CN104480157B - 一种制备司他霉素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明还提供了制备司他霉素的方法，该方法包括可产生司他霉素的链霉菌在含有可利用的碳源、可利用的氮源和3‑羟基‑4‑氨基丁酸的发酵培养基里发酵的步骤，和在发酵中途向发酵培养基里中加入植物油的步骤。本方法具有效价高，终产物易于提取等优点，克服了原工艺发酵产率低，粘度大，糊状，过滤不清，收率低，损失大的异常现象。

Description

一种制备司他霉素的方法
技术领域
本发明涉及生物制药领域，尤其涉及一种发酵制备司他霉素的方法。
背景技术
司他霉素是由链霉菌Streptomyces netropsis或S.distallicus产生的抗生素，其盐酸盐为黄白色结晶性粉末，分子式为C22H27N9O4HCL，分子量为517.975，熔点184～187℃。溶于水，不溶于有机溶剂。本品应在避光防潮条件下储存。司他霉素对革兰氏阳性菌、真菌、病毒有抑制作用，其作用机理主要是抑制DNA的合成。司他霉素主要用于由单纯疱疹、带状疱疹、牛痘病毒等引起的皮肤和黏膜感染。也是具有一定抗癌活性的低聚肽类抗生素，它能与DNA的特定序列进行亲合并识别DNA，它基于对小分子靶向序列的表达和基因开关的控制，可作为抗疟疾药物和抗血管生成药物。司他霉素是临床应用的一类低毒高效抗生素，国内研究甚少，产品主要来自进口。Arcamone,F；Penco,S；Orezzi,P.G；Nicolella,V；Pirelli,A.Nature1964,203,1064；Michaelw.Van Dyke,Robert P.Hertzberg PeterB.Dervian Proc.Natl.Acad.sci.USA1982,79:5470-5474；Stockert JC,Castillo P DBella JL.DNA-induced distamycin A fluorescence.Histochemistry,1990.94:45-47；Baliga R,Crothers DM.The Kinetic basis for sequence discrimination bydistamycin A Jam Chem soc 2000.122:11751-11752等文献描述了有关司他霉素及其类似物的理化性质与抗肿瘤活性等内容。意大利法玛西雅公司的发明专利(公开号CN1468099A)描述了多种司他霉素衍生物的抗肿瘤疗效，拓宽了司他霉素的应用前景。Horiet al研究了司他霉素诱发脆性位点的性质，为人类因受应激因素产生的染色体不稳定性提供了一个线索。中国专利(公开号CN86104774A)描述了有关司他霉素衍生物制备方法。但国内外文献未见报道有关制备司他霉素的先进发酵方法。目前的司他霉素生产工艺，因发酵水平低，工艺尚未完善，菌种优良特性不易充分表达，导致司他霉素效价低，产量波动大，收率低，成本高等缺点。蒋世春等远端霉素高产菌株的选育(激光生物学报，2014，23(2)，189-192)通过诱变获得突变株Streptomyces distallicus DZ206，其产率较出发菌株Streptomyces distallicus D32提高1.38倍，提供了一种提高司他霉素生产水平的途径，由于没有进一步优化发酵工艺，Streptomyces distallicus DZ206菌种潜力得不到充分挖掘，对大幅度提高产量有局限，因此寻找一种高效的制备司他霉素方法的工作仍然在继续进行中。
发明内容
本发明还提供了一种高效制备司他霉素的方法，该方法包括：可产生司他霉素的链霉菌在含有可利用的碳源、可利用的氮源和3-羟基-4-氨基丁酸的发酵培养基里发酵的步骤，和在发酵中途向发酵培养基中加入植物油的步骤。
在优选的实施方案中，其中所述可产生司他霉素的链霉菌优选自链霉菌Streptomyces distallicus NRRL NO.2886，链霉菌Streptomyces distallicus D32，链霉菌Streptomyces distallicus DZ206。
在优选的实施方案中，其中所述的3-羟基-4-氨基丁酸(其结构如下所示，以下简称HABA)在发酵培养基中的重量浓度为0.005％-0.05％，更优选为0.01％。
在优选的实施方案中，其中所述发酵优选自发酵开始48-120小时向发酵培养基中加入植物油。
在优选的实施方案中，其中加入植物油的间隔优选为每24小时一次。
在优选的实施方案中，其中植物油的每次加入量与发酵培养基的重量比优选为0.3-1.0％，更优选为0.5％；植物油的加入总量与发酵培养基的重量比优选为1-4％，更优选为2％。
