CN108410783B - 一种培养大肠杆菌发酵生产氨基葡萄糖的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明微生物发酵技术领域，具体涉及一种培养大肠杆菌发酵生产氨基葡萄糖的方法。本发明所述培养大肠杆菌发酵生产氨基葡萄糖的方法，仅利用现有技术中常规的大肠杆菌为发酵菌株，并通过对种子培养基以及发酵培养基的优化，有效提高了大肠杆菌的菌量，同时在无需对菌株进行基因工程改造的情况下，有效提高了发酵液中氨基葡萄糖的含量。

Description

一种培养大肠杆菌发酵生产氨基葡萄糖的方法
技术领域
本发明微生物发酵技术领域，具体涉及一种培养大肠杆菌发酵生产氨基葡萄糖的方法。
背景技术
氨基葡萄糖(Glucosamine，GlcN)又称氨糖、氨基葡糖或葡糖胺，是葡萄糖的一个羟基被氨基取代后的化合物，是一种重要的功能单糖，也是第一个被确认结构的氨基单糖。氨糖易溶于水及亲水性溶剂，以其衍生物N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)经酸解可得到氨基葡萄糖。GlcN几乎存在于所有机体中，包括细菌、酵母、丝状真菌、植物以及动物体，是糖蛋白和蛋白聚糖的主要组成成分，同时也是壳聚糖和甲壳素的主要组成成分。
氨基葡萄糖在医药、食品和保健等领域均具有广泛应用。由于氨糖能特异性地作用于关节软骨，恢复软骨细胞正常的代谢功能，能刺激软骨细胞产生具有正常多聚体结构的蛋白多糖，抑制损伤软骨的酶，延缓骨性关节炎的病理过程和疾病的进展，改善关节活动，缓解疼痛，因此在临床上被大量用于骨关节炎的治疗。此外，氨基葡萄糖在体内也具有重要的生理作用，如具有肝肾解毒，发挥抗炎、护肝的作用；也能作为抗菌消炎药物，治疗胃溃疡等。再者，由于GlcN对人体没有毒性，被视作天然无害的食品及保健品配料，日本和美国均将其作为食品配料广泛使用；由于氨糖有助于刺激婴儿肠道中双歧杆菌的增生，常被用作婴儿配方乳中添加的一种重要微量糖类成分。同时氨基葡萄糖也是合成VB6和核黄素中间体的起始原料，是一种新型生化药品、药物中间体和高档化妆品的添加剂。
目前，GlcN工业化生产的方法主要可以分为三种：酸水解法、酶解法以及微生物发酵法。酸水解法以及酶解法的生产原料主要为虾蟹的外骨骼，主要是从虾蟹壳中提取甲壳素与壳聚糖，再经酸解或者酶解获得目标产物GlcN。但是酸水解法以及酶解法自身存在着诸如原材料来源限制、水解过程的酸会污染环境、生产效率低下等问题，严重制约了氨基葡萄糖产业的发展。而微生物发酵法生产不受资源限制，对环境污染小，产品无鱼腥味，不存在过敏效应，因此，国内外学者不断探索寻求利用微生物发酵法高效生产GlcN的方法。
近年来，国内外研究人员从生化工程和代谢工程两个方面对微生物生产氨基葡萄糖的菌株及工艺进行了系统性地研究。目前已知的发酵生产氨糖的菌株主要集中在真菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。对GlcN的生物合成研究表明：在大肠杆菌中，由谷氨酰胺作为氨基供体，6-磷酸果糖在氨基葡萄糖合成酶(GlmS)的催化作用下，生成GlcN。但是，现有直接以野生型大肠杆菌株进行氨糖发酵生产的工艺中，由于氨基葡萄糖对大肠杆菌具有一定的刺激作用，对大肠杆菌的生长具有较大的抑制作用，因此都存在着菌株发酵密度较低导致氨糖生产量较低的问题，进而影响了目标产物氨基葡萄糖的胞外积累量，这也成为了限制微生物发酵生产氨糖工艺的技术难题。而如何有效提高发酵菌株的发酵密度并进一步提高氨基葡萄糖的产量成为亟待解决的问题。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种培养大肠杆菌发酵生产氨基葡萄糖的方法，以解决现有技术中微生物发酵生产氨糖工艺中菌株发酵密度较低导致氨糖产量较低的问题。
