CN107164438B - 一种提高短短芽孢杆菌细菌素生产水平的发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高短短芽孢杆菌细菌素生产水平的发酵方法,先获取菌种,然后将获取的菌种接种到发酵培养基中进行发酵获得短短芽孢杆菌细菌素,根据菌体发酵开始后前6~18h的对数生长期和菌体发酵开始18h后至发酵结束的稳定期生长状况按照发酵时间进行分段调整。在短短芽孢杆菌细菌素发酵过程中按时间分段调控发酵体系的温度、溶氧、以及pH,通过以上参数的调整可使发酵前期菌种能够快速稳定的生长,发酵中后期菌种能够高效稳定的产细菌素,降低其它副产物的生成。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种提高短短芽孢杆菌细菌素生产水平的发酵方法。
背景技术
细菌素是某些细菌产生的具有抗菌活性的物质,主要成分为小分子多肽、蛋白质、酶、或蛋白质复合物,最早是由Jacob于1953年提出,后经Konisly进一步补充完善。近年来,种类繁多的抗生素在食品工业、动物生产、医疗、畜禽饲料等方面广泛使用的负面效应日益突出,寻找新型抗生素得到了研究者的足够重视,细菌素作为一种新型抗生素在抗菌方面,具有高效无毒、耐酸碱、耐高温、无残留、几乎无抗药性的特性,是极具潜力的传统抗生素替代品。目前除了商业化生产的细菌素Nisin外、其它的细菌素还处在试验及临床研究阶段,其主要受限于细菌素的制备成本高,产量较低,产量不稳定。上述问题在较大的程度限制了各类细菌素的鉴定及开发利用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足,提供一种提高短短芽孢杆菌细菌素生产水平的发酵方法,用于高效生产短短芽孢杆菌细菌素。
本发明采用以下技术方案:
一种提高短短芽孢杆菌细菌素生产水平的发酵方法,先获取菌种,然后将获取的菌种接种到发酵培养基中进行发酵获得短短芽孢杆菌细菌素,根据菌体发酵开始后前6~18h的对数生长期和菌体发酵开始18h后至发酵结束的稳定期生长状况按照发酵时间进行分段调整。
优选的,所述获取菌种具体为:将发酵菌种短短芽孢杆菌接种到种子培养基中29~31℃培养12~16h得种子液。
优选的,所述种子培养基包括葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、磷酸二氢钾和Tween-20,所述葡萄糖的质量百分含量为0.5%,所述蛋白胨的质量百分含量为1.2%、牛肉膏的质量百分含量为0.65%,氯化钠的质量百分含量为0.4%,磷酸二氢钾的质量百分含量为0.14%、Tween-20的质量百分含量为0.1%,所述种子培养基的pH为7.2。
优选的,所述发酵具体为:将产短短芽孢杆菌细菌素的菌种种子液按照体积比为2:25~3:50比例接种到发酵培养基中进行短短芽孢杆菌细菌素发酵。
优选的,在发酵开始后的前6~18h内发酵体系温度调整为29~31℃,发酵开始18h后至发酵结束发酵体系温度调为27~29℃。
优选的,在发酵开始后的前6~18h内发酵体系中溶氧调高为60%~80%,发酵开始18h后至发酵结束发酵体系溶氧调低为40%~60%。
优选的,在发酵开始后的前6~18h内发酵体系pH调整为7.3~7.5,发酵开始18h后至发酵结束发酵体系pH调整为6.8~7.2。
优选的,所述发酵培养基按质量百分含量包括马铃薯淀粉2%、豆饼粉3%、氯化钙0.20%、磷酸氢二钾0.025%、吐温-20 0.8%和吐温-80 0.2%,所述发酵培养基的pH为6.8。