在优选的实施方案中，其中所述的植物油优选自菜籽油，葵花油，花生油，大豆油，橄榄油或它们的混合物，更优选为大豆油。
在优选的实施方案中，其中所述可利用的碳源在发酵培养基中的重量浓度优选为4-10％，更优选为5-8％，最优选为6％；所述可利用的氮源在发酵培养基中的重量浓度优选为2-7％，更优选为3-6％，最优选为5％。
在优选的实施方案中，其中所述可利用的碳源优选自乳糖，麦芽糖，糊精，木薯粉，玉米淀粉、葡萄糖、小麦淀粉、马铃薯淀粉、甘油、植物油或它们的混合物，更优选葡萄糖、糊精、大豆油或它们的混合物；所述可利用的氮源优选自大豆粉、黄豆饼粉、酵母粉、玉米浆、玉米浆干粉、鱼粉、蛋白胨、花生饼粉，棉籽饼粉，麸皮、麸质粉、硫酸铵、磷酸铵、氯化铵、硝酸铵或它们的混合物，更优选大豆粉，麸质粉或它们的混合物。
在优选的实施方案中，其中所述发酵的温度优选为20-40℃，所述发酵的时间优选为144-192小时，所述发酵培养基的pH为6.0-9.0。
本发明所述的链霉菌Streptomyces distallicus NRRL NO.2886参见专利US3190801；链霉菌Streptomyces distallicus D32和链霉菌Streptomyces distallicusDZ206参见蒋世春等远端霉素高产菌株的选育(激光生物学报，2014，23(2)，189-192)。
本发明涉及的斜面孢子培养基内含(1)有3-5％可利用的碳源，合适的可利用的碳源包括玉米淀粉，木薯粉，糊精，乳糖，葡萄糖，麦芽糖等；(2)可利用的1-2％氮源，合适的可利用的的氮源包括酵母粉，酵母抽提物，干酪素，蛋白胨，玉米浆，鱼粉，硫酸铵、磷酸铵等。
本发明涉及的斜面孢子培养基的制备，种子培养基的制备和发酵培养工艺如下：
斜面孢子培养基的制备：
配制的斜面孢子培养基进行湿热灭菌，温度121-125℃，压力0.10-0.13Mpa灭菌时间30分钟，其优选固体培养基，合适的培养温度20-40℃，最佳温度29±2℃，培养时间4-14天，优选6-12天。
种子培养基的制备：
本发明的种子培养基内含(1)1-4％可利用的碳源，合适的可利用的碳源包括淀粉，糊精，甘油，葡萄糖，乳糖，麦芽糖等。1-4％可利用的氮源，合适的可利用的氮源包括黄豆饼粉，酵母粉，蛋白胨，玉米浆，麸皮，麸质粉，氯化铵，硝酸铵，硫酸铵等，培养基湿热灭菌，温度121-125℃，压力0.10-0.13Mpa，灭菌时间30分钟，冷却后，将斜面孢子悬浮液接入到种子培养基内，进行培养，摇瓶装量为摇瓶体积的10-15％，以8层纱布过滤介质，摇床转速200-240rpm，种子罐装量为65-75％，通气比为1:1v/v/m，搅拌转速200-240rpm，合适的培养温度为20-40℃，最优为29±2℃，培养时间20-48小时，菌丝浓度为5-20％。
发酵培养
本发明的发酵培养基内含：(1)4-10％可利用的碳源，合适的可利用的碳源包括玉米淀粉，糊精，甘油，葡萄糖，木薯粉、马铃薯粉、小麦淀粉、乳糖，麦芽糖、植物油等，优选的是糊精，葡萄糖，大豆油或它们的混合物。(2)2-7％可利用的氮源，合适的可利用的氮源包括黄豆饼粉，花生饼粉，棉籽饼粉，大豆粉，酵母粉，蛋白胨，玉米浆、玉米浆干粉，鱼粉，麸皮，麸质粉，氯化铵，硝酸铵，硫酸铵、磷酸铵等，其中优选的是大豆粉，麸质粉或它们的混合物。发酵中途(48-120小时)添加1-4％的可利用的植物油包括选自菜籽油，葵花油，花生油，大豆油，橄榄油之一或其混合物。优选的是大豆油，菜籽油，更优选的是大豆油，优选浓度为1-4％，最佳浓度为2％。可利用的HABA浓度为0.005-0.05％，优选为0.01％。培养基于121-125℃，0.10-0.13Mpa，灭菌30分钟，冷却后，将斜面孢子悬浮液接入到种子培养基内，进行培养，摇瓶装量为摇瓶体积的10-12％，以8层纱布过滤介质，摇床转速200-240rpm；发酵罐装量为65-75％，通气比为1:0.8v/v/m，搅拌转速200-240rpm，培养温度为20-40℃，最优为29±2℃，培养时间144-192小时，菌丝浓度为30-50％。
司他霉素的效价测定
司他霉素的高效液相(HPLC)检测方法：
发酵结束后，发酵菌丝液加3倍体积的80％乙醇，浸泡15-30分钟，过滤，取滤液进行HPLC检测，其检测条件为：色谱柱：Shandon Hypersil 250*2.1mm，柱温40℃，流动相：溶剂A为乙氰；溶剂B为十二烷基硫酸钠的水溶液12g/L(其制备方法：12克十二烷基硫酸钠，加上85％的磷酸水溶液12ml，加纯水定容至1000ml，然后用20％氢氧化钠水溶液调PH为2.6)。流动相流速：0.25ml/分种，检测波长304nm。司他霉素的保留时间为8.2分钟。流动相梯度条件如下：
时间(分钟) 0 2 5 17 19 23 24 25 28