为解决上述技术问题，本发明所述的一种培养大肠杆菌发酵生产氨基葡萄糖的方法，包括如下步骤：
(1)将斜面保存的大肠杆菌接种入种子培养基中进行种子活化；所述种子培养基的溶质如下：蛋白胨10-20g/L，酵母膏15-25g/L，甘油2-4g/L，甘氨酸3-8g/L，生物素0.1-0.3g/L，调pH7.0-7.2；
(2)将活化后的种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，得到含氨基葡萄糖的发酵液；所述发酵培养基的溶质如下：葡萄糖25-35g/L，酵母膏15-25g/L，无氨基氮源8-12g/L，甘露糖醇6-10g/L，乳酸钠3-8g/L，甘氨酸硝酸盐3-8g/L，MgSO4·7H2O 0.4-0.8g/L，K2HPO4 0.8-1.2g/L，(NH4)2SO42-4g/L，FeSO4·7H2O 0.4-0.6mg/L，调pH7.0-7.2。
所述步骤(1)中，所述种子培养基的溶质如下：蛋白胨15g/L，酵母膏20g/L，甘油3g/L，甘氨酸5g/L，生物素0.2g/L。
所述步骤(1)中，所述种子活化步骤的培养温度为35-37℃，控制摇床转速200-220rpm，培养时间为10-12h。
所述步骤(2)中，所述发酵培养基的溶质如下：葡萄糖30g/L，酵母膏20g/L，无氨基氮源10g/L，甘露糖醇8g/L，乳酸钠5g/L，甘氨酸硝酸盐5g/L，MgSO4·7H2O 0.6g/L，K2HPO41.0g/L，(NH4)2SO4 3g/L，FeSO4·7H2O0.5mg/L。
所述步骤(2)中，所述发酵培养步骤的培养温度为30-37℃，搅拌速度为250-300rpm，通气量为1.2-1.8vvm，培养时间为36-48h。
所述步骤(2)中，还包括在发酵过程中加入补料培养基进行补料的步骤，所述补料培养基的溶质如下：葡萄糖500-600g/L，半乳聚糖60-100g/L。
所述补料步骤为恒速补料，控制补料速率为5-6L/h。
所述步骤(1)中，所述大肠杆菌用LB斜面培养基进行保存。
所述步骤(1)中，还包括在种子活化步骤之前，将斜面保存的大肠杆菌划线至LB固体平板培养基中进行培养活化的步骤。
所述LB斜面培养基和/或所述LB固体平板培养基中添加2-3g/L的半乳聚糖。
本发明所述培养大肠杆菌发酵生产氨基葡萄糖的方法，仅利用现有技术中常规的大肠杆菌为发酵菌株，并通过对种子培养基以及发酵培养基的优化，有效提高了大肠杆菌的菌量，同时在无需对菌株进行基因工程改造的情况下，有效提高了发酵液中氨基葡萄糖的含量。
本发明所述方法利用添加半乳聚糖的LB固体培养基进行菌株的日常保存，实验数据表明，添加的半乳聚糖对菌株的发酵活力有一定的促进作用，有益于获得高密度的发酵菌液。
本发明所述方法在现有种子培养基的基础上，添加甘氨酸进行种子液培养，有助于提高发酵菌株的发酵活力，使得大肠杆菌在后续发酵过程中获得更高的菌种密度，并累计更多的目标产物，所得目标产物的发酵量与现有技术基因工程菌的发酵量近似甚至更高。
本发明所述方法在现有发酵培养基的基础上，通过添加甘氨酸硝酸盐，能有效降低目标产物氨基葡萄糖对菌株的刺激作用，有助于目标产物的胞外积累，而甘露糖醇的添加则有助于提高菌株的发酵密度，同时能有效提高氨基葡萄糖的含量，所得目标产物的发酵量与现有技术基因工程菌的发酵量近似甚至更高。
具体实施方式
本发明下述实施例1-4中，以常规的大肠杆菌BL21为发酵菌株进行氨基葡萄糖的发酵，并将所述大肠杆菌BL21保存于LB斜面培养基中，4℃保存；并在进行种子活化步骤前，将保存的所述菌株划线至LB平板培养基中进行培养10h。
所述LB斜面培养基包括：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、半乳聚糖2g/L、硫酸卡那霉素50mg/L，琼脂20g/L；