优选的,所述菌种为BNCC138469短短芽孢杆菌。
与现有技术相比,本发明至少具有以下有益效果:
本发明通过对短短芽孢杆菌发酵过程菌种生长及产短短芽孢杆菌细菌素规律的的深入研究,提出了一种提高短短芽孢杆菌细菌素生产水平的发酵方法,包括获取菌种和短短芽孢杆菌细菌素发酵,其中,短短芽孢杆菌细菌素发酵过程为将培养14h后的菌种培养液按照体积比为2:25~3:50的比例接种到5L发酵罐的发酵培养基中制成发酵体系开始短短芽孢杆菌细菌素发酵;在短短芽孢杆菌细菌素发酵过程中按时间分段调控发酵体系的温度、溶氧、以及pH,通过以上参数的调整可使发酵前期菌种能够快速稳定的生长,发酵中后期菌种能够高效稳定的产短短芽孢杆菌细菌素,降低其它副产物的生成。
进一步的,本发明工艺菌种种子培养基的成分比如下:葡萄糖0.5%、蛋白胨1.2%、牛肉膏0.65%、氯化钠0.4%、磷酸二氢钾0.14%、Tween-20 0.1%,在此营养成分比下,制备的发酵所用种子液中菌种的生长繁殖更快,菌种的活力达到最高。
进一步的,本发明工艺根据产短短芽孢杆菌细菌素菌种的生长及产素规律,提出了分段控制发酵过程参数,有效的为菌种前期生长及后期产素提供了良好的条件,很大程度上提高了短短芽孢杆菌细菌素的生产水平,并且短短芽孢杆菌细菌素产量稳定,发酵培养基营养配方主要原料廉价易得,节省成本,适合工业规模化生产。
进一步的,本发明工艺菌种发酵培养基的成分比如下:马铃薯淀粉2%、豆饼粉3%、氯化钙0.20%、磷酸氢二钾0.025%、Tween-20 0.8%、Tween-80 0.2%。在此营养成分比下,短短芽孢杆菌代谢分泌短短芽孢杆菌细菌素的活力更强,产量更高。
下面通过附图和实施例,对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
图1为采用本方法发酵对短短芽孢杆菌素抑菌活力的影响示意图。
具体实施方式
本发明提供了一种提高短短芽孢杆菌细菌素生产水平的发酵方法,对短短芽孢杆菌的代谢规律进行深入研究,根据不同营养调节因子对短短芽孢杆菌菌株产短短芽孢杆菌细菌素量的影响不同,对发酵营养配方进行调整,同时根据菌体对数生长期和菌体稳定期的生长状况的不同,对发酵条件比如温度、溶氧和发酵体系pH等按照发酵时间进行分段调整,达到提高短短芽孢杆菌细菌素产量的目的。
本发明提高短短芽孢杆菌细菌素生产水平的发酵方法,包括获取菌种以及将获取的菌种接种到最适发酵培养基中进行发酵获得短短芽孢杆菌细菌素,在短短芽孢杆菌细菌素发酵过程中,在发酵开始后的前6~18h为菌种的菌体对数生长期,发酵开始18h后至发酵结束为菌种的菌体稳定期,根据菌体对数生长期和菌体稳定期生长状况的不同对发酵条件按照发酵时间进行分段调整。
在发酵开始后的前6~18h内发酵体系温度调整为29~31℃,发酵开始18h后至发酵结束发酵体系温度调为27~29℃;
在发酵开始后的前6~18h内发酵体系中溶氧调高为60%~80%,发酵开始18h后至发酵结束发酵体系溶氧调低为40%~60%;
在发酵开始后的前6~18h内发酵体系pH调整为7.3~7.5,发酵开始18h后至发酵结束发酵体系pH调整为6.8~7.2;
所述短短芽孢杆菌细菌素发酵方法具体步骤如下:
(1)获取菌种:将发酵菌种短短芽孢杆菌接种到种子培养基中30℃培养14h得种子液;
(2)将产短短芽孢杆菌细菌素的所述菌种种子液按照体积比为2:25~3:50比例接种到发酵培养基中进行短短芽孢杆菌细菌素发酵。