A％ 100 35 37 48.3 52 56 70 70 35
B％ 0 65 63 51.7 48 44 30 30 65
本发明与原工艺相比具有以下优点：
本发明提供一种高效发酵司他霉素的方法，该方法采用可产生司他霉素的链霉菌接种到液体种子培养基中，待细胞长成熟后，转接到优化的发酵培养基中并调整部分工艺条件及通过发酵中途补料培养的方式，发酵水平大幅度提高，司他霉素产率达到原工艺的2.2倍，为国际领先。由于发酵工艺的改进，使发酵菌丝液由原来的糊团状变为颗粒状，有利于固液分离，提取收率升高。同时，提高了设备和原料的利用率，大大降低了生产成本，为跻身国际市场与国产化奠定基础，具有显著的经济效益与社会效益：
(1)采用本发明方法，菌种高产特性得到充分发挥，发酵前期菌丝生长旺盛，发酵代谢速度快，抗生素产量增幅大，有利于降低染菌率。
(2)采用本发明方法，发酵终止料液粘度低，滤速快，获得滤液澄清，有利于提高提取收率与成品质量，克服了原工艺发酵产率低，粘度大，糊状，过滤不清，收率低，损失大的异常现象。
(3)采用本发明，发酵基础培养基添加HABA，培养过程采用补加植物油工艺，发酵水平稳定递增，同时避免逃液，增加放罐体积，提高发酵指数，发酵效价达到原工艺的2.2倍。大大提高了生产水平，同时大幅度降低了生产成本。
(4)本发明在发酵培养基中添加HABA，调整了培养基中碳氮营养成分结构和比例；同时培养过程中采用补加植物油工艺，高产量性能得到充分的发挥，抗生素分泌快，产量增幅多，有效组分比例提高，杂质少，而且过滤后菌丝残渣含水量低，滤渣松散，便于装卸，减轻了劳动强度。
(5)采用本发明，能在现有制药生产设备上实施，无额外投资。
具体实施方式
下面通过实施例进一步说明本发明，以便于本专业技术人员更全面理解。本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。除非另有说明，本发明中的百分数是指重量百分数或重量百分比浓度。
对比实施例1：司他霉素的制备
(1)菌种：链霉菌Streptomyces distallicus NRRL NO.2886
(2)斜面孢子的制备与培养
培养基配方(％)：葡萄糖4.5，酵母粉1.5，氯化钠0.3，七水硫酸镁0.05，碳酸钙0.2，硫酸铵0.05，EDTA0.02，消前PH6.2，用自然水配制，250ml规格的茄子瓶装量为50ml。培养基于温度121-125℃，压力0.10-0.13Mpa下灭菌30分钟，适当冷却后搁置成斜面，待用。
将司他霉素产生菌链霉菌Streptomyces distallicus NRRL NO.2886的孢子液均匀涂布于上述空白斜面上，在29±2℃的恒温培养箱中培养6-12天，待长成熟后，孢子为灰白色。
(3)摇瓶种子培养基的制备与培养
培养基配方(％)：葡萄糖2，玉米浆2.5，碳酸钙1.0，硫酸铵0.1磷酸二氢钾0.01，PH6.0，饮用水配制，500ml规格的三角瓶装量为50ml。培养基于温度121-125℃，压力0.10-0.13Mpa下灭菌30分钟，冷却后，用挖块法，将斜面孢子接入种子培养基中，在温度29±2℃，转速为220转/分的摇床震荡培养40小时，菌丝浓度7％，外观淡黄色镜检菌丝染色较深，分支分节明显。
(4)摇瓶发酵培养基的制备与培养
培养基配方(％)：葡萄糖6，麸质粉2.5，大豆粉3，氯化钠0.25，碳酸钙0.3，磷酸二氢钾0.02，大豆油0.1。PH6.2，饮用水配制。500ml规格的三角瓶装量为50ml，培养基于温度121-125℃，压力0.10-0.13Mpa下湿热灭菌30分钟，然后将种子液接入发酵培养基中，接种量为10％，培养温度29±2℃，转速为220转/分的摇床震荡培养168小时，放瓶发酵液的菌丝浓度约35％，PH为7.5左右，外观为暗黄色。在发酵液中加入3倍体积的80％的乙醇，浸泡30分钟，过滤，取滤液，采用高效液相(HPLC)测得司他霉素效价为730ug/ml。
对比实施例2：司他霉素的制备
(1)菌种：链霉菌Streptomyces distallicus D32
(2)斜面孢子的制备与培养
培养基配方(％)：葡萄糖4.5，酵母粉1.5，氯化钠0.3，七水硫酸镁0.05，碳酸钙0.2，硫酸铵0.05，EDTA0.02，消前PH6.2，用自然水配制，250ml规格的茄子瓶装量为50ml。培养基于温度121-125℃，压力0.10-0.13Mpa下灭菌30分钟，适当冷却后搁置成斜面，待用。
将司他霉素产生菌链霉菌Streptomyces distallicus D32的孢子液均匀涂布于上述空白斜面上，在29±2℃的恒温培养箱中培养6-12天，待长成熟后，孢子为灰白色。
(3)摇瓶种子培养基的制备与培养
