CN100420754C

CN100420754C - 一种制备蒽莎姆菌素的方法

Info

Publication number: CN100420754C
Application number: CNB200610150763XA
Authority: CN
Inventors: 蒋世春; 许玉丽; 白骅
Original assignee: Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2006-10-26
Filing date: 2006-10-26
Publication date: 2008-09-24
Anticipated expiration: 2026-10-26
Also published as: CN1955305A

Abstract

本发明提供了一种高产发酵蒽莎姆菌素的生产方法，本发明采用诺卡氏链霉菌(S.nocardia)在含有一定比例的微量元素混合液的适当发酵培养基下发酵生产蒽莎姆菌素，所述发酵培养基含有6-8%的可利用碳源和3-6%的可利用氮源，并且以0.15-0.45%的异丁醇作为前体物。本发明的方法由于投料配比与组成改变以及调整部分工艺控制条件，使蒽莎姆菌素生物合成水平正常、稳定。其产率较原工艺稳增3倍且成品产量有很大的提高。

Description

一种制备蒽莎姆菌素的方法

技术领域

本发明涉及生物制药领域，具体而言，本发明涉及一种高产发酵生产蒽莎姆菌素的方法。

背景技术

蒽莎姆菌素(ansamitocin)为安莎类抗生素，其产生菌诺卡氏链霉菌(S.Nocardia)在液体深层发酵过程中，产生的主要有效成分为蒽莎姆菌素P3，它具有很强的细胞毒和抗肿瘤活性，是一类广谱的抗肿瘤抗生素，并且对革兰氏阳性细菌和分枝杆菌有很强的抗菌活性，对革兰氏阴性细菌和病毒也有一定作用，对丝状真菌及原虫显示强的作用，其作用机制为抑制细胞内DNA，RNA和蛋白质的合成。临床表明对多种淋巴白血病和恶性淋巴瘤有显著疗效，其蒽莎姆菌素P3的分子量为635.2，分子式为C₃₂H₄₃ClN₂O₉，溶于甲醇，乙醇，丙酮，氯仿等溶剂，微溶于乙醚，结晶稳定，在PH2-9下稳定，PH大于10时不稳定。

有关报道蒽莎姆菌素的专利有美国专利US4265814，US42643913，WO0345312，WO0177360，WO0366005，WO0430731，WO0115119以及日本抗生素杂志(1981年)等描述了有关理化特性，疗效，传统发酵与提取分离等内容，但根据文献报道的培养基进行发酵生产，受其产生菌的特性和发酵工艺，控制条件等影响，其高产基因型得不到充分表达，导致蒽莎姆菌素发酵效价低，产量波动性大，不稳定，成本高等缺点。

发明内容

本发明提供了一种高产发酵蒽莎姆菌素的生产方法。本发明采用诺卡氏链霉菌(S.Nocardia)在含有一定比例的微量元素混合液的适当发酵培养基下发酵生产蒽莎姆菌素，所述发酵培养基含有6-8％的可利用碳源和3-6％的可利用氮源，并且以0.15-0.45％的异丁醇作为前体物。本发明采用的诺卡氏链霉菌(S.Nocardia)为Nocardia S.PNO C-14482(可参见The journal ofantibiotics，May 1981，Vol.XXXIVNo.5，496；申请人声明从该专利申请日起20年内向公众发放该生物材料)。本发明采用一种特定生物合成配方(配比、组成)，并适当调整原工艺部分工艺条件，在现有制药生产及设备上实施，无需额外投资；由于投料配比与组成改变以及调整部分工艺控制条件，使蒽莎姆菌素生物合成水平正常、稳定。其产率较原工艺稳增3倍且成品产量有很大的提高。

本发明涉及的斜面孢子制备，种子液的制备与发酵培养的生产工艺过程如下：

斜面孢子的制备

本发明的斜面孢子培养基内含有(1)1-2％可利用的碳源，合适的可利用的碳源包括淀粉，燕麦粉，马铃薯，糊精，甘油，葡萄糖，乳糖，蔗糖，麦芽糖等；(2)1-2％的可利用氮原，合适的可利用氮原包括酵母膏(浸出粉)，麦芽抽提物，干酪素，蛋白胨，天门冬酰胺，精氨酸等

产孢子培养基的制备

可采用传统技术，在121-125℃下灭菌30分钟后，冷动，布涂菌种于固体培养基上，其优选固体培养基YMS(含1％甘油)，合适的培养温度17-37℃，最佳温度29±2℃，培养时间3-12天，最佳5-7天。