在发酵开始后的前6~18h内发酵体系温度调整为30℃,发酵开始18h后至发酵结束发酵体系温度调为28℃。
在发酵开始后的前6~18h内发酵体系中溶氧调高为70%,发酵开始18h后至发酵结束发酵体系溶氧调低为50%。
在发酵开始后的前6~18h内发酵体系pH调整为7.4,发酵开始18h后至发酵结束发酵体系pH调整为7.0。
所述种子培养基包括葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、磷酸二氢钾和Tween-20,所述葡萄糖的质量百分含量为0.5%,所述蛋白胨的质量百分含量为1.2%、牛肉膏的质量百分含量为0.65%,氯化钠的质量百分含量为0.4%,磷酸二氢钾的质量百分含量为0.14%、Tween-20的质量百分含量为0.1%,所述种子培养基的pH为7.2。
所述发酵培养基按质量百分含量包括马铃薯淀粉2%、豆饼粉3%、氯化钙0.20%、磷酸氢二钾0.025%、吐温-20 0.8%和吐温-80 0.2%,所述发酵培养基的pH为6.8。
所述菌种为短短芽孢杆菌(BNCC138469)。
根据上述方法进行短短芽孢杆菌细菌素发酵:
短短芽孢杆菌细菌素抑菌活力测定
本发明涉及的细菌素活力测定为杯碟抑菌圈法测定:指示菌为金黄色葡萄球菌CICC21600,短短芽孢杆菌细菌素抑菌活力表示方法(效价值AU/mL);将发酵上清液用pH6.8的Tris-HCl缓冲液进行二倍系列稀释,取样200μl进行抑菌实验,以观察不到抑菌圈出现的最高稀释度定义为一个活力单位(1AU),其倒数即为原发酵液短短芽孢杆菌细菌素的效价值AU/mL。
短短芽孢杆菌细菌素产量的测定
将发酵上清液(1L)采用旋转蒸发仪在0.1Mpa,45℃的条件下浓缩至400mL,80%乙醇沉淀,透析除盐24h,SephadexG-50凝胶纯化,冷冻干燥20h,得粉末状短短芽孢杆菌细菌素,称其质量。
实施例1
(1)菌种获取:将短短芽孢杆菌株接种于斜面,于30℃恒温培养箱中培养,然后将斜面培养基上活化后的菌株制备成浓度为3×106个/ml。
菌悬液,按照2%的接种量接种于新鲜的种子培养基中,于30℃,200rpm的摇床上震荡培养。
(2)将培养14h后的种子液按照6%接种量接种至新鲜的发酵培养基中(5L发酵罐装液量3.6L)进行培养,在短短芽孢杆菌细菌素发酵过程中,在发酵开始后的前6~18h为菌种的菌体对数生长期,在发酵开始后的18h直至发酵结束为菌种的菌体稳定期,根据菌体对数生长期和菌体稳定期生长状况的不同对发酵条件按照发酵时间进行分段调整。
在发酵开始后的前6~18h内发酵体系温度调整为30℃,发酵开始18h后至发酵结束发酵体系温度调为28℃;
在发酵开始后的前6~18h内发酵体系中溶氧调高为70%,发酵开始18h后至发酵结束发酵体系溶氧调低为50%;
在发酵开始后的前6~18h内发酵体系pH调整为7.4,发酵开始18h后至发酵结束发酵体系pH调整为7.0;
发酵50h结束,采用短短芽孢杆菌细菌素抑菌活力测定方法测定发酵液中短短芽孢杆菌细菌素抑菌活力,得到短短芽孢杆菌细菌素抑菌活力为814.08AU/ml。同时采用短短芽孢杆菌细菌素产量的测定方法测得短短芽孢杆菌细菌素产量为12.72g/L。
其中,发酵过程中采用1mol/L的HCl调节发酵液的pH。
短短芽孢杆菌细菌素最适发酵培养基成分组成:马铃薯淀粉2%、豆饼粉3%、氯化钙0.20%、磷酸氢二钾0.025%、吐温-20 0.8%、吐温-80 0.2%,初始pH为6.8。
实施例2