培养基配方(％)：葡萄糖2，玉米浆2.5，碳酸钙1.0，硫酸铵0.1磷酸二氢钾0.01，PH6.0，饮用水配制，500ml规格的三角瓶装量为50ml。培养基于温度121-125℃，压力0.10-0.13Mpa下灭菌30分钟，冷却后，用挖块法，将斜面孢子接入种子培养基中，在温度29±2℃，转速为220转/分的摇床震荡培养40小时，菌丝浓度8％，外观淡黄色镜检菌丝染色较深，分支分节明显。
(4)摇瓶发酵培养基的制备与培养
培养基配方(％)：葡萄糖6，麸质粉2.5，大豆粉3，氯化钠0.25，碳酸钙0.3，磷酸二氢钾0.02，大豆油0.1。PH6.2，饮用水配制。500ml规格的三角瓶装量为50ml，培养基于温度121-125℃，压力0.10-0.13Mpa下湿热灭菌30分钟，然后将种子液接入发酵培养基中，接种量为10％，培养温度29±2℃，转速为220转/分的摇床震荡培养168小时，放瓶发酵液的菌丝浓度约35％，PH为7.9左右，外观为暗黄色。在发酵液中加入3倍体积的80％的乙醇，浸泡30分钟，过滤，取滤液，采用高效液相(HPLC)测得司他霉素效价为1030ug/ml。
对比实施例3：司他霉素的制备
(1)菌种：链霉菌Streptomyces distallicus DZ206
(2)斜面孢子的制备与培养
培养基配方(％)：葡萄糖4.5，酵母粉1.5，氯化钠0.3，七水硫酸镁0.05，碳酸钙0.2，硫酸铵0.05，EDTA0.02，消前PH6.2，用自然水配制，250ml规格的茄子瓶装量为50ml。培养基于温度121-125℃，压力0.10-0.13Mpa下灭菌30分钟，适当冷却后搁置成斜面，待用。
将司他霉素产生菌链霉菌Streptomyces distallicus DZ206的孢子液均匀涂布于上述空白斜面上，在29±2℃的恒温培养箱中培养6-12天，待长成熟后，孢子为灰白色。
(3)摇瓶种子培养基的制备与培养
培养基配方(％)：葡萄糖2，玉米浆2.5，碳酸钙1.0，硫酸铵0.1磷酸二氢钾0.01，PH6.0，饮用水配制，500ml规格的三角瓶装量为50ml。培养基于温度121-125℃，压力0.10-0.13Mpa下灭菌30分钟，冷却后，用挖块法，将斜面孢子接入种子培养基中，在温度29±2℃，转速为220转/分的摇床震荡培养40小时，菌丝浓度10％，外观淡黄色镜检菌丝染色深，分支分节明显。
(4)摇瓶发酵培养基的制备与培养
培养基配方(％)：葡萄糖6，麸质粉2.5，大豆粉3，氯化钠0.25，碳酸钙0.3，磷酸二氢钾0.02，大豆油0.1。PH6.2，饮用水配制。500ml规格的三角瓶装量为50ml，培养基于温度121-125℃，压力0.10-0.13Mpa下湿热灭菌30分钟，然后将种子液接入发酵培养基中，接种量为10％，培养温度29±2℃，转速为220转/分的摇床震荡培养168小时，放瓶发酵液的菌丝浓度约35％，PH为7.9左右，外观为暗黄色。在发酵液中加入3倍体积的80％的乙醇，浸泡30分钟，过滤，取滤液，采用高效液相(HPLC)测得司他霉素效价为2420ug/ml。
对比实施例4：司他霉素的制备
小型发酵罐试验
(1)菌种与斜面孢子的制备与培养见对比实施例3
(2)摇瓶菌丝的制备
培养基配方(％)：葡萄糖2，玉米浆2.5，碳酸钙1.0，硫酸铵0.1，磷酸二氢钾0.01，PH6.0，饮用水配制。1000ml规格的三角瓶装量为200ml，培养基于温度121-125℃，压力0.10-0.13Mpa下灭菌30分钟，冷却后，用挖块法，将斜面孢子接入种子培养基中，培养温度29±2℃，转速为220转/分的摇床中，震荡培养约40小时，菌丝浓度14％左右，外观淡黄色，镜检菌丝染色深，有分支分节。
(3)种子罐的配料与培养
培养基配方(％)：葡萄糖2，玉米浆2.5，碳酸钙1.0，硫酸铵0.1，磷酸二氢钾0.01，PH6.0，饮用水配制，100L种子罐的装量为65L，培养基于温度121-125℃，压力0.10-0.13Mpa下灭菌30分钟，冷却后，接入摇瓶菌丝液，在温度29±2℃，搅拌转速220转/分，通气比1:1v/v/m，培养40时，菌丝浓度12％，外观淡黄色，镜检菌丝染色深，粗壮，分支分节明显。
(4)发酵罐的配料与培养
培养基配方(％)：葡萄糖6，麸质粉2.5，大豆粉3碳酸钙0.3，磷酸二氢钾0.02，大豆油0.1，PH6.2，饮用水配制，1000L发酵罐的装量为700L,培养基在温度121-125℃，压力0.10-0.13Mpa下灭菌30分钟，冷却后，以10％的接种量接入种子液，培养温度29±2℃，搅拌转速220转/分，通气比1:0.8v/v/m，发酵周期168小时，菌丝浓度约40％，外观暗黄色，PH8.2，发酵液经预处理后，用高效液相(HPLC)测得司他霉素效价为2470ug/ml。