所述LB平板培养基包括：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、半乳聚糖3g/L、硫酸卡那霉素50mg/L，琼脂20g/L。
实施例1 5L发酵罐发酵
本实施例所述培养大肠杆菌发酵生产氨基葡萄糖的方法，包括如下步骤：
(1)将经过所述LB平板培养基活化培养的大肠杆菌用接种环接种一环至种子培养基中进行种子活化，控制培养温度为35℃，控制摇床转速200rpm，培养时间为10h，得到种子液；
所述种子培养基包括：蛋白胨10g/L，酵母膏25g/L，甘油2g/L，甘氨酸8g/L，生物素0.1g/L，调pH7.0-7.2；
(2)将活化后的种子液按照10％的接种量接种至装有2.5L发酵培养基的5L发酵罐中进行发酵培养，控制培养温度为35℃，搅拌速度为300rpm，通气量为1.2vvm，培养时间为40h，得到含氨基葡萄糖的发酵液；
所述发酵培养基包括：葡萄糖25g/L，酵母膏25g/L，无氨基氮源8g/L，甘露糖醇10g/L，乳酸钠3g/L，甘氨酸硝酸盐8g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L，K2HPO4 1.2g/L，(NH4)2SO42g/L，FeSO4·7H2O 0.6mg/L，调pH7.0-7.2；
发酵过程中取样检测发酵液的OD660，当OD660＝2.0时，开始进行补料培养基补料，所述补料培养基包括：葡萄糖500g/L，半乳聚糖60g/L，控制补料速率为6L/h。
实施例2 5L发酵罐发酵
本实施例所述培养大肠杆菌发酵生产氨基葡萄糖的方法，包括如下步骤：
(1)将经过所述LB平板培养基活化培养的大肠杆菌用接种环接种一环至种子培养基中进行种子活化，控制培养温度为37℃，控制摇床转速220rpm，培养时间为10h，得到种子液；
所述种子培养基包括：蛋白胨20g/L，酵母膏15g/L，甘油4g/L，甘氨酸3g/L，生物素0.3g/L，调pH7.0-7.2；
(2)将活化后的种子液按照10％的接种量接种至装有2.5L发酵培养基的5L发酵罐中进行发酵培养，控制培养温度为37℃，搅拌速度为250rpm，通气量为1.8vvm，培养时间为40h，得到含氨基葡萄糖的发酵液；
所述发酵培养基包括：葡萄糖35g/L，酵母膏15g/L，无氨基氮源12g/L，甘露糖醇6g/L，乳酸钠8g/L，甘氨酸硝酸盐3g/L，MgSO4·7H2O 0.8g/L，K2HPO4 0.8g/L，(NH4)2SO4 4g/L，FeSO4·7H2O 0.4mg/L，调pH7.0-7.2；
发酵过程中取样检测发酵液的OD660，当OD660＝2.0时，开始进行补料培养基补料，所述补料培养基包括：葡萄糖600g/L，半乳聚糖100g/L，控制补料速率为5L/h。
实施例3 5L发酵罐发酵
本实施例所述培养大肠杆菌发酵生产氨基葡萄糖的方法，包括如下步骤：
(1)将经过所述LB平板培养基活化培养的大肠杆菌用接种环接种一环至种子培养基中进行种子活化，控制培养温度为35℃，控制摇床转速220rpm，培养时间为10h，得到种子液；
所述种子培养基包括：蛋白胨15g/L，酵母膏20g/L，甘油3g/L，甘氨酸5g/L，生物素0.2g/L，调pH7.0-7.2；
(2)将活化后的种子液按照10％的接种量接种至装有2.5L发酵培养基的5L发酵罐中进行发酵培养，控制培养温度为32℃，搅拌速度为280rpm，通气量为1.5vvm，培养时间为42h，得到含氨基葡萄糖的发酵液；
所述发酵培养基包括：葡萄糖30g/L，酵母膏20g/L，无氨基氮源10g/L，甘露糖醇8g/L，乳酸钠5g/L，甘氨酸硝酸盐5g/L，MgSO4·7H2O 0.6g/L，K2HPO4 1.0g/L，(NH4)2SO4 3g/L，FeSO4·7H2O 0.5mg/L，调pH7.0-7.2；
发酵过程中取样检测发酵液的OD660，当OD660＝2.0时，开始进行补料培养基补料，所述补料培养基包括：葡萄糖550g/L，半乳聚糖80g/L，控制补料速率为5.5L/h。