(1)菌种获取:将短短芽孢杆菌株接种于斜面,于30℃恒温培养箱中培养,然后将斜面培养基上活化后的菌株制备成浓度为3×106个/ml。
菌悬液,按照2%的接种量接种于新鲜的种子培养基中,于29℃,220rpm的摇床上震荡培养。
(2)将培养12h后的种子液按照7%接种量接种至新鲜的发酵培养基中(5L发酵罐装液量3.6L)进行培养,在短短芽孢杆菌细菌素发酵过程中,在发酵开始后的前6~18h为菌种的菌体对数生长期,在发酵开始后的18h直至发酵结束为菌种的菌体稳定期,根据菌体对数生长期和菌体稳定期生长状况的不同对发酵条件按照发酵时间进行分段调整。
在发酵开始后的前6~18h内发酵体系温度调整为29℃,发酵开始18h后至发酵结束发酵体系温度调为27℃;
在发酵开始后的前6~18h内发酵体系中溶氧调高为60%,发酵开始18h后至发酵结束发酵体系溶氧调低为40%;
在发酵开始后的前6~18h内发酵体系pH调整为7.3,发酵开始18h后至发酵结束发酵体系pH调整为6.8;
发酵54h结束,采用短短芽孢杆菌细菌素抑菌活力测定方法测定发酵液中短短芽孢杆菌细菌素抑菌活力,得到短短芽孢杆菌细菌素抑菌活力为726.4AU/ml。同时采用短短芽孢杆菌细菌素产量的测定方法测得短短芽孢杆菌细菌素产量为11.46g/L。
其中,发酵过程中采用1mol/L的HCl调节发酵液的pH。
短短芽孢杆菌细菌素最适发酵培养基成分组成:马铃薯淀粉2%、豆饼粉3%、氯化钙0.20%、磷酸氢二钾0.025%、吐温-20 0.8%、吐温-80 0.2%,初始pH为6.8。
实施例3
(1)菌种获取:将短短芽孢杆菌株接种于斜面,于30℃恒温培养箱中培养,然后将斜面培养基上活化后的菌株制备成浓度为3×106个/ml。
菌悬液,按照2%的接种量接种于新鲜的种子培养基中,于31℃,180rpm的摇床上震荡培养。
(2)将培养16h后的种子液按照8%接种量接种至新鲜的发酵培养基中(5L发酵罐装液量3.6L)进行培养,在短短芽孢杆菌细菌素发酵过程中,在发酵开始后的前6~18h为菌种的菌体对数生长期,在发酵开始后的18h直至发酵结束为菌种的菌体稳定期,根据菌体对数生长期和菌体稳定期生长状况的不同对发酵条件按照发酵时间进行分段调整。
在发酵开始后的前6~18h内发酵体系温度调整为31℃,发酵开始18h后至发酵结束发酵体系温度调为29℃;
在发酵开始后的前6~18h内发酵体系中溶氧调高为80%,发酵开始18h后至发酵结束发酵体系溶氧调低为60%;
在发酵开始后的前6~18h内发酵体系pH调整为7.5,发酵开始18h后至发酵结束发酵体系pH调整为7.2;
发酵58h结束,采用短短芽孢杆菌细菌素抑菌活力测定方法测定发酵液中短短芽孢杆菌细菌素抑菌活力,得到短短芽孢杆菌细菌素抑菌活力为747.6AU/ml。同时采用短短芽孢杆菌细菌素产量的测定方法测得短短芽孢杆菌细菌素产量为11.12g/L。
其中,发酵过程中采用1mol/L的HCl调节发酵液的pH。
短短芽孢杆菌细菌素最适发酵培养基成分组成:马铃薯淀粉2%、豆饼粉3%、氯化钙0.20%、磷酸氢二钾0.025%、吐温-20 0.8%、吐温-80 0.2%,初始pH为6.8。
