Ausbeute der Extraktionsstufe = 97%).
Der Extrakt wurde in 120 ml Toluol aufgenommen und auf eine Kieselerdesäule (Kieselgel 60, 125 ml Bettvolumen, gepackt in Toluol, 4 cm Durchmesser × 10 cm) in 375 ml Toluol (3 Bettvolumina) aufgetragen. Die Säule wurde mit 2 Bettvolumina Toluol gewaschen und dann mit 4 × 2 Bettvolumina von 2% MeOH in Toluol, gefolgt von 12 × 1 Bettvolumen von 4% MeOH in Toluol eluiert. Die Säule wurde mit 40 ml/min eluiert und erzeugte enge Farbbanden. Fraktionen 7–10, die Ansamitocin P-3 enthielten, wurde vereinigt und eingeengt, um 3,2 g öligen Feststoff zu erzeugen, der 2,5 g P-3 enthielt. Dieses Material wurde durch LC-MS und MS-MS analysiert.
In dieser Stufe enthielt das Produkt 85,1% Ansamitocin P-3 und insgesamt 93,9% der gewünschten Ansamitocine (Ausbeute der Säulenstufe = 80,6%).
Das Produkt aus der Kieselerdesäule wurde in 200 ml EtOAc, erwärmt auf 40°C, aufgenommen. Heptan (200 ml) wurde hinzugegeben und die Lösung abkühlen gelassen. Die Lösung wurde mit 1 mg reinen P-3 Kristallen geimpft (eine Kristallisation erfolgte auch spontan an anderen Stellen im Kolben). Nach 4 Stunden bei Umgebungstemperatur wurde der Überstand durch HPLC analysiert, und 0,8 g P-3 (30%) wurden noch in Lösung festgestellt. Weiteres Heptan wurde hinzugegeben (150 ml) und der Kolben für weitere 3 Stunden stehengelassen und erneut analysiert. Die zeigte, daß 0,4 g P-3 (16%) in Lösung blieben. Der Kolben wurde über Nacht bei 4°C stehengelassen. Eine anschließende Analyse zeigte, daß nur 70 mg P-3 (3%) in Lösung verblieben. Die Mutterlaugen wurden durch Absaugen unter Verwendung einer Reihenanordnung von Filtertiegeln entfernt. Die weißen Nadelkristalle wurden mit 2 × 15 ml 1:3 EtOAc:Heptan gewaschen. Die Kristalle wurden in situ unter Vakuum an einem Rotationsverdampfer für 10 Stunden bei 30°C getrocknet. 2,5 g Kristalle wurden erhalten (Kristallisationsausbeute = 86%).
Das Endprodukt enthielt 86% Ansamitocin P-3 und insgesamt 98,4% der gewünschten acylierten Ansamitocine (P-1, P-2, P-3, P-3', P-4, P-4').
Beispiel 2
Extraktion von Actinosynnema pretiosum-Kulturbouillon und Ansamitocinreinigung
1100 l Vollbouillon, die den Erzeugerstamm Actinosynnema pretiosum ATCC 31565 enthielt (Ansamitocin P-3-Titer 75,1 mg/l, 82,6 g P-3), wurden in situ bei 75°C für 60 min wärmebehandelt, um den Mikroorganismus abzutöten und die Lösungsmittelextraktion der Ansamitocine zu erleichtern. 77,6 g P-3 verblieben nach dem Wärmeabtötungsprozeß. Ein gleiches Volumen Toluol, vorerwärmt auf 45°C, wurde hinzugegeben, und die Mischung wurde auf 45°C gehalten. Die Phasen wurden gerührt, so daß ein Wirbel der oberen Toluolphase in die untere Bouillonphase gezogen wurde, aber ohne Emulgieren oder vollständige Homogenisierung der Phasen. Die Extraktion wurde für 45 Stunden durchgeführt, gefolgt von Abtrennung unter Schwerkraft, was innerhalb von 30 min erfolgt (Ausbeute der Extraktionsstufe 90,3%). 1127 l des Toluolextrakts, der die Ansamitocine enthielt, wurden unter Verwendung eines Fallfilmverdampfers (FFE) auf 22 l aufkonzentriert. Das Konzentrat wurde in einen 50 l-Rotationsverdampfer überführt und auf ein geringes Volumen eingeengt (Verdampfungsrate 14,6 l/h). Der FFE wurde mit 2 × 20 l Toluol gespült und die Spüllösungen in den Verdampfer geleitet, um eine vollständige Produktübertragung sicherzustellen. Das Konzentrat wurde zur Trockene eingeengt.