实施例1：司他霉素的制备
(1)菌种：链霉菌Streptomyces distallicus DZ206
(2)斜面孢子的制备与培养培养基配方(％)：葡萄糖4.5，酵母粉1.5，氯化钠0.3，七水硫酸镁0.05，碳酸钙0.2，硫酸铵0.05，EDTA0.02，消前PH6.2，用自然水配制，500ml规格的三角瓶装量为50ml。培养基于温度121-125℃，压力0.10-0.13Mpa下灭菌30分钟，适当冷却后搁置成斜面，待用。
将司他霉素产生菌链霉菌Streptomyces distallicus DZ206的孢子液均匀涂布于上述空白斜面上，在29±2℃的恒温培养箱中培养6-12天，待长成熟后，孢子为灰白色。
(3)摇瓶种子培养基的制备与培养
培养基配方(％)：葡萄糖2，玉米浆2.5，碳酸钙1.0，硫酸铵0.1，磷酸二氢钾0.01，PH6.0，饮用水配制，500ml规格的三角瓶装量为50ml。培养基于温度121-125℃，压力0.10-0.13Mpa下灭菌30分钟，冷却后，用挖块法，将斜面孢子接入种子培养基中，在温度29±2℃，转速为220转/分的摇床震荡培养40小时，菌丝浓度12％，外观淡黄色镜检菌丝染色深，分支分节明显。
(4)摇瓶发酵培养基的制备与培养
培养基配方(％)：葡萄糖6，麸质粉2.5，大豆粉3，氯化钠0.25，碳酸钙0.3，磷酸二氢钾0.02，HABA0.005，大豆油0.1。PH6.2，饮用水配制。500ml规格的三角瓶装量为50ml，培养基于温度121-125℃，压力0.10-0.13Mpa下湿热灭菌30分钟，然后将种子液接入发酵培养基中，接种量为10％，培养温度29±2℃，转速为220转/分的摇床震荡培养48小时后开始，每隔24小时添加0.5％大豆油(整个发酵过程共添加2％大豆油)培养168小时放瓶。发酵液的菌丝浓度约35％，PH为7.8左右，外观为暗黄色。在发酵液中加入3倍体积的80％的乙醇，浸泡30分钟，过滤，取滤液，采用高效液相(HPLC)测得司他霉素效价为5430ug/ml。
实施例2：司他霉素的制备
小型发酵罐试验
(1)菌种与斜面孢子的制备与培养见实施例1
(2)摇瓶菌丝的制备
培养基配方(％)葡萄糖2，玉米浆2.5，碳酸钙1.0，硫酸铵0.1，磷酸二氢钾0.01，PH6.0，饮用水配制。1000ml规格的三角瓶装量为200ml，培养基于温度121-125℃，压力0.10-0.13Mpa下灭菌30分钟，冷却后，用挖块法，将斜面孢子接入种子培养基中，培养温度29±2℃，转速为220转/分的摇床中，震荡培养约40小时，菌丝浓度12％左右，外观淡黄色，镜检菌丝染色深，有分支分节。
(3)种子罐的配料与培养
培养基配方(％)：葡萄糖2，玉米浆2.5，碳酸钙1.0，硫酸铵0.1，磷酸二氢钾0.01，PH6.0，饮用水配制，100L种子罐的装量为65L，培养基于温度121-125℃，压力0.10-0.13Mpa下灭菌30分钟，冷却后，接入摇瓶菌丝液，在温度29±2℃，搅拌转速220转/分，通气比1:1v/v/m，培养40小时，菌丝浓度14％，外观淡黄色，镜检菌丝染色深，粗壮，分支分节明显。
(4)发酵罐的配料与培养
培养基配方(％)：葡萄糖6，麸质粉2.5，大豆粉3.0，碳酸钙0.3，磷酸二氢钾0.02，大豆油0.1，HABA0.01，PH6.2，饮用水配制，1000L发酵罐的装量为700L，培养基在温度121-125℃，压力0.10-0.13Mpa下灭菌30分钟，冷却后，以10％的接种量接入种子液，培养温度29±2℃，搅拌转速220转/分，通气比1:0.8v/v/m，培养48小时后开始补加大豆油，每天一次补加0.3％，一共补加1.2％大豆油，发酵周期168小时，菌丝浓度约40％，外观暗黄色，PH8.2，发酵液经预处理后，用高效液相(HPLC)测得司他霉素效价为5360ug/ml。
实施例3：司他霉素的制备
(1)菌种与斜面孢子的制备与培养见实施例1
(2)摇瓶菌丝的制备
培养基配方(％)葡萄糖2，玉米浆2.5，碳酸钙1.0，硫酸铵0.1，磷酸二氢钾0.01，PH6.0，饮用水配制。1000ml规格的三角瓶装量为200ml，培养基于温度121-125℃，压力0.10-0.13Mpa下灭菌30分钟，冷却后，用挖块法，将斜面孢子接入种子培养基中，培养温度29±2℃，转速为220转/分的摇床中，震荡培养约40小时，菌丝浓度12％左右，外观淡黄色，镜检菌丝染色深，有分支分节。
(3)种子罐的配料与培养
培养基配方(％)：葡萄糖2，玉米浆2.5，碳酸钙1.0，硫酸铵0.1，磷酸二氢钾0.01，PH6.0，饮用水配制，100L种子罐的装量为65L，培养基于温度121-125℃，压力0.10-0.13Mpa下灭菌30分钟，冷却后，接入摇瓶菌丝液，在温度29±2℃，搅拌转速220转/分，通气比1:1v/v/m，培养40小时，菌丝浓度13％，外观淡黄色，镜检菌丝染色深，粗壮，分支分节明显。