种子的制备

本发明的种子培养基内含(1)2-4％可利用的碳源，合适的可利用的碳源包括淀粉，糊精，甘油，葡萄糖，乳糖，蔗糖，麦芽糖等；(2)3-5％的可利用氮原，合适的可利用氮源包括黄豆饼粉，柿子饼粉，花生饼粉，酵母粉，蛋白胨，玉米浆，麸皮，麸质，氯化铵，硝酸铵，硫酸铵等，培养基于121-125℃下灭菌30分钟，冷却后，将斜面孢子悬浮液接入到种子培养基内，进行培养，摇瓶装量为摇瓶体积的10-15％，以8层纱布作过滤介质，摇瓶转速200-250rpm，种子罐装量为60-70％，通气比为1∶1 V/V/m，搅拌转速100-200rpm，合适的培养温度为17-37℃，最优为29±2℃，培养时间36-48天，这时菌丝浓度为30-50％。

发酵培养

本发明的发酵培养基内含：(1)6-8％可利用的碳源，合适的可利用的碳源包括淀粉，糊精，甘油，葡萄糖，乳糖，蔗糖，麦芽糖等，优选的是淀粉，葡萄糖；(2)3-6％的可利用氮源，优选5％，合适的可利用氮源包括黄豆饼粉，蛋白胨，酵母膏(或抽提物)，柿子饼粉，花生饼粉，玉米浆，鱼粉，麸皮，麸质，氯化铵，硝酸铵，硫酸铵等，其中优选的是黄豆饼粉，蛋白胨；(3)0.002-0.04％的可利用的微量元素混合液，合适的可利用的微量元素包括CO²⁺，Cu²⁺，Zn²⁺，Fe²⁺，Mg²⁺，Ca²⁺等，微量元素优选的是CO²⁺，Fe²⁺，更优选的是CO²⁺；微量元素优选含量是0.005％-0.02％，更优选0.001％；(4)可利用的0.2-0.4％的异丁醇作为前体物。摇瓶发酵培养基装量系数为摇瓶体积的8-12％，发酵罐装量为罐体积的60-70％，发酵培养基于培养基于121-125℃下灭菌30分钟，冷却后，接入1-10％的种子液，发酵培养时，搅拌转速为100-250rpm，通气比为1∶0.8-1V/V/m，发酵周期为7-8天，而摇瓶发酵的摇床转速为200-250rpm，以8层纱布作过滤介质，培养温度均为29±2℃

蒽莎姆菌素的效价测定

采用高效液相法，流动相：H₂O/CH₃CN/MeOH＝55/35/10，检测波长：252nm

流速：1.0ml/分钟

样品的制备

发酵液加入2倍至10倍体积的乙醇浸泡30分钟，过滤，滤液供高效液相分析。

本发明与原工艺相比具有以下优点：

(1)采用本发明，发酵终止料液粘度低，滤速快，滤液澄清，有利于提取收率与成品质量提高，克服了原工艺粘度大，糊状，过滤液不清，收率低，产量低，损失大的异常现象；

(2)采用本发明，发酵水平稳定，培养过程避免逃液，增加放罐体积，提高发酵指数，发酵效价比原工艺稳增3倍以上；

(3)采用本发明碳氮营养成分结构和比例合理，高产优良基因型得到充分表达，克抗生素分泌期延长，有效组分比例高，杂质少，而且过滤后菌丝残渣含水量低，滤渣松散，便于装卸减轻了劳动强度；

(4)采用本发明，能在现有制药生产及设备上实施，无需额外投资。

具体实施方式

下面通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。除非另有说明，本发明中的百分数是指重量百分数或重量百分比浓度。

实施例1：制备蒽沙菌素

(1)斜面孢子的制备与培养

斜面孢子培养基配比(％)：酵母膏0.2，麦芽抽提物0.3％，蛋白胨0.1，甘油1.0，琼脂粉2，灭菌前PH7.0，试管30×200mm，装量20ml，经121℃灭菌30分钟后，冷却至50-60℃搁置斜面，然后接入孢子经29±1℃培养5-7天后，长成熟。

(2)种子液的制备与培养

种子培养基配比(％)：淀粉2，大豆蛋白胨0.6，玉米浆0.5，CaCO₃ 0.5，黄豆饼粉1.0，葡萄糖1，NaCl 0.3，消前PH6.8，培养温度29±1℃，220rpm，摇床振荡培养36-48小时，这时PH7.0-8.0，菌丝浓度为30-50％(注：摇瓶500ml规格装量50ml，斜面孢子接种量为1×1cm²，种子培养的过滤介质为8层纱布。

(3)蒽莎姆菌素的发酵培养基的制备与培养

发酵培养基配比(％)，淀粉5.0，葡萄糖1，乳糖1，黄豆饼粉1.0，大豆蛋白胨1，玉米浆0.5，CaCO₃ 0.5，NaCl 0.1，异丁醇0.2，NiCl₂ 0.005，FeSO₄ 0.002(消前PH7.0)，摇瓶500ml规格装量为40ml，灭菌条件为121℃下30分钟(备注：其中异丁醇为灭菌后，在无菌状态下加入)，然后将2ml的种子液接入，在29±1℃，220rpm摇床振荡培养7-8天，发酵结束后用高效液相测蒽莎姆菌素效价，测得效价为650r/ml。