Der trockene Extrakt wurde in 7,2 l 4%igem Methanol in Toluol aufgenommen und auf eine Kieselerdesäule (Kieselgel 60, 4,8 l Bettvolumen, gepackt in 4% Methanol in Toluol, 15,0 cm Durchmesser × 27,0 cm, Beladungsrate 120 ml/min) aufgetragen. Die Säule wurde isokratisch unter Verwendung von 4% Methanol in Toluol mit einer Fließgeschwindigkeit von 227–384 ml/min eluiert und erzeugte enge Farbbanden. Anfangsfraktionen waren ein Bettvolumen; die Fraktionen 3 bis 6 wurden als Halbbettvolumina aufgefangen. Die Fraktionen wurden durch DC (Kieselgel 60 F₂₅₄-Platten, gelaufen in 5% Methanol in Dichlormethan, visualisiert durch UV bei 254 nm) überwacht, und diejenigen, die Ansamitocine enthielten, wurden durch HPLC und LC-MS überwacht. Die Fraktionsselektion zur Kristallisation beruhte auf HPLC- und LC-MS-Analyse der Fraktionen zur Optimierung der Ansamitocin P-3-Gewinnung und Minimierung ungewünschter Ansamitocine. Die Fraktionen 5 bis 10, die Ansamitocin P-3 enthielten, wurden vereinigt und eingeengt, um einen Feststoff zu erzeugen, der 54,6 g P-3 enthielt. In dieser Stufe enthielt das Produkt 77,1% Ansamitocin P-3 und insgesamt 96,1% der gewünschten Ansamitocine (Ausbeute der Säulenstufe = 92,5%).
Das Produkt aus der Kieselerdesäule wurde in 91 ml Methanol, das zuvor auf 46°C erwärmt worden war, gefolgt von 546 ml Ethylacetat, das auf die gleiche Temperatur erwärmt worden war, aufgenommen. Weitere Teilmengen von Methanol wurden zur Unterstützung der Auflösung des Feststoffs hinzugegeben. Insgesamt 166 ml Methanol wurden zur Mischung hinzugegeben. Heptan (100 ml), erwärmt auf 50°C, wurde bis zum ersten Anzeichen von Trübung hinzugegeben, und dann wurde die Lösung auf Umgebungstemperatur abkühlen gelassen, als die Kristallisation begann. Nach 4 Stunden wurden weitere 1324 ml Heptan (bei Umgebungstemperatur) hinzugegeben. Der Überstand wurde durch HPLC analysiert und 6,6 g P-3 als noch in Lösung befindlich bestimmt. Die Mischung wurde auf Eis abgekühlt, und weitere Teilmengen Heptan (200 und 400 ml) wurden hinzugegeben, bis 3,9 g P-3 (6,8%) in der Mutterlauge verblieben.
Die Mutterlaugen wurden durch Absaugen unter Verwendung einer Reihenanordnung von Filtertiegeln entfernt. Die Kristalle wurden mit 2 × 150 ml 1:3 Ethylacetat:Heptan gewaschen. Die Kristalle wurden in situ an einem Rotationsverdampfer, anfänglich unter geringem Vakuum, gefolgt von Hochvakuum (1,0–1,3 mbar) bei 30°C für 88,5 Stunden getrocknet. 76,4 g Kristalle wurden erhalten.
Das Endprodukt enthielt 74,5% Ansamitocin P-3 (56,9 g) und insgesamt 97,8% der gewünschten acylierten Ansamitocine (Gesamtausbeute = 69%).
Beispiel 3
Kieselerdechromatographie und Kristallisation der Ansamitocine
1008 l Actinosynnema pretiosum-Vollbouillon mit einem Titer von 64,8 mg/l Ansamitocin P-3 wurden wärmebehandelt, mit Toluol extrahiert und eingeengt, im wesentlichen wie in Beispiel 1 beschrieben.
Das Konzentrat, das 34,5 g Ansamitocin P-3 enthielt, wurde in 3 l Toluol aufgenommen und auf eine Kieselerdesäule (Kieselgel 60, 3,0 l Bettvolumen, gepackt in Toluol, 13,8 cm Durchmesser × 16,6 cm) aufgetragen. Die Säule wurde mit einem 4 cm-Sandbett abgedeckt. Die Säule wurde mit 5 l Toluol gewaschen, gefolgt von 20 l 2% MeOH in Toluol, das als 5 l-Fraktionen aufgefangen wurde. Die Säule wurde dann mit 20 l 4% MeOH in Toluol eluiert, aufgefangen als 2,5 l-Fraktionen. Die Ansamitocine wurden in Fraktionen 9 bis 15 eluiert. Die Fraktionsselektionskristallisation beruhte auf der HPLC- und LC-MS-Analyse der Fraktionen zur Optimierung der Ansamitocin P-3-Gewinnung und Minimierung ungewünschter Ansamitocine. Fraktionen 10 bis 12 wurden vereinigt und zur Trockene eingeengt, um ein Öl zu liefern, das 32,5 g Ansamitocin P-3 enthielt.