(4)发酵培养基的配制与培养
培养基配方(％)：葡萄糖6，麸质粉2.5，大豆粉3，氯化钠0.25，碳酸钙0.3，磷酸二氢钾0.02，HABA0.01，大豆油0.1。PH6.2，饮用水配制。1000L发酵罐的装量为700L，培养基在温度121-125℃，压力0.10-0.13Mpa下灭菌30分钟，冷却后，以10％的接种量接入种子液，培养温度29±2℃，搅拌转速220转/分，通气比1:0.8v/v/m，培养48小时后开始补加大豆油，每天一次补加0.5％，一共补加2％大豆油，发酵周期168小时，菌丝浓度约38％，外观暗黄色，PH8.4，发酵液经预处理后，用高效液相(HPLC)测得司他霉素效价为5400ug/ml。
实施例4：司他霉素的制备
(1)菌种与斜面孢子的制备与培养见实施例1
(2)摇瓶菌丝的制备
培养基配方(％)葡萄糖2，玉米浆2.5，碳酸钙1.0，硫酸铵0.1，磷酸二氢钾0.01，PH6.0，饮用水配制。1000ml规格的三角瓶装量为200ml，培养基于温度121-125℃，压力0.10-0.13Mpa下灭菌30分钟，冷却后，用挖块法，将斜面孢子接入种子培养基中，在培养温度29±2℃，转速为220转/分的摇床中，震荡培养约40小时，菌丝浓度14％左右，外观淡黄色，镜检菌丝染色深，有分支分节。
(3)种子罐的配料与培养
培养基配方(％)：葡萄糖2，玉米浆2.5，碳酸钙1.0，硫酸铵0.1，磷酸二氢钾0.01，PH6.0，饮用水配制，100L种子罐的装量为65L，培养基于温度121-125℃，压力0.10-0.13Mpa下灭菌30分钟，冷却后，接入摇瓶菌丝液，在温度29±2℃，搅拌转速220转/分，通气比1:1v/v/m，培养40小时，菌丝浓度14％，外观淡黄色，镜检菌丝染色深，粗壮，分支分节明显。
(4)发酵罐的配料与培养
培养基配方(％)：葡萄糖6，麸质粉2.5，大豆粉3.0，碳酸钙0.3，磷酸二氢钾0.02，大豆油0.1，HABA0.01，PH6.2，饮用水配制，1000L发酵罐的装量为700L，培养基在温度121-125℃，压力0.10-0.13Mpa下灭菌30分钟，冷却后，以10％的接种量接入种子液，培养温度29±2℃，搅拌转速220转/分，通气比1:0.8v/v/m，培养48小时后开始补加大豆油，每隔24小时补加一次，其添加量为1.0％，整个发酵过程一共补加4％大豆油，发酵周期168小时，菌丝浓度约36％，外观暗黄色，PH7.8，发酵液经预处理后，用高效液相(HPLC)测得司他霉素效价为5210ug/ml。
实施例5：司他霉素的制备
(1)菌种与斜面孢子的制备与培养见实施例1
(2)摇瓶种子培养基的制备与培养见实施例1
(3)摇瓶发酵培养基的制备与培养
培养基配方(％)：葡萄糖6，麸质粉2.5，大豆粉3，氯化钠0.25，碳酸钙0.3，磷酸二氢钾0.02，HABA0.01，大豆油0.1。PH6.2，饮用水配制。500ml规格的三角瓶装量为50ml，培养基于温度121-125℃，压力0.10-0.13Mpa下湿热灭菌30分钟，然后将种子液接入发酵培养基中，接种量为10％，培养温度29±2℃，转速为220转/分的摇床震荡培养48小时后开始，每隔24小时添加0.5％大豆油(整个发酵过程共添加2％大豆油)168小时放瓶，发酵液的菌丝浓度约％，PH为8.3，外观为暗黄色。在发酵液中加入3倍体积的80％的乙醇，浸泡30分钟，过滤，取滤液，采用高效液相(HPLC)测得司他霉效价5500ug/ml。
实施例6：
(1)菌种与斜面孢子的制备与培养见实施例1
(2)摇瓶种子培养基的制备与培养见实施例1
(3)摇瓶发酵培养基的制备与培养
培养基配方(％)：葡萄糖6，麸质粉2.5，大豆粉3，氯化钠0.25，碳酸钙0.3，磷酸二氢钾0.02，HABA0.05，大豆油0.1。PH6.2，饮用水配制。500ml规格的三角瓶装量为50ml，培养基于温度121-125℃，压力0.10-0.13Mpa下湿热灭菌30分钟，然后将种子液接入发酵培养基中，接种量为10％，培养温度29±2℃，转速为220转/分的摇床震荡培养48小时后开始，每隔24小时添加0.5％大豆油(整个发酵过程共添加2％大豆油)培养168小时放瓶，发酵液的菌丝浓度约％，PH为8.0，外观为暗黄色。在发酵液中加入3倍体积的80％的乙醇，浸泡30分钟，过滤，取滤液，采用高效液相(HPLC)测得司他霉效价5220ug/ml。
实施例7：司他霉素的制备
(1)菌种与斜面孢子的制备与培养见对比实施例1
(2)摇瓶种子培养基的制备与培养见对比实施例1
(3)摇瓶发酵培养基的制备与培养