另外,请参阅图1,为采用本工艺发酵对短短芽孢杆菌素抑菌活力的影响,其中,1未采用本工艺发酵抑菌直径18.2mm,2为采用本工艺发酵抑菌直径24.6mm,CK1为无菌水,CK2为空白发酵培养基,生产阶段中对发酵过程不进行控制以及对种子培养基及发酵培养基成分组成不做调整作为空白实验,经比较,采用本发明方法进行实施案例1、2、3,即在不同发酵工艺条件下短短芽孢杆菌细菌素发酵,获得的短短芽孢杆菌细菌素抑菌活力及其产量与未采用本发明方法发酵获得的短短芽孢杆菌细菌素抑菌活力及其产量高低如下表1、2、3所示。采用本发明方法进行实施案例1、2、3,短短芽孢杆菌细菌素抑菌活力及其产量分别比未采用本发明方法提高了59%和48.9%、46.1%和38.7%、48.3%和36.1%。
根据实施例1得出下表
表1为是否采用本发明方法细菌素抑菌活力及产量的比较
根据实施例2得出下表
表2为是否采用本发明方法细菌素抑菌活力及产量的比较
根据实施例3得出下表
表3为是否采用本发明方法细菌素抑菌活力及产量的比较
表4为种子液制备培养基成分比改进前后对菌体生长的影响
能够得出在此营养成分比下,制备的发酵所用种子液中菌种的生长繁殖更快,菌种的活力达到最高。
表5为本发酵工艺所用发酵培养基营养成分优化前后对短短芽孢杆菌细菌素抑菌活力及产量的影响(旧工艺下测定)
本发明中所用的短短芽孢杆菌(BNCC138469)由北纳创联生物技术有限公司(BNCC)购得。
以上内容仅为说明本发明的技术思想,不能以此限定本发明的保护范围,凡是按照本发明提出的技术思想,在技术方案基础上所做的任何改动,均落入本发明权利要求书的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种提高短短芽孢杆菌细菌素生产水平的发酵方法,其特征在于,先获取菌种,所述菌种为BNCC138469短短芽孢杆菌,具体为:将发酵菌种短短芽孢杆菌接种到种子培养基中29~31℃培养12~16h得种子液,然后将获取的菌种接种到发酵培养基中进行发酵获得短短芽孢杆菌细菌素,具体为:将产短短芽孢杆菌细菌素的菌种种子液按照体积比为2:25~3:50比例接种到发酵培养基中进行短短芽孢杆菌细菌素发酵,所述发酵培养基按质量百分含量包括马铃薯淀粉2%、豆饼粉3%、氯化钙0.20%、磷酸氢二钾0.025%、吐温-20 0.8%和吐温-80 0.2%,所述发酵培养基的pH为6.8,根据菌体发酵开始后前6~18h的对数生长期和菌体发酵开始18h后至发酵结束的稳定期生长状况按照发酵时间进行分段调整,在发酵开始后的前6~18h内发酵体系中溶氧调高为60%~80%,发酵开始18h后至发酵结束发酵体系溶氧调低为40%~60%,所述种子培养基包括葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、磷酸二氢钾和Tween-20,所述葡萄糖的质量百分含量为0.5%,所述蛋白胨的质量百分含量为1.2%、牛肉膏的质量百分含量为0.65%,氯化钠的质量百分含量为0.4%,磷酸二氢钾的质量百分含量为0.14%、Tween-20的质量百分含量为0.1%,所述种子培养基的pH为7.2。
2.根据权利要求1所述的一种提高短短芽孢杆菌细菌素生产水平的发酵方法,其特征在于,在发酵开始后的前6~18h内发酵体系温度调整为29~31℃,发酵开始18h后至发酵结束发酵体系温度调为27~29℃。
3.根据权利要求1所述的一种提高短短芽孢杆菌细菌素生产水平的发酵方法,其特征在于,在发酵开始后的前6~18h内发酵体系pH调整为7.3~7.5,发酵开始18h后至发酵结束发酵体系pH调整为6.8~7.2。
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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