In dieser Stufe enthielt das Produkt 91,8% Ansamitocin P-3 und insgesamt 95,3% der gewünschten acylierten Ansamitocine (Ausbeute der Säulenstufe = 94,2%).
Das Konzentrat aus den vereinigten Kieselerdefraktionen wurde in einem Wasserbad auf 50°C erwärmt und in einem minimalen Volumen von warmem Methanol/Ethylacetat (50°C) gelöst. 60 ml Methanol wurden zunächst hinzugegeben, gefolgt von langsamer Zugabe von 300 ml Ethylacetat. Weitere 20 ml warmes Methanol wurden hinzugegeben, und zu diesem Punkt war das Konzentrat vollständig gelöst. 200 ml warmes Heptan (50°C) wurden hinzugegeben und die Kristallisationslösung aus dem Wasserbad entfernt. Die Kristallisation begann, und weiteres Heptan wurde in 200 ml-Teilmengen hinzugegeben, bis ein Gesamtvolumen von 800 ml hinzugegeben worden war. Die Mischung wurde in einem Eisbad für 18 Stunden gekühlt. Die Kristallisation wurde durch HPLC-Analyse der Mutterlaugen überwacht. Nach 18 Stunden verblieben 6,3% Ansamitocin P-3 in den Mutterlaufen. Weitere 200 ml Heptan wurden hinzugegeben und die Mischung für weitere 5 Stunden gekühlt. Eine HPLC-Analyse zeigte 4,0% Ansamitocine an, die in den Mutterlaugen verblieben.
Die Kristalle wurden durch Absaugen der dunkelbraunen Mutterlaugen gewonnen. Die Kristalle wurden 3-mal mit 50 ml Heptan:Ethylacetat 3:1 gewaschen und unter Vakuum (0,8 mbar) über Nacht getrocknet. Die Kristalle waren gleichförmige, feine, cremefarbene Nadeln, die 28,2 g Ansamitocin P-3 enthielten (Ausbeute der Kristallisationsstufe = 86,9%).
Das Endprodukt enthielt 93,1% Ansamitocin P-3 und insgesamt 98,4% gewünschte acylierte Ansamitocine.
Beispiel 4
Reinigung und Kristallisation von Ansamitocinen aus Toluolextrakt
1001 l Actinosynnema pretiosum-Vollbouillon mit einem Titer von 74,5 mg/l Ansamitocin P-3 wurden im wesentlichen wie in Beispiel 1 beschrieben wärmebehandelt, mit Toluol extrahiert und eingeengt, um 9,5 l konzentrierten Extrakt zu ergeben, der 54,7 g Ansamitocin P-3 enthielt.
Das Konzentrat wurde auf 45°C erwärmt, und 14,5 l Heptan wurden während 33 min hinzugegeben, um die Ansamitocine auszufällen. Die Mischung wurde auf Eis abgekühlt. Weitere 5 l Heptan wurden hinzugegeben und die Mischung über Nacht absetzen gelassen. Die Mutterlauge wurde durch Absaugen entfernt, und die Ausfällung wurde mit 10 l Toluol:Heptan 1:1 gewaschen. HPLC-Analyse zeigte an, daß die Mutterlauge 6,5% Ansamitocin P-3 enthielt, und die Waschlösung enthielt 1,8% P-3. Die Ausfällung wurde in 2 l Methanol gelöst und durch ein 0,2 μm-Filter filtriert.
Die Methanol-Lösung wurde zur Trockene eingeengt und in 85 ml Methanol bei 50°C erneut gelöst. 510 ml Ethylacetat wurden zur Lösung hinzugegeben, gefolgt von 200 ml Heptan. Die Mischung wurde auf Umgebungstemperatur abgekühlt, und weitere 990 ml Heptan wurden langsam hinzugegeben, als die Kristallisation begann. 4,14 g Ansamitocin P-3 verblieben in der Mutterlauge. Weitere 400 ml Heptan wurden hinzugegeben und die Mischung auf Eis gekühlt. 2,7 g Ansamitocin P-3 verblieben in der Mutterlauge.