培养基配方(％)：葡萄糖6，麸质粉2.5，大豆粉3，氯化钠0.25，碳酸钙0.3，磷酸二氢钾0.02，HABA0.01，大豆油0.1。PH6.2，饮用水配制。500ml规格的三角瓶装量为50ml，培养基于温度121-125℃，压力0.10-0.13Mpa下湿热灭菌30分钟，然后将种子液接入发酵培养基中，接种量为10％，培养温度29±2℃，转速为220转/分的摇床震荡培养48小时后开始，每隔24小时添加0.5％大豆油(整个发酵过程共添加2％大豆油)168小时放瓶，发酵液的菌丝浓度约34％，PH为8.5，外观为暗黄色。在发酵液中加入3倍体积的80％的乙醇，浸泡30分钟，过滤，取滤液，采用高效液相(HPLC)测得司他霉效价1610ug/ml。
实施例8：司他霉素的制备
(1)菌种与斜面孢子的制备与培养见对比实施例2
(2)摇瓶种子培养基的制备与培养见对比实施例2
(3)摇瓶发酵培养基的制备与培养
培养基配方(％)：葡萄糖6，麸质粉2.5，大豆粉3，氯化钠0.25，碳酸钙0.3，磷酸二氢钾0.02，HABA0.01，大豆油0.1。PH6.2，饮用水配制。500ml规格的三角瓶装量为50ml，培养基于温度121-125℃，压力0.10-0.13Mpa下湿热灭菌30分钟，然后将种子液接入发酵培养基中，接种量为10％，培养温度29±2℃，转速为220转/分的摇床震荡培养48小时后开始，每隔24小时添加0.5％大豆油(整个发酵过程共添加2％大豆油)培养168小时放瓶，发酵液的菌丝浓度约35％，PH为8.4，外观为暗黄色。在发酵液中加入3倍体积的80％的乙醇，浸泡30分钟，过滤，取滤液，采用高效液相(HPLC)测得司他霉效价2270ug/ml。
实施例9：司他霉素的制备
(1)菌种与斜面孢子的制备与培养见实施例1
(2)摇瓶种子培养基的制备与培养见实施例1
(3)摇瓶发酵培养基的制备与培养
培养基配方(％)：葡萄糖6，麸质粉2.5，大豆粉3，氯化钠0.25，碳酸钙0.3，磷酸二氢钾0.02，HABA0.01，大豆油0.1。PH6.2，饮用水配制。500ml规格的三角瓶装量为50ml，培养基于温度121-125℃，压力0.10-0.13Mpa下湿热灭菌30分钟，然后将种子液接入发酵培养基中，接种量为10％，培养温度29±2℃，转速为220转/分的摇床震荡培养48小时后开始，每隔24小时添加0.5％菜籽油(整个发酵过程共添加2％菜籽油)168小时放瓶，发酵液的菌丝浓度约35％，PH为8.3，外观为暗黄色。在发酵液中加入3倍体积的80％的乙醇，浸泡30分钟，过滤，取滤液，采用高效液相(HPLC)测得司他霉效价5400ug/ml。
实施例10：司他霉素的制备
(1)菌种与斜面孢子的制备与培养见实施例1
(2)摇瓶种子培养基的制备与培养见实施例1
(3)摇瓶发酵培养基的制备与培养
培养基配方(％)：葡萄糖6，麸质粉2.5，大豆粉3，氯化钠0.25，碳酸钙0.3，磷酸二氢钾0.02，HABA0.01，大豆油0.1。PH6.2，饮用水配制。500ml规格的三角瓶装量为50ml，培养基于温度121-125℃，压力0.10-0.13Mpa下湿热灭菌30分钟，然后将种子液接入发酵培养基中，接种量为10％，培养温度29±2℃，转速为220转/分的摇床震荡培养48小时后开始，每隔24小时添加0.5％花生油(整个发酵过程共添加2％花生油)168小时放瓶，发酵液的菌丝浓度约38％，PH为8.3，外观为暗黄色。在发酵液中加入3倍体积的80％的乙醇，浸泡30分钟，过滤，取滤液，采用高效液相(HPLC)测得司他霉效价5200ug/ml。
实施例11：司他霉素的制备
(1)菌种与斜面孢子的制备与培养见实施例1
(2)摇瓶种子培养基的制备与培养见实施例1
(3)摇瓶发酵培养基的制备与培养
培养基配方(％)：葡萄糖6，麸质粉2.5，大豆粉3，氯化钠0.25，碳酸钙0.3，磷酸二氢钾0.02，HABA0.01，大豆油0.1。PH6.2，饮用水配制。500ml规格的三角瓶装量为50ml，培养基于温度121-125℃，压力0.10-0.13Mpa下湿热灭菌30分钟，然后将种子液接入发酵培养基中，接种量为10％，培养温度29±2℃，转速为220转/分的摇床震荡培养48小时后开始，每隔24小时添加0.5％橄榄油(整个发酵过程共添加2％橄榄油)168小时放瓶，发酵液的菌丝浓度约42％，PH为8.2，外观为暗黄色。在发酵液中加入3倍体积的80％的乙醇，浸泡30分钟，过滤，取滤液，采用高效液相(HPLC)测得司他霉效价5230ug/ml。
实施例12：司他霉素的制备
(1)菌种与斜面孢子的制备与培养见实施例1
(2)摇瓶种子培养基的制备与培养见实施例1
(3)摇瓶发酵培养基的制备与培养