实施例4 5L发酵罐发酵
本实施例所述培养大肠杆菌发酵生产氨基葡萄糖的方法，包括如下步骤：
(1)将经过所述LB平板培养基活化培养的大肠杆菌用接种环接种一环至种子培养基中进行种子活化，控制培养温度为35℃，控制摇床转速220rpm，培养时间为10h，得到种子液；
所述种子培养基包括：蛋白胨15g/L，酵母膏20g/L，甘油3g/L，甘氨酸5g/L，生物素0.2g/L，调pH7.0-7.2；
(2)将活化后的种子液按照10％的接种量接种至装有2.5L发酵培养基的5L发酵罐中进行发酵培养，控制培养温度为32℃，搅拌速度为280rpm，通气量为1.5vvm，培养时间为42h，得到含氨基葡萄糖的发酵液；
所述发酵培养基包括：葡萄糖30g/L，酵母膏20g/L，无氨基氮源10g/L，甘露糖醇8g/L，乳酸钠5g/L，甘氨酸硝酸盐5g/L，MgSO4·7H2O 0.6g/L，K2HPO4 1.0g/L，(NH4)2SO4 3g/L，FeSO4·7H2O 0.5mg/L，调pH7.0-7.2；
发酵过程中取样检测发酵液的OD660，当OD660＝2.0时，开始进行补料培养基补料，所述补料培养基包括：葡萄糖550g/L，控制补料速率为5.5L/h。
对比例1
本对比例所述培养大肠杆菌发酵生产氨基葡萄糖的方法同实施例3，其区别仅在于，所述种子培养基中不含有甘氨酸。
对比例2
本对比例所述培养大肠杆菌发酵生产氨基葡萄糖的方法同实施例3，其区别仅在于，所述发酵培养基中不含有甘氨酸硝酸盐。
对比例3
本对比例所述培养大肠杆菌发酵生产氨基葡萄糖的方法同实施例3，其区别仅在于，所述发酵培养基中不含有甘露糖醇。
对比例4
本对比例所述培养大肠杆菌发酵生产氨基葡萄糖的方法同实施例3，其区别仅在于，所述LB斜面培养基和所述LB平板培养基中不含有半乳聚糖。
对比例5
本对比例所述培养大肠杆菌发酵生产氨基葡萄糖的方法为现有技术的常规方法，即种子培养基包括：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L；发酵培养基包括：蛋白胨12g/L，酵母粉24g/L，甘油4g/L，葡萄糖100g/L，KH2PO42.31g/L，K2HPO4 12.54g/L，乳糖10g/L，硫酸卡那霉素50mg/ml；补料培养基包括：800g/L葡萄糖。种子活化剂发酵培养的工艺条件与实施例3相同。
实验例
分别对上述实施例1-4及对比例1-4中所得发酵液中菌体量和氨基葡萄糖含量进行测定，所述菌体量以OD660进行表征，所述氨基葡萄糖的含量按照现有技术常规方法进行测定，如江南大学梁芳《氨基葡萄糖的发酵中试放大和提取工艺研究》中记载的方法，检测数据记录于下表1。
表1发酵液菌体量及氨基葡萄糖含量测定结果
Figure GDA0002643559880000081
Figure GDA0002643559880000091
从上表数据可知，本发明所述培养大肠杆菌发酵生产氨基葡萄糖的方法，利用常规大肠杆菌为发酵菌株，通过对种子培养基以及发酵培养基的优化，有效提高了大肠杆菌的菌量，同时有效提高了发酵液中氨基葡萄糖的含量。
本发明所述方法利用添加半乳聚糖的LB固体培养基进行菌株的日常保存，实验数据表明，添加的半乳聚糖对菌株的发酵活力有一定的促进作用，有益于获得高密度的发酵菌液。
本发明所述方法在现有种子培养基的基础上，添加甘氨酸进行种子液培养，有助于提高发酵菌株的发酵活力，使得大肠杆菌在后续发酵过程中获得更高的菌种密度，并累计更多的目标产物。
本发明所述方法在现有发酵培养基的基础上，通过添加甘氨酸硝酸盐，能有效降低目标产物氨基葡萄糖对菌株的刺激作用，有助于目标产物的胞外积累，而甘露糖醇的添加则有助于提高菌株的发酵密度，同时能有效提高氨基葡萄糖的含量。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种培养大肠杆菌发酵生产氨基葡萄糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将斜面保存的大肠杆菌接种入种子培养基中进行种子活化；所述种子培养基的溶质如下：蛋白胨10-20g/L，酵母膏15-25g/L，甘油2-4g/L，甘氨酸3-8g/L，生物素0.1-0.3g/L，调pH7.0-7.2；
(2)将活化后的种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，得到含氨基葡萄糖的发酵液；所述发酵培养基的溶质如下：葡萄糖25-35g/L，酵母膏15-25g/L，无氨基氮源8-12g/L，甘露糖醇6-10g/L，乳酸钠3-8g/L，甘氨酸硝酸盐3-8g/L，MgSO4·7H2O 0.4-0.8g/L，K2HPO40.8-1.2g/L，(NH4)2SO42-4g/L，FeSO4·7H2O 0.4-0.6mg/L，调pH7.0-7.2。
2.根据权利要求1所述的培养大肠杆菌发酵生产氨基葡萄糖的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述种子培养基的溶质如下：蛋白胨15g/L，酵母膏20g/L，甘油3g/L，甘氨酸5g/L，生物素0.2g/L。
3.根据权利要求2所述的培养大肠杆菌发酵生产氨基葡萄糖的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述种子活化步骤的培养温度为35-37℃，控制摇床转速200-220rpm，培养时间为10-12h。
4.根据权利要求3所述的培养大肠杆菌发酵生产氨基葡萄糖的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述发酵培养基的溶质如下：葡萄糖30g/L，酵母膏20g/L，无氨基氮源10g/L，甘露糖醇8g/L，乳酸钠5g/L，甘氨酸硝酸盐5g/L，MgSO4·7H2O 0.6g/L，K2HPO4 1.0g/L，(NH4)2SO4 3g/L，FeSO4·7H2O 0.5mg/L。
5.根据权利要求4所述的培养大肠杆菌发酵生产氨基葡萄糖的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述发酵培养步骤的培养温度为30-37℃，搅拌速度为250-300rpm，通气量为1.2-1.8vvm，培养时间为36-48h。
6.根据权利要求1-5任一项所述的培养大肠杆菌发酵生产氨基葡萄糖的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，还包括在发酵过程中加入补料培养基进行补料的步骤，所述补料培养基的溶质如下：葡萄糖500-600g/L，半乳聚糖60-100g/L。
7.根据权利要求6所述的培养大肠杆菌发酵生产氨基葡萄糖的方法，其特征在于，所述补料步骤为恒速补料，控制补料速率为5-6L/h。
8.根据权利要求7所述的培养大肠杆菌发酵生产氨基葡萄糖的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述大肠杆菌用LB斜面培养基进行保存。
9.根据权利要求8所述的培养大肠杆菌发酵生产氨基葡萄糖的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，还包括在种子活化步骤之前，将斜面保存的大肠杆菌划线至LB固体平板培养基中进行培养活化的步骤。
10.根据权利要求9所述的培养大肠杆菌发酵生产氨基葡萄糖的方法，其特征在于，所述LB斜面培养基和/或所述LB固体平板培养基中添加2-3g/L的半乳聚糖。
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