Die Mutterlauge wurde durch Absaugen entfernt, und die Kristalle wurden in 110 ml Methanol und 520 ml Ethylacetat bei 50°C gelöst. Heptan wurden in zwei 75 ml-Teilmengen hinzugegeben, die Mischung wurde auf Umgebungstemperatur abgekühlt und mit weiteren 900 ml versetzt. Weitere 400 ml Heptan wurden hinzugegeben und die Mischung aus Eis gekühlt und über Nacht kristallisieren gelassen. HPLC-Analyse zeigte, daß 2,3 g Ansamitocin P-3 in der Mutterlauge verblieben. Die Mutterlauge wurde durch Absaugen entfernt, und die Kristalle wurden mit Heptan:Ethylacetat 3:1 gewaschen und unter Vakuum (0,6 mbar) über Nacht getrocknet. Die 47,8 g Kristalle enthielten 84,3% Ansamitocin P-3 und insgesamt 97,0% gewünschte acylierte Ansamitocine.
Beispiel 5
Extraktion von Actinosynnema pretosium-Kulturbouillon mit Xylol und Ansamitocinreinigung
220 ml von wärmebehandeltem Actinosynnema pretiosum mit einem Titer von 44 μg/ml Ansamitocin P-3 wurden in ein Wasserbad von 45°C gegeben, und ein gleiches Volumen Xylol wurde hinzugegeben. Die Phasen wurden vermischt, so daß ein Wirbel von Xylol in die untere Bouillonphase gezogen wurde, aber ohne Bildung einer Emulsion. Nach 20 Stunden waren 64% des Ansamitocin P-3 in die Xylolphase extrahiert.
Die Mischung wurde unter Schwerkraft getrennt, und 170 ml Xylol wurden entfernt. Der Xylolextrakt wurde zur Trockene eingeengt. Der Xylolextrakt wurde unter Verwendung von Kieselerdechromatographie gereinigt. Der Extrakt wurde in 2 ml 4% Methanol in Toluol gelöst und aufgetragen und unter Verwendung der gleichen Lösungsmittelmischung eluiert. Fraktionen (0,5 ml) wurden aufgefangen und durch DC getestet (Kieselgel 60 F₂₅₄-Platten, gelaufen in Dichlormethan:Methanol 20:1). Fraktionen, die Ansamitocin P-3 enthielten, wurden unter Verwendung des in den vorhergehenden Beispielen beschriebenen Verfahrens kristallisiert. Das kristalline Produkt war von vergleichbarer Qualität hinsichtlich Farbe und Reinheit zu demjenigen, das durch Toluolextraktion von Fermentationsbouillon erzeugt wurde.
Die vorliegende Erfindung kann in anderen spezifischen Formen ohne Abweichen von ihrem Geist oder wesentlichen Eigenschaften ausgeführt werden, und entsprechend sollte auf die anhängenden Ansprüche hinsichtlich der vorhergehenden Beschreibung als Angabe des Erfindungsumfangs verwiesen werden.

Claims

Verfahren zur Herstellung gereinigter Ansamitocine, das die folgenden Schritte umfaßt: (a) Kultivieren eines Ansamitocin-erzeugenden Mikroorganismus in einem flüssigen Kulturmedium; (b) Behandeln des Kulturmediums zur Erleichterung der Lösungsmittelextraktion von Ansamitocinen; (c) Extrahieren von Ansamitocinen aus dem Kulturmedium mit Toluol oder Xylol; (d) Auf konzentrieren der extrahierten Ansamitocine; und (e) Reinigen der Ansamitocine durch Kristallisation, worin das Verfahren keinen Filtrationsschritt einschließt.
Verfahren zur Herstellung gereinigter Ansamitocine, das die folgenden Schritte umfaßt: (a) Kultivieren eines Ansamitocin-erzeugenden Mikroorganismus in einem flüssigen Kulturmedium; (b) Extrahieren von Ansamitocinen aus dem Kulturmedium mit Toluol oder Xylol; (c) Auf konzentrieren der extrahierten Ansamitocine; und (d) Reinigen der Ansamitocine durch Kristallisation, worin das Verfahren keinen Filtrationsschritt einschließt.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, worin der Ansamitocinerzeugende Mikroorganismus Actinosynnema spp. ist.
Verfahren gemäß Anspruch 3, worin die Actinosynnema spp. Actinosynnema pretiosum ATCC 31565 ist.
Verfahren gemäß Anspruch 3, worin die Actinosynnema spp. Actinosynnema pretiosum ATCC 31281 ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die Behandlung ein Erwärmen auf ca. 75°C ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, worin das Lösungsmittel Toluol ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, worin das Lösungsmittel Xylol ist.
Verfahren gemäß Anspruch 7 oder 8, worin das Verhältnis von Toluol oder Xylol zu wärmebehandeltem Kulturmedium ca. 1:1 ist.
Verfahren gemäß Anspruch 9, worin die Extraktion bei ca. 45°C erfolgt.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, worin die Ansamitocine acylierte Ansamitocine umfassen, die eine reduktive Spaltung unter Bildung von Maytansinol erfahren können.