实施例2：制备蒽沙菌素

(1)种子罐种子液的制备

在20L的种子罐中投入9L的种子培养基(种子培养基的配比见实施例1，同时要添加0.3％的豆油作消沫剂)，灭菌采用湿热121℃下30分钟，待冷却后，接入100ml的摇瓶种子液，经搅拌150rpm，通气比为1∶1 V/V/m，培养36-48小时，此时PH 7.0-8.0，菌丝浓度为30-50％。

(2)发酵罐培养基的配制与培养

发酵培养基的配比与前述实施例1相同，但还要添加0.05％PPG作消沫剂，发酵罐30L，投料体积为18L，消前PH6.7，消后PH约7.0，于121℃下灭菌30分钟，冷却后，接入约1.8L的种子罐培养液，然后经29±1℃，搅拌150-200rpm，通气比为1∶0.8-1V/V/m，溶氧大于30％，培养7-8天，放罐，测得蒽莎姆菌素效价为680r/ml

实施例3：制备蒽沙菌素

斜面孢子的制备与种子液的制备见实施例1。

发酵培养基的配方组成(％)：淀粉5，葡萄糖1，乳糖1，黄豆饼粉2，蛋白胨1，玉米浆0.5，CaCO₃ 0.5，NaCl 0.1，异丁醇0.2，NiCl₂ 0.001，MgSO₄ 0.002，500ml规格摇瓶装量为40ml，灭菌条件为121下30分钟，其中异丁醇为灭菌后，在无菌状态下加入。然后将2ml种子液接入，在在29±1℃，220rpm摇床振荡培养7-8天，发酵结束后用高效液相测得蒽莎姆菌素效价为660r/ml。

实施例4：制备蒽沙菌素

斜面孢子的制备与种子液的制备见实施例1。

发酵培养基的配方组成(％)：淀粉5，葡萄糖1，乳糖1，黄豆饼粉2，蛋白胨1，玉米浆0.5，CaCO₃ 0.5，NaCl 0.1，异丁醇0.2，FeSO₄ 0.002，CaCl₂ 0.001，MgSO₄ 0.002，500ml规格摇瓶装量为40ml，灭菌条件为121下30分钟，其中异丁醇为灭菌后，在无菌状态下加入。然后将2ml种子液接入，在29±1℃，220rpm摇床振荡培养7-8天，发酵结束后用高效液相测蒽莎姆菌素效价为650r/ml

实施例5：制备蒽沙菌素

斜面孢子的制备与种子液的制备见实施例1。

发酵培养基的配方组成(％)：麦芽糖2，糊精5，葡萄糖1，黄豆饼粉3，玉米浆0.5，CaCO₃ 0.5，NaCl 0.1，异丁醇0.2，NiCl₂ 0.001，MgSO₄ 0.002，500ml规格摇瓶装量为40ml，灭菌条件为121下30分钟，其中异丁醇为灭菌后，在无菌状态下加入。然后将2ml种子液接入，在29±1℃，220rpm摇床振荡培养7-8天，发酵结束后用高效液相测蒽莎姆菌素效价为700r/ml。

Claims

1. 一种发酵制备蒽莎姆菌素的方法，其特征在于由诺卡氏链霉菌(S.Nocardia)在含有微量元素的发酵培养基下发酵制得，所述发酵培养基含有重量比6-8％的可利用碳源和重量比3-6％的可利用氮源，并且以重量比0.15-0.45％的异丁醇作为前体物。

2. 根据权利要求1的方法，其中可利用碳源重量比为7％，可利用氮源重量比为5％，异丁醇前体物的重量比为0.2-0.4％。

3. 根据权利要求1中的方法，其中微量元素选自Co²⁺，Cu²⁺，Zn²⁺，Fe²⁺，Mg²⁺，或Ca²⁺之一或其混合物。

4. 根据权利要求3的方法，其中发酵培养基中微量元素的重量浓度为0.0002-0.04％。

5. 根据权利要求4的方法，其中微量元素为Co²⁺。

6. 根据权利要求5的方法，其中微量元素Co²⁺的重量浓度为0.001％。

7. 根据权利要求1-6之一的方法，其中可利用的碳源选自淀粉，糊精，甘油，葡萄糖，乳糖，蔗糖，麦芽糖之一或其混合物；可利用氮源选自黄豆饼粉，蛋白胨，酵母膏或其抽提物，棉子饼粉，花生饼粉，玉米浆，鱼粉，麸皮，麸质，氯化铵，硝酸铵，硫酸铵之一或其混合物。

8. 根据权利要求7的方法，其中可利用的碳源选自淀粉或葡萄糖或者它们的混合物；可利用的氮源选自黄豆饼粉、蛋白胨或它们的混合物。