培养基配方(％)：葡萄糖6，麸质粉2.5，大豆粉3，氯化钠0.25，碳酸钙0.3，磷酸二氢钾0.02，HABA0.01，大豆油0.1。PH6.2，饮用水配制。500ml规格的三角瓶装量为50ml，培养基于温度121-125℃，压力0.10-0.13Mpa下湿热灭菌30分钟，然后将种子液接入发酵培养基中，接种量为10％，培养温度29±2℃，转速为220转/分的摇床震荡培养48小时后开始，每隔24小时添加0.5％葵花油(整个发酵过程共添加2％葵花油)168小时放瓶，发酵液的菌丝浓度约40％，PH为8.5，外观为暗黄色。在发酵液中加入3倍体积的80％的乙醇，浸泡30分钟，过滤，取滤液，采用高效液相(HPLC)测得司他霉效价5210ug/ml。

Claims (20)

1.一种制备司他霉素的方法，其特征在于：包括可产生司他霉素的链霉菌在含有可利用的碳源、可利用的氮源和3-羟基-4-氨基丁酸的发酵培养基里发酵的步骤，和在发酵中途向发酵培养基中加入植物油的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的链霉菌选自链霉菌Streptomycesdistallicus NRRL NO.2886，链霉菌Streptomyces distallicus D32，链霉菌Streptomyces distallicus DZ206。
3.根据权利要求1-2任一项所述的方法，其特征在于：所述的3-羟基-4-氨基丁酸在发酵培养基中的重量浓度为0.005％-0.05％。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的3-羟基-4-氨基丁酸在发酵培养基中的重量浓度为0.01％。
5.根据权利要求1-2任一项所述的方法，其特征在于：所述发酵中途为自发酵开始48-120小时。
6.根据权利要求1-2任一项所述的方法，其特征在于：加入植物油的间隔为每24小时一次。
7.根据权利要求1-2任一项所述的方法，其特征在于：植物油的每次加入量与发酵培养基的重量比为0.3-1.0％；植物油的加入总量与发酵培养基的重量比为1-4％。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：植物油的每次加入量与发酵培养基的重量比为0.5％。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：植物油的加入总量与发酵培养基的重量比为2％。
10.根据权利要求1-2任一项所述的方法，其特征在于：所述的植物油选自菜籽油，葵花油，花生油，大豆油，橄榄油或它们的混合物。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：所述的植物油为大豆油。
12.根据权利要求1-2任一项所述的方法，其特征在于：所述可利用的碳源在发酵培养基中的重量浓度为4-10％；所述可利用的氮源在发酵培养基中的重量浓度为2-7％。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：所述可利用的碳源在发酵培养基中的重量浓度为5-8％。
14.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：所述可利用的碳源在发酵培养基中的重量浓度为6％。
15.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：所述可利用的氮源在发酵培养基中的重量浓度为3-6％。
16.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：所述可利用的氮源在发酵培养基中的重量浓度为5％。
17.根据权利要求1-2任一项所述的方法，其特征在于：所述可利用的碳源选自乳糖，麦芽糖，糊精，木薯粉，玉米淀粉、葡萄糖、小麦淀粉、马铃薯淀粉、甘油、植物油或它们的混合物；所述可利用的氮源选自大豆粉、黄豆饼粉、酵母粉、玉米浆、玉米浆干粉、鱼粉、蛋白胨、花生饼粉，棉籽饼粉，麸皮、麸质粉、硫酸铵、磷酸铵、氯化铵、硝酸铵或它们的混合物。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于：所述可利用的碳源选自葡萄糖、糊精、大豆油或它们的混合物。
19.根据权利要求17所述的方法，其特征在于：所述可利用的氮源选自大豆粉，麸质粉或它们的混合物。
20.根据权利要求1-2任一项所述的方法，其特征在于：所述发酵的温度为20-40℃，所述发酵的时间为144-192小时，所述发酵培养基的pH为6.0-9.